JPH07163362A - 新規なｄｎａ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 配列表の配列番号１〜５の塩基配列で示され
る染色体ＣＤ４０リガンド遺伝子を含むＤＮＡ断片およ
び該ＤＮＡ断片に対して相補性を有するオリゴヌクレオ
チド。 【効果】 本発明のＤＮＡ断片およびオリゴヌクレオチ
ドは、ＲＮＡの解析では困難な染色体ＣＤ４０リガンド
遺伝子の解析を可能にし、さらにＨＩＭ症候群の遺伝子
診断および遺伝子治療に利用することが可能である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はヒト染色体に由来する遺
伝子に関し、さらに詳しくはＣＤ４０リガンドをコード
するＤＮＡに関する。

【０００２】

【従来の技術および発明が解決しようとする課題】ＣＤ
４０リガンド遺伝子は、そのｃＤＮＡが1992年にHollen
baugh, D. 等〔EMBO J. 11(12)4313, 1992〕により発見
された。また、Disanto, J. P.等〔Nature361(11)541,
1993 〕およびUlf Korthauer 〔Nature 361(11)539, 19
93 〕は、本遺伝子上に点突然変異や欠失などを認め、
本遺伝子が原発性免疫不全症候群の一つであるハイパー
イムノグロブリンＭ（ＨＩＭ）症候群の発症に中心的役
割を担っていることを示唆した。本症候群は、臨床症状
として抗体産生障害、血清ＩｇＭの高値とその他の免疫
グロブリンの低値を特徴とし、感染症に繰り返し罹患す
る疾患であり、本遺伝子の解析は大いに期待されてい
る。

【０００３】しかしながら、本遺伝子についての報告は
何れもｃＤＮＡに関する報告であり、染色体ＤＮＡに関
わる報告は僅かにAruffo, A.等〔Cell 72, 291, 1993〕
による３´末端の非翻訳領域を増幅するＰＣＲ（ポリメ
ラーゼチェーンリアクション）プライマーの記載がある
にすぎず、染色体ＤＮＡのエクソン領域に関する報告は
その重要性にも関わらず未だにない。従って、従来の技
術では、検体からｍＲＮＡを抽出し、これをＤＮＡに逆
転写した上で遺伝子の解析をするよりなかった。しかも
本遺伝子のｍＲＮＡは、発現させるのにＰＨＡ（フィト
ヘマグルチニン）等で刺激する必要があり、その調製に
煩雑な操作を伴う。従って、本遺伝子の解析をより効率
的に行う方法が望まれている。

【０００４】本遺伝子の染色体ＤＮＡ塩基配列が明らか
になれば、ＰＣＲプライマーの設計が可能となり、検体
としてＲＮＡを用いず、比較的取扱いの容易な染色体Ｄ
ＮＡを用いることができる。さらに染色体ＤＮＡの解析
が可能となれば、ＲＮＡでは困難であった解析、例えば
調節領域、スプライシング部位等の解析も可能となる。
従って、本発明の目的は、染色体ＣＤ４０リガンド遺伝
子の塩基配列を決定することおよびこの配列より選択さ
れるオリゴヌクレオチドプライマーを設定することであ
る。また、本発明の目的は、それにより染色体ＤＮＡを
用いるＣＤ４０リガンド遺伝子の解析を可能にすること
にある。詳しくは、本遺伝子の染色体ＤＮＡ塩基配列を
決定し、これを利用して染色体ＤＮＡを鋳型にしたＰＣ
Ｒを可能にするオリゴヌクレオチドプライマーを設定
し、該増幅産物を解析することにより、ＣＤ４０リガン
ド遺伝子を解析する方法を提供することにある。さらに
この方法は、ＨＩＭ症候群の遺伝子診断および遺伝子治
療に利用することが可能である。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明は、後記配列表の
配列番号１〜５の塩基配列で示される染色体ＣＤ４０リ
ガンド遺伝子を含むＤＮＡ断片、および該ＤＮＡ断片に
対して相補性を有するオリゴヌクレオチド、例えば配列
番号６〜１９の塩基配列のいずれかで示されるオリゴヌ
クレオチドである。このようなオリゴヌクレオチド（プ
ライマー）は、該配列から、アミノ酸をコードしている
領域を挟むようにして選ばれる。

【０００６】本発明の遺伝子を含むＤＮＡ断片は、例え
ば以下のようにして調製される。まず、本遺伝子をスク
リーニングするためのプローブの調製は次のように行
う。末梢血よりリンパ球を分画した後、ＰＨＡで刺激
し、このリンパ球画分より常法に従ってＲＮＡを調製す
る。次に、Hollenbaugh, D. 等〔EMBO J. 1 1(12)4313,
1992〕により報告されたｃＤＮＡ塩基配列をもとに化学
合成したオリゴヌクレオチド（5'-CAGCCTGCAAGGTGAGACT
GT-3')をプライマーとして用い、上述のＲＮＡを鋳型に
して逆転写酵素によりｃＤＮＡを合成する。さらにこれ
を鋳型にして、Ulf Korthauer 〔Nature 361(11)539, 1
993 〕等が報告したプライマー（5'-GGCATGTCGACTCAGAG
TTTGAGTAAGCCA-3'；5'-GGCTAGAATTCATGATCGAAACATACAAC
C-3'）を用いてＰＣＲ〔Saiki, Science 239, 487-491,
1988 〕を行い、ＣＤ４０リガンド遺伝子のｃＤＮＡ
（スクリーニングプローブ）を増幅調製する。

【０００７】このＣＤ４０リガンド遺伝子ｃＤＮＡをプ
ローブにして、ヒトゲノミックライブラリーをコロニー
ハイブリダイゼーション法でスクリーニングすることに
より、目的のＣＤ４０リガンド遺伝子染色体ＤＮＡを得
ることができる。得られたクローンをサブクローニング
し、同じくｃＤＮＡプローブを用いてコロニーハイブリ
ダイゼーション法によるスクリーニングを繰り返すこと
によりＣＤ４０リガンド遺伝子の本ｃＤＮＡ領域を包含
するサブクローンを選択することができる。これらのサ
ブクローンよりアルカリ法〔T. Maniatis et al.: Mole
cular Cloning,1.38, Cold Spring Harbor Laboratory
(1989) 〕で組換えプラスミドを調製し、タック・ダイ
・デオキシ・ターミネーター・サイクル・シークエンス
キット（Taq Dye Deoxy Terminator Cycle Sequence ki
t)〔アプライド・バイオシステムズ（Applied Biosyste
ms）製〕を用いてジデオキシ法〔F. Sanger et al., Pr
oc. Natl. Acad. Sci. USA., 74, 5463, 1977 〕による
塩基配列の決定を行うことにより、本遺伝子を同定する
と共にエクソン及びエクソン周辺領域の塩基配列を決定
することができる。

