JPH0716405B2 - 酵素固定化物 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は担体結合法による酵素固定化物に関し、特に、
担体と酵素の間にスペーサーを介する酵素固定化物に関
する。

［従来の技術］ 酵素は通常の化学触媒と異なり、常温、常圧といった緩
和な条件下で効率よく化学反応を触媒的に促進し、しか
も、その触媒作用特異性が非常に高いという特徴をもっ
ており、食品工業、医薬品工業、化学工業等の広い分野
にわたって利用されている。しかしながら、酵素は一般
に熱、強酸、強アルカリ、有機溶媒などに対して不安定
であって、使用条件が非常に限定されている。また、酵
素反応は酵素を水に溶かした状態で基質に作用させ、い
わゆるバッチ法（回分法）で行われるため、反応終了後
に反応液から酵素を回収し、再利用することは技術的に
非常に困難で、１反応毎に酵素を捨ててしまうという不
経済な利用法となっている。

そこで、酵素本来の特性を生かし、更に利用目的に適し
たように酵素の性質を人工的に改善しようという試みが
行われるようになった。その１つの手段として、酵素を
触媒活性をもったまま水に不溶性にする、すなわち担体
に酵素を固定化することが検討されるに至っている。

酵素を固定化する利点は酵素が安定化すること、同一の
酵素を反応に何度もつかえること、酵素を高密度化でき
ること、有機溶媒中でも酵素反応を行えることなどであ
る。

酵素の固定化方法は既に多くの方法が報告されており、
次の３つの方法に大別することができる。

担体結合法：水不溶性の担体に酵素を結合させる方
法。

架橋法：官能基を２個以上もった試薬を酵素に作用さ
せて酵素分子同士を架橋することによって固定化する方
法。

包括法：酵素を高分子ゲルマトリックス格子の中に包
み込んだり、半透膜の高分子の皮膜のマイクロカプセル
の中に封じ込める方法。

しかし、これらの方法による酵素固定化物中の酵素は、
いずれも高分子基質に対して高活性が得られず、また、
有機溶媒中の反応においては安定性は増加しているもの
の、依然として十分な安定性を得られていない。

更に、上述の問題を解決する方法として、酵素と担体の
間にスペーサーを介する方法、光架橋性樹脂プレポリマ
ーあるいはウレタンプレポリマーを用いる方法が開発さ
れた。

このうち、酵素と担体の間にスペーサーを介する方法
は、スペーサーとしてアクリル酸を用いるものであり、
この酵素固定化方法は「機能材料」９月号（1985）の13
頁に記載されている。これによると、アクリル酸をグラ
フトした綿セルロースを担体として、水溶性カルボジイ
ミド［１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピ
ル）カルボジイミド塩酸塩］を縮合剤として用い、酵素
をスペーサーに結合して酵素を固定化する方法である。

また、光架橋性樹脂プレポリマーあるいはウレタンプレ
ポリマーを用いる方法は親水性のプレポリマーと疎水性
のプレポリマーとを混合することによって、親水性−疎
水性バランスが任意の割合に調整されたゲルに酵素を固
定化するという方法であり、醗酵工学第61巻第３号153
頁（1983）に記載されている。

光架橋性樹脂プレポリマーを用いる方法では、ポリエチ
レングリコール、ヒドロキシエチルアクリレート、イソ
ホロンジイソシアナートから合成されるENT（商品名：
関西ペイント製）やポリプロピレングリコール、ヒドロ
キシエチルアクリレート、イソホロンジイソシアナート
から合成されるENTP（商品名：関西ペイント製）等に光
増感剤（ベンゾインエチルエーテル、ベンゾインイソブ
チルエーテル等）を混合し、酵素水溶液を加え、300〜4
00nmの近紫外線を照射することによって酵素が固定化さ
れている。

