JPH07177899A

JPH07177899A - 遺伝子の検出方法

Info

Publication number: JPH07177899A
Application number: JP32752893A
Authority: JP
Inventors: Michihiro Nakamura; 通宏中村; Toshimi Matsui; 聡美松井; Tadashi Hatanaka; 唯史畑中; Masao Tsuji; 正男辻; Mitsuru Ishikawa; 満石川; Masayuki Masuko; 正行増子
Original assignee: BIO SENSOR KENKYUSHO KK
Current assignee: BIO SENSOR KENKYUSHO KK
Priority date: 1993-12-24
Filing date: 1993-12-24
Publication date: 1995-07-18

Abstract

(57)【要約】【目的】極めて簡便で迅速な遺伝子の検出方法を提供
する。【構成】蛍光色素で標識されたプライマを用いて、検
出対象となる遺伝子をポリメラーゼ・チェイン・リアク
ション（ＰＣＲ）により増幅させる。増幅された遺伝子
が有する該蛍光色素の蛍光偏光解消度を時間分解的に測
定する。【効果】蛍光色素で標識されたプライマーを用いて、
検出対象となる遺伝子を鋳型としてＰＣＲにより増幅さ
せることによって、蛍光色素で標識されたプライマーを
含む遺伝子が増幅、生成される。また、増幅遺伝子の塩
基配列上の該蛍光色素の蛍光を励起させ、該蛍光の偏光
解消度を時間分解的に測定することによって、該増幅遺
伝子の分子回転運動による蛍光異方性の消失を捉えるこ
とができる。したがって、ＰＣＲにより増幅された増幅
遺伝子の鋳型である検出対象遺伝子を極めて簡便に、か
つ短時間で検出することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、微量の遺伝子の検出方
法に関するものであり、その主たる利用分野としては、
医学、法医学、獣医学などの分野における遺伝子検査、
および生化学、生物学、薬理学、農学、さらには考古学
の分野における遺伝子測定が挙げられる。

【０００２】

【従来の技術】ポリメラーゼ・チェイン・リアクション
（以下「ＰＣＲ」という。）は、微量の遺伝子を指数関
数的に増幅させる反応であり、近年、遺伝子の検出やク
ローニングに多用されている。特に、数分子から数千分
子の極微量遺伝子の検出は、本法をもって初めて可能に
なったと言える。

【０００３】検出対象となる遺伝子（以下「検出対象遺
伝子」ともいう。）を鋳型としてＰＣＲにより増幅され
た遺伝子（以下「増幅遺伝子」という。）の測定につい
て、多数の方法が開発されているが、その中でも頻繁に
用いられる方法としては、ドットブロット法、ゲル
電気泳動法、およびサザンブロット法が挙げられる
（例えば、斉藤監訳、ＰＣＲ実験マニュアル、ＨＢＪ出
版局、１９９１年発行を参照）。以下、上記〜の各
法について説明する。

【０００４】ドットブロット法においては、まずＰＣ
Ｒ反応終了後に、反応溶液中の増幅遺伝子を二本鎖から
一本鎖に変性させる。その後、反応溶液の一部を多孔性
のドットブロット膜に滴下し、増幅遺伝子を該膜上に付
着させ、次いで増幅遺伝子に特異的にハイブリダイズす
る標識プローブの溶液と該膜とを反応させる。ドットブ
ロット膜上に付着した増幅遺伝子と標識プローブとをハ
イブリダイズさせた後、該膜をよく洗浄してハイブリダ
イズしていない未反応の標識プローブを除去し、残存す
る標識プローブの量を測定する。標識としては、放射性
同位元素または適当な酵素が用いられ、前者については
オートラジオグラフィで、後者については発色法、蛍光
法または化学発光法で測定される。