【０００８】このようにして、アミノ酸をコードしてい
るｃＤＮＡ断片は、染色体ＤＮＡ上で５つの領域に分か
れて存在していることが見いだされる。かくして得られ
る５つの領域の塩基配列を後記配列表の配列番号１〜５
に示す。この配列番号１〜５に示される塩基配列を包含
する本発明のヒトＣＤ４０リガンド遺伝子を含むＤＮＡ
断片は、ヒトゲノミックライブラリーから分離されたヒ
トＣＤ４０リガンド遺伝子を含むＤＮＡ断片のみなら
ず、通常用いられるＤＮＡ合成装置、例えばApplied Bi
osystems社製モデル３９４を用いて合成されたものであ
ってもよい。

【０００９】さらに本発明のＤＮＡ断片は、機能を実質
的に損なわない限り配列番号１〜５に示される塩基配列
の一部の塩基が他の塩基で置換されていてもよくまたは
削除されていてもよく、あるいは新たに塩基が挿入され
ていてもよく、さらに塩基配列の一部が転位されている
ものであってもよく、これらの誘導体の何れもが本発明
の染色体ＣＤ４０リガンド遺伝子を含むＤＮＡ断片に包
含されるものである。

【００１０】さらにこのＤＮＡ断片をＰＣＲ法で増幅可
能にするオリゴヌクレオチドプライマーの設計は、配列
番号１〜５を参考にして、本遺伝子の種々の解析目的に
応じて、例えばエクソン−イントロンジャンクション領
域、アミノ酸コーディング領域、あるいは発現調節領域
等の解析が可能となるような位置に設定すれば良い。設
定方法は、DNASIS Mac（日立製作所）などによるコンピ
ューター検索を行うことでより効率的となる。

【００１１】本遺伝子を解析するためのオリゴヌクレオ
チドプライマーは、配列番号１〜５で示される二本鎖Ｄ
ＮＡ塩基配列の一部と相補性を有するものであれば如何
なるものであってもよい。このようなオリゴヌクレオチ
ドの具体例としては、例えば配列番号１を解析するため
のオリゴヌクレオチドとして、下記の配列： 5'-GCTGCAACGATTGTGCGCTC 配列番号６ 5'-CCATCATTTGGGTAGAACCA 配列番号７； 例えば配列番号２を解析するためのオリゴヌクレオチド
として、下記の配列： 5'-TTAGCTGTATTCTCCTTCCG 配列番号８ 5'-TGATGCCGTGGAAATGAATG 配列番号９ 5'-CATTGTCAGTTTCCCGATCT 配列番号１０； 例えば配列番号３を解析するためのオリゴヌクレオチド
として、下記の配列： 5'-ATGACCTCTTGCAATGCTTC 配列番号１１ 5'-GACAGATGCAAAACGACTGA 配列番号１２ 5'-TCCCTGATGCAACAACACTG 配列番号１３ 5'-GGTGTTCAATATGATCAGCC 配列番号１４； 例えば配列番号４を解析するためのオリゴヌクレオチド
として、下記の配列： 5'-CAGTTGTAGAACTGGACCAG 配列番号１５ 5'-GGGAGAGATGTCAGACCATT 配列番号１６ 5'-GGTAACATGACTTCGGCATC 配列番号１７； 例えば配列番号５を解析するためのオリゴヌクレオチド
として、下記の配列： 5'-TGTGAACCATGCTCTGCTTC 配列番号１８ 5'-CAGCCTGCAAGGTGAGACTGT 配列番号１９ などで示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプ
ライマーを挙げることができる。

【００１２】また、上記オリゴヌクレオチドプライマー
は、それ自体既知の通常用いられている核酸合成装置、
例えばApplied Biosystems社製モデル３９４ＤＮＡ合成
機を用いる固相合成により容易に製造することができ
る。さらにＰＣＲ法はSaiki 等の方法（前出）に準じて
容易に行うことができる。該増幅ＤＮＡ断片の解析方法
には特に制限はないが、制限酵素を利用する方法、ＳＳ
ＣＰ法（シングルストランド・コンホメィション・ポリ
モルフィズム）〔Orita, M. et al.: Proc. Natl. Aca
d. Sci. USA, 86, 2766-2770, 1989 〕、ＲＮＡアーゼ
プロテクション法（Ribonuclease Protection Assay Ki
t ）、ＰＣＲーＳＳＯ法（ピーシーアール・シークエン
ス・スペシフィック・オリゴヌクレオチド）〔Saiki,
R. K. et al.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 6230
-6234, 1989〕および塩基配列の決定等が好適に用いら
れる。

【００１３】次に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に
説明するが、下記の実施例は本発明について具体的な認
識を得る一助としてのみ挙げたものであり、これによっ
て本発明の範囲は何ら限定されるものではない。

【００１４】

【実施例】

《例１》 染色体ＣＤ４０リガンド遺伝子スクリーニン
グプローブの調製 １．ｍＲＮＡの調製 末梢血１０mlを採取し、２０mlのリン酸緩衝液を加えて
よく混和し、あらかじめ３mlのリンホセパールを分注し
ておいたチューブに７．５mlずつ重層し、比重遠心分離
（１５００rpm 、３０分、４℃）を行い、バフィコート
白血球画分を無菌的に分取した。この画分を、リン酸緩
衝液で洗浄後同緩衝液１mlに懸濁し、１００μg/mlスト
レプトマイシンおよび１００U/mlペニシリンを含む５０
mlのＲＰＭＩ１６４０培地（GIBCO 製）に懸濁した。そ
の後、１mlのＰＨＡ(phytohemagglutinin M form ５ml
用 GIBCO製）を加え、３７℃で７０時間培養した。遠心
分離により培地交換を行い、引き続き３７℃で４時間培
養した。培養終了後、遠心分離によりリンパ球画分を回
収し、常法〔T. Maniatis et al.: Molecular Cloning
（前出）、1.25〕に従ってＲＮＡを抽出し、０．５mgを
得た。

