JPH07179364A - エルカトニン安定化剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 エルカトニンと類似した構造を有する特定な
ペプチドからなる群よりえらばれた１種または２種以上
を有効成分とするエルカトニン水溶液剤の安定化剤。 【効果】 本発明のペプチドは、極めて少量で注射用水
溶液中のエルカトニンの安定性を向上することが可能で
あり、エルカトニン水溶液製剤の安定化剤として有用で
ある。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はエルカトニン水溶液剤の
安定化ペプチドに関する。

【０００２】

【従来の技術】エルカトニンは化学名１−ブチル−７−
（Ｌ−２−アミノブチル酸）−２６−Ｌ−アスパラギン
酸−２７−Ｌ−バリン−２９−Ｌ−アラニンカルシトニ
ン（サケ）〔１−butyric acid−７−（Ｌ−２−aminob
utyric acid ）−２６−Ｌ−aspartic acid −２７−Ｌ
−valine−２９−Ｌ-alaninecalcitonin（salmon）〕
で、高カルシウム血症、骨ページェット病あるいは骨粗
鬆症に用いられるカルシトニン類の一種である。現在エ
ルカトニンは注射用水溶液製剤として使用されている
が、他のカルシトニンと同様エルカトニンのようなペプ
チド性医薬を水溶液製剤とする場合には、熱安定性（長
期保存安定性）、光に対する安定性、さらには輸送時等
において受ける振とうに対する安定性等に十分配慮した
製剤化が必要である。そこで従来、エルカトニンの水溶
液製剤化においては、溶液のｐＨ、使用される緩衝剤の
種類、イオン強度について厳密な選択がなされ、さらに
は使用されるアンプル等のガラス容器の物性についても
厳密な選択が必要であった。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】このように、エルカト
ニンのようなペプチド性医薬の水溶液製剤は極めてデリ
ケートであるため、その有効な安定化剤については長い
間求められていた。

【０００４】

【課題を解決するための手段】発明者らは従来より、水
溶液とした場合のエルカトニンの安定化剤について、数
多くの物質についてスクリーニングを行ってきたが、偶
然にもエルカトニンと構造が似ているペプチドのいくつ
かにおいて、極めて少量でエルカトニンの安定化作用が
あることを見いだし本発明に至った。すなわち本発明
は、下記式ＡからＨ

【０００５】

【化４】

【０００６】

【化５】

【０００７】

【化６】

【０００８】で表されるペプチドからなる群よりえらば
れた１種または２種以上を有効成分とするエルカトニン
水溶液剤の安定化剤である。本発明のエルカトニン水溶
液注射剤の安定化剤は、公知のペプチド合成の常法手段
によって合成できる。 （１）液相法によって製造する場合 例えば、Ｃ末端のプロリン基のカルボキシル基をアミド
基に転化し、式ＡからＨで示されるアミノ酸順序に個々
の保護されていないか、又は好ましくは保護されたアミ
ノ酸および（または）低級ペプチドを縮合し、任意の過
程で環化反応に付し、縮合反応し、保護基がある場合
は、例えば、最終段階で活性基の保護基を酸分解により
脱離することにより得られる。

【０００９】縮合反応及び環化反応自体はペプチド合成
の常法手段に従って、保護基の脱着、縮合反応を繰り返
すことにより行なわれる。即ち、本化合物の製造におい
て使用される各種の保護基はペプチド合成において既知
なもの、例えば加水分解、酸分解、還元、アミノリシ
ス、ヒドラジノリシスなどのような既知手段によって容
易に脱離することができる保護基が用いられる。このよ
うな保護基はペプチド合成化学の分野の文献ならびに参
考書に記載されている。本発明においては、例えばα−
アミノ基の保護にｔ−ブチルオキシカルボニル基、ベン
ジルオキシカルボニル基、ｐ−メトキシベンジルオキシ
カルボニル基を用い、側鎖のアミノ基、即ちリジンのε
−アミノ基の保護にベンジルオキシカルボニル基、ｐ−
クロロベンジルオキシカルボニル基を用い、α−カルボ
キシル基の保護にメチルエステル基、ベンジルエステル
基を用い、側鎖のカルボキシル基、即ちのアスパラギン
酸またはグルタミン酸の側鎖のカルボキシル基の保護に
ベンジルエステル基、シクロヘキシルエステル基を用
い、α−アミノスベリン酸の側鎖のカルボキシル基の保
護にｔ−ブチルエステル基を用い、セリンおよびスレオ
ニンの水酸基の保護にベンジル基を用い、チロシンの水
酸基の保護に２、６−ジクロルベンジル基を用い、アル
ギニンのグアニジノ基の保護にメシチレン−２−スルホ
ニル基またはトシル基を用いるのが好ましい。

【００１０】本化合物の合成においては個々のアミノ酸
および（または）低級ペプチドの縮合は例えば、保護さ
れたα−アミノ基および活性化末端α−カルボキシル基
をもつアミノ酸または低級ペプチドと遊離のαアミノ基
および保護された末端カルボキシル基をもつアミノ酸ま
たは低級ペプチドとを反応させるか、あるいは活性化α
−アミノ基および保護された末端カルボキシル基をもつ
アミノ酸または低級ペプチドと遊離の末端カルボキシル
基をもつアミノ酸または低級ペプチドとを反応させるこ
とにより実施することができる。