【０００５】電気泳動法においては、ＰＣＲ反応溶液
の一部が、例えばポリアクリルアミドゲル電気泳動に供
され、分子サイズに応じた分離を行った後、分離された
バンドを例えばエチジウムブロマイドのような蛍光色素
で染色し、バンド強度を肉眼またはデンシトメータで測
定する。

【０００６】サザンブロット法においては、と同様
の電気泳動による分離を行った後、ゲルをＮａＯＨで変
性させる。その後、ゲル上の遺伝子を多孔性の膜にトラ
ンスファさせ、該膜と標識プローブとをのドットブロ
ット法の場合と同じように反応させ、洗浄した後、残存
する標識プローブの量を定量する。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】以上のように、ＰＣＲ
反応溶液中の増幅遺伝子の検出に関する従来の方法は、
いずれも繁雑である。特に、感度および特異性に優れた
サザンブロット法においては、電気泳動、膜への転写、
プローブとのハイブリダイゼーション、標識の測定など
と多くの工程、時間および繁雑な操作を要する。したが
って、本発明の目的は、従来の方法に比べて、簡便で迅
速な遺伝子の検出方法を提供することにある。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明の遺伝子の検出方
法は、蛍光色素で標識されたプライマーを用いて、検出
対象遺伝子をＰＣＲにより増幅させた後に、増幅遺伝子
が有する該蛍光色素の蛍光偏光解消度を時間分解的に測
定することを特徴とする。

【０００９】本発明方法においては、まず（１）検出対
象となる遺伝子（ＰＣＲにより増幅される鋳型となる遺
伝子）に対して相補性を有するプライマーを作成し、該
プライマーを蛍光色素で標識して、蛍光標識プライマー
を準備することが必要である。次に、（２）該プライマ
ーを用いて、検出対象となる遺伝子を鋳型とするＰＣＲ
を実施し、（３）ＰＣＲ終了後に、増幅遺伝子について
該蛍光色素の蛍光偏光解消度を時間分解的に測定する。
以下これらの各工程について詳しく説明する。

【００１０】まず、蛍光標識プライマーの作成について
述べる。プライマーは、検出対象遺伝子の各一本鎖のＤ
ＮＡにそれぞれ特異的にハイブリダイズして、ＰＣＲの
開始点（ＰＣＲによる増幅反応後の二本鎖の増幅遺伝子
の両末端）となる二種類の遺伝子断片であるので、以下
の条件を満足するものでなければならない。

【００１１】検出対象遺伝子の塩基配列の中から該遺伝
子のみに特異的な塩基配列を検索し、その中から一組
（二種類）のプライマーを選択する。但し、プライマー
同士の相補鎖生成を避けるために、二種類のプライマー
の３’側が相補性を有しないこと、プライマー内にパリ
ンドロームを形成しないことなどに注意して、プライマ
ーの配列を選択することが必要である。プライマーの長
さは、特に限定されないが、通常は１０塩基〜４０塩
基、好ましくは１５塩基〜３０塩基である。

【００１２】検出対象遺伝子の塩基配列のうち二種類の
プライマーに挟まれる塩基配列の領域が、ＰＣＲにより
増幅される領域（以下「ＰＣＲ増幅領域」という。）と
なる。このＰＣＲ増幅領域の鎖長は、特に限定されない
が、通常は５０塩基〜５０００塩基、好ましくは１００
塩基〜２０００塩基となるように二種類のプライマーを
選択することが望ましい。なお、通常は、検出対象遺伝
子の一部の領域がＰＣＲ増幅領域となるが、特に検出対
象遺伝子が短鎖である場合には、その全領域がＰＣＲ増
幅領域となることもあり得る。