【００１５】２．ＣＤ４０リガンド遺伝子ｃＤＮＡの調
製 上記ＲＮＡ５μg を鋳型とし、Hollenbaugh, D. 等（前
出）の報告したｃＤＮＡ塩基配列より選択した塩基配列
（5'-CAGCCTGCAAGGTGACACTGT-3')を自動ＤＮＡ合成機
〔モデル394 、Applied Biosystems製〕で化学合成して
得たオリゴヌクレオチドをプライマーとして、ｃＤＮＡ
合成キット〔ベーリンガー マンハイムバイオケミカ
（Boehringer Mannheim Biochemica）製〕を利用してｃ
ＤＮＡを合成した。次いでこの合成液５μl を鋳型とし
て、１×緩衝液（１０mMトリス−ＨＣｌ、pH８．３、
１．５mMＭｇＣｌ₂ 、５０mMＫＣｌ、０．０１％ゼラチ
ン）、０．２mMｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣ
ＴＰ、ｄＴＴＰ）および２５pmolの各プライマー、０．
６μl （３単位）のＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Boeh
ringer Mannheim Biochemica製）の反応液組成で、全量
１００μl の系でＰＣＲを行った。尚、プライマーはUl
f Korthauer 等（前出）が報告した5'-GGCATGTCGACTCAG
AGTTTGAGTAAGCCA-3'; 5'-GGCTAGAATTCATGATCGAAACATACA
ACC-3'を用いた。増幅反応は、変性（９４℃、４０秒
間）、アニーリング（６０℃、６０秒間）、伸長（７２
℃、７０秒間）の順序で行い、これを３５サイクル繰り
返した。遺伝子増幅反応終了後、生成物を３％アガロー
スゲル電気泳動で検出したところ、約８２０bpの産物を
検出できた。この反応終了液を、等量のフェノール／ク
ロロホルム（１：１）で抽出し、エタノール沈殿した
後、１×緩衝液（５０mMトリス−ＨＣｌ、pH７．５、１
００mMＮａＣｌ、７mMＭｇＣｌ₂ 、７mMメルカプトエタ
ノール、０．０１％ＢＳＡ）中、各々３単位の制限酵素
ＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩ（Boehringer Mannheim Bio
chemica 製）を用い、３７℃で１時間消化した。この反
応終了液を等量のフェノール／クロロホルム（１：１）
で抽出し、エタノール沈殿した後、同様にＥｃｏＲＩと
ＳａｌＩで二重消化したｐＨＳＧ２９８（宝酒造製）ベ
クター（１００ng）と混ぜ、ＤＮＡライゲーションキッ
ト（宝酒造製）を用いて連結反応を行った。

【００１６】反応終了後、この反応液を用いて大腸菌
（E. Coli HB101 Competent Cell、宝酒造製）を形質転
換した。２５μg/mlカナマイシンを含むＬＢプレート上
に生じたコロニーを同組成の液体培地１．５mlに植菌
し、一晩培養した。この培養液からプラスミドを常法
〔T. Maniatis et al.: Molecular Cloning （前出）、
1.25〕に従って調製した。得られたプラスミドＤＮＡ２
００ngを、１単位のＥｃｏＲＩとＳａｌＩ（Boehringer
Mannheim Biochemica製）で二重消化し、アガロースゲ
ル電気泳動により８２０bpのｃＤＮＡ断片がｐＨＳＧ２
９８ベクターに挿入されていることを確かめた。次に、
この組換えプラスミドをアルカリ法〔T. Maniatis et a
l.: MolecularCloning （前出）、1.38〕に従って調製
し、タック・ダイ・デオキシ・ターミネーター・サイク
ル・シークエンス・キット（Applied Biosystems製）を
用いたジデオキシ法（F. Sanger et al., 前出）により
塩基配列を決定したところ、Hollenbaugh, D. 等の報告
（前出）とよく一致した。このプラスミドを、上述した
如くＥｃｏＲＩとＳａｌＩで切断し、３％アガロースゲ
ル電気泳動により８２０bpの挿入断片を分離し、常法
〔T. Maniatis et al.: Molecular Cloning （前出）、
1.25〕に従って回収し、染色体ＣＤ４０リガンド遺伝子
スクリーニングプローブとした。

【００１７】《例２》 染色体ＣＤ４０リガンド遺伝子
のクローニング 調製したＣＤ４０リガンド遺伝子スクリーニングプロー
ブを用いて、ヒトゲノミックライブラリーより染色体Ｃ
Ｄ４０リガンド遺伝子をクローニングした。ヒトゲノミ
ックライブラリーは以下のようにして調製した。染色体
ＤＮＡは正常人末梢血より調製した。すなわち、採血し
た血液に対し３倍量のＡ液（１５５mMＮＨ₄ Ｃｌ、１０
mMＫＨＣＯ₃ 、１００mMＥＤＴＡ・２Ｎａ、pH７．４）
を混ぜ合わせ、氷中に１５分間放置した後、４℃、１０
００rpmで１０分間遠心分離した。上清を除き、Ｂ液
（１００mMトリス−ＨＣｌ、１０mMＥＤＴＡ・２Ｎａ、
８mM尿素、１％ＳＤＳ、pH７．０）を加えて３０分間緩
やかに転倒混和した。フェノールとフェノール／クロロ
ホルム（１：１）で抽出精製した後、２．５倍容の冷エ
タノールを加えて染色体ＤＮＡを析出させ、この析出し
たＤＮＡをガラス棒で巻き取り回収した。このＤＮＡを
ＴＥ（１０mMトリス−ＨＣｌ、１mMＥＤＴＡ・２Ｎａ、
pH８．０）に溶解させ、染色体ＤＮＡ試料とした。

【００１８】得られた染色体ＤＮＡ１００μg を、緩衝
液（１００mMＮａＣｌ、１００mMトリス−ＨＣｌ、pH
７．５、７mMＭｇＣｌ₂ ）中、３７℃で１単位のＳａｕ
３ＡＩ（Boehringer Mannheim Biochemica製）で部分消
化し、常法〔T. Maniatis et al.: Molecular Cloning
（前出）、9.24〕に従い、ショ糖密度勾配超遠心により
４５Kb前後のサイズの消化ＤＮＡ断片を分画し、エタノ
ール沈殿により回収した。このＤＮＡ１μg を、３単位
のＴ４ ＤＮＡリガーゼ（宝酒造製）を用いて、１μg
のｐＷＥ１５コスミドベクター〔ストラタジーン（STRA
TAGENE）製〕のＢａｍＨＩ認識部位に連結させた。その
後、ギガパックII・パッケージング・エクストラクト
（GIGAPACK II PACKAGING EXTRACT ；STRATAGENE製）を
用い、上記連結反応終了液ＤＮＡのパッケージングを行
った。

【００１９】次いで、その一部を、ＴＢ培地（純水１リ
ットル中、バクトトリプトン１０g、ＮａＣｌ ５g 、
１０mMＭｇＳＯ₄ 、０．２％マルトース）で一晩培養し
た大腸菌ＮＭ５５４株に感染させ、ＮＺＹ〔ディフコ
（Difco)製〕寒天培地上にまいて３７℃で一晩培養し、
タイターの測定を行った。タイター測定の結果から算出
して、４×１０⁵ 個の形質転換株が得られるように、上
記パッケージング溶液を用いて同様に大腸菌ＮＭ５５４
株に感染させ、形質転換株のコロニーをつくらせ、コロ
ニーハイブリダイゼーション法〔T. Maniatis et al.:
Molecular Cloning （前出）、1.90〕によるスクリーニ
ングを行った。尚、プローブとしては例１で調製したス
クリーニングプローブをランダムプライマーＤＮＡラベ
リングキット（宝酒造製）で〔α−Ｐ³²〕ｄＣＴＰラベ
ルしたものを使用した。

