JPH07313175A - アントシアニン生産促進因子とそれを含む培地 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 アントシアニン生産細胞を培養する際に培地
中に添加することでアントシアニン生産量を増大させる
ことのできるアントシアニン生産促進因子とそれを含む
培地の提供を目的としている。 【構成】 イチゴ培養細胞を培養する際に該培養細胞か
ら放出され、次の特徴（ａ）１１５℃以上の温度で蒸気
加圧滅菌しても失活しない耐熱性を有する、（ｂ）ゲル
ろ過によって分子量既知の標準物質と比べたときの分子
量が５００〜１５００の間である、（ｃ）液体培地に添
加し、この培地でイチゴ培養細胞を培養する場合に、無
添加の培地と比べイチゴ培養細胞のアントシアニン生産
量が増加する、を持つことを特徴とするアントシアニン
生産促進因子とそれを含む培地である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、アントシアニン生産能
力を持つ植物細胞を培養してアントシアニンを生産する
技術において、培養細胞のアントシアニン生産を促進さ
せるアントシアニン生産促進因子とそれを含む培地に関
する。

【０００２】

【従来の技術】アントシアニンは着色料や塗料の素材と
して実用価値が高いため、その大量生産が検討されてい
る。また最近ではアントシアニンの血圧降下作用などの
薬理的な利用のための研究もなされており、色素以外の
用途にも興味深い性質を有している。従来、アントシア
ニンの一般的な製法は、アントシアニンを含む種々の植
物を材料とし、適宜な分離精製法を用いてアントシアニ
ンを得ている。しかし、このように栽培植物からアント
シアニンを抽出する方法では原料コストが高くなり、ア
ントシアニンを安価に製造することが不可能であった。
また栽培植物を原料とすると、植物の成長が遅く、栽培
に時間と手間がかかり、アントシアニンの生産効率が悪
い問題があった。さらにアントシアニンの製造が栽培植
物の収穫時期に左右され、年間を通して平均的にアント
シアニンの製造ができない等の問題があった。

【０００３】そして従来、栽培植物体からのアントシア
ニンの製造方法に比べ、アントシアニンの生産効率が高
く、アントシアニンを大量にかつ年間を通して平均的に
製造することが可能な方法として、イチゴ、ニンジン、
ブドウ、バラ、リンゴ、キクイモなどから誘導されたア
ントシアニン生産細胞を大量に培養し、この培養細胞か
らアントシアニンを抽出する方法が検討されている。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、現段階
では上述したようにアントシアニン生産細胞を工業的規
模で大量に培養するまでには至っていない。この原因と
しては、アントシアニン生産細胞を材料から取り出し、
培養を行う際に、培養細胞をスケールアップして培養
し、増殖させるのが難しいことが挙げられる。また、
光、培地成分、培地のｐＨなど培養環境を最適培養条件
としてアントシアニン生産細胞を培養しても、培養細胞
中にアントシアニンが生成されない若しくは生産量が非
常に少ない場合があった。

【０００５】本発明は上記事情に鑑みてなされたもの
で、アントシアニン生産細胞を培養する際に培地中に添
加することでアントシアニン生産量を増大させることの
できるアントシアニン生産促進因子とそれを含む培地の
提供を目的としている。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明にかかるアントシ
アニン生成促進因子は、イチゴ培養細胞を培養する際
に、該培養細胞から放出され、次の特徴、（ａ）１１５
℃以上の温度で蒸気加圧滅菌しても失活しない耐熱性を
有する、（ｂ）ゲルろ過によって分子量既知の標準物質
と比べたときの分子量が５００〜１５００の間である、
（ｃ）液体培地に添加し、この培地でイチゴ培養細胞を
培養する場合に、無添加の培地と比べイチゴ培養細胞の
アントシアニン生産量が増加する、を持つことを特徴と
するものである。

【０００７】また本発明にかかる培地は、上記アントシ
アニン生産促進因子を含んだものである。このアントシ
アニン生産促進因子を含む培地としては、イチゴ培養細
胞の培養液から細胞を分離した培養残液或いは該培養残
液と新規に調製した液体培地とを混合した液体培地、イ
チゴ培養細胞の培養液から細胞を分離した培養残液を乾
燥して得られた乾燥物、好ましくは凍結乾燥物を新たに
調製した液体培地に添加したもの、或いはイチゴ培養細
胞の培養液から細胞を分離した培養残液を精製して得ら
れたアントシアニン生産促進因子画分を新たに調製した
液体培地に添加したものである。

