JPH07265100A - 核酸増幅のための方法および装置 - Google Patents

核酸増幅のための方法および装置

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Abstract

(57)【要約】 【目的】 本発明は、生物学的操作を実施するために有
用な装置、特に、汚染アンプリコンの除去工程および核
酸増幅工程を含む操作に有用な装置に関する。 【構成】 本発明の装置は、生物学的流体サンプルを導
入および取り出すためのサンプルウエル；サンプルウエ
ルと液体連絡している、乾燥試薬を含む少なくともひと
つの反応チェンバー；反応チェンバーおよびサンプルウ
エルと空気連絡している空気チェンバー；および装置内
で流体サンプルの流れを引き起こす空気吸引／排出手段
の装置を接続するための空気チェンバー内の空気口から
なる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、生物学的操作例えば核
酸増幅を実施するために有用な装置、特に、混入するア
ンプリコンを除去または分解するための汚染除去工程お
よび標的核酸セグメントの数を増やすための増幅工程を
含む生物学的操作を実施するために有用な単一装置また
はモジュールに関する。
【０００２】
【従来の技術】生物学的操作は臨床診断分析においてし
ばしば利用される。しかしながら、この操作の工程は、
しばしば実験室の異なるエリアおよび／または異なる容
器またはコンテナーに接続されており、そのため、生物
学的サンプルおよび試薬を輸送する必要があり、他の臨
床サンプルの汚染の危険の増加が生じる。
【０００３】この汚染の危険は、操作が核酸増幅反応、
例えば一本鎖核酸（標的核酸）を数百万コピー（アンプ
リコン）増幅することができる鎖置換増幅（ＳＤＡ）ま
たはポリメラーゼチェインリアクション（ＰＣＲ）を含
む場合に特に関係する。臨床診断実験室における莫大な
潜在的利用性に拘わらず、核酸増幅反応はしかしなが
ら、前の増幅反応の増幅産物（アンプリコン）により容
易に汚染されうる。このような汚染アンプリコンはひる
がえって、実験室に入って来た新たなサンプルを汚染し
うるが、それにより、汚染された物質が誤った陽性の指
示を伴ってサンプル中において検出されることになる
（例えば、誤診）。
【０００４】アンプリコンの汚染の問題は多くの汚染除
去技術の開発に通じてきた。効果的にすべく、これらの
汚染除去技術は増幅工程の前に汚染除去工程が起こるよ
うにし、それにより汚染アンプリコンが増幅工程の間に
標的核酸として認識される可能性を大きく減らすことが
通常必要であった。
【０００５】汚染除去試薬および増幅試薬はしばしば互
いに混ぜることが不可能であり、各々の反応条件を必要
とする。時には、汚染除去および増幅のための試薬を混
ぜると、互いを不活性化する。さらに、ひとつのコンテ
ナー中での汚染除去反応の実施および汚染除去されたサ
ンプルを増幅のために他のコンテナーに移すことは、移
す間にサンプルが再び汚染される危険性が高いため、実
行可能なオプションではない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】前記の点から、本発明
の第１の目的は、相互に排他的になる必然性のある生物
学的操作を単一の装置において実施するための方法およ
び装置を提供することである。
【０００７】本発明の第２の目的は、必要な試薬が単一
の装置に含まれるように、核酸サンプルの汚染除去およ
び増幅を含む生物学的操作を実施するための技術を提供
することである。
【０００８】本発明のさらに他の目的は、核酸汚染除去
反応および増幅反応を含む生物学的操作をはかどらせる
のに用いられうる、単一モジュール形態の装置を提供す
ることである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】生物学的操作におけるサ
ンプル、試薬および生成物の汚染に関連する問題を解決
するために、本発明は生物学的操作を実施するための装
置に関するが、該装置は：（ａ）流体生物学的サンプル
を導入および除去するためのサンプルウエル；（ｂ）該
サンプルウエルと液体連絡している少なくともひとつの
反応チェンバー；（ｃ）反応チェンバーとサンプルウエ
ルとの間を空気連絡する空気チェンバー；および（ｄ）
サンプルウエルと反応チェンバーの間に流体生物学的サ
ンプルの流れを生じさせる空気吸引／排出手段に上記装
置を接続するための、空気チェンバー内の空気口（ｐｎ
ｅｕｍａｔｉｃ ｐｏｒｔ）を含む。この装置は通常、
横長であり、サンプルウエルと空気口を両端に有し、そ
の間に反応チェンバーを有する。生物学的操作に必要な
試薬は、反応チェンバー内で別の位置に離して設置され
る。
【００１０】上記のとおり、本発明は、生物学的操作を
実施するための方法および装置を提供する。概説すれ
ば、本発明の一つの態様は、サンプルウエルおよびその
中に形成される少なくとも一つのチェンバーを有する装
置を提供する。チェンバーはサンプルウエルと液体連絡
している。生物学的操作の工程はチェンバー内の異なる
部位またはエリアにて実施される。
【００１１】別の態様において、装置中には複数のチェ
ンバーが存在することにより、生物学的操作の複数工程
の各々を適合させる。汚染除去工程および増幅工程を含
む生物学的操作における使用に適合した別の態様におい
て、汚染除去エリアはサンプルウエルと液体連絡し、そ
して増幅エリアは汚染除去エリアと液体連絡している。
アンプリコンの汚染除去試薬は汚染除去エリアに存在
し、そして核酸増幅試薬は増幅エリアに存在する。
【００１２】使用においては、核酸を含む流体サンプル
をサンプルウエルから汚染除去エリアに移すが、その
際、流体サンプルは汚染除去試薬に接触し、そしてサン
プル中のアンプリコンは分解される。次に、流体サンプ
ルは汚染除去エリアから増幅エリアに移されるが、その
際、流体サンプルは増幅試薬に接触し、即ちアンプリコ
ンがサンプル中に生じる。次に、流体サンプルは増幅エ
リアから除かれて、汚染除去エリアを通ってサンプルウ
エルに行く。サンプルの移動および回収はあらゆる適切
な空気手段により実施される。
【００１３】サンプルが回収されたら、サンプル中のア
ンプリコンの存在はあらゆる適切な手段、例えばアンプ
リコンに結合する核酸プローブを用いて検出されるが、
その際プローブは検出可能な基で標識されており（例え
ば、酵素、ラジオアイソトープ等）、すべては当業界に
おいて公知である。別法としては、装置は、装置に付加
的なエリアおよび試薬を含ませることによりインサイチ
ュでの検出工程の実施を可能にするために配置される。
【００１４】
【実施例】本発明の装置のひとつの態様の等距離図を図