【００２０】得られた陽性クローンを分離し、常法〔T.
Maniatis et al.: Molecular Cloning （前出）、1.2
5〕に従ってコスミドＤＮＡを抽出した。得られたコス
ミドＤＮＡ（２００ng）を緩衝液（５０mMトリス−ＨＣ
ｌ、１００mMＮａＣｌ、７mMＭｇＣｌ₂ 、pH７．５)
中、１単位のＥｃｏＲＩを用い、３７℃で２時間消化し
た。消化後、０．７％アガロースゲル電気泳動を行い、
サザンブロット法（Southern, E.: J. Mol. Biol. 98,
503, 1975 ）を用いてＤＮＡをナイロンメンブレン〔バ
イオダインＢ ＢＮＢＺＦ３ＲＴ；ポール・バイオ・サ
ポート・ディビジョン（Pall Bio Support Division ）
製〕に１６時間ブロッティングした。その後、２×ＳＳ
Ｃ溶液（０．３M ＮａＣｌ、０．０３M クエン酸三ナト
リウム）でメンブレンを洗い、ＵＶ照射することにより
ＤＮＡをメンブレンに固定した。このメンブレンをラン
ダムプライマーＤＮＡラベリングキット（宝酒造製）を
用いて〔α−Ｐ³²〕ｄＣＴＰラベルした染色体ＣＤ４０
リガンド遺伝子スクリーニングプローブを用いてサザン
ハイブリダイゼーション〔T. Maniatis et al.: Molecu
lar Cloning （前出）、1.25〕を行った。その結果、対
照として行った染色体ＤＮＡのＥｃｏＲＩ消化のサザン
ハイブリダイゼーションの結果とよく一致し、約１０K
b、２．３Kbに陽性のバンドが検出された。

【００２１】この組換えコスミドＤＮＡの制限酵素切断
地図（図１）を作成し、この地図を参考に種々の制限酵
素を用いてサブクローニングを行い、前記プローブを用
いたコロニーハイブリダイゼーションを繰り返すことに
よりサブクローンを特定化したところ、ＣＤ４０リガン
ド遺伝子のアミノ酸コーディング領域は、染色体ＤＮＡ
上で５つの領域に分かれて存在することが明らかとなっ
た。そこでアミノ酸コーディング領域を含むサブクロー
ンを選択し、塩基配列を決定した。

【００２２】塩基配列の決定は、例１と同様に行い、目
的とする染色体ＣＤ４０リガンド遺伝子を同定した。

【００２３】《例３》配列番号１〜５に示す塩基配列を
利用して、これらの塩基配列のうちアミノ酸をコードし
ている領域を挟むようにオリゴヌクレオチドプライマー
（配列番号６〜１９）を設計した。これらのオリゴヌク
レオチド（配列番号６〜１９）をプライマーにしてＰＣ
Ｒを行った。反応液組成は、染色体ＤＮＡ５０ng／μl
５μl、１×緩衝液（１０mMトリス−ＨＣｌ、pH８．
３、１．５mMＭｇＣｌ₂ 、５０mMＫＣｌ、０．０１％ゼ
ラチン）１０μl 、０．２mMｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄ
ＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ）１０μl 、２５pmol／μ
l の各プライマー１μl 、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ
（Boehringer Mannheim Biochemica製）０．６μl（３
単位）、Ｈ₂ ０ ７２．４μl で、全量１００μl の系
で行った。尚、プライマーのセットは配列番号６と７、
８と１０、９と１０、１１と１３、１１と１４、１２と
１３、１２と１４、１５と１７、１６と１７、１８と１
９であり、増幅反応は、変性（９４℃、３０秒間）、ア
ニーリング（５５℃、３０秒間）、伸長（７２℃、６０
秒間）の順序で行い、これを４０サイクル繰り返した。
遺伝子増幅反応終了後、生成物を３％アガロースゲル電
気泳動で検出したところ、それぞれ約３５１bp、２６３
bp、２９８bp、１８４bp、１６３bp、２３８bp、２１７
bp、２１０bp、２７６bp、４５１bpの産物を検出でき
た。各増幅産物５００ngを、５０mMトリス−ＨＣｌ、pH
８．０、１０mMＭｇＣｌ₂ 、２mMＡＴＰ、１０ＵＴ４ポ
リヌクレオチドキナーゼの反応液中、３７℃で１時間反
応させた。反応終了液を等量のフェノール／クロロホル
ム（１：１）で抽出し、エタノール沈殿した後、ＤＮＡ
ライゲーションキットを用いて、制限酵素ＳｍａＩ消化
したｐＵＣ１９（宝酒造製）１００ngに連結させた。こ
の５つのライゲーション反応物を用いて、それぞれ大腸
菌（E. coli HB101 Competent Cell；宝酒造製）を形質
転換させた。形質転換株の単離・確認後、例１と同様に
塩基配列を決定したところ、配列番号１〜５と一致し
た。

【００２４】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：６２０ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類:Genomic DNA 起源 生物名：ヒト 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：１６４〜３１９ 特徴を決定した方法：Ｅ TTTGCTGGGA GAGAAGACTA CGAAGCACAT TTTCCAGGAA GTGTGGGCTG CAACGATTGT 60 GCGCTCTTAA CTAATCCTGA GTAAGGTGGC CACTTTGACA GTCTTCTCAT GCTGCCTCTG 120 CCACCTTCTC TGCCAGAAGA TACCATTTCA ACTTTAACAC AGC ATG ATC GAA ACA 175 Met Ile Glu Thr 1 TAC AAC CAA ACT TCT CCC CGA TCT GCG GCC ACT GGA CTG CCC ATC AGC 223 Tyr Asn Gln Thr Ser Pro Arg Ser Ala Ala Thr Gly Leu Pro Ile Ser 5 10 15 20 ATG AAA ATT TTT ATG TAT TTA CTT ACT GTT TTT CTT ATC ACC CAG ATG 271 Met Lys Ile Phe Met Tyr Leu Leu Thr Val Phe Leu Ile Thr Gln Met 25 30 35 ATT GGG TCA GCA CTT TTT GCT GTG TAT CTT CAT AGA AGG CTG GAC AAG A 320 Ile Gly Ser Ala Leu Phe Ala Val Tyr Leu His Arg Arg Leu Asp Lys 40 45 50 TAAGATGAAC CACAAGCCTT TATTAACTAA ATTTGGGGTC CTTACTAATT CATAGGTTGG 380 TTCTACCCAA ATGATGGATG ATGGTAGAAA CCAAATAGAA GAATGGTCTT GTGGCATAAT 440 GTTTGTTCCC TAGTCAATGA ACTCTCATAT TCTTGTCTCT GGTTAGGATC TTGGGATCTG 500 GAGTCAGACT GCCTGGGCTC AAATCTTGGC TCTGCCCATA CCATCTCTGT TATCCTGGGG 560 CAAGTGCCTC AGTTTCCACA TCTGAGAAAT GGGGATGGTA GTGGTGTCCA TTTCATAGAT 620