【０００８】

【作用】イチゴ培養細胞を用いてアントシアニンを生産
する研究において、光、培地成分、培地のｐＨなど培養
環境を最適培養条件に整えても、細胞接種量が極めて低
い場合にはアントシアニンの生産が見られなくなるとい
う現象が見られ、そのためイチゴ培養液中に培養細胞の
アントシアニン生産を高める作用を持つアントシアニン
生産促進因子（コンディショニングファクター）が放出
されていると推定し、培養を終えた培養ろ液を用い、イ
チゴ細胞の培養における効果について報告している（桜
井美栄，茂田潤一，森司 化学工学会第２６回秋季大会
要旨集 第２分冊 ｐ．２８６（１９９３））。すなわ
ち、イチゴ培養細胞を培養した後の培養ろ液（コンディ
ショニング培地）にイチゴ培養細胞を加えて培養したと
ころ、アントシアニンの蓄積量と全生産量を増加させる
ことができた。

【０００９】本発明は、前記培養ろ液に含まれるアント
シアニン生産促進因子が、次の特徴（ａ）１１５℃以上
の温度で蒸気加圧滅菌しても失活しない耐熱性を有す
る、（ｂ）ゲルろ過によって分子量既知の標準物質と比
べたときの分子量が５００〜１５００の間である、
（ｃ）液体培地に添加し、この培地でイチゴ培養細胞を
培養する場合に、無添加の培地と比べイチゴ培養細胞の
アントシアニン生産量が増加する、を有しているとの新
たな知見に基づいてなされたものである。すなわち本発
明にかかるアントシアニン生産促進因子は、イチゴ等の
アントシアニン生産能を有する植物培養細胞を培養する
際に、その培地に添加することにより、その細胞のアン
トシアニン生産量を増大させることができる。またこの
アントシアニン生産促進因子は上記特徴を有しているこ
とから、これを含む培地を蒸気加圧滅菌することができ
る。さらにアントシアニン生産促進因子はゲルろ過によ
って精製し、あるいは凍結乾燥等によって培地に添加し
易くかつ保存性の良い状態とすることができ、アントシ
アニン生産促進因子の調製が容易となる。

【００１０】

【実施例】以下、本発明を詳細に説明する。本発明にか
かるアントシアニン生産促進因子は、イチゴ培養細胞を
液体培地中で培養した際に、イチゴ培養細胞から放出さ
れる物質であり、その存在量が微量であるために現在ま
でのところその構造を完全に同定するまでには至ってい
ない。このアントシアニン生産促進因子は、それを含む
培養ろ液を１２１℃で１５分間程度加熱処理しても、そ
のアントシアニン生産促進作用が損なわれない程度の耐
熱性を有し、また凍結乾燥をしてもそのアントシアニン
生産促進作用が損なわれない程度の耐凍性を有してい
る。また、このアントシアニン生産促進因子の分子量
は、ゲルろ過によって分子量既知の標準物質と比べたと
きの分子量が５００〜１５００の間である。さらに、こ
のアントシアニン生産促進因子は水溶性であり、この物
質は細胞壁を構成する多糖類でないことが確認されてい
る。

【００１１】そして、このアントシアニン生産促進因子
の作用上の特徴は、これを含む液体培地でイチゴ培養細
胞を培養すると、培養細胞のアントシアニンの蓄積量と
全生産量とを大幅に増加させることができる点にある。

【００１２】本発明において用いるアントシアニン生産
促進因子を含む液体培地は、イチゴ培養細胞の培養液か
ら細胞を分離した培養残液或いは該培養残液と新規に調
製した液体培地、この培養残液を乾燥して得られた乾燥
物、好ましくは凍結乾燥物を新たに調製した液体培地に
添加した液体培地、あるいは培養残液を精製して得られ
たアントシアニン生産促進因子画分を新たに調製した液
体培地に添加した液体培地が用いられる。

【００１３】イチゴ培養細胞の培養液から細胞を分離し
た培養残液は、イチゴから誘導したカルス（培養細胞）
を、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）、
ナフタレン酢酸、インドール酢酸、インドール酪酸、ト
リクロロ安息香酸などのオーキシン、又はオーキシンと
ベンジルアデニン（ＢＡ）、ゼアチンなどのサイトカイ
ニンとを添加した液体培地に入れて３日〜２週間程度培
養した培養液をナイロンメッシュなどでろ過するか、あ
るいは遠心分離によって培養細胞を分離した残液が用い
られる。この培養残液は２回以上の培養を繰り返した後
の残液でも良い。また、この培養残液は新規調製培地と
比べて栄養成分（炭素源、窒素源、無機塩類など）、ｐ
Ｈ及びオーキシン等のホルモン量が変化しているので、
この培養残液を用い、或いは培養残液と新規調製培地と
を混合して用いる場合には、その栄養成分量、ｐＨ及び
ホルモン量を適宜調整し、不足する成分を添加して使用
しても良い。