【００１１】この場合、カルボキシル基は、例えば、酸
アジド、酸無水物、酸イミダゾリドまたは活性エステ
ル、例えばシアノメチルエステル、ｐ−ニトロフェニル
エステル、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドエステルなど
に変換することによって活性化させることができる。ま
た、カルボジイミド、例えばＮ，Ｎ’−ジシクロヘキシ
ル−カルボジイミド（ＤＣＣ）、Ｎ−エチル−Ｎ’−３
−ジメチルアミノプロピル−カルボジイミド、Ｎ，Ｎ’
−カルボニル−ジイミダゾールなどの縮合剤を使用して
反応させることによって活性化することができる。

【００１２】本発明において好ましい縮合方法及び環化
反応は、アジド法、活性エステル法、混合酸無水物法お
よびカルボジイミド法である。縮合の各段階ではラセミ
化が起こらない方法またはラセミ化が最小になる方法を
用いるのが望ましく、好ましくはアジド法、活性エステ
ル法、Ｗｕｎｓｃｈ法［Ｚ．Ｎａｔｕｒｆｏｒｓｃ
ｈ．，２１ｂ，４２６（１９６６）］またはＧｅｉｇｅ
ｒ法（Ｃｈｅｍ．Ｂｅｒ．，１０．，７８８（１９７
０）］などが挙げられる。

【００１３】なお、環化反応は上述の縮合反応と同じ方
法が可能である。縮合順序および環化位置は式で示され
るアミノ酸順序であれば、如何なる順序如何なる位置で
も合成し得るが、Ｃ末端側から順次アミノ酸および（ま
たは）低級ペプチドを連結させること、およびアミノス
ベリン酸のωカルボキシル末端と所定のＮ末端アミノ酸
との結合を環化位置とすることが好ましい。

【００１４】こうして保護されたε−アミノ基、側鎖カ
ルボキシル基、グアニジノ基および水酸基を有するペプ
チドが得られる、これらの保護基は好ましくは、酸分
解、例えばトリフルオロメタンスルホン酸、無水弗化水
素などによる方法によって一段階で脱離され、目的の化
合物が得られる。 （２）固相法によって製造する場合 本発明においては、上記の液相法によるペプチド合成法
の他に、固相法によるペプチド合成法を一部または全部
利用して本化合物を合成することができる。

【００１５】たとえば、Ｃ末端ペプチドフラグメントを
固相法により合成し、Ｎ−末端部のα−アミノスベリン
酸を含む環状ペプチドフラグメントを液相法により合成
し、引続き上記２つのペプチドフラグメントを固相法に
より縮合して得られた保護されたペプチド樹脂が得られ
る。これらの保護基および樹脂は、公知の方法、例えば
トリフルオロメタンスルホン酸、無水弗化水素などによ
る方法によって一段階で脱離され、目的の化合物が得ら
れる。

【００１６】上記の固相法で用いられる樹脂としては、
固相法で通常用いられる樹脂、例えばベンズヒドリルア
ミン樹脂、ｐ−メチルベンズヒドリルアミン樹脂などが
挙げられる。この樹脂は、官能基当量や架橋度の違いに
よって所望の性状を有する樹脂が入手可能であり、市販
品を購入することもできる。上記の固相法においては、
樹脂に式で示されるアミノ酸順序にＣ−末端のアミノ酸
から順次一つずつ縮合させて行なう。該アミノ酸の官能
基は公知の方法により保護基で保護される。上記の保護
基の例としては、上記でのべた通りである。

【００１７】上記の固相反応に際しては、樹脂を反応器
に入れ、ジクロロメタン、クロロホルム、ジメチルホル
ムアミド、ベンゼン等の樹脂を膨潤させる溶媒を樹脂１
ｇに対し、溶媒２〜２０ｍｌの割合で添加する。これ
に、予め別の反応器で樹脂中のアミノ基１当量に対し１
〜６当量のＢｏｃ（ｔ−ブチルオキシカルボニル）アミ
ノ酸とＤＣＣを反応させ、得られた対称無水物を副生し
たジシクロヘキシル尿素（ＤＣＵ）より分離して、上記
樹脂の入った反応器に加える。縮合剤（ＤＣＣ）の使用
量はＢｏｃ−アミノ酸１当量に対し、０．５から３当量
を用いる。反応は通常５〜６０分行なわれる。

【００１８】各工程で得られたＢｏｃ−アミノ酸−樹脂
またはＢｏｃ−ペプチド−樹脂の一部を採取し、常法に
従い反応したＢｏｃ−アミノ酸量を求めればよい。次
に、α−アミノ基の保護基であるＢｏｃをトリフルオロ
酢酸のような酸で脱離して、順次縮合反応を遂行すれば
よい。上記の固相法によるペプチド合成は自動固相合成
機を用いるが、手動法で遂行してもよい。これらの操作
はすべて窒素ガス気流下で行なうのが望ましい。