また、ウレタンプレポリマーを用いる方法では、ポリエ
チレングリコールあるいはポリエチレングリコールとポ
リプロピレングリコールからなる主鎖の両末端にトルエ
ンジイソシアナートを結合させたウレタンプレポリマー
を任意の割合で混合し、酵素水溶液を加えることによっ
て酵素が固定化されている。

［発明が解決しようとする課題］ このような酵素と担体の間にスペーサーとしてアクリル
酸を介する酵素固定化物、光架橋性樹脂プレポリマーあ
るいはウレタンプレポリマーを用いる酵素固定化物は従
来の酵素固定化物に比べ、酵素と担体の間にアクリル酸
を介した場合には、酵素の触媒作用を受ける基質の担体
による立体障害が少なくなり、高分子基質に対しても高
活性を得ることができるが、有機溶媒中での反応に対す
る検討がなされておらず、有機溶媒中では酵素が不安定
で、活性が低いままであった。

また、光架橋性樹脂プレポリマーあるいはウレタンプレ
ポリマーを用いた場合には、ゲルの有機溶媒に対する保
護作用、ゲルによる透過、拡散の調節等により有機溶媒
中での安定性が増し、高活性を得ることができたが、高
分子基質では酵素がゲルの網目中に存在するため、基質
が酵素近くまで到達することができないので、酵素の活
性は改善されなかった。

［課題を解決するための手段］ 本発明は酵素の触媒作用を受ける高分子基質に対して酵
素が高活性を有し、また、有機溶媒中においても酵素が
安定で、高活性を維持することができる酵素の固定化物
について鋭意研究した結果、担体結合法において、担体
と酵素の間にスペーサーを介する場合に、スペーサーと
してポリエチレングリコールを共有結合で介在させるこ
とによって高分子基質に対して酵素が担体による立体障
害を受けることなく、高活性を有し且つ有機溶媒中にお
いてもポリエチレングリコールの水分保持作用により、
酵素が安定で、高活性を維持できることを見出したもの
である。

即ち、本発明は担体と酵素の間にスペーサーを介する酵
素固定化物において、スペーサーがポリエチレングリコ
ールであることを特徴とする酵素固定化物を提供するに
ある。

［作用］ 本発明の酵素固定化物は、担体と酵素の間にスペーサー
としてポリエチレングリコールを共有結合で介在させる
ことによって、高分子基質に対して高活性を有し、ま
た、有機溶媒中においても安定で、高活性を維持するこ
とができる。

該酵素固定化物は、多孔性ガラス、多孔性セラミック、
セルロース等の担体に、カップリング剤を用いてポリエ
チレングリコールを共有結合させ、更に、そのポリエチ
レングリコール鎖の先端にカップリング剤を用いて酵素
を共有結合させるか、あるいは担体に、酵素が共有結合
しているポリエチレングリコールの鎖の先端をカップリ
ング剤を用いて共有結合させるか、あるいは活性基を有
しているポリエチレングリコールに担体と酵素を共有結
合させることによって得ることができる。

本発明の酵素固定化物に用いることができる担体はポリ
エチレングリコールとの共有結合に関与する官能基を十
分量有するものが好ましく、例えば多孔性ガラス、多孔
性セラミックス、セルロース等のいずれも使用できる。

ポリエチレングリコールは分子量200から20000まで種々
のものが市販されているが、これらのいずれも使用する
ことができる。

担体とポリエチレングリコールとを共有結合させるカッ
プリング剤については担体の種類に依存して選択する必
要があり、例えば多孔性ガラスを担体とした場合には、
シランカップリング剤であるγ−イソシアネートプロピ
ルトリエトキシシランあるいはγ−グリシドキシプロピ
ルトリメトキシシラン等を使用することができる。