【００１４】また、前記培養残液の乾燥物を新規調製培
地に添加した液体培地を用いる場合には、培養残液を凍
結乾燥して得られた乾燥物を、新規調製培地１００ｍｌ
当り０.０１ｇ〜５.０ｇ、好ましくは０.１〜０.５ｇ程
度添加して用いれば良い。なお、培養残液の乾燥物は凍
結乾燥物に限らず、噴霧乾燥、熱風乾燥など他の乾燥方
法を用いて乾燥したものを使用しても良い。また、新規
調製培地としては、ＬＳ培地、ＭＳ培地、Ｂ５培地など
の一般に植物組織培養の分野において用いられる液体培
地を基本とし、それにオーキシン等のホルモンや必要に
応じてショ糖などの炭素源、硝酸カリウム、硝酸アンモ
ニウムなどの窒素源、ビタミン類などを添加した液体培
地を使用して良い。この液体培地中のオーキシン量は、
２，４−Ｄの場合には０.１〜５.０ｐｐｍ、好ましくは
０.５〜２.０ｐｐｍ程度とし、ＢＡなどのサイトカイニ
ンは０〜３.０ｐｐｍ、好ましくは０〜０.２ｐｐｍ程度
とする。

【００１５】また、培養残液を精製してアントシアニン
生産促進因子画分（培養残液の低分子の部分）を得るに
は、ゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィーなどの精
製手段を用いる。これら手段によって精製されたアント
シアニン生産促進因子は、新規に調製した液体培地に添
加される。精製したアントシアニン生産促進因子は、凍
結乾燥などによって乾燥物としても良い。

【００１６】本発明では、上述した何れかのアントシア
ニン生産促進因子を含む液体培地を、好ましくは１１５
℃以上での蒸気加圧滅菌処理により、更に好ましくは、
一般の液体培地の滅菌処理として用いられる１２１℃，
１５分以上の加熱により滅菌した液体培地を用い、その
滅菌済みの液体培地にイチゴなどのアントシアニン生産
能を有する植物の培養細胞（カルス）を入れて培養す
る。このアントシアニン生産能を有する植物の培養細胞
としては、イチゴ、バラ、ニンジン、ブドウなどが好適
に用いられ、これら植物の培養細胞は、摘出した細胞か
ら誘導したカルスを用いても良いし、このカルスを液体
培地で３０００Lux以下、好ましくは１０００Lux以下の
光条件下で培養し、或いは多数回継代培養した培養細胞
が用いられる。

【００１７】（実験例）本発明にかかるアントシアニン
生産促進因子のキャラクタリゼーションを目的として以
下の実験を行った。 ・細胞系 イチゴ培養細胞のカルスは、イチゴ（品種：四季成）の
培養苗の葉から誘導したカルスを用いた。この培養細胞
の生産するアントシアニンの組成を分析した結果、ペオ
ニジン−３−グルコシドが最も多く、次にシアニジン−
３−グルコシドが多く含まれていた。 ・コンディショニング培地 ２，４−Ｄを１ｐｐｍ、ＢＡを０.１ｐｐｍ、ショ糖を
３％含むＬＳ液体培地中で８００Lux、温度２５℃、８
０r.p.m.での回転振とう条件で１０日間培養した培養液
を、ナイロンメッシュ（３０μｍ）でろ過した培養ろ液
（培養残液）を得た。この培養ろ液をコンディショニン
グ培地（以下ＣＭという）とした。 ・ゲルろ過による分画 まず内径１６ｍｍのカラムに、糖を含まないＢ５培地
（ＭＥＳ ５ｍＭ，ｐＨ５.５）で平衡化したセファデッ
クスＧ−２５をゲル層高３４ｃｍとなるように充填し、
２５倍濃縮したＣＭ１ｍｌをこのカラムを用いてゲルろ
過した。溶離液としては糖を含まないＢ５培地（ＭＥＳ
５ｍＭ，ｐＨ５.５）を用い、１０ｍｌずつのフラクシ
ョンを試験管に分取し、オートクレーブ（１２１℃、１
５分間）にかけた。 ・検定 ゲルろ過で分画された各フラクションを添加した培地で
イチゴ培養細胞を培養することにより、アントシアニン
生産促進作用を検定した。培養はファルコン社のマルチ
ウェルプレート（各ウェルの内径３５ｍｍ）を用い、４
０００Lux、２５℃、１００r.p.m.で往復振とうを６日
間行った。また分画前のＣＭを添加した培養も行った。
ここで用いた培養液の組成を表１に示す。