【００１９】このようにしてペプチドが結合した樹脂が
得られる。このようにして得られた保護ペプチド結合樹
脂は上記で述べた通り、無水弗化水素などにより、一段
階で保護基と樹脂が脱離される。 （３）分離精製その他 このようにして得られた化合物はペプチドまたは蛋白質
を精製する公知の手段によって分離精製することができ
る。例えば、セファデックスＧ−２５，セファデックス
Ｇ−５０、セファデックスＬＨ−２０などのゲル濾過剤
を用いるゲル濾過法、カルボキシメチルセルロース、そ
の他のイオン交換樹脂を用いるカラムクロマトグラフィ
ー、逆相系合成高分子樹脂または化学修飾シリカゲル担
体を用いたカラムクロマトグラフィ及び高速液体クロマ
トグラフィーなどにより行なうことができる。

【００２０】本発明の新規化合物はその方法の条件によ
り塩基またはその塩の形で得られる。たとえば、酢酸な
どの公知の有機酸との塩を形成することができる。尚、
本明細書に記載の略記号は次の意味を有する。 Ａｓｕ：Ｌ−α−アミノスベリン酸 Ａｓｎ：Ｌ−アスパラギン Ａｓｐ：Ｌ−アスパラギン酸 Ａｌａ：Ｌ−アラニン Ｔｈｒ：Ｌ−スレオニン Ｖａｌ：Ｌ−バリン Ｈｉｓ：Ｌ−ヒスチジン Ａｒｇ：Ｌ−アルギニン Ｌｅｕ：Ｌ−ロイシン Ｔｙｒ：Ｌ−チロシン Ｓｅｒ：Ｌ−セリン Ｇｌｙ：グリシン Ｌｙｓ：Ｌ−リジン Ｐｒｏ：Ｌ−プロリン Ｇｌｕ：Ｌ−グルタミン酸 Ｇｌｎ：Ｌ−グルタミン Ｄ−Ｌｅｕ：Ｄ−ロイシン Ｂｏｃ−：ｔ−ブチルオキシカルボニル Ｚ−：カルボベンゾキシ Ｆｍｏｃ−：フルオレニルメチル Ｃｌ−Ｚ：ｐ−クロロベンジルオキシカルボニル Ｃｌ2 Ｂｚｌ：2,6-ジクロロベンジル Ａｃ：アセチル Ｂｚｌ：ベンジル ＯＢｚｌ：ベンジルエステル ＯＭｅ：メチルエステル Ｔｏｓ：トシル ＴＦＡ：トリフルオロ酢酸 エーテル：ジエチルエーテル ＤＭＦ：Ｎ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド ＭｅＯＨ：メタノール ＤＣＭ：ジクロロメタン ＤＩＥＡ：ジイソプロピルエチルアミン ＨＯＢｔ：１−ヒドロキシベンゾトリアゾール ＭＢＨＡ樹脂：ｐ−メチルベンズヒドリルアミン樹脂 ＯＳｕ：Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドエステル −ＯｔＢｕ：ｔ−ブチルエステル ＷＳＣＤ・ＨＣｌ：１−エチル−３−（３−ジメチルア
ミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩 このようにして合成、精製して得られたエルカトニン安
定化剤は、その１種または２種以上を、あらかじめエル
カトニン原末に配合して、その後エルカトニン水溶液剤
を調製するか、またはエルカトニン水溶液に直接添加溶
解して、またはあらかじめ別に溶解しておいたエルカト
ニン安定化剤の溶液を、エルカトニン水溶液に加えて用
いる。その有効量としては、エルカトニンの重量に対し
て通常、０．５〜１０重量％、さらに好ましくは１〜５
重量％である。

【００２１】エルカトニン水溶液は、通常に使用される
ものであれば特に限定されないが、生理食塩液や各種緩
衝液が挙げられ、緩衝液としては特に例えばクエン酸
や、酢酸等及びそれら酸の水可溶塩が例示される。それ
らの濃度は通常、０．０５〜２０ｍＭ程度が好ましく、
ｐＨは通常５〜７が好ましい例として挙げられる。この
液に浸透圧調整剤として塩化ナトリウム、塩化カリウム
等の非毒性の強電解質無機塩類を添加してもよい。活性
成分であるエルカトニンは、適応症や用法等によるが、
通常は、容器当たり１〜４０マイクログラム、濃度とし
ては通常これらを１ｍｌ中に溶解された水溶液が例示さ
れる。

【００２２】このエルカトニン安定化剤を含んだ注射用
エルカトニン水溶液は、例えばアンプル、バイアル等の
医薬用ガラス容器またはプラスチック容器に充填して定
法により水溶液注射剤とすることができ、活性成分であ
るエルカトニンの特に振とう安定性に優れた注射剤とす
ることができる。