【００２５】配列番号：２ 配列の長さ：１１１４ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類:Genomic DNA 起源 生物名：ヒト 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：３７５〜５０５ 特徴を決定した方法：Ｅ CTGCAGAAAA CTATTTTCTA GGCTGATGTT TATAATGACC AATCATTACT GAAGCAATGA 60 GAAATGTGAC AATTACAGAA TATTGCTGCT ATAGTATGTT GAAAAAATAT GCATTTTGTA 120 GTGAACATTT AGTAGAATAG CTCTGATTTC TACCTGGAGT TTCTGATAAC ATGACATCTT 180 AATTGCTGTC TTTTATAGAT TTTTAAACTG CAAATACAAA ATAGCAATCA GCCAATATAA 240 TAACTTATTA TTCTCCATTT ATGCCTGAAA GTCCTCCTCT TGTTGATGCC GTGGAAATGA 300 ATGTAGAGGC AGATATCATT AGCTGTATTC TCCTTCCGAA TGACATTTAT CATATCCTTG 360 TTATTCCAAA ATAG ATA GAA GAT GAA AGG AAT CTT CAT GAA GAT TTT GTA 410 Ile Glu Asp Glu Arg Asn Leu His Glu Asp Phe Val 1 5 10 TTC ATG AAA ACG ATA CAG AGA TGC AAC ACA GGA GAA AGA TCC TTA TCC 458 Phe Met Lys Thr Ile Gln Arg Cys Asn Thr Gly Glu Arg Ser Leu Ser 15 20 25 TTA CTG AAC TGT GAG GAG ATT AAA AGC CAG TTT GAA GGC TTT GTG AAG 506 Leu Leu Asn Cys Glu Glu Ile Lys Ser Gln Phe Glu Gly Phe Val Lys 30 35 40 GTAAGCAGCT TAATTACTGG TAAAAGTGTC ATTGAAATAT TTTACTACAT TTGCTAGATC 566 GGGAAACTGA CAATGCCAAT GTTTAAAGAT TGGTTATAGA CACAGACACA CAGACACACA 626 CACACATATA TATGCATGCA GATATACACA CATACATGGG TGTGTGTGTG GGGGTTAAAA 686 AAAAAAAACA CAAAGACACT CTCTGGGGAA AATACACCCT TAGGGGCACA CTCACACATA 746 TTTGTCAGCT TACATATGCA GCTACCACTA GGCAAAATGA TGAAGTCCAC CAAGCTTGGT 806 TTTCGCATTG CTGTGTCTCC CCATCCAAAC CTTGATGCTC TCGCACTGGG GACCCAGAGT 866 CTGATCCCCA TTTCCCAGGG AAGCAATAGC CGTCAACAGC TGCCGTGGCA GCAGGCCACA 926 AGTGAAGGGA CACCTGAAGA CTGGTAACAG TCTCTGGTGC TTCTCTGATG ATGGAATTTT 986 AGGTGTCCTG ACAGTGAGAT CTTTCCCTTT TACTGGGGAG AGAGGTGCAG GGAATAAGTA 1046 ATAGACATTC TCAGTGTCGC TCAAACCAGA CTCCATATAA TATCACTTGC TCATGAAGCC 1106 CGCCCACT 1114

【００２６】配列番号：３ 配列の長さ：７０９ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類:Genomic DNA 起源 生物名：ヒト 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：３１７〜３７４ 特徴を決定した方法：Ｅ TCAAAGCCAA GGAGGTTGAG GTCATAGGAA GGGTCAGGAT CACAGCCTCT GGTCTGGAGA 60 GAGCACTGGA ATGGAGATAA TAAGGCCTGG ATTTTACTTC CAGATTCTCC CCTGGGCTTT 120 CTGGGTTGTT GGCTCATCTG TCAGATCCAT GGACTCCCAA TTGGCATGAT GGAATTAATG 180 ACAGGATCTG AGTCTATATG ATAATCCTCA CCAGAAACAG ACAACAGAGT AATGACAGAT 240 GCAAAACGAC TGATATTTTA AAACCCCACA GCAGAGCCCC TGTCAAAATG ACCTCTTGCA 300 ATGCTTCTTA TTTTAG GAT ATA ATG TTA AAC AAA GAG GAG ACG AAG AAA GAA 352 Asp Ile Met Leu Asn Lys Glu Glu Thr Lys Lys Glu 1 5 10 AAC AGC TTT GAA ATG CAA AAA G GTAGGTTTGC TATTTGCTAA TTTCTATGAA 404 Asn Ser Phe Glu Met Gln Lys 15 TGCCTAAAAA CTAAAAGGAA GCTTTAGGCT GATCATATTG AACACCCCAG TGTTGTTGCA 464 TCAGGGAAAC TTTTAGCCCT GGAAATAAAA CAGGAACACA ATTGTCAAAT TGACACCTTC 524 TCTGGTCCCT GTGATTTGGA AAGACTTTGT ACATATATAT TTATGAAAAA AGGATGTGTT 584 CCTTTAATGC CGATGATACC AAATCTGAAG AAATCCCATT ATGTTCAATA CCTTAATAGA 644 AGCAACCATA CAGGCTGATA CCACCTACAG TGGAATAAGA AGACAGGAAA GTCATCATTT 704 GGTAA 709

【００２７】配列番号：４ 配列の長さ：４５３ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類:Genomic DNA 起源 生物名：ヒト 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：２２６〜２８８ 特徴を決定した方法：Ｅ GATCAACTGT TAGGAGAATG AGACCGATGG AAACAGCCAA TTCAATTACT CAGATATTAG 60 AAACCAACTT TTCCTTCAGT GGGAGAGATG TCAGACCATT TTATCTTTCC TTTTATATAA 120 TCTATTTTTG CACAGTCTCT ATTACACAGT TGTAGAACTG GACCAGATAG TTTTGTGGGC 180 AGTTTTTGCA TTATTTTAGC CTGACAGTTT TTGGTTCCAT TTCAG GT GAT CAG 233 Gly ASp Gln 1 AAT CCT CAA ATT GCG GCA CAT GTC ATA AGT GAG GCC AGC AGT AAA ACA 281 Asn Pro Gln Ile Ala Ala His Val Ile Ser Glu Ala Ser Ser Lys Thr 5 10 15 ACA TCT G GTAAGTCACA CAGCATCTGA GCGGTAGCCA CCCAAGGGGA AAGGCTGGGA 338 Thr Ser 20 TGCCGAAGTC ATGTTACCTA ATGGTTAAAC TCCTCTTTTC CCCTGGGACC CAATTTACAA 398 ACCTACCCCC TACACTTCTC CTATTCCCTT CTTTGTCTTC AAAAGTGAGT TCAAA 453