１に示す。この図は、ほぼ長方形のプリズムの形態の複
数チェンバーの態様を示し、約１．３７０インチの長
さ、約０．３０４インチの幅、そして約０．２００イン
チの高さの名目上の寸法を有する。直径約０．２１４イ
ンチおよび深さ約０．１６０インチであって流体の生物
学的サンプル約７５μｌを受けるためのサンプルウエル
（１１）は、一方の端にあって操作されるサンプルを受
けるために装置の上部表面に開いている。当業者には理
解されるとおり、装置の寸法は上記のように特定する必
要はなく、装置が実質的に所望の生物学的操作の実施の
ための密閉装置として十分に機能し続けるならば変更可
能である。しかしながら、寸法の変更の一般的ガイドラ
インは、上記の特定された寸法により表されるのとほぼ
等しい寸法比を保持すべきである。サンプルウエル（１
１）の反対の端は、約０．１８５インチの直径を有する
空気口（１２）である。該空気口も、装置（１０）の上
部表面に開いている。
【００１５】図２および３を参照すると、図３は拡大図
であり、図２の線２Ｂ−２Ｂで切った装置（１０）の断
面図である。サンプルウエル（１１）は壁（２９）およ
び（３１）および底（２８）により規定される。このサ
ンプルウエル（１１）は、装置の底（２８）への壁（１
３）の実質上のアーチにより作られる第１マイクロチャ
ンネル（１４）により汚染除去エリア（１５）と連絡す
る。この特定の態様において第１マイクロチャンネル
（１４）を作る、壁（１３）と装置の底（２８）の間の
隙間は約０．００６インチの高さであり、そして装置
（１０）の全内部幅を横切って存在する。該装置の別の
態様はより高くより狭い幅を有するドーム型のマイクロ
チャンネルを有する（即ち、一般的にはＵの字が倒置し
た形態）。マイクロチャンネルの大きさおよび形態は、
装置を通って移動する流体の粘度および表面張力に依存
する。
【００１６】汚染除去エリア（１５）は、壁（１３）お
よび（１７）、天井（１７）および装置の底（２８）に
より規定される。本発明のこの好ましい態様において
は、汚染除去エリアは約０．３１５インチの長さ、約
０．２２２インチの幅、そして約０．０８０インチの高
さである。汚染除去エリアは約９０μｌの容積を有す
る。上記のとおり、汚染除去エリアの寸法は、装置の寸
法のように、汚染除去工程が正しく機能する限りかなり
変更してよい。しかしながら、寸法を変更するための通
常のガイドラインは、上記の特定の寸法により表される
寸法間の比を維持すべきである。
【００１７】汚染除去エリアに含まれるものは、汚染除
去反応に必要な核酸汚染除去試薬である。汚染除去試薬
（上記のとおり汚染除去反応のために必要な活性成分）
は、汚染除去のためのあらゆる適切な手段に必要なもの
でありうる。汚染除去試薬はあらゆる適切な形態であり
え、例えば固体、例えば乾燥フィルム、凍結乾燥ペレッ
トまたは試薬を含浸した紙を含むがこれらに限定されな
い。
【００１８】本発明の好ましい態様においては、汚染除
去試薬は、乾燥形態で天井（２７）の内部表面におかれ
る（即ち、接着される）。図５は図４の線２Ｄ−２Ｄで
切り取られた拡大断面図であるが、エリア（１５）と装
置（１０）内の乾燥した化学汚染除去試薬の位置を示
す。汚染除去試薬を乾燥するための好ましい方法は、ト
レハロースの存在下で試薬を乾燥することであり、クオ
ドラントバイオリソーセスリミテッド（Ｑｕａｄｒａｎ
ｔ Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ）によ
り出願された米国特許第４，８９１，３１９号および特
許協力条約国際公開番号第８７／００１９６号により教
示されているとおりであり、これら文献は引用により本
明細書の一部をなす。簡単に言えば、好ましい乾燥技術
は乾燥の間の変成から生物学的物質を保護し、生物学的
物質を含む水性系を、該系の全重量の約０．０５から２
０パーセントの量のトレハロース存在下に、凍結するよ
り高い温度に供することを含む。トレハロースは天然に
存在する非還元ジサッカライドであり、α−Ｄ−グルコ
ピラノシル−α−Ｄ−グルコ−ピラノシドとしても知ら
れている。
【００１９】トレハロース存在下での乾燥は単純な空気
乾燥であってよく、好ましくは雰囲気圧にて行う。汚染
除去試薬および増幅試薬の乾燥において、トレハロース
はこれら試薬の化学安定性を著しく高める。即ち、トレ
ハロース技術は本発明の装置において用いられるあらゆ
る試薬を乾燥するために優秀なシステムである。
【００２０】汚染除去エリア（１５）は装置の底（２
８）への壁（１７）の実質上のアーチにより作られる第
２のマイクロチャンネル（１８）により増幅エリア（１
９）と連絡する。第１のマイクロチャンネルのように、
この特定の態様においては、壁（１７）と装置の底（２
８）の間の隙間が第２のマイクロチャンネル（１８）を
作り、該マイクロチャンネルは約０．００６インチの高
さを有し、そして装置（１０）の全内部幅を横切って存
在する。しかしながら、第１のマイクロチャンネルに関
してあてはまるとおり、別の態様はより高くかつより狭
い幅を有するドーム型のマイクロチャンネルを有する。
【００２１】増幅エリア（１９）は、壁（１７）および
（２１）、天井（１７）および装置の底（２８）により
規定される。汚染除去エリアに関してあてはまるとお
り、この特定の態様において、増幅エリアは約０．３１
５インチの長さ、約０．２２２インチの幅、約０．０８
０インチの高さ、そして約９０μｌの容積を有する。し
かしながら、この寸法は汚染除去エリアの寸法に関して
前に記載されたのと同じガイドラインにしたがって変更
される。
【００２２】増幅エリアに含まれるのは増幅反応に必要
な試薬である。増幅試薬は上記のとおり、あらゆる適切
な核酸増幅反応に必要な活性試薬である。本発明の好ま
しい態様において、用いられる増幅方法は鎖置換増幅
（ＳＤＡ）である。汚染除去試薬のように、増幅試薬は
あらゆる適切な形態でありえ、例えば固体、例えば乾燥
フィルム、凍結乾燥ペレットまたは試薬を含浸した紙を
含むがこれらに限定されない。増幅試薬は、活性試薬、
例えば上記のとおり生成されるアンプリコンの検出に必
要なプローブを、特に検出がインサイチュにて実施され
る場合に含んでよい。もちろん、増幅試薬は汚染除去試
薬と同じ形態で提供される必要はない。
【００２３】本発明の好ましい態様において、増幅試薬
（２０）は乾燥形態にて天井（２７）の内部表面におか
れる。図５は、好ましい態様のテェンバー（１９）内の
乾燥された化学増幅試薬（２０）の位置を示す。汚染除
去試薬の乾燥に好ましいトレハロース技術も、増幅試薬
の乾燥に好ましい。
【００２４】増幅エリア（１９）は、装置の底（２８）
への壁（２１）の実質上のアーチにより作られる第３の
マイクロチャンネル（２２）により空気チェンバーと連