【００２３】

【実施例】以下に製造例、実施例を挙げて本発明を具体
的に説明するが、本発明はこれらに限定されない。な
お、各製造例におけるアミノ酸分析は被検体に６Ｎ塩酸
を加え、１１０゜Ｃで２４時間加水分解させ、これを減
圧乾固した後、アミノ酸分析計により分析した。また、
物性値で示した高速液体クロマトグラフィーの条件は、
以下の通りである。 （高速液体クロマトグラフィー条件） カラム：ＯＤＳカラム 内径４ｍｍ,長さ１５０ｍｍ 溶出液：グラジエント A液：０．１％ＴＦＡ水 B液：アセトニトリル 初期Ｂ液濃度１５％からＢ液濃度４５％までの直線濃度勾配溶出 （30分間） 流速 １ｍｌ／分 検出波長 ２２５ｎｍ

【００２４】

【製造例１】

【００２５】

【化７】

【００２６】上記、式Ａで表される化合物（Ｆ０４化合
物と略すことがある）の製造 （１）

【００２７】

【化８】

【００２８】表記化合物（以下、フラグメント（１）と
略すことがある）は、特公昭５３−４１６７７公報実施
例２(1)〜(14)の方法により製造した。 （２）

【００２９】

【化９】

【００３０】の製造 固相合成装置としてApplied BiosystemS社製４３０−Ａ
ペプチドシンセサイザーを用いて固相合成を行った。Ｍ
ＢＨＡ樹脂（Applied Biosystems社製、アミノ基0.61m
モル／ｇ）０．８ｇをペプチド固相合成用反応容器に入
れ、ＤＣＭ８ｍｌ（４回、各１分）、６０％ＴＦＡ含有
ＤＣＭ溶液８ｍｌ（２０分）、ＤＣＭ４ｍｌ（３回、各
１５秒）、ＤＩＥＡ１ｍｌ含有ＤＭＦ溶液３ｍｌ（２
回、各１分）、ＤＭＦ８ｍｌ（６回、各４０秒）の順に
窒素ガス気流中攪拌下処理し、各々の処理後濾過した。

【００３１】一方、Boc-Pro ２ｍモルをＤＣＭ５ｍｌに
溶かし、アミノ酸活性化容器中でＤＣＣ（０．５Ｍ−Ｄ
ＣＭ溶液）２ｍｌを加え、５分間反応させた。反応液を
濾過して濃縮容器に移し、これにＤＭＦ３ｍｌを加え、
窒素ガス気流下ＤＣＭを留去した。これにＤＭＦ３ｍｌ
を加え、前記の反応容器に移して２５分反応させた。次
いで、ＤＣＭ８ｍｌ（６回、各２０秒）で洗浄、濾過し
てBoc-Pro-MBHA樹脂を得た。

【００３２】次に、前記のBoc-Pro-MBHA樹脂を反応容器
中ＤＣＭ８ｍｌ（４回、各１分で洗浄し、濾過した。こ
れに６０％ＴＦＡ含有ＤＣＭ溶液８ｍｌを加え、２０分
間攪拌し、Bocを脱離した。得られた樹脂をＤＣＭ４ｍ
ｌ（３回、各１５秒）、ＤＩＥＡ１ｍｌ含有ＤＭＦ溶液
３ｍｌ（２回、各１分）、ＤＭＦ８ｍｌ（６回、各４０
秒）で順次洗浄し、濾過した。

【００３３】さらに、BocThr(Bzl) ２ｍモルをＤＣＭ５
ｍｌに溶解し、アミノ酸活性化容器中でＤＣＣ（０．５
Ｍ−ＤＣＭ溶液）２ｍｌを加え、５分間反応させた。次
いで、Boc-Proの場合と同様に処理し、ＤＭＦを加えて
窒素ガス気流下で濃縮した後、反応容器に移して２０分
間反応させた。次いで、ＤＣＭ８ｍｌ（６回、各２０
秒）で洗浄、濾過してBoc-Thr(Bzl)-Pro-MBHA樹脂を得
た。

【００３４】以下、Ｃ末端からＮ末端への順で上記目的
物の配列に従い、順次対応する保護アミノ酸をカップリ
ングして最後の保護アミノ酸を結合後、Ｎ末端Ｂｏｃ基
を脱保護するため、ＴＦＡ処理とその後の洗浄を行い、
上記化合物２．２ｇを得た。上記固相合成において、Ar
g,Glnを結合する場合は、２ｍモルの対応する保護アミ
ノ酸をＤＭＦ−ＤＣＭ（３：１）混合溶媒４ｍｌ中、Ｄ
ＣＣ溶液２ｍｌ、ＨＯＢｔ溶液（０．５Ｍ−ＤＭＦ溶
液）２ｍｌを加え、１分間反応させた後、他のアミノ酸
同様に処理し、反応容器に移してカップリング反応さ
せ、ＤＣＭ洗浄、濾過後、もう一度２ｍモル保護アミノ
酸をＤＭＦ−ＤＣＭ（３：１）混合溶媒４ｍｌ中ＤＣＣ
溶液２ｍｌ、ＨＯＢｔ溶液（０．５Ｍ−ＤＭＦ）２ｍｌ
を加え、２５分間反応させたものを反応容器に移してカ
ップリングさせる、いわゆるダブルカップリング法で行
なった。