【００１８】

【表１】

【００１９】培養終了後、ナイロンメッシュで細胞を集
め、細胞重量を測定した。また、アントシアニンは細胞
０.１ｇから０.１％塩酸メタノールで抽出し、５２８ｎ
ｍでの吸光度を測定し、検量線から定量した。

【００２０】・結果 分画前のＣＭを添加し培養を行った結果を、コントロー
ル（ＣＭ添加せず）と比較して図１から図３に示す。図
１は１ウェル当りの細胞重量を示すグラフであり、図２
は培養細胞ｇ当りの色素（アントシアニン）蓄積量を示
すグラフであり、図３は１ウェル当りの色素生産量を示
すグラフである。また、分画後の各フラクションを添加
して培養した結果を図４から図６に示す。図４は１ウェ
ル当りの細胞重量を示すグラフであり、図５は培養細胞
ｇ当りの色素（アントシアニン）蓄積量を示すグラフで
あり、図６は１ウェル当りの色素生産量を示すグラフで
ある。

【００２１】図１ないし図３の結果から、コンディショ
ニング培地によってイチゴ培養細胞のアントシアニン生
産が促進されることが明白となった。また、図４から図
６の結果から、細胞重量はＮｏ．７のフラクション、色
素蓄積量及び色素生産量はＮｏ．６のフラクションがそ
れぞれ最高値を示した。この結果から細胞増殖に寄与す
るコンディショニング因子と色素生産に寄与するコンデ
ィショニング因子がそれぞれ独立に作用していることが
認められた。また細胞重量と色素含有量を掛け合わせて
得られる色素生産量ではＮｏ．６のフラクションで最も
良い結果が得られた。分子量が既知の標準物質（シアノ
コバラミン（ビタミンＢ１２）；分子量１３５５）の溶
出曲線からこれらのコンディショニング因子の分子量は
およそ５００〜１５００の間（ほぼ１０００程度）であ
ることがわかった。

【００２２】

【発明の効果】以上説明したように、本発明によれば、
イチゴ等のアントシアニン生産能を有する植物培養細胞
を培養する際に、その培地に添加することにより、その
細胞のアントシアニン生産量を増大させることができる
アントシアニン生産促進因子を提供しえる。またこのア
ントシアニン生産促進因子を含む培地は、蒸気加圧滅菌
することができ、さらにアントシアニン生産促進因子は
ゲルろ過によって精製し、あるいは凍結乾燥等によって
培地に添加し易くかつ保存性の良い状態とすることがで
きるので、アントシアニン生産促進因子を含む培地の調
製が容易となる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明にかかる実験例の結果として、分画前の
コンディショニング培地を用いた培養における１ウェル
当りの細胞重量を示すグラフである。

【図２】同じく培養細胞ｇ当りの色素（アントシアニ
ン）蓄積量を示すグラフである。

【図３】同じく１ウェル当りの色素生産量を示すグラフ
である。

【図４】コンディショニング培地分画フラクションを用
いた培養における１ウェル当りの細胞重量を示すグラフ
である。

【図５】同じく培養細胞ｇ当りの色素蓄積量を示すグラ
フである。

【図６】同じく１ウェル当りの色素生産量を示すグラフ
である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ｃ１２Ｐ 19/44 7432−4Ｂ (Ｃ１２Ｎ 5/04 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 19/44 Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 古崎 新太郎 神奈川県藤沢市大鋸１−７−７ (72)発明者 松村 悟 東京都豊島区長崎２−16−９ つたえ荘 205

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 イチゴ培養細胞を培養する際に、該培養
   細胞から放出され、次の特徴、（ａ）１１５℃以上の温
   度で蒸気加圧滅菌しても失活しない耐熱性を有する、
   （ｂ）ゲルろ過によって分子量既知の標準物質と比べた
   ときの分子量が５００〜１５００の間である、（ｃ）液
   体培地に添加し、この培地でイチゴ培養細胞を培養する
   場合に、無添加の培地と比べイチゴ培養細胞のアントシ
   アニン生産量が増加する、を持つことを特徴とするアン
   トシアニン生産促進因子。
2. 【請求項２】 請求項１記載のアントシアニン生産促進
   因子を含む培地。
3. 【請求項３】 アントシアニン生産促進因子を含む培地
   が、イチゴ培養細胞の培養液から細胞を分離した培養残
   液或いは該培養残液と新規に調製した液体培地とを混合
   した液体培地であることを特徴とする請求項２記載のア
   ントシアニン生産促進因子を含む培地。
4. 【請求項４】 アントシアニン生産促進因子を含む培地
   が、イチゴ培養細胞の培養液から細胞を分離した培養残
   液を乾燥して得られた乾燥物を、新たに調製した液体培
   地に添加したものであることを特徴とする請求項２記載
   のアントシアニン生産促進因子を含む培地。