【００１３】このように設計、作成されたプライマーに
蛍光色素を結合させる方法としては、プライマーの５’
末端にアミノ基などの官能基をまず導入し、該官能基と
結合できるように修飾された蛍光色素を反応させる方法
が、一般的に用いられる（上記“ＰＣＲ実験マニュア
ル”８９頁参照）。これとは別に、プライマーをＤＮＡ
合成装置で合成する際に、蛍光色素で標識されたヌクレ
オチド三リン酸を取り込ませる方法もある。前者の方法
では、蛍光色素が５’末端のみに導入されるのに対し
て、後者の方法では、プライマーの鎖の中にいくつかの
蛍光色素が導入される。なお、２種類のプライマーのう
ち少なくとも一方のプライマーに蛍光色素を結合させれ
ばよい。

【００１４】蛍光色素としては、フルオレシン、ローダ
ミンなどが例示され、例えばフルオレシン・イソチオシ
アネートは、チオクルドミド結合を介してプライマーに
結合する。

【００１５】次に、蛍光標識プライマーを用いたＰＣＲ
法について説明する。まず、検出対象遺伝子を９２℃〜
９６℃で１０秒〜３分間加熱して熱変性させ、一本鎖の
ＤＮＡとする。その後、蛍光標識プライマーを一本鎖の
ＤＮＡにアニーリングする。アニーリングは、５５℃〜
７２℃で１０秒〜３分間加熱して行われる。さらに、塩
基の存在下で、上記のポリメラーゼを用いて、７０℃〜
７３℃で３０秒〜３分間加熱して、プライマーの伸長反
応を行う。

【００１６】伸長反応に用いられるポリメラーゼとして
は、特に限定されるものではないが、通常はTaq ＤＮＡ
ポリメラーゼが用いられる。また、ポリメラーゼの基質
となる塩基は、デオキシヌクレオチド5'−トリフォスフ
ェート[dNTP]、すなわち、アデニン、グアニン、シトシ
ンおよびチミンである。

【００１７】以上の工程を経ることによって、検出対象
遺伝子の一部または全領域（ＰＣＲ増幅領域）の遺伝子
の複製が行われ、さらに上記の熱変性、アニーリングお
よびプライマーの伸長反応を順次複数回行うことによっ
て、ＰＣＲ増幅領域の遺伝子の増幅が行われる。ＰＣＲ
のサイクル数は、通常は１０回〜５０回、好ましくは２
０回〜３５回である。

【００１８】標準的なＰＣＲ仕込み液の組成は以下の通
りである。所定量の検出対象遺伝子０．５ｍＭ〜５００ｍＭのＫＣｌ１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．３）０．２５ｍＭ〜１５ｍＭのＭｇＣｌ₂ ０．１重量％ゼラチン２０μＭ〜２００μＭの各ｄＮＴＰ０．０１μＭ〜１μＭの蛍光標識プライマー１ｕｎｉｔ〜３ｕｎｉｔのＴａｑＤＮＡポリメラーゼ

【００１９】ＰＣＲが終了した後の反応溶液は、そのま
ま、あるいは必要ならばエタノール沈殿によってＤＮＡ
分画のみを分離した後、適当な溶媒に再溶解して、時間
分解的な蛍光偏光解消度の測定に供される。また、適当
なカラムによって未反応の蛍光標識プライマーを分離除
去し、増幅遺伝子のみを該測定に供することも可能であ
る。多くの場合、ＰＣＲ反応溶液をそのまま該測定に供
することが可能である。

【００２０】次に、蛍光偏光解消度を時間分解的に測定
する方法について説明する。図１は、時間分解蛍光偏光
解消度測定装置の基本構成の一例を示す図である。モー
ド同期アルゴンイオンレーザ１によって駆動されたＣＷ
色素レーザ２とキャビティーダンパ３とから、ピコ秒単
位でパルスを発振できる波長可変な色素レーザ共振器が
構成される。該共振器のパルス幅は、通常、５ピコ秒〜
２０ピコ秒であり、パルスの繰り返し周期は、通常、８
２ＭＨｚ〜０．８ＭＨｚである。