【００３５】固相法及び製造例で使用したアミノ酸は次
の通りである。

【００３６】

【化１０】

【００３７】（３）上記（１）で得られた化合物と
（２）で得られた化合物との結合 上記（１）で得られた化合物 700mgをＤＭＦ４ｍｌとＮ
メチルピロリドン２ｍｌの混合溶媒に溶解し、これに、
上記（２）で得られた化合物１．６ｇを加えＨＯＢｔ
０．１３５ｇを加え、−１５゜Ｃに冷却下、ＷＳＣＤ・
ＨＣｌ ０．１９２ｇを加え、一晩攪拌した。反応終了
後、吸引濾過し、ＤＭＦ５ｍｌとＮメチルピロリドン５
ｍｌの混合溶媒１０ｍｌ、ＤＭＦ１０ｍｌ、ＤＣＭ１０
ｍｌの順に洗浄し、減圧乾燥して、上記目的物１．９ｇ
を得た。 （４）Ｆ０４化合物の製造 上記（３）で得られた化合物１．０gをＨＦ反応装置
（（株）ペプチド研究所製）に移し、アニソール２ｍｌ
を加え、これに無水フッ化水素２０ｍｌを加え、０゜Ｃ
で１時間攪拌した。反応後、無水フッ化水素を減圧下留
去後、残渣をエーテルで洗浄し、これに０．１Ｍ酢酸２
０ｍｌを加え、ペプチドを抽出した。抽出液をＤｏｗｅ
ｘ １Ｘ２のカラム（２．６×１５ｃｍ）に通し、０．
１Ｍ酢酸６０ｍｌで溶出して凍結乾燥した。これを逆相
系高速液体クロマトグラフィーにより精製し、セファデ
ックスGー25樹脂を使用し0.1M- 酢酸水でゲル濾過して
４．５ｍｇを得た。 物性値 アミノ酸分析値 Asp 1.97(2),Thr 3.87(4),Ser 2.83(3),Glu 3.13(3),Pr
o 2.20(2),Gly 3.95(4), Ala 1.00(1),Val 1.91(2),Leu
6.32(6),Tyr 0.97(1),Lys 2.18(2),His 1.15(1), Arg
1.12(1),Asu 1.18(1) 高速液体クロマトグラフィー 保持時間２５．５分

【００３８】

【製造例２】

【００３９】

【化１１】

【００４０】上記、式Ｂで表される化合物（以下Ｆ０５
化合物と略すことがある）の製造 （１）フラグメント（１）の製造 フラグメント（１）は特公昭５３−４１６７７公報実施
例２(1)〜(14)の方法により製造した。 （２）

【００４１】

【化１２】

【００４２】の製造 製造例１．（２）と同様に製造例１．（２）で製造した
配列と変化している所定のＬｅｕを結合する際、Boc-Le
u・H2Oの代りにBoc-DーLeu・H2Oを使用して固相合成して
２．１ｇを得た。 （３）上記（１）で得られた化合物と（２）で得られた
化合物との結合 上記（１）で得られた化合物５００ｍｇと上記（２）で
得られた化合物１．１ｇを使用して製造例１．（３）と
同様に実施して上記目的物１．４ｇを得た。 （４）Ｆ０５化合物の製造 上記（３）で得られた化合物１．０gを製造例１．
（４）と同様に処理して逆相系高速液体クロマトグラフ
ィーにより精製し、セファデックスGー25樹脂を使用し0.
1M-酢酸水でゲル濾過して上記目的物５．６ｍｇを得
た。 物性値 アミノ酸分析値 Asp 2.02(2),Thr 3.91(4),Ser 2.85(3),Glu 3.13(3),Pr
o 2.33(2),Gly 3.09(3), Ala 1.00(1),Val 1.93(2),Leu
5.38(5),Tyr 0.98(1),Lys 2.20(2),His 1.17(1), Arg
1.07(1),Asu 1.20(1) 高速液体クロマトグラフィー 保持時間 ２３．５分

【００４３】

【製造例３】

【００４４】

【化１３】

【００４５】上記、式Ｃで表される化合物（以下Ｆ０８
化合物と略すことがある）の製造 （１）フラグメント（１）の製造 フラグメント（１）は特公昭５３−４１６７７公報実施
例２(1)〜(14)の方法により製造した。 （２）