絡する。第１および第２のマイクロチャンネルのよう
に、この特定の態様においては、壁（２１）とモジュー
ルの底（２８）の間の隙間が第３のマイクロチャンネル
（２２）を作り、約０．００６インチであり、そして装
置（１０）の全内部幅を横切って存在する。
【００２５】空気チェンバー（２３）は、壁（２１）お
よび（２６）、空気口（１２）および装置の底（２８）
により規定される。本発明の好ましい態様においては、
空気チェンバーは約０．３１５インチの長さ、約０．２
２２インチの幅、そして図３に示すとおり高さを約０．
０８０インチから約０．０４０インチに変更できる。空
気チェンバーは約５５μｌの容積である。汚染除去エリ
アおよび増幅エリアの寸法に関してあてはまるとおり、
空気チェンバーの寸法も、汚染除去エリアおよび増幅エ
リアの寸法の変更に関する上記ガイドラインにしたがっ
て変更されうる。空気チェンバー（２３）は、穴（２
４）およびＯリングまたは他の手段のような密封機構
（２５）の中心を通して、空気口（１２）の装置（１
０）上部表面に、空気口（１２）と連絡する。
【００２６】図１の装置の幾何学的形態および構成する
物質は、装置内の流体生物学的サンプルを制御する本質
的な力を生じる。この態様においては、流体サンプルと
接触しているすべての表面が、装置と流体生物学的サン
プルの間で約９０度以上の接触角を有する。約９０度以
上の接触角を有することは、しばしば非湿潤表面と呼ば
れる。毛細管現象および静水力による装置内部の流体の
流れは、マイクロチャンネルと反応チェンバーの間の高
さにおける鋭さの増加と共に、装置内の非湿潤表面によ
り本質的に促進される（好ましい態様においては、約
０．００６インチのマイクロチャンネルから約０．０８
０インチのチェンバー）。この装置は、即ち液体をトラ
ップする幾つかの異なる領域を有する。
【００２７】マイクロチャンネルおよび反応チェンバー
の形態の因子は、反応チェンバーの上部における空気の
トラップを実質的に低下させ、そして流体サンプルが装
置内で別々に、正確にそして予想どおりに位置するよう
な直線のプロフィールを展開することも保証する。図６
を参照すると、汚染除去エリア（１５）の壁（１３）と
壁（１７）の間の長さ（Ｌ）は、装置の底（２８）と天
井（２７）の間の高さ（Ｈ）より大きくあるべきであ
る。高さに対する長さの同じ比は、増幅エリア（１９）
には望ましい。この形態の因子（Ｌ＞Ｈ）は、汚染除去
エリア（１５）または増幅エリア（１９）上部に空気が
トラップされず、したがって、これらチェンバー内のさ
まざまな試薬が流体サンプルに完全に暴露されることを
保証する。
【００２８】この形態（長さ＞高さ）およびマイクロチ
ャンネルの位置は、流体の生物学的サンプルの蒸発によ
る損失を減らすように機能する。図３および７は、マイ
クロチャンネル（１４）、（１８）、（２２）の形態お
よび位置およびそれらの流体サンプル（３４）に対する
関係を示すが、ここでは汚染除去エリア（１５）内に示
される。この態様において、マイクロチャンネルは各々
の壁（１３）、（１７）、（２１）により形成される約
０．００６インチの高さを有する。これらの壁は、約
０．０４０インチの寸法の厚さを有するが、約０．０３
０から約０．０６０インチの範囲で変更可能である。マ
イクロチャンネル（１４）、（１８）、（２２）は、し
たがって、それらの高さより大きい長さを有する。この
比（Ｌ＞Ｈ）は、汚染除去エリア（１５）または増幅エ
リア（１９）のいずれかからの流体サンプルの蒸発によ
る損失の速度を低下させる。汚染除去エリア（１５）お
よび増幅エリア（１９）の底のマイクロチャンネルの位
置は、さらに流体サンプルの蒸発速度を低下させる。
【００２９】本発明の装置の第２の態様を、図２３にお
いて等距離図法で示す。本発明の第１の態様のとおり、
この第２の態様は、ほぼ長方形のプリズムの形態であっ
て、第１の態様と同じような名目上の寸法を有する、複
数チェンバーの態様である。サンプルウエル（２１１）
も、第１の態様と同一の直径および容積を有し、同じ目
的で用いられる。サンプルウエル（２１１）の反対の端
は、本発明の第１の態様と同じ直径の空気口（２１２）
である。
【００３０】本発明の第１と第２の態様の違いは図２４
に示されるとおり、汚染除去エリア（２１５）および増
幅エリア（２１９）のコーナーの半径が増加している点
である。図２４に示されるとおり、汚染除去エリア（２
１６）の内部のコーナーのすべては半径が増加してお
り、そして汚染除去エリアに接する増幅エリア（２１
９）のコーナーも半径が増加している。コーナー半径の
増加は一つのエリアから装置内の別のエリアへの流体の
流れを改良する。最適には、流体は、図２６から２８に
示すとおり、装置内の一つのエリアから他のエリアへ分
断されずに流れる。コーナー半径の増加がこの特徴的な
液体の流れを改良したことが見いだされた。半径の程度
は、流体サンプルの塊として流体がこれらのコーナーか
ら移動可能になるのに十分な程度である。最適な半径
は、約０．０４０インチの半径である。対照的に、第１
の態様のコーナーの半径は約０．０１５インチである。
【００３１】装置内のひとつのエリアから他のエリアへ
の流体の流れを改良する他の特徴は、より高くそしてよ
り幅の狭いドーム型マイクロチャンネルの使用である。
このチャンネルの形態は、サンプルウエル（２１１）と
汚染除去エリア（２１５）の間、並びに汚染除去エリア
（２１５）と増幅エリア（２１９）の間にて利用され
る。流体は増幅エリア（２１９）と空気チェンバー（２
２３）の間を流れないので、装置のこれら２つのエリア
の間のマイクロチャンネルをドーム型にする必要はな
い。
【００３２】本発明のこの第２の態様の他の特徴は、第
１の態様の特徴とまったく同一と言うわけではないが、
極めて類似している。同様に、本発明のこの第２の態様
のさまざまな側面の寸法は、第１の態様の寸法とまった
く同一ではないが極めて類似している。また、汚染除去
エリアおよび増幅エリアに用いられる試薬は、乾燥形態
で装置の上部（２２７）の内部表面におかれる。
【００３３】本発明の第３の態様を図３０において等距
離図法で示す。本発明のこの態様の明らかな特徴は、装
置の汚染除去エリア（３１５）と増幅エリア（３１９）
の間に壁またはマイクロチャンネルがないことである。
図３３から３５に示すとおり、流体は単一の分断されな
い塊としてチェンバー内でひとつのエリアから別のエリ
アに移動しうることが見いだされた。即ち、汚染除去試
薬はサンプルウエルに近いエリアにおいて装置の上部
（３２７）におかれるが、増幅試薬は、サンプルウエル
（３１１）からさらに移動し且つ空気口（３１２）に近
いエリア中で装置の上部（３２７）におかれる。再び、
チェンバー内で流体サンプルの流れが分断されない塊と