【００２１】該共振器から発せられたレーザ光の一部
が、ビームスプリッタ４によって分岐されて、ＰＩＮホ
トダイオード５に入射する。入射したレーザ光は、ＰＩ
Ｎホトダイオード５によって光電変換され、入射光と同
期したトリガ信号として、時間遅延ケーブルユニット６
を経由して、シンクロスキャンストリークカメラ１６に
送信される。時間遅延ケーブルユニット６は、該トリガ
信号と後述の蛍光信号との時間関係の調節に用いられ
る。

【００２２】一方、該共振器から発せられたレーザ光の
うちビームスプリッタ４を透過したレーザ光は、ＮＤ
（neutral density ）フィルタ７によって適当な強度に
減衰された後、パビネソレイユ補償板８によって偏光化
され、集光レンズ９によって、ＰＣＲ反応溶液が充填さ
れた試料室１０に入射する。入射したレーザ光は、蛍光
標識プライマーを含む増幅遺伝子の蛍光を励起させる励
起光として作用する。

【００２３】試料室１０から出射した蛍光は、蛍光集光
レンズ１１によって集められて平行ビームとなる。平行
化された蛍光ビームは、偏光子１２を透過することによ
って、蛍光ビームの偏光方向が励起光の偏光方向と平行
な場合と垂直な場合の二通りに分光可能となる。

【００２４】偏光子１２を透過したビームは、蛍光フォ
ーカス用レンズ１３によって、入射口側に偏光解消板１
４が設けられた分光器１５の入射スリットに集光され
る。分光器１５によって分光された蛍光は、分光器１５
の出射口を経てシンクロスキャンストリークカメラ１６
の入射スリットに結像される。なお、偏光解消板１４
は、分光器１５中の回析格子やカメラ１６の光電変換面
が有する望ましくない偏光特性をキャンセルする。

【００２５】カメラ１６によって光電変換された蛍光信
号は、時間遅延ケーブルユニット６によって時間分解さ
れる。すなわち、ユニット６からのトリガー信号が、カ
メラ１６をストリーク掃引させることによって、レーザ
光発振（励起光照射）後、予め定められた時間経過毎に
分解された蛍光信号が、それぞれ選択される。励起光照
射後の分解時間幅としては、後述の蛍光偏光解消度が１
となる時間よりも短ければ特に限定されないが、通常
は、０．１ナノ秒〜１０００ナノ秒、好ましくは１ナノ
秒〜１００ナノ秒である。

【００２６】時間分解された蛍光信号は、二次元画像
（時間−波長）としてＳＩＴ（Silicon Intensified Ta
rget) カメラ１７により撮像された後、デジタル信号と
してデータプロセッサ１８中のメモリやフロッピーディ
スク駆動装置１９中のフロッピーディスクの記憶領域に
蓄えられる。このデータは、データ処理を行うためのコ
ンピュータ２０によって演算解析され、その演算結果
は、図示しないディスプレイ、プリンタなどの出力装置
に出力される。

【００２７】蛍光偏光解消度測定装置によって求められ
る偏光解消度は、１−ｒ（ｔ）と定義される。ｒ（ｔ）
は、励起光照射後の経過時間に依存する蛍光異方性を示
し、次式で表される。ｒ（ｔ）＝｛Ｉ_W（ｔ）−Ｉ_VH（ｔ）｝／｛Ｉ_W（ｔ）
＋２Ｉ_VH（ｔ）｝但し、Ｉ_W（ｔ）は蛍光強度のうち励起偏光と同じ方向
の偏光の強度を、Ｉ_VH（ｔ）は励起偏光と垂直方向の偏
光の強度を、ｔは励起光照射後の経過時間をそれぞれ示
す。