【００２８】配列番号：５ 配列の長さ：９１１ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類:Genomic DNA 起源 生物名：ヒト 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：２３８〜６４４ 特徴を決定した方法：Ｅ ATATGAGCCC CGTGTTGCAG ATGAGGAACT GAAGCTCATG GAGATTTAGA GACTTGCCCA 60 AGCTTAAATA GAGCCTAGAT TGGAACATGG CTCTGTCTGA CTCTGAAGCC CATGGAAGGG 120 GCCTTGAGAA TCCATCCCTA TACAAAGCCA ATATCCAACA TTAAACTATA TTTTTTGTCA 180 GAATGTGAAC CATGCTCTGC TTCACCTCAC CACAAACTTT CCCTTTCTTT GTAACAG TG 239 Val 1 TTA CAG TGG GCT GAA AAA GGA TAC TAC ACC ATG AGC AAC AAC TTG GTA 287 Leu Gln Trp Ala Glu Lys Gly Tyr Tyr Thr Met Ser Asn Asn Leu Val 5 10 15 ACC CTG GAA AAT GGG AAA CAG CTG ACC GTT AAA AGA CAA GGA CTC TAT 335 Thr Leu Glu Asn Gly Lys Gln Leu Thr Val Lys Arg Gln Gly Leu Tyr 20 25 30 TAT ATC TAT GCC CAA GTC ACC TTC TGT TCC AAT CGG GAA GCT TCG AGT 383 Tyr Ile Tyr Ala Gln Val Thr Phe Cys Ser Asn Arg Glu Ala Ser Ser 35 40 45 CAA GCT CCA TTT ATA GCC AGC CTC TGC CTA AAG TCC CCC GGT AGA TTC 431 Gln Ala Pro Phe Ile Ala Ser Leu Cys Leu Lys Ser Pro Gly Arg Phe 50 55 60 65 GAG AGA ATC TTA CTC AGA GCT GCA AAT ACC CAC AGT TCC GCC AAA CCT 479 Glu Arg Ile Leu Leu Arg Ala Ala Asn Thr His Ser Ser Ala Lys Pro 70 75 80 TGC GGG CAA CAA TCC ATT CAC TTG GGA GGA GTA TTT GAA TTG CAA CCA 527 Cys Gly Gln Gln Ser Ile His Leu Gly Gly Val Phe Glu Leu Gln Pro 85 90 95 GGT GCT TCG GTG TTT GTC AAT GTG ACT GAT CCA AGC CAA GTG AGC CAT 575 Gly Ala Ser Val Phe Val Asn Val Thr Asp Pro Ser Gln Val Ser His 100 105 110 GGC ACT GGC TTC ACG TCC TTT GGC TTA CTC AAA CTC TGA ACAGTGTCAC 624 Gly Thr Gly Phe Thr Ser Phe Gly Leu Leu Lys Leu 115 120 125 CTTGCAGGCT GTGGTGGAGC TGACGCTGGG AGTCTTCATA ATACAGCACA GCGGTTAAGC 684 CCACCCCCTG TTAACTGCCT ATTTATAACC CTAGGATCCT CCTTATGGAG AACTATTTAT 744 TATACACTCC AAGGCATGTA GAACTGTAAT AAGTGAATTA CAGGTCACAT GAAACCAAAA 804 CGGGCCCTGC TCCATAAGAG CTTATATATC TGAAGCAGCA ACCCCACTGA TGCAGACATC 864 CAGAGAGTCC TATGAAAAGA CAAGGCCATT ATGCACAGGT TGAATTC 911

【００２９】配列番号 ：６ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GCTGCAACGA TTGTGCGCTC

【００３０】配列番号 ：７ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CCATCATTTG GGTAGAACCA

【００３１】配列番号 ：８ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TTAGCTGTAT TCTCCTTCCG

【００３２】配列番号 ：９ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TGATGCCGTG GAAATGAATG

【００３３】配列番号 ：１０ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CATTGTCAGT TTCCCGATCT

【００３４】配列番号 ：１１ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ATGACCTCTT GCAATGCTTC

【００３５】配列番号 ：１２ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GACAGATGCA AAACGACTGA

【００３６】配列番号 ：１３ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TCCCTGATGC AACAACACTG

【００３７】配列番号 ：１４ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ＧＧＴＧＴＴＣＡＡＴ ＡＴＧＡＴＣＡＧＣＣ

【００３８】配列番号 ：１５ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CAGTTGTAGA ACTGGACCAG

【００３９】配列番号 ：１６ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GGGAGAGATG TCAGACCATT

【００４０】配列番号 ：１７ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GGTAACATGA CTTCGGCATC

【００４１】配列番号 ：１８ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TGTGAACCAT GCTCTGCTTC

【００４２】配列番号 ：１９ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CAGCCTGCAA GGTGAGACTG T

【図面の簡単な説明】

【図１】染色体ＣＤ４０リガンド遺伝子を含むＤＮＡ断
片の制限酵素切断地図。

─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【提出日】平成６年１１月４日

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００１１

【補正方法】変更

【補正内容】

【００１１】本遺伝子を解析するためのオリゴヌクレオ
チドプライマーは、配列番号１〜５で示される二本鎖Ｄ
ＮＡ塩基配列の一部と相補性を有するものであれば如何
なるものであってもよい。このようなオリゴヌクレオチ
ドの具体例としては、例えば配列番号１を解析するため
のオリゴヌクレオチドとして、下記の配列： 5'-GCTGCAACGATTGTGCGCTC 配列番号６ 5'-CCATCATTTGGGTAGAACCA 配列番号７； 例えば配列番号２を解析するためのオリゴヌクレオチド
として、下記の配列： 5'-TTAGCTGTATTCTCCTTCCG 配列番号８ 5'-TGATGCCGTGGAAATGAATG 配列番号９ 5'-CATTGTCAGTTTCCCGATCT 配列番号１０； 例えば配列番号３を解析するためのオリゴヌクレオチド
として、下記の配列： 5'-ATGACCTCTTGCAATGCTTC 配列番号１１ 5'-GACAGATGCAAAACGACTGA 配列番号１２ 5'-TCCCTGATGCAACAACACTG 配列番号１３ 5'-GTTGTTCAATATGATCAGCC 配列番号１４； 例えば配列番号４を解析するためのオリゴヌクレオチド
として、下記の配列： 5'-CAGTTGTAGAACTGGACCAG 配列番号１５ 5'-GGGAGAGATGTCAGACCATT 配列番号１６ 5'-GGTAACATGACTTCGGCATC 配列番号１７； 例えば配列番号５を解析するためのオリゴヌクレオチド
として、下記の配列： 5'-TGTGAACCATGCTCTGCTTC 配列番号１８ 5'-CAGCCTGCAAGGTGACACTGT 配列番号１９ などで示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプ
ライマーを挙げることができる。