して最適化されるためには、サンプルウエル（３１１）
に最も近いチェンバーの内部コーナーは、本発明の第２
の態様のように丸みをつけられる。本発明の第２の態様
のように、丸みをつけられたコーナーの曲線の程度は、
空気圧が流体サンプルに適用されるようにサンプルの塊
でそれらのコーナーから流体が移動しうるのに十分なも
のでなければならない。即ち、コーナーの最適な丸みは
約０．０４０インチであることが見いだされる。本発明
の第２の態様のように、本発明の第３の態様は、装置の
汚染除去エリア（３１５）と増幅エリア（３１９）の間
に壁およびマイクロチャンネルが無い以外、第１の態様
とまったく同一の特徴および寸法ではないが、極めて類
似している。
【００３４】本発明の装置はあらゆる適切なプラスチッ
クにより、あらゆる適切なプラスチック加工法により便
利に構成され次のアッセンブリーのために単一部分また
は複数部分として存在する。そのような材料および方法
は、慣用的成形技術例えば注入成形を用いて成形された
熱可塑性ポリマーを含むがこれに限定されない。例示さ
れる熱可塑性ポリマーは、ポリプロピレン、ポリメチル
ペンテン、およびそのコポリマーおよび混合物を含む。
【００３５】本発明の装置は、好ましくは２つの部分を
形成するようにポリプロピレンのプラスチック注入成形
から生成されるが、２つの部分とは：装置の天井と装置
の底（２８）である。底の天井を倒置し、そして増幅
（２０）および汚染除去（１６）に必要な試薬を、増幅
エリア（１９）および汚染除去エリア（１５）の各々の
内側上部表面上でフィルムとして乾燥する。次に、装置
の底（２８）を超音波で天井に接合して単一のユニット
を形成する。
【００３６】本発明の装置は、内部が異なる温度環境に
おかれるため、異なる反応温度を必要とする試薬の使用
が可能になる。装置は操作の全時間の間、加熱盤（４
２）上に置かれる。この加熱盤はあらゆる適切な温度、
典型的には２０℃から１００℃に制御される。実際の試
薬に依存して、汚染除去反応は、増幅エリア内の増幅試
薬を破壊するはずの温度を必要とする。図７に示すとお
り（汚染除去反応の間の複数チェンバーの態様を示
す）、加熱盤（４２）は装置の底（２８）に直接接し、
該底は直接流体サンプルに接する。適切な時間経過のの
ち、流体サンプル（３４）は温度平衡に達し、加熱盤
（４２）の温度とほぼ等しい温度になる。この時間の
間、しかしながら、増幅エリア（１９）は流体サンプル
ではなく空気で満たされる。空気は流体サンプルよりも
約２５倍低い温度伝達性を有する。このため、増幅エリ
ア内の空気は装置の底（２８）と増幅試薬（２０）の間
の温度絶縁体として作用する。これにより、増幅試薬
（２０）が分解されるはずの温度に暴露されることが防
がれる。汚染除去反応が完了したら、加熱盤（４２）の
温度は増幅試薬も適合しうる温度に変更でき、そしてこ
の新しい温度に平衡化された後、流体サンプル（３４）
は、ピペットまたは他の適当な空気手段、またはマニュ
アルまたは機械操作により操作される吸引／排出手段に
より増幅エリア（１９）に移動されうる。汚染除去試薬
が増幅試薬の必要とする温度に適応できないような上記
と反対の場合はも本発明により適合される。さらに、こ
れらの恒温の原理は、流体がチェンバー内の一つのエリ
アに存在して空気がチェンバーの他のエリアに存在する
場合の単一チェンバーの態様に適応できる。
【００３７】本発明において、流体サンプルは好ましく
はヘッドスペースのないチェンバー内に閉じ込められ
る。ヘッドスペースとは、コンテナー中の流体の上部の
空気で満たされたスペースを意味する。ヘッドスペース
はしばしば、流体が均一温度にて化学反応を受けるシス
テムにおいては望まれないが、ヘッドスペースが流体の
一部をコンテナーの壁および天井に濃縮させ、そして流
体の一部を流体の塊とは異なる温度にしてしまうからで
ある。異なる温度になることにより、幾つかの化学反応
は正確に完了しない。流体サンプルの増幅の場合、これ
は通常、増幅の低下を意味する。図７に示されるとお
り、流体サンプル（３４）は汚染除去エリアの上部に完
全に接触し、事実上ヘッドスペースはない。同様に、好
ましい態様においては、流体サンプルは増幅エリアの上
部に完全に接触する。
【００３８】増幅工程を含む生物学的操作の実施のため
に用いられる場合、本発明の装置の第一の機能のひとつ
は、汚染アンプリコンを含まない環境を提供することで
ある。汚染核酸を含む流体核酸サンプルに加えて、汚染
された物質へのサンプルの接触がアンプリコンの汚染の
主要な様式である。核酸の増幅を実施する実験室におい
ては、すべてがアンプリコン汚染の潜在的要素である。
本発明の装置は増幅エリア内に増幅環境を物理的に隔離
する。装置のデザインはいつも開きうる移動部分を含ま
ないことであり、したがって、アンプリコンが汚染する
外部環境に増幅エリアをけっして暴露させない。増幅エ
リアへのサンプルの内部接触は、いずれかの端の汚染除
去エリア（１５）および空気チェンバー（２３）および
それらのマイクロチャンネルの接近により妨害される。
【００３９】本発明の装置を通る空気の流れは、ピペッ
トまたは他の空気手段により引き起こされるエアゾール
アンプリコン汚染を最小にするようにデザインされる。
増幅前のさまざまな段階の間、ピペット装置から空気を
動かすのみである。ピペットは空気を装置中に持ち込ま
ない。この方法により、ピペットを汚染するかもしれな
いアンプリコンは増幅エリアから隔離される。
【００４０】増幅が起これば、空気の流れ方向は反対に
なる。今、ピペットは空気を装置外に出すのみである。
この方法により、増幅エリア内のアンプリコンはピペッ
トから遠ざかり、それにより、ピペットのエアゾールア
ンプリコンの汚染の可能性が低下する。増幅された流体
サンプルは装置（１１）のサンプルウエルに戻り、そし
て次の核酸プローブ分析のために除かれる。
【００４１】本発明の装置の特定の形態の因子は、多数
の装置を同時に反応させることが可能であり、それらの
最終増幅生成物は操作者の介入なしに自動的に核酸プロ
ーブ分析に移送されうる。
【００４２】装置の第１の態様（例えば、図１および
２）における流体核酸サンプルの流れは、図８−１２、
図１３−１７そして図１８−２２に示される。しかしな
がら、この流れと同じ原理および記載は本発明の他の例
示された態様に関して実質的に同様である。
【００４３】図８は装置が最初に空であった状態を示
す。（説明上明確にするために、モジュールが典型的な
操作の間置かれる加熱盤はこの図においては省略されて
いる。図７を参照すれば、加熱盤（４２）を含む典型的
な操作の代表図で示される装置が参照できる。）図９
は、サンプルウエル中の流体サンプルおよび装置の空気
口に引き入れられたピペットのチップ（３１）を示す。