【００２８】検出対象遺伝子は、蛍光標識されたプライ
マーに比して長鎖であるので、ＰＣＲにより増幅され、
蛍光標識プライマーを含む増幅遺伝子も、該プライマー
に比して長鎖となる。長鎖の遺伝子分子が１回転するの
に要する時間は、アニーリングしていない未反応の短鎖
プライマーのそれよりも長いので、励起光照射後、蛍光
異方性が消失するまでの時間は、該未反応プライマーよ
りも該増幅遺伝子の方が長く残存する。すなわち、ＰＣ
Ｒ反応溶液中に検出対象遺伝子が存在する場合、偏光解
消度が１となるまでの励起光照射後の経過時間は、検出
対象遺伝子が存在しない場合の経過時間よりも長くな
る。したがって、予めブランク試験を行って、偏光解消
度が１となるまでの励起光照射後の経過時間を求め、ブ
ランク試験の結果と比較することによって、ＰＣＲ反応
溶液中に検出対象遺伝子が存在するか否かを判定するこ
とができる。

【００２９】

【作用】本発明の遺伝子の検出方法によれば、蛍光色素
で標識されたプライマーを用いて、検出対象となる遺伝
子をＰＣＲにより増幅させることによって、蛍光色素で
標識されたプライマーを含む遺伝子が増幅、生成され
る。また、増幅遺伝子の塩基配列上の該蛍光色素の蛍光
を励起させ、該蛍光の偏光解消度を時間分解的に測定す
ることによって、該増幅遺伝子の分子回転運動による蛍
光異方性の消失を捉えることが可能となり、該増幅遺伝
子の有無を判定できる。したがって、ＰＣＲにより増幅
された増幅遺伝子の鋳型である検出対象遺伝子を極めて
簡便に、かつ短時間で検出することができる。

【００３０】

【実施例】以下、本発明を詳細に説明するため実施例を
挙げるが、本発明はこれら実施例によって何ら限定され
るものではない。

【００３１】実施例１プライマーの合成成人Ｔ細胞白血病ウイルス（ＨＴＬＶ−Ｉ）のプロウイ
ルス遺伝子の検出について説明する。ＨＴＬＶ−Ｉプロ
ウイルスは９０３２塩基よりなる遺伝子である。ここで
は、該プロウイルス遺伝子の塩基配列のうちｅｎｖ領域
からｐＸ領域にわたる１６２塩基対を増幅するよう一組
のプライマー、Ａ（ＴＴＣＴＣＣＴＧＣＡＧＣＡＡＣＴ
ＴＣＣＴ）およびＢ（ＧＡＡＣＧＣＧＡＧＴＧＣＣＧＣ
ＧＡＧＧ）を選択した。プライマーＢについては、Appl
ied Biosystems社の自動ＤＮＡ合成装置３８０Ｂ型を用
いて合成し、エタノール沈殿の後、ＨＰＬＣで精製して
得た。

【００３２】一方、プライマーＡについては、その合成
および５’末端へのアミノリンク（アミノ基導入試薬、
Applied Biosystems社製）の結合を上記の自動ＤＮＡ合
成装置によって行った後、エタノール沈殿した。このプ
ライマーＡに、０．５ＭのＮａＨＣＯ₃／Ｎａ₂ＣＯ₃
緩衝液（ｐＨ９．０）中にて、Ｎ−ヒドロキシサクシミ
ド化ＲＯＸ蛍光色素（以下「ＲＯＸ−ＮＨＳ」と略称す
る。Applied Biosystems社製）を反応させ、エタノール
沈殿の後、ＨＰＬＣによって精製した。このようにし
て、５’末端にＲＯＸ色素を有するプライマー（Ａ−Ｒ
ＯＸ）を得た。

【００３３】ＭＴ−１細胞からのゲノム遺伝子の抽出ＨＴＬＶ−Ｉ感染株化細胞であるＭＴ−１からＨＴＬＶ
−Ｉプロウイルス遺伝子を含むゲノム遺伝子を以下のよ
うに抽出した。７×１０⁶個のＭＴ−１細胞を含む１０
ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌと１ｍＭのＥＤＴＡとを含む緩
衝液（ｐＨ８．０）０．１ｍｌに、蛋白分解用緩衝液
（１００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣ
ｌ、２５ｍＭのＥＤＴＡ、０．５％ドデシル硫酸ナトリ
ウム、０．１ｍｇ／ｍｌプロテナーゼＫ、ｐＨ８．０）
１ｍｌを添加し、７０℃で１５分間インキュベートし
た。