【手続補正２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００２２

【補正方法】変更

【補正内容】

【００２２】塩基配列の決定は、例１と同様に行い、目
的とする染色体ＣＤ４０リガンド遺伝子を同定した。そ
れらの配列を、配 列番号１〜５に示す。

【手続補正３】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００２４

【補正方法】変更

【補正内容】

【００２４】

【配列表】 配列番号：１ 配列の長さ：６２０ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類:Genomic DNA 起源 生物名：ヒト 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：１６４〜３１９ 特徴を決定した方法：Ｅ TTTGCTGGGA GAGAAGACTA CGAAGCACAT TTTCCAGGAA GTGTGGGCTG CAACGATTGT 60 GCGCTCTTAA CTAATCCTGA GTAAGGTGGC CACTTTGACA GTCTTCTCAT GCTGCCTCTG 120 CCACCTTCTC TGCCAGAAGA TACCATTTCA ACTTTAACAC AGC ATG ATC GAA ACA 175 Met Ile Glu Thr 1 TAC AAC CAA ACT TCT CCC CGA TCT GCG GCC ACT GGA CTG CCC ATC AGC 223 Tyr Asn Gln Thr Ser Pro Arg Ser Ala Ala Thr Gly Leu Pro Ile Ser 5 10 15 20 ATG AAA ATT TTT ATG TAT TTA CTT ACT GTT TTT CTT ATC ACC CAG ATG 271 Met Lys Ile Phe Met Tyr Leu Leu Thr Val Phe Leu Ile Thr Gln Met 25 30 35 ATT GGG TCA GCA CTT TTT GCT GTG TAT CTT CAT AGA AGG CTG GAC AAG G 320 Ile Gly Ser Ala Leu Phe Ala Val Tyr Leu His Arg Arg Leu Asp Lys 40 45 50 TAAGATGAAC CACAAGCCTT TATTAACTAA ATTTGGGGTC CTTACTAATT CATAGGTTGG 380 TTCTACCCAA ATGATGGATG ATGGTAGAAA CCAAATAGAA GAATGGTCTT GTGGCATAAT 440 GTTTGTTCCC TAGTCAATGA ACTCTCATAT TCTTGTCTCT GGTTAGGATC TTGGGATCTG 500 GAGTCAGACT GCCTGGGCTC AAATCTTGGC TCTGCCCATA CCATCTCTGT TATCCTGGGG 560 CAAGTGCCTC AGTTTCCACA TCTGAGAAAT GGGGATGGTA GTGGTGTCCA TTTCATAGAT 620

【手続補正４】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００２５

【補正方法】変更

【補正内容】

【００２５】配列番号：２ 配列の長さ：１１１４ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：ヒト 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：３７５〜５０６ 特徴を決定した方法：Ｅ CTGCAGAAAA CTATTTTCTA GGCTGATGTT TATAATGACC AATCATTACT GAAGCAATGA 60 GAAATGTGAC AATTACAGAA TATTGCTGCT ATAGTATGTT GAAAAAATAT GCATTTTGTA 120 GTGAACATTT AGTAGAATAG CTCTGATTTC TACCTGGAGT TTCTGATAAC ATGACATCTT 180 AATTGCTGTC TTTTATAGAT TTTTAAACTG CAAATACAAA ATAGCAATCA GCCAATATAA 240 TAACTTATTA TTCTCCATTT ATGCCTGAAA GTCCTCCTCT TGTTGATGCC GTGGAAATGA 300 ATGTAGAGGC AGATATCATT AGCTGTATTC TCCTTCCGAA TGACATTTAT CATATCCTTG 360 TTATTCCAAA ATAG ATA GAA GAT GAA AGG AAT CTT CAT GAA GAT TTT GTA 410 Ile Glu Asp Glu Arg Asn Leu His Glu Asp Phe Val 1 5 10 TTC ATG AAA ACG ATA CAG AGA TGC AAC ACA GGA GAA AGA TCC TTA TCC 458 Phe Met Lys Thr Ile Gln Arg Cys Asn Thr Gly Glu Arg Ser Leu Ser 15 20 25 TTA CTG AAC TGT GAG GAG ATT AAA AGC CAG TTT GAA GGC TTT GTG AAG 506 Leu Leu Asn Cys Glu Glu Ile Lys Ser Gln Phe Glu Gly Phe Val Lys 30 35 40 GTAAGCAGCT TAATTACTGG TAAAAGTGTC ATTGAAATAT TTTACTACAT TTGCTAGATC 566 GGGAAACTGA CAATGCCAAT GTTTAAAGAT TGGTTATAGA CACAGACACA CAGACACACA 626 CACACATATA TATGCATGCA GATATACACA CATACATGGG TGTGTGTGTG GGGGTTAAAA 686 AAAAAAAACA CAAAGACACT CTCTGGGGAA AATACACCCT TAGGGGCACA CTCACACATA 746 TTTGTCAGCT TACATATGCA GCTACCACTA GGCAAAATGA TGAAGTCCAC CAAGCTTGGT 806 TTTCGCATTG CTGTGTCTCC CCATCCAAAC CTTGATGCTC TCGCACTGGG GACCCAGAGT 866 CTGATCCCCA TTTCCCAGGG AAGCAATAGC CGTCAACAGC TGCCGTGGCA GCAGGCCACA 926 AGTGAAGGGA CACCTGAAGA CTGGTAACAG TCTCTGGTGC TTCTCTGATG ATGGAATTTT 986 AGGTGTCCTG ACAGTGAGAT CTTTCCCTTT TACTGGGGAG AGAGGTGCAG GGAATAAGTA 1046 ATAGACATTC TCAGTGTCGC TCAAACCAGA CTCCATATAA TATCACTTGC TCATGAAGCC 1106 CGCCCACT 1114

【手続補正５】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００２６

【補正方法】変更

【補正内容】

【００２６】配列番号：３ 配列の長さ：７０９ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：ヒト 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：３１７〜３７４ 特徴を決定した方法：Ｅ TCAAAGCCAA GGAGGTTGAG GTCATAGGAA GGGTCAGGAT CACAGCCTCT GGTCTGGAGA 60 GAGCACTGGA ATGGAGATAA TAAGGCCTGG ATTTTACTTC CAGATTCTCC CCTGGGCTTT 120 CTGGGTTGTT GGCTCATCTG TCAGATCCAT GGACTCCCAA TTGGCATGAT GGAATTAATG 180 ACAGGATCTG AGTCTATATG ATAATCCTCA CCAGAAACAG ACAACAGAGT AATGACAGAT 240 GCAAAACGAC TGATATTTTA AAACCCCACA GCAGAGCCCC TGTCAAAATG ACCTCTTGCA 300 ATGCTTCTTA TTTTAG GAT ATA ATG TTA AAC AAA GAG GAG ACG AAG AAA GAA 352 Asp Ile Met Leu Asn Lys Glu Glu Thr Lys Lys Glu 1 5 10 AAC AGC TTT GAA ATG CAA AAA G GTAGGTTTGC TATTTGCTAA TTTCTATGAA 404 Asn Ser Phe Glu Met Gln Lys 15 TGCCTAAAAA CTAAAAGGAA GCTTTAGGCT GATCATATTG AACAACCCAG TGTTGTTGCA 464 TCAGGGAAAC TTTTAGCCCT GGAAATAAAA CAGGAACACA ATTGTCAAAT TGACACCTTC 524 TCTGGTCCCT GTGATTTGGA AAGACTTTGT ACATATATAT TTATGAAAAA AGGATGTGTT 584 CCTTTAATGC CGATGATACC AAATCTGAAG AAATCCCATT ATGTTCAATA CCTTAATAGA 644 AGCAACCATA CAGGCTGATA CCACCTACAG TGGAATAAGA AGACAGGAAA GTCATCATTT 704 GGTAA 709