装置の非湿潤特性および形態は、流体がマイクロチャン
ネルを通ってサンプルウエルの外へ通過するのを防ぐ。
【００４４】図１０は、ピペットにより装置の汚染除去
エリアに最初に吸い上げられた流体サンプルを示す。流
体サンプルの球面のプロフィール（３２）は、垂直の壁
と連続してフィルムの表面張力により生じる。
【００４５】図１１は、汚染除去エリアにさらに吸い上
げられた流体サンプルを示す。
【００４６】図１２は、汚染除去エリア内にすべて入れ
られた流体サンプル（３４）を示す。試薬は流体サンプ
ルに完全に接触しており（覆われており）、そして流体
表面張力フィルムのプロフィールは直線である。
【００４７】図１３は、汚染除去の間の流体サンプル
（３４）を示す。ピペットは装置から抜かれ、そして汚
染除去が完了して流体サンプルが次のエリアに移動する
必要があるまで、必要ない。別法としては、汚染除去が
完了するまで吸引が必要ないならピペットを抜く必要は
ない。
【００４８】図１４−１７は、装置へのピペットの再挿
入および汚染除去エリアから増幅エリアへの流体サンプ
ル（３４）の移動を示す。
【００４９】図１８は、増幅の間の流体サンプル（３
４）を示す。再び、ピペットは装置から抜かれ、そして
増幅が完了して流体サンプルが移動する必要があるま
で、必要ない。しかしながら、汚染除去工程の場合のよ
うに、増幅が完了するまで空気の排出が必要ないならピ
ペットを抜く必要はない。
【００５０】図１９−２２は、装置へのピペット（３
１）の再挿入および汚染除去エリアからの流体サンプル
（３４）の逆戻りの移動を示す。流れの逆戻りはピペッ
トによる装置への空気の排出により達成される。好まし
い態様においては、増幅されたサンプルをすべてサンプ
ルウエルに移動させるために、ピペットは汚染除去エリ
アおよび増幅エリアの総体積と等しいかまたはそれ以上
の体積の空気を排出するはずであり、あるいは、特に例
示された態様の場合、約１８０μｌ以上を必要とする。
典型的には、この体積は２００μｌであろう。
【００５１】通常、本発明に用いられる流体サンプル
は、標的核酸（即ち、リボ核酸（ＲＮＡ）、デオキシリ
ボ核酸（ＤＮＡ））およびあらゆる汚染アンプリコンを
含む水性調製物であり、一本鎖の形態の標的核酸および
アンプリコンの両方またはいずれかを伴う。例えば、標
的核酸はランダムに穿断されたゲノミックＤＮＡ断片か
らなる。調製物は公知の技術にしたがい核酸増幅法にお
ける使用に適切な形態になる。標的核酸は約５，０００
ヌクレオチドの長さから約２００，０００ヌクレオチド
の長さの核酸断片からなるのが典型的である（この長さ
は調製物において見いだされる平均的な値である）。標
的核酸の中には増幅されるべき興味のある配列が含まれ
る。増幅のための配列は１０塩基対から数千でありえ、
約１５から約２００塩基対が好ましい。
【００５２】本発明の方法により生成されるアンプリコ
ンの長さは、アンプリコンが生成される特定の核酸増幅
法に依存して変更されるが、通常は少なくとも約２５ヌ
クレオチドの長さになり、２，０００ヌクレオチドの長
さを超えない。アンプリコンが鎖置換増幅法（ＳＤＡ）
により生産される場合、アンプリコンは約２００ヌクレ
オチドを超えない長さになる。
【００５３】標的核酸配列を含むサンプル中の汚染アン
プリコンを除くための汚染除去はあらゆる適切な手段に
より実施あれ、二本鎖特異的エキソヌクレアーゼおよび
一本鎖特異的エキソヌクレアーゼの使用等を含む。した
がって、汚染除去試薬はひとつ以上の一本鎖特異的また
は二本鎖特異的エキソヌクレアーゼを含んでよい。例え
ば、グリフィス（Ｒ．Ｇｒｉｆｆｉｓ）、ＰＣＴ出願国
際公開番号９１／００３６３（１９９１年１月１０日公
開）は、５’ラムダエキソヌクレアーゼを用いたＰＣＲ
反応産物の汚染除去法を開示している。同様に、ツー
（Ｙ．Ｓ．Ｚｈｕ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．１９，２５１１（１９９１）は、ＰＣＲ反応産
物からのアンプリコンの除去のためのエキソヌクレアー
ゼＩＩＩの使用を開示している。ラムダエキソヌクレア
ーゼおよびエキソヌクレアーゼＩＩＩの両者は、二本鎖
特異的エキソヌクレアーゼである。アンプリコンを分解
できれば、あらゆる一本鎖特異的エキソヌクレアーゼを
本発明の実施に用いることができる。適切な一本鎖特異
的エキソヌクレアーゼは、以下のものを含むがこれらに
限定されない：エキソヌクレアーゼＶＩＩ（例えば、チ
ェイス（Ｊ．Ｃｊａｓｅ）とリチャードソン（Ｃ．Ｒｉ
ｃｈａｒｄｓｏｎ）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４
９，４５４５−４５５２（１９７４）；チェイスとリチ
ャードソン、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４９，４５５
３−４５６１（１９７４）を参照されたい）、エキソヌ
クレアーゼＩ（例えば、ブロッディ（Ｒ．Ｂｒｏｄ
ｙ）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３０，７０７２−７
０８０（１９９１）を参照されたい）、ピロコッカスフ
リオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ）
のＰｆｕのＤＮＡポリメラーゼ（ストラタジーン（Ｓｔ
ｒａｔａｇｅｎｅ）、ラジョラ、ＣＡ）、大腸菌のＤＮ
ＡポリメラーゼＩ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのクレ
ノー断片、Ｔ７のＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４のＤＮＡポ
リメラーゼ、膵臓のエキソヌクレアーゼ（Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．２５３，４２４（１９７８））、Ｔ５の
Ｄ１５エキソヌクレアーゼ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ
ｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ１９，４１２７（１９９１））、
サーモコッカスリトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｕｃｃｕｓ
ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）の「ベント」ＤＮＡポリメラー
ゼ（ニューイングランドバイオラブズ（Ｎｅｗ Ｅｎｇ
ｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、ビバリー、ＭＡ）および