上記の担体、カップリング剤、ポリエチレングリコール
を常法に従って結合させることによって担体−ポリエチ
レングリコール複合体を得ることができる。

また、ポリエチレングリコールと酵素とを共有結合させ
るカップリング剤については、酵素における結合させた
い官能基によって選択されるが、リゾープスニベウス由
来の酵素であるグルコアミラーゼ中のアミノ基に共有結
合させる場合には、例えば臭化ブロモアセチルあるいは
トリクロロ−Ｓ−トリアジン等をカップリング剤として
使用することができる。

上記の酵素、カップリング剤、担体−ポリエチレングリ
コール複合体を常法に従って共有結合させることによっ
てポリエチレングリコールを介した酵素固定化物を得る
ことができる。

なお、本発明の酵素固定化物において固定化される酵素
は特に限定されるものではなく、任意の酵素を固定化す
ることができ、例えば細菌、酵母、糸状菌、豚すい臓起
源の酵素であるリパーゼ、豚肝臓起源の酵素であるエス
テラーゼ等を固定化することができる。

［実 施 例］ 以下に実施例を挙げて本発明の酵素固定化物を更に説明
する。

実施例１ ポリエチレングリコール2000（分子量2000）0.1gをベン
ゼン2.7mlに溶解し、得られたベンゼン溶液に多孔性シ
リカガラス（エレクトローヌクレオニクス社製:CPG−1
0、表面積6.8m²/g、孔容積0.73cc/g、平均孔径2734Å、
粒径120〜200メッシュ）1000mg、γ−イソシアネートプ
ロピルトリエトキシシラン（日本ユニカー製:Y−9030）
0.3mlを添加し、十分攪拌した後、25℃で４時間静置し
た。この混合物を105℃で２時間真空乾燥し、乾燥終了
後ガラスフィルター（1G4）を用いてアセトン150mlで洗
浄過し、再度、真空乾燥し、多孔性シリカガラス−ポ
リエチレングリコール複合体（1029mg）を得た。

この多孔性シリカガラス−ポリエチレングリコール複合
体500mgをジオキサン3mlとブロモ酢酸10.0gを混合した
溶液中に加え、回転振とう器を用いて30℃、100rpmで16
時間振とう後、臭化ブロモアセチル7.5mlを加え、更に
７時間振とうし、反応させた。反応終了後、この反応物
を蒸留水１中に注加し、静置後、上澄を除去した。こ
の操作を２回反復した。得られた沈澱物をガラスフィル
ター（1G4）を用いて0.1規定炭酸ナトリウム150ml、蒸
留水150mlで洗浄過した。

次に、得られた活性化多孔性シリカガラス−ポリエチレ
ングリコール複合体をグルコアミラーゼ［グルコアミラ
ーゼ（長瀬生化学工業製：リゾープスニベウス起源、比
活性５単位/mg、分子量70000）200mg及び硫酸アンモニ
ウム2.0gをpH8.5の0.2モル濃度りん酸緩衝液10mlに溶解
して1ml当たり酵素を酵素蛋白として2.4mg含有する溶
液］5ml中に添加し、回転振とう器を用いて７℃、100rp
mで24時間振とうし、グルコアミラーゼの固定化を行っ
た。反応終了後、ガラスフィルター（1G4）を用いて0.9
％塩化ナトリウム水溶液150ml、pH5.0の0.05モル濃度マ
キルベイン緩衝液150mlで洗浄過し、固定化グルコア
ミラーゼ（酵素固定化物）を得た。

次に、この固定化グルコアモラーゼ（酵素固定化物）を
２％可溶性デンペン（高分子基質）水溶液50ml中に加
え、回転振とう器を用いて25℃、100rpmで10分間反応さ
せた。反応終了後、グルコース定量用試薬（テクニコン
社製：グルシネット試薬）を用いて生成グルコース量を
測定し、固定化グルコアミラーゼの活性を求めた。

なお、グルコアミラーゼの活性化多孔性シリカガラス−
ポリエチレングリコール複合体への固定化量は固定化反
応残液中の残存蛋白量をローリーらの方法を用いて測定
し、添加蛋白量との差として求めた。結果を第１表に示
す。