【００３４】その後、ドデシル硫酸ナトリウムを含まな
い上記蛋白分解用緩衝液１ｍｌを添加し、３７℃で１６
時間さらに反応を行った。反応後の溶液からＤＮＡ以外
をまずフェノール、ついでフェノール／クロロホルム／
イソアミルアルコールの混液、さらにクロロホルム／イ
ソアミルアルコールの混液で十分に抽出し、水層を別チ
ューブに移した後、７．５Ｍの酢酸アンモニウム１／２
容と１００％エタノール２容とを添加し、遠心分離によ
ってゲノム遺伝子を得た。７０％エタノールで洗浄した
後、ペレットを乾燥し、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌと
１ｍＭのＥＤＴＡとを含む緩衝液（ｐＨ８．０）０．１
ｍｌに再溶解した。２６０ｎｍの吸収から計算したＤＮ
Ａの濃度は、１．３ｍｇ／ｍｌであった。

【００３５】ＰＣＲＰＣＲは、５ピコモルの蛍光標識プライマー（Ａ−ＲＯ
Ｘ）、１００ピコモルの未標識プライマー（Ｂ）、２．
５ｕｎｉｔのＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）
を用い、１０ｎｇのＭＴ−１ゲノム遺伝子を鋳型とし
て、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１．５ｍＭのＭｇＣ
ｌ₂、２５ｍＭのＫＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、
１００μｇ／ｍｌのＢＳＡ、および５０μＭのｄＮＴＰ
を含む反応液（ｐＨ８．３）１００μｌ中で行われた。
反応条件は、変性が９４℃で１分間、アニーリングが５
５℃で２分間、伸長が７２℃で１分間であり、これを３
５サイクル行った。一方、ブランク試験として、鋳型と
なるＭＴ−１ゲノム遺伝子を含まない溶液を用い、その
他の反応条件は上記と全く同一でＰＣＲを行った。

【００３６】時間分解蛍光偏光解消度の測定ＲＯＸ−ＮＨＳは、５７９ｎｍに吸収ピーク（分子吸光
係数は約９５，０００ｃｍ^-1・Ｍ^-1）を、６０２ｎｍに
蛍光ピークを有する。蛍光偏光解消度の測定を行う前
に、上記の二つのＰＣＲ反応液についてＲＯＸ色素の蛍
光寿命を測定した。すなわち５７０ｎｍ、１０ピコ秒の
励起光パルスを照射した後の６０２ｎｍの蛍光の減衰を
測定した。その結果、いずれの試料も単一指数関数的減
衰を示し、その寿命（励起光照射直後の強度の１／ｅと
なるまでの経過時間）は、ブランク試験液が４．６ナノ
秒、ＭＴ−１ゲノム遺伝子を含む増幅液が５．２ナノ秒
であった。すなわち未反応のプライマー上のＲＯＸ色素
と、増幅遺伝子上のＲＯＸ色素とは、ほぼ同一の蛍光寿
命を有することが確認された。

【００３７】次に、蛍光偏光解消度の測定を行った。蛍
光偏光解消度測定装置として図１に示される装置を用
い、励起光パルス幅約１０ピコ秒、繰り返し周期４ＭＨ
ｚ、励起光平均出力１００ｍＷで２０秒間行った。

【００３８】偏光解消度は、上述の通り、１−ｒ（ｔ）
と定義されるが、ここでは蛍光異方性を用いて説明す
る。表１に、ブランク試験液およびＭＴ−１ゲノム遺伝
子を含む増幅液のｒ（ｔ）の測定結果を示した。表１か
ら明らかなように、ブランク試験液では、７．７ナノ秒
の時点で蛍光異方性が消失しているのに対して、ＭＴ−
１ゲノム遺伝子を含む増幅反応液においては、１１．５
ナノ秒の時点でも約０．１１の蛍光異方性が残存してい
る。