３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリ
メラーゼ。本発明の実施に用いる３’−５’エキソヌク
レアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼは、分解され
るアンプリコンがＳＤＡ産物である場合、ホスホロチオ
エート結合を分解することができる。例えば、エクスタ
イン（Ｆ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎ）、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ．５４，３６７−４０２（１９８５）（Ｔ４
のＤＮＡポリメラーゼの３’−５’エクスタイン活性は
ホスホロチオエートＤＮＡを分解することができるが、
大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ由来のそれは分解できな
い）を参照されたい。エクスタインはアンプリコンを十
分に分解することにみを必要とされるので、アンプリコ
ンは次の核酸増幅反応のための基質として作用しないこ
とは理解されるであろう（即ち、増幅反応のための基質
として作用しないがアンプリコンにより汚染の基質とし
て作用するはずの、核酸調製物による偽陽性の結果を生
じる）。
【００５４】別法として、本発明の方法の汚染除去工程
は、引用により本明細書の一部をなす米国特許第５，０
３５，９９６号および公開された欧州特許出願第０４１
５７５５号（Ａ２）に教示された技術を用いて実施され
る。これらの特許文献はライフテクノロジー社により出
願されたものであり、増幅方法に用いる４つの通常のリ
ボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのひと
つをエキソ（ｅｘｏ）サンプルのヌクレオチドに置き換
える汚染除去技術を記載している。次に、増幅後、他の
サンプルを汚染するあらゆるアンプリコンを物理的、化
学的、酵素的、または生物学的処理に供して、エキソサ
ンプルヌクレオチド含有アンプリコンを実質的に増幅不
可能にする。好ましいエキソサンプルヌクレオチドは、
標的がＤＮＡの場合、デオキシウリジン（ｄＵＴＰ）で
ある。エキソサンプルヌクレオチドとしてｄＵＴＰを利
用する場合、汚染アンプリコンはウラシルＤＮＡグリコ
シラーゼ（ＵＤＧ）による酵素処理に供されることによ
り、アンプリコンを増幅不可能にする。
【００５５】選択された核酸配列または標的となる核酸
配列の増幅はあらゆる適切な手段により実施される。一
般的には、コー（Ｄ．Ｋｗｏｈ）とコー（Ｔ．Ｋｗｏ
ｈ）、Ａｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌａｂ．８，１４
−２５（１９９０）を参照されたい。適切な増幅技術の
例は以下のものを含むがこれらに限定されない：ポリメ
ラーゼチェインリアクション（ＰＣＲ）、ライゲースチ
ェインリアクション（ＬＣＲ）、鎖置換増幅（ＳＤ
Ａ）、転写に基づく増幅（コー（Ｄ．Ｋｗｏｈ）ら、Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６，
１１７３−１１７７（１９８９））、自己維持配列複製
（または３ＳＲ）（グアテリ（Ｊ．Ｇｕａｔｅｌｌｉ）
ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
８７，１８７４−１８７８（１９９０））、Ｑβレプリ
カーゼシステム（リザルディ（Ｐ．Ｌｉｚａｒｄｉ）
ら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６，１１９７−１２
０２（１９８８））、核酸配列に基づく増幅（またはＮ
ＡＳＢＡ）（レビス（Ｒ．Ｌｅｗｉｓ）、Ｇｅｎｅｔｉ
ｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｎｅｗｓ １２（９），
１（１９９２））、修復鎖反応（またはＲＣＲ）（レビ
ス（Ｒ．Ｌｅｗｉｓ）、前記）およびブーメランＤＮＡ
増幅（またはＢＤＡ）（レビス、前記を参照された
い）。鎖置換増幅（ＳＤＡ）が好ましい。
【００５６】鎖置換増幅は公知の技術にしたがって実施
される。ウオーカー（Ｇ．Ｗａｌｋｅｒ）ら、Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９，３９
２−３９６（１９９２）；ウオーカーら、Ｎｕｃｌｅｉ
ｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０，１６９１−１６９６
（１９９２）を参照されたい。例えば、ＳＤＡは、単一
の増幅プライマーまたは一対の増幅プライマーを用い
て、後に対数増幅を実行して実施される。通常、ＳＤＡ
増幅プライマーは、５’から３’の方向に向かって、周
辺配列（関係ないＤＮＡ配列）、反応に用いられる制限
酵素の認識部位、および増幅および／または検出される
標的配列にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド配列
からなる。認識配列に制限酵素が結合しやすくして制限
部位にニックが入った後にＤＮＡポリメラーゼの複製開
始部位を提供するための周辺配列は、約１５から２０ヌ
クレオチドの長さが好ましく；制限部位はＳＤＡ反応に
おいて機能し（即ち、プライマー鎖に導入されたホスホ
ロチオエート結合が非パリンドロームの制限部位の使用
を通して満足される次のニッキング条件を阻害する）；
オリゴヌクレオチドプローブ部分は約１３から１５ヌク
レオチドの長さが好ましい。
【００５７】ＳＤＡは単一増幅プライマーを用いて以下
のとおりに実施される：検出される配列を含む制限断片
（約５０から１００ヌクレオチドの長さであり低いＧＣ
含有率が好ましい）は、ひとつ以上の制限酵素によりＤ
ＮＡサンプルを分解することにより調製され、ＳＤＡ増
幅プライマーを制限断片含有反応混合物に加えることに
より制限断片と増幅プライマーの間に各々５’突出を有
する二本鎖を形成させ、増幅プローブ上の制限部位に結
合する制限酵素（例えば、ＨｉｎｃＩＩ）を反応混合物
に加え、エキソヌクレアーゼ欠損ＤＮＡポリメラーゼ
（例えば、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのエキソヌクレ
アーゼ欠損体、ダービーシアー（Ｖ．Ｄｅｒｂｙｓｈｉ
ｒｅ）、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０，１９９−２０１（１
９８８）を参照されたい）を反応混合物に加え、そして