第１表の結果から、高分子基質での活性保持率が従来の
直接に酵素を担体に共有結合した酵素固定化物の場合の
５〜20％、アクリル酸をスペーサーとしグラフト綿セル
ロースを担体とした酵素固定化物の場合の20〜65％（い
ずれも酵素はグルコアミラーゼ）［参考文献：機能材料
９月号（1985年）13頁］と比較して80％と大きく、本発
明の効果が非常に大きいことが判る。

実施例２ 実施例１と同様の方法で得られた多孔性シリカガラス−
ポリエチレングリコール複合体500mgにベンゼン20ml、
無水炭酸ナトリウム1.3g、トリクロロ−Ｓ−トリアジン
75.6mgを加え、還流しながら120時間反応を行った。反
応終了後、石油エーテル150mlとベンゼン：アセトン
（1:1）溶液150mlを用いて洗浄した。この操作を３回反
復した。洗浄終了後、真空乾燥器を用いて60℃で２時間
乾燥を行った。この活性化多孔性シリカガラス−ポリエ
チレングリコール複合体をグルコアミラーゼ水溶液（グ
ルコアミラーゼ200mgをpH10.0の0.4モル濃度ホウ酸緩衝
液10mlに溶解して1ml当たり酵素を酵素蛋白として3.3mg
含有する溶液）5ml中に添加し、回転式振とう器を用い
て37℃、100rpmで１時間振とうし、グルコアミラーゼの
固定化を行い、pH8.0の0.1モル濃度ホウ酸緩衝液100ml
を加えることで反応を終了させた。反応終了後、ガラス
フィルター（1G4）を用いてpH5.0のマキルベイン緩衝液
150mlで洗浄過し、固定化グルコアミラーゼ（酵素固
定化物）を得た。固定化グルコアミラーゼの活性及び固
定化量の測定は実施例１と同様の方法で行った。結果を
第２表に示す。

第２表の結果から、活性保持率は実施例１の場合より小
さいが、前記従来法によるスペーサーとしてアクリル酸
を用いた酵素固定化物よりも大きく、本発明の効果が大
きいことが判った。

［発明の効果］ 以上のように、担体と酵素の間にスペーサーとして本発
明の特徴であるポリエチレングリコールを共有結合で介
させることによって高分子基質に対して高活性を有し、
また、有機溶媒中においても安定で、高活性を維持でき
る酵素固定化物を得ることができ、工業的に有効に利用
できる。

例えば酵素として細菌、酵母、糸状菌、豚すい臓起源の
酵素であるリパーゼ、豚肝臓起源の酵素であるエステラ
ーゼ等を用いると、各種のポリエステルの加水分解ある
いは合成を行うことができるので、高分子基質に対して
高活性を有し、有機溶媒中でも安定で、高活性を持続で
きる本発明の酵素固定化物において、酵素としてリパー
ゼ、エステラーゼ等を用いると廃棄されたポリエステル
樹脂の分解処理あるいは各種モノマーからのポリエステ
ル合成を効率的に行うことができ、工業化が可能とな
る。この時のポリエステル合成は生分解性（微生物分解
性）ポリマーの合成となるものである。また、水に不溶
で、有機溶媒に可溶な物質を基質とし、光学活性選択的
な酵素反応を利用することによって化学合成法では得ら
れない高純度な香料、色素等ファインケミカル物質を効
率的に合成でき、工業化が可能となる。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】担体と酵素の間にスペーサーを介する酵素
   固定化物において、スペーサーがポリエチレングリコー
   ルであることを特徴とする酵素固定化物。
2. 【請求項２】担体とポリエチレングリコールとの間が化
   学的に結合している請求項１記載の酵素固定化物。
3. 【請求項３】ポリエチレングリコールと酵素との間が化
   学的に結合している請求項１記載の酵素固定化物。