【００４６】

【化１４】

【００４７】の製造 製造例１．（２）と同様にMBHA樹脂にBoc-Proを反応
し、結合させ、同様に処理した後、 以下、Ｃ末端から
Ｎ末端への順で上記目的物の配列に従い、順次対応する
保護アミノ酸をカップリングして最後の保護アミノ酸を
結合後、Ｎ末端Ｂｏｃ基を脱保護するため、 ＴＦＡ処
理とその後の洗浄を行い、上記化合物２．３ｇを得た。 （３）上記（１）で得られた化合物と（２）で得られた
化合物との結合 上記（１）で得られた化合物５００ｍｇと上記（２）で
得られた化合物１．２ｇを使用して製造例１．（３）と
同様に実施して上記目的物１．４ｇを得た。 （４）Ｆ０８化合物の製造 上記（３）で得られた化合物１．０gを製造例１．
（４）と同様に処理して逆相系高速液体クロマトグラフ
ィーにより精製し、セファデックスGー25樹脂を使用し0.
1M-酢酸水でゲル濾過して上記目的物８．５ｍｇを得
た。 物性値 アミノ酸分析値 Asp 1.93(2),Thr 3.88(4),Ser 3.61(4),Glu 5.00(5),Pr
o 2.02(2),Gly 3.02(3), Ala 1.00(1),Val 1.93(2),Leu
6.74(7),Tyr 1.01(1),Lys 3.33(3),His 1.03(1), Arg
1.14(1),Asu 1.07(1) 高速液体クロマトグラフィー 保持時間 ２３．３分

【００４８】

【製造例４】

【００４９】

【化１５】

【００５０】上記、式Ｄで表される化合物（以下Ｆ１７
化合物と略すことがある）の製造 （１）フラグメント（１）の製造 フラグメント（１）は特公昭５３−４１６７７公報実施
例２(1)〜(14)の方法により製造した。 （２）

【００５１】

【化１６】

【００５２】の製造 製造例１．（２）と同様に製造例１．（２）で製造した
配列と変化している所定のＬｙｓを結合する際、Boc-Ly
s(Cl-Z)の代りにBoc-Lys(Ac)を使用して固相合成して
２．１ｇを得た。 （３）上記（１）で得られた化合物と（２）で得られた
化合物との結合 上記（１）で得られた化合物５００ｍｇと上記（２）で
得られた化合物１．１ｇを使用して製造例１．（３）と
同様に実施して上記目的物１．４ｇを得た。 （４）Ｆ１７化合物の製造 上記（３）で得られた化合物１．０gを製造例１．
（４）と同様に処理して逆相系高速液体クロマトグラフ
ィーにより精製し、セファデックスGー25樹脂を使用し0.
1M-酢酸水でゲル濾過して上記目的物４．９ｍｇを得
た。 物性値 アミノ酸分析値 Asp 1.94(2),Thr 3.65(4),Ser 2.56(3),Glu 3.06(3),Pr
o 1.96(2),Gly 2.91(3), Ala 1.00(1),Val 1.96(2),Leu
4.76(5),Tyr 0.96(1),Lys 1.95(2),His 0.97(1), Arg
0.98(1),Asu 0.90(1) 高速液体クロマトグラフィー 保持時間 ２８．５分

【００５３】

【製造例５】

【００５４】

【化１７】

【００５５】上記、式Ｅで表される化合物（以下Ｆ２３
化合物と略すことがある）の製造 （１）フラグメント（１）の製造 フラグメント（１）は特公昭５３−４１６７７公報実施
例２(1)〜(14)の方法により製造した。 （２）

【００５６】

【化１８】

【００５７】の製造 製造例１．（２）と同様にMBHA樹脂にBoc-Proを反応
し、結合させ、同様に処理した後、以下、Ｃ末端からＮ
末端への順で上記目的物の配列に従い、順次対応する保
護アミノ酸をカップリングして最後の保護アミノ酸を結
合後、Ｎ末端Ｂｏｃ基を脱保護するため、ＴＦＡ処理と
その後の洗浄を行い、上記化合物１．６ｇを得た。 （３）上記（１）で得られた化合物と（２）で得られた
化合物との結合 上記（１）で得られた化合物５００ｍｇと上記（２）で
得られた化合物１．０ｇを使用して製造例１．（３）と
同様に実施して上記目的物１．３ｇを得た。 （４）Ｆ２３化合物の製造 上記（３）で得られた化合物０．９gを製造例１．
（４）と同様に処理して逆相系高速液体クロマトグラフ
ィーにより精製し、セファデックスGー25樹脂を使用し0.
1M-酢酸水でゲル濾過して上記目的物５．６ｍｇを得
た。 物性値 アミノ酸分析値 Asp 2.13(2),Thr 3.88(4),Ser 1.97(2),Glu 1.07(1),Pr
o 1.56(2),Gly 3.06(3), Ala 1.00(1),Val 2.04(2),Leu
3.10(3),Tyr 0.92(1),Lys 1.02(1),Arg 0.94(1), Asu
1.16(1) 高速液体クロマトグラフィー 保持時間 １８．５分

【００５８】

【製造例６】

【００５９】

【化１９】

【００６０】上記、式Ｆで表される化合物（以下Ｆ２６
化合物と略すことがある）の製造 （１）フラグメント（１）の製造 フラグメント（１）は特公昭５３−４１６７７公報実施
例２(1)〜(14)の方法により製造した。 （２）