３つのｄＮＴＰおよびひとつのｄＮＴＰ［Ｓ］を加える
が、その際ｄＮＴＰ［Ｓ］は用いられる特定の制限酵素
のための制限部位においてプライマーにホスホロチオエ
ート結合が挿入されるようにする（例えば、制限酵素が
ＨｉｎｃＩＩの場合、ｄＧＴＰ．ｄＣＴＰ．ｄＴＴＰお
よびｄＡＴＰ［Ｓ］）。ＤＮＡポリメラーゼはｄＮＴＰ
を用いて二本鎖の３’末端から伸長合成して標的鎖の下
流の相補鎖を形成する。制限酵素は増幅プライマー上の
制限部位にニックを入れ、そしてＤＮＡポリメラーゼは
該ニックから増幅プライマーの３’末端を伸長合成し
て、前に形成された標的鎖の下流相補鎖を置換する。こ
の工程は永遠に繰り返されるが、それは、制限酵素が制
限部位から形成される新たな相補鎖に連続してニックを
入れ、そしてＤＮＡポリメラーゼがニックの入った制限
部位から新たな相補鎖を連続して形成するからである。
【００５８】ＳＤＡは二本鎖標的ＤＮＡ配列上で一対の
プライマーを用いて実施されるが、第２プライマーは相
補鎖の３’末端に結合し、そして２セットの繰り返し反
応が同時に起こり、該工程は対数的に進行する。なぜな
らば、１セットの反応産物が他のセットの反応の増幅プ
ライマーのための標的として機能するからである。
【００５９】ＳＤＡ反応において制限断片を形成するた
めのＤＮＡサンプルの第１分解工程は、ＤＮＡポリメラ
ーゼの鎖置換活性を利用し、且つ各増幅プライマーが結
合する位置の５’側周辺位置にて基質を結合する一対の
バンパープライマーを加えることにより促進されうる。
各バンパープライマーの伸長合成産物は対応する増幅プ
ライマー伸長合成産物を置換する。過剰に存在する増幅
プライマーは、次に、置換されたプライマー伸長合成産
物に結合し、そして置換合成と共に二本鎖ＤＮＡ断片が
形成され、該断片は増幅プライマーの対と共に対数的Ｓ
ＤＡのための基質として機能しうる。
【００６０】ポリメラーゼチェインリアクション（ＰＣ
Ｒ）も公知技術を用いて実施可能である。例えば、米国
特許第４，６８３，１９５号、第４，６８３，２０２
号、第４，８００，１５９号、および第４，９６５，１
８８号を参照されたい（これら全米国特許の開示は引用
により本明細書の一部をなす）。通常、ＰＣＲは、第１
にハイブリダイズする条件下にて検出される特定の配列
の各鎖のためのオリゴヌクレオチドプライマーで核酸サ
ンプルを処理して（即ち、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ
の存在下で）、各核酸鎖に相補的な各プライマーの伸長
合成産物を合成するが、その際プライマーはハイブリダ
イズする特定の配列の各鎖に十分相補的であることによ
り各プライマーから合成された伸長合成産物が相補鎖か
ら分離されるときに他方のプライマーの伸長合成産物の
合成の鋳型として機能し、そして次に、検出されるべき
配列が存在するならばプライマー伸長合成産物を鋳型か
ら分離するためにサンプルを加熱する。これらの工程は
繰り返し連続され、好ましくは恒温循環機（ｃｙｃｌｅ
ｒ）中で、所望の程度の増幅が得られるまで繰り返され
る。増幅された配列の検出は反応産物にハイブリダイズ
することができる、検出可能な標識で標識されたオリゴ
ヌクレオチドプローブ（例えば、本発明のオリゴヌクレ
オチドプローブ）を反応産物に加え、そして次に、公知
技術により標識を検出することにより実施される。
【００６１】ライゲースチェインリアクション（ＬＣ
Ｒ）も、公知技術により実施される。例えば、バイス
（Ｒ．Ｗｅｉｓｓ）、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４，１２９
２（１９９１）を参照されたい。通常、反応は２対のオ
リゴヌクレオチドプローブを用いて実施され、一つの対
は検出される一方の鎖に結合し、そして他方の対は検出
される他方の鎖に結合する。各対は共に対応する鎖と完
全にオーバーラップする。反応は第一に、検出される配
列の鎖を変成（即ち、分離）し、次に、熱安定性ライゲ
ースの存在下で２対のオリゴヌクレオチドプローブを鎖
に反応させることにより、各対のオリゴヌクレオチドプ
ローブが共に連結され、次に反応産物を分離し、そして
配列が所望の程度に増幅されるまで、循環して繰り返さ
れる。次に、検出はＰＣＲに関して上記に記載されたの
と同じ様式により実施される。
【００６２】上記の記載は本発明の例示であり、これら
に限定するためのものではなく、本発明に含まれる限り
上記方法および装置の大幅な変更は当業者には理解され
るであろう。したがって、本発明は特許請求の範囲によ
り規定されるものであり、特許請求の範囲に記載された
発明の均等物もその範囲に含まれる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明の装置のひとつの態様の等距離
図である。
【図２】図２は、図１の装置の俯瞰図である。
【図３】図３は、図２の装置の、図２の線２Ｂ−２Ｂの
断面図である。
【図４】図４は、図１の装置の側面図である。
【図５】図５は、図４の装置の、図２の線２Ｄ−２Ｄの
断面図である。
【図６】図６は、図３の側面断面図であって、長さ
（Ｌ）および高さ（Ｈ）を詳細にしてある。
【図７】図７は、図３の側面断面図であって、吸引／排
出手段としてピペットを用いた、加熱盤上の操作時にお
ける、モジュールを例示する。
【図８】図８は、図２の線２Ｂ−２Ｂの断面図であり、
流体核酸サンプル、およびサンプルウエルから汚染除去
エリアへの流体核酸サンプルの流れを示す。
【図９】図９は、図２の線２Ｂ−２Ｂの断面図であり、
流体核酸サンプル、およびサンプルウエルから汚染除去
エリアへの流体核酸サンプルの流れを示す。
【図１０】図１０は、図２の線２Ｂ−２Ｂの断面図であ
り、流体核酸サンプル、およびサンプルウエルから汚染
除去エリアへの流体核酸サンプルの流れを示す。
【図１１】図１１は、図２の線２Ｂ−２Ｂの断面図であ
り、流体核酸サンプル、およびサンプルウエルから汚染
除去エリアへの流体核酸サンプルの流れを示す。
【図１２】図１２は、図２の線２Ｂ−２Ｂの断面図であ
り、流体核酸サンプル、およびサンプルウエルから汚染
除去エリアへの流体核酸サンプルの流れを示す。
【図１３】図１３は、図８−１２と同様の断面図であ
り、汚染除去エリアから増幅エリアへの流体核酸サンプ
ルの流れを示す。
【図１４】図１４は、図８−１２と同様の断面図であ
り、汚染除去エリアから増幅エリアへの流体核酸サンプ
ルの流れを示す。
【図１５】図１５は、図８−１２と同様の断面図であ
り、汚染除去エリアから増幅エリアへの流体核酸サンプ
ルの流れを示す。
【図１６】図１６は、図８−１２と同様の断面図であ
り、汚染除去エリアから増幅エリアへの流体核酸サンプ
ルの流れを示す。