【００３９】

【表１】

【００４０】表１の結果から、本実施例においては、時
間分解的に、すなわち励起光照射後、約１０ナノ秒の分
解時間毎に、または約１０ナノ秒を２以上の自然数で除
した分解時間毎に蛍光異方性を測定することによって、
増幅遺伝子の有無を極めて簡易に、かつ短時間で判定で
きることが判る。なお、本実施例で用いたＭＴ−１細胞
のゲノム遺伝子１０ｎｇは、約５００個のＭＴ−１細胞
に相当する。

【００４１】比較例１次に、実施例１と同じ試料を用いて、定常光による蛍光
偏光解消度を測定した。測定装置としては、日立製作所
製の蛍光分光光度計６５０−６０型を使用し、偏光特性
Ｐ＝（Ｉ_W−Ｉ_VH）／（Ｉ_W＋Ｉ_VH）を測定した。ここ
でＩ_Wは励起光の偏光面を測定蛍光偏光面と平行にした
ときの蛍光強度であり、Ｉ_VHは同じく垂直にしたときの
蛍光強度である。励起光波長、蛍光測定波長、ＨＴＬＶ
−Ｉプロウイルス遺伝子を含む増幅反応液の調製、ブラ
ンク試験液の調製などの条件は、実施例１とまったく同
一である。但し、Ｐの値は試料の濃度によって若干変化
するので、いずれの試料もＩ_Wの値が０．２付近となる
濃度で測定を行った。

【００４２】その結果、ブランク試験液およびＨＴＬＶ
−Ｉプロウイルス遺伝子を含む増幅反応液についてのＰ
値として、それぞれ０．２３５±０．０２３および０．
２５４±０．０３３という値が得られ、両者に有意差は
認められなかった。

【００４３】このように定常光蛍光偏光解消度の測定で
は、増幅されたＨＴＬＶ−Ｉプロウイルス遺伝子の分子
回転運動による蛍光異方性の消失を捉えることができ
ず、偏光特性が平均化されて測定されるので、該プロウ
イルス遺伝子とブランク試験液中の未反応プライマーと
を区別することは困難である。

【００４４】

【発明の効果】以上のように、本発明の遺伝子の検出方
法によれば、極めて容易に、かつ短時間で遺伝子を検出
することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】ピコ秒時間分解蛍光偏光解消度測定システムの
基本構成を例示する。

【符号の説明】

１：モード同期アルゴンイオンレーザ２：ＣＷ色素レーザ３：キャビティーダンパ４：ビームスプリッタ５：ＰＩＮホトダイオード６：時間遅延ケーブルユニット７：ＮＤフィルタ８：パビネソレイユ補償板９：集光レンズ１０：試料室１１：蛍光集光レンズ１２：偏光子１３：蛍光フォーカス用レンズ１４：偏光解消板１５：分光器１６：シンクロスキャンストリークカメラ１７：ＳＩＴカメラ１８：データプロセッサ１９：フロッピーディスク駆動装置２０：コンピュータ

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者辻正男岡山県倉敷市酒津2045番地の１株式会社クラレ内 (72)発明者石川満茨城県つくば市東光台５−９−２浜松ホトニクス株式会社内 (72)発明者増子正行茨城県つくば市東光台５−９−２浜松ホトニクス株式会社内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】蛍光色素で標識されたプライマーを用い
て、検出対象となる遺伝子をポリメラーゼ・チェイン・
リアクションにより増幅させた後に、増幅された遺伝子
が有する該蛍光色素の蛍光偏光解消度を時間分解的に測
定することを特徴とする遺伝子の検出方法。