【００６１】

【化２０】

【００６２】の製造 製造例１．（２）と同様にMBHA樹脂にBoc-Proを反応
し、結合させ、同様に処理した後、 以下、Ｃ末端から
Ｎ末端への順で上記目的物の配列に従い、順次対応する
保護アミノ酸をカップリングして最後の保護アミノ酸を
結合後、Ｎ末端Ｂｏｃ基を脱保護するため、ＴＦＡ処理
とその後の洗浄を行い、上記化合物２．４ｇを得た。 （３）上記（１）で得られた化合物と（２）で得られた
化合物との結合 上記（１）で得られた化合物５００ｍｇと上記（２）で
得られた化合物１．３ｇを使用して製造例１．（３）と
同様に実施して上記目的物１．６ｇを得た。 （４）Ｆ２６化合物の製造 上記（３）で得られた化合物１．０gを製造例１．
（４）と同様に処理して逆相系高速液体クロマトグラフ
ィーにより精製し、セファデックスGー25樹脂を使用し0.
1M-酢酸水でゲル濾過して上記目的物９．１ｍｇを得
た。 物性値 アミノ酸分析値 Asp 2.20(2),Thr 4.94(5),Ser 2.93(3),Glu 4.41(4),Pr
o 2.42(2),Gly 3.05(3), Ala 1.00(1),Val 2.06(2),Leu
6.19(6),Tyr 1.66(2),Lys 3.20(3),His 2.05(2), Arg
0.98(1),Asu 1.15(1) 高速液体クロマトグラフィー 保持時間 ２４．５分

【００６３】

【製造例７】

【００６４】

【化２１】

【００６５】上記、式Ｇで表される化合物（以下Ｆ３２
化合物と略すことがる）の製造 （１）フラグメント（１）の製造 フラグメント（１）は特公昭５３−４１６７７公報実施
例２(1)〜(14)の方法により製造した。 （２）

【００６６】

【化２２】

【００６７】の製造 製造例１．（２）と同様にMBHA樹脂にBoc-Proを反応
し、結合させ、同様に処理した後、以下、Ｃ末端からＮ
末端への順で上記目的物の配列に従い、順次対応する保
護アミノ酸をカップリングして最後の保護アミノ酸を結
合後、Ｎ末端Ｂｏｃ基を脱保護するため、ＴＦＡ処理と
その後の洗浄を行い、上記化合物２．５ｇを得た。 （３）上記（１）で得られた化合物と（２）で得られた
化合物との結合 上記（１）で得られた化合物５００ｍｇと上記（２）で
得られた化合物１．１ｇを使用して製造例１．（３）と
同様に実施して上記目的物１．４ｇを得た。 （４）Ｆ３２化合物の製造 上記（３）で得られた化合物１．０gを製造例１．
（４）と同様に処理して逆相系高速液体クロマトグラフ
ィーにより精製し、セファデックスGー25樹脂を使用し0.
1M-酢酸水でゲル濾過して上記目的物１１．７ｍｇを得
た。 物性値 アミノ酸分析値 Asp 2.04(2),Thr 4.62(5),Ser 3.42(4),Glu 6.03(6),Pr
o 3.05(3),Gly 2.99(3), Ala 1.00(1),Val 2.14(2),Leu
7.71(8),Tyr 1.61(2),Lys 3.82(4),His 1.87(2), Arg
1.16(1),Asu 0.97(1) 高速液体クロマトグラフィー 保持時間 ２５．５分

【００６８】

【製造例８】

【００６９】

【化２３】

【００７０】上記、式Ｈで表される化合物（以下Ｆ４８
化合物と略すことがある）の製造 （１）フラグメント（１）の製造 フラグメント（１）は特公昭５３−４１６７７公報実施
例２(1)〜(14)の方法により製造した。 （２）

【００７１】

【化２４】

【００７２】の製造 製造例１．（２）と同様に製造例１．（２）で製造した
配列と変化している所定のＬｙｓを結合する際、Boc-Ly
s(Cl-Z)の代りにBoc-Lys(Ac)を使用して固相合成して
２．０ｇを得た。 （３）上記（１）で得られた化合物と（２）で得られた
化合物との結合 上記（１）で得られた化合物５００ｍｇと上記（２）で
得られた化合物１．１ｇを使用して製造例１．（３）と
同様に実施して上記目的物１．４ｇを得た。 （４）Ｆ４８化合物の製造 上記（３）で得られた化合物１．０gを製造例１．
（４）と同様に処理して逆相系高速液体クロマトグラフ
ィーにより精製し、セファデックスGー25樹脂を使用し0.
1M-酢酸水でゲル濾過して上記目的物７．８ｍｇを得
た。 物性値 アミノ酸分析値 Asp 1.98(2),Thr 3.63(4),Ser 2.55(3),Glu 3.09(3),Pr
o 1.96(2),Gly 2.89(3), Ala 1.00(1),Val 1.94(2),Leu
4.71(5),Tyr 0.80(1),Lys 1.93(2),His 0.96(1), Arg
1.00(1),Asu 0.88(1) 高速液体クロマトグラフィー 保持時間 ２７．７分