【図１７】図１７は、図８−１２と同様の断面図であ
り、汚染除去エリアから増幅エリアへの流体核酸サンプ
ルの流れを示す。
【図１８】図１８は、図８−１２と同様の断面図であ
り、汚染除去エリアを通って増幅エリアからサンプルウ
エルへの増幅された流体核酸サンプルの逆戻りの流れを
示す。
【図１９】図１９は、図８−１２と同様の断面図であ
り、汚染除去エリアを通って増幅エリアからサンプルウ
エルへの増幅された流体核酸サンプルの逆戻りの流れを
示す。
【図２０】図２０は、図８−１２と同様の断面図であ
り、汚染除去エリアを通って増幅エリアからサンプルウ
エルへの増幅された流体核酸サンプルの逆戻りの流れを
示す。
【図２１】図２１は、図８−１２と同様の断面図であ
り、汚染除去エリアを通って増幅エリアからサンプルウ
エルへの増幅された流体核酸サンプルの逆戻りの流れを
示す。
【図２２】図２２は、図８−１２と同様の断面図であ
り、汚染除去エリアを通って増幅エリアからサンプルウ
エルへの増幅された流体核酸サンプルの逆戻りの流れを
示す。
【図２３】図２３は、本発明の装置の別の態様の等距離
図である。
【図２４】図２４は図２３の装置の俯瞰図を示す。
【図２５】図２５は、図２３の装置の、図２の線８−８
の断面図である。
【図２６】図２６は、図２３の線８−８の断面図であ
り、流体核酸サンプル、およびサンプルウエルから汚染
除去エリアへ、続いて汚染除去エリアから増幅エリアへ
の流体核酸サンプルの流れを示す。
【図２７】図２７は、図２３の線８−８の断面図であ
り、流体核酸サンプル、およびサンプルウエルから汚染
除去エリアへ、続いて汚染除去エリアから増幅エリアへ
の流体核酸サンプルの流れを示す。
【図２８】図２８は、図２３の線８−８の断面図であ
り、流体核酸サンプル、およびサンプルウエルから汚染
除去エリアへ、続いて汚染除去エリアから増幅エリアへ
の流体核酸サンプルの流れを示す。
【図２９】図２９は、図２３の線８−８の断面図であ
り、流体核酸サンプル、およびサンプルウエルから汚染
除去エリアへ、続いて汚染除去エリアから増幅エリアへ
の流体核酸サンプルの流れを示す。
【図３０】図３０は、本発明の装置の別の態様の等距離
図である。
【図３１】図３１は図３０の装置の俯瞰図を示す。
【図３２】図３２は、図３０の装置の、図３０の線１５
−１５の断面図である。
【図３３】図３３は、図３０の線１５−１５の断面図で
あり、流体核酸サンプル、およびサンプルウエルから汚
染除去エリアへ、続いて汚染除去エリアから増幅エリア
への流体核酸サンプルの流れを示す。
【図３４】図３４は、図３０の線１５−１５の断面図で
あり、流体核酸サンプル、およびサンプルウエルから汚
染除去エリアへ、続いて汚染除去エリアから増幅エリア
への流体核酸サンプルの流れを示す。
【図３５】図３５は、図３０の線１５−１５の断面図で
あり、流体核酸サンプル、およびサンプルウエルから汚
染除去エリアへ、続いて汚染除去エリアから増幅エリア
への流体核酸サンプルの流れを示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 アレン・レイチラー アメリカ合衆国メリーランド州21117，オ ーウィングス・ミルズ，コーチハウス・ド ライブ １ (72)発明者 ピーター・バーデル アメリカ合衆国ペンシルバニア州17327− 9703，グレン・ロック，アールアール１・ ボックス 16ケイ

Claims (10)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 生物学的操作を実施するための装置であ
    って、 （ａ）生物学的流体サンプルを導入および取り出すため
    のサンプルウエル； （ｂ）少なくともひとつの反応チェンバーであって、該
    チェンバー内の別々の位置に生物学的操作のための試薬
    が固定されており、かつ、該チェンバーはサンプルウエ
    ルと液体連絡している、上記チェンバー； （ｃ）反応チェンバーおよびサンプルウエルと空気連絡
    している空気チェンバー；および （ｄ）サンプルウエルと反応チェンバーの間に生物学的
    流体サンプルの流れを引き起こすための空気吸引／排出
    手段に上記装置を接続するための、空気チェンバー内の
    空気口；からなる、上記装置。
  2. 【請求項２】 サンプルウエルと空気口が互いに両端に
    位置する横長の形態であって、かつ、反応チェンバーが
    該サンプルウエルと空気口の間に位置する、請求項１記
    載の装置。
  3. 【請求項３】 流体の流れ制御手段がサンプルウエルと
    反応チェンバーの間に位置する、請求項１記載の装置。
  4. 【請求項４】 流体の流れ制御手段がマイクロチャンネ
    ルである、請求項３記載の装置。
  5. 【請求項５】 生物学的操作が、汚染アンプリコンを除
    去するための汚染除去工程および核酸増幅工程を含む
    が、その際、これらの工程のための試薬が反応チェンバ
    ーの内部壁上の別々のエリアにおかれていることにより
    生物学的サンプルが増幅工程の前に汚染除去工程に供さ
    れる、請求項１記載の装置。
  6. 【請求項６】 サンプルウエルと直接液体連絡している
    第１反応チェンバー、および第１反応チェンバーを通し
    てサンプルウエルと間接的に液体連絡しており空気チェ
    ンバーと直接空気連絡している第２反応チェンバーを含
    む、請求項１記載の装置。
  7. 【請求項７】 さらに、サンプルウエルと第１反応チェ
    ンバーチェンバーの間および第１反応チェンバーチェン
    バーと第２反応チェンバーチェンバーの間に流体流れ制
    御手段を含む、請求項６記載の装置。
  8. 【請求項８】 流体の流れ制御手段がマイクロチャンネ
    ルである、請求項７記載の装置。
  9. 【請求項９】 生物学的操作が、汚染アンプリコンを除
    去するための汚染除去工程および核酸増幅工程を含む
    が、その際、汚染除去工程のための試薬が第１反応チェ
    ンバーの内部壁上に固定されており、そして核酸増幅工
    程のための試薬が第２反応チェンバーの内部壁上に固定
    されている、請求項６記載の装置。
  10. 【請求項１０】 以下の工程： （ａ）生物学的流体サンプルをサンプルウエルに導入
    し； （ｂ）サンプルが試薬と接触するようにサンプルウエル
    を反応チェンバーに移動させ；そして （ｃ）サンプルを取り出すためにサンプルを反応チェン
    バーからサンプルウエルに移動させることからなる、生
    物学的操作を実施するための方法。
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