【手続補正６】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００２７

【補正方法】変更

【補正内容】

【００２７】配列番号：４ 配列の長さ：４５３ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：ヒト 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：２２６〜２８８ 特徴を決定した方法：Ｅ GATCAACTGT TAGGAGAATG AGACCGATGG AAACAGCCAA TTCAATTACT CAGATATTAG 60 AAACCAACTT TTCCTTCAGT GGGAGAGATG TCAGACCATT TTATCTTTCC TTTTATATAA 120 TCTATTTTTG CACAGTCTCT ATTACACAGT TGTAGAACTG GACCAGATAG TTTTGTGGGC 180 AGTTTTTGCA TTATTTTAGC CTGACAGTTT TTGGTTCCAT TTCAG GT GAT CAG 233 Gly Asp Gln 1 AAT CCT CAA ATT GCG GCA CAT GTC ATA AGT GAG GCC AGC AGT AAA ACA 281 Asn Pro Gln Ile Ala Ala His Val Ile Ser Glu Ala Ser Ser Lys Thr 5 10 15 ACA TCT G GTAAGTCACA CAGCATCTGA GCGGTAGCCA CCCAAGGGGA AAGGCTGGGA 338 Thr Ser 20 TGCCGAAGTC ATGTTACCTA ATGGTTAAAC TCCTCTTTTC CCCTGGGACC CAATTTACAA 398 ACCTACCCCC TACACTTCTC CTATTCCCTT CTTTGTCTTC AAAAGTGAGT TCAAA 453

【手続補正７】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００２８

【補正方法】変更

【補正内容】

【００２８】配列番号：５ 配列の長さ：９１１ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：ヒト 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：２３８〜６１４ 特徴を決定した方法：Ｅ ATATGAGCCC CGTGTTGCAG ATGAGGAACT GAAGCTCATG GAGATTTAGA GACTTGCCCA 60 AGCTTAAATA GAGCCTAGAT TGGAACATGG CTCTGTCTGA CTCTGAAGCC CATGGAAGGG 120 GCCTTGAGAA TCCATCCCTA TACAAAGCCA ATATCCAACA TTAAACTATA TTTTTTGTCA 180 GAATGTGAAC CATGCTCTGC TTCACCTCAC CACAAACTTT CCCTTTCTTT GTAACAG TG 239 Val 1 TTA CAG TGG GCT GAA AAA GGA TAC TAC ACC ATG AGC AAC AAC TTG GTA 287 Leu Gln Trp Ala Glu Lys Gly Tyr Tyr Thr Met Ser Asn Asn Leu Val 5 10 15 ACC CTG GAA AAT GGG AAA CAG CTG ACC GTT AAA AGA CAA GGA CTC TAT 335 Thr Leu Glu Asn Gly Lys Gln Leu Thr Val Lys Arg Gln Gly Leu Tyr 20 25 30 TAT ATC TAT GCC CAA GTC ACC TTC TGT TCC AAT CGG GAA GCT TCG AGT 383 Tyr Ile Tyr Ala Gln Val Thr Phe Cys Ser Asn Arg Glu Ala Ser Ser 35 40 45 CAA GCT CCA TTT ATA GCC AGC CTC TGC CTA AAG TCC CCC GGT AGA TTC 431 Gln Ala Pro Phe Ile Ala Ser Leu Cys Leu Lys Ser Pro Gly Arg Phe 50 55 60 65 GAG AGA ATC TTA CTC AGA GCT GCA AAT ACC CAC AGT TCC GCC AAA CCT 479 Glu Arg Ile Leu Leu Arg Ala Ala Asn Thr His Ser Ser Ala Lys Pro 70 75 80 TGC GGG CAA CAA TCC ATT CAC TTG GGA GGA GTA TTT GAA TTG CAA CCA 527 Cys Gly Gln Gln Ser Ile His Leu Gly Gly Val Phe Glu Leu Gln Pro 85 90 95 GGT GCT TCG GTG TTT GTC AAT GTG ACT GAT CCA AGC CAA GTG AGC CAT 575 Gly Ala Ser Val Phe Val Asn Val Thr Asp Pro Ser Gln Val Ser His 100 105 110 GGC ACT GGC TTC ACG TCC TTT GGC TTA CTC AAA CTC TGA ACAGTGTCAC 624 Gly Thr Gly Phe Thr Ser Phe Gly Leu Leu Lys Leu 115 120 125 CTTGCAGGCT GTGGTGGAGC TGACGCTGGG AGTCTTCATA ATACAGCACA GCGGTTAAGC 684 CCACCCCCTG TTAACTGCCT ATTTATAACC CTAGGATCCT CCTTATGGAG AACTATTTAT 744 TATACACTCC AAGGCATGTA GAACTGTAAT AAGTGAATTA CAGGTCACAT GAAACCAAAA 804 CGGGCCCTGC TCCATAAGAG CTTATATATC TGAAGCAGCA ACCCCACTGA TGCAGACATC 864 CAGAGAGTCC TATGAAAAGA CAAGGCCATT ATGCACAGGT TGAATTC 911

【手続補正８】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００３７

【補正方法】変更

【補正内容】

【００３７】配列番号 ：１４ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GTTGTTCAAT ATGATCAGCC

【手続補正９】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００４２

【補正方法】変更

【補正内容】

【００４２】配列番号 ：１９ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CAGCCTGCAA GGTGACACTG T

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 清水 昭一 東京都板橋区志村３−30−１ 株式会社三 菱油化ビーシーエル内

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列表の配列番号１〜５の塩基配列で示
   される染色体ＣＤ４０リガンド遺伝子を含むＤＮＡ断
   片。
2. 【請求項２】 染色体ＣＤ４０リガンド遺伝子を含むＤ
   ＮＡ断片の塩基配列の解析を可能にするような配列番号
   １〜５に示す二本鎖ＤＮＡ断片に対して相補性を有する
   オリゴヌクレオチド。
3. 【請求項３】 配列表の配列番号６〜１９の塩基配列の
   いずれかで示される請求項２のオリゴヌクレオチド。