【００７３】

【実施例１】製造例１〜８で合成、精製して得た８種の
エルカトニン安定化剤について、その安定化効果を調べ
るため、それぞれエルカトニン注射用水溶液に添加し、
エルカトニンの振とう安定性を試験した。 （１）エルカトニン注射用水溶液の調製：蒸留水１００
０ｍｌ当たりクエン酸ナトリウム・３Ｈ₂Ｏを４．６３
ｇ、無水クエン酸を０．３７ｇ、さらに塩化ナトリウム
を７．０ｇ加えて溶解し、ｐＨ６．０の水溶液を調製し
た。この水溶液にエルカトニンを約１０μｇ／ｍｌ濃度
となるように溶解し、エルカトニン注射用水溶液を調製
した。 （２）注射剤の調製：蒸留水１０００ｍｌ当たりクエン
酸ナトリウム・３Ｈ₂Ｏを４．６３ｇ、無水クエン酸を
０．３７ｇ、さらに塩化ナトリウムを７．０ｇ加えて溶
解し、ｐＨ６．０の水溶液を調製した。この水溶液に製
造例１〜８で製造した８種のエルカトニン安定化剤を各
々約１０μｇ／ｍｌ濃度、または約１．０μｇ／ｍｌ濃
度となるように溶解し、エルカトニン安定化剤の水溶液
を調製した。このエルカトニン安定化剤の水溶液とエル
カトニン注射用水溶液を混合し、安定化剤１種以上の総
量がエルカトニンの量に対して５％、または０．５％含
まれたエルカトニン注射用水溶液の試験液を調製した。
つぎに各々の試験液を１ｍｌずつ通常のガラスアンプル
に充填し、各々約５０本のアンプル剤とした。

【００７４】また、対照として本発明の安定化剤を含ま
ない注射用エルカトニン水溶液のアンプル剤を同様に調
製した。 （３）安定性試験：上記の試験液のアンプル剤を恒温振
とう機に入れ、経時的にエルカトニンの含量を液体クロ
マトグラフィーにて測定し、その振とう安定性を調べ
た。 ・振とう条件〔振幅：１０ｃｍ、振とう速度：１８０回
／分、温度：２５゜Ｃ〕 ・液体クロマトグラフィー測定条件〔カラム：ＯＤＳカ
ラム（４．６×１５０ｍｍ）、移動相：ＣＨ₃ＣＮ−
０．１％ＴＦＡ（１：２）、流速：１ｍｌ／ｍｉｎ、検
出：ＵＶ２２０ｎｍ〕 各注射剤の振とう４週間の残存率を表１に示した。

【００７５】

【表１】

【００７６】表１から明らかなように、本発明のエルカ
トニン安定化剤を含んだ注射用エルカトニン水溶液のア
ンプル剤は、安定化剤を含まない対照例のアンプル剤よ
り振とう安定性が向上していた。

【００７７】

【実施例２】 １）注射剤の調製：蒸留水１０００ｍｌ当たりクエン酸
ナトリウム・３Ｈ₂Ｏを４．６３ｇ、無水クエン酸を
０．３７ｇ、さらに塩化ナトリウムを７．０ｇ加えて溶
解し、ｐＨ６．０の水溶液を調製した。この水溶液に製
造例３で製造したＦ０８を約１０μｇ／ｍｌ濃度となる
ように溶解した。このＦ０８の水溶液と実施例１で調製
したエルカトニン注射用水溶液を混合し、Ｆ０８がエル
カトニンの量に対して０％、１％、５％、及び１０％含
まれたエルカトニン注射用水溶液の試験液を調製した。
つぎに各々の試験液を１ｍｌずつ通常のガラスアンプル
に充填し、各々約１００本のアンプル剤とした。 ２）安定性試験：上記の試験液のアンプル剤を実施例１
と同様に恒温振とう機に入れ、経時的にエルカトニンの
含量を液体クロマトグラフィーにて測定し、その振とう
安定性を調べた。また、別に上記の試験液のアンプル剤
を４０゜Ｃの恒温器に入れ、経時的にエルカトニンの含
量を液体クロマトグラフィーにて測定し、その保存安定
性を調べた。なお、振とう条件及び液体クロマトグラフ
ィー測定条件は実施例１と同条件で行った。

【００７８】各注射剤の振とう４週間の残存率を表２
に、４０゜Ｃ、６カ月の保存安定性を表３に示した。

【００７９】

【表２】

【００８０】

【表３】

【００８１】表２及び表３の結果から、本発明のエルカ
トニン安定化剤であるＦ０８を含んだエルカトニン注射
剤は、振とう安定性及び４０゜Ｃの保存安定性に優れて
いた。

【００８２】

【発明の効果】本発明のペプチドは、極めて少量で注射
用水溶液中のエルカトニンの安定性を向上することが可
能であり、エルカトニン水溶液製剤の安定化剤として有
用である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ａ６１Ｋ 38/23 ＡＤＤ // Ｃ０７Ｋ 14/585 8318−4Ｈ

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記式ＡからＨ 【化１】 【化２】 【化３】 で表されるペプチドからなる群よりえらばれた１種また
   は２種以上を有効成分とするエルカトニン水溶液剤の安
   定化剤。