JPH0681A - ランゲルハンス島の分離用器具 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 膵臓組織片懸濁液を導入する管状体を有する
遠心分離用軟質容器と、該遠心分離用軟質容器と比重液
流通手段を介して連結する少なくとも１つの比重液用軟
質容器よりなるランゲルハンス島の分離用器具。 【効果】 容易にしかも無菌的にランゲルハンス島が分
離できる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、糖尿病の研究及び治療
に用いるランゲルハンス島の分離用の器具に関するもの
である。

【０００２】

【従来の技術】膵臓のランゲルハンス島（以下ラ島）
は、インスリン等のホルモンを分泌する内分泌細胞の集
団であり、膵臓全体重量の１〜２％を占めている。糖尿
病は、ラ島が障害され、インスリンの絶対的または相対
的欠損によって糖を中心とした代謝過程に異常を生じた
病気である。糖尿病の治療を目的として、血糖値に応じ
たインスリンを投与する人工膵臓の開発が試みられてい
るが、常に変化している血糖値を長期にセンシングし
て、適応量のインスリンを正確に投与できるシステムに
は未だ困難を残している。一方、近年、糖尿病の根本的
治療として膵臓移植の研究が盛んに行われている。移植
の成功率は年々向上しているが、免疫学的拒絶反応や膵
臓保存等の問題が残されており、実験的治療の段階であ
る。

【０００３】そこで、インスリンを合成分泌するラ島と
人工物とをハイブリット化したものを移植する研究が行
われている。ハイブリット化したラ島の移植では、膵臓
移植のような大手術を行う必要がなく、副作用を有する
免疫抑制を使用せずに拒絶反応を防ぐことができ、ま
た、不必要な外分泌細胞の移植を排除することができる
など、多くの利点があり、糖尿病の根本的治療として期
待されている。

【０００４】ところで、ラ島は、膵臓の中で外分泌細
胞、血管、膵管、結合組織と複雑に入り組んで存在して
おり、特にその形状が複雑な中、大動物では、ラ島を、
そのインスリン分泌能を保持させたまま、高収率かつ高
純度で回収することが、きわめて困難である。このた
め、酵素処理の程度を調製して、結合組織や外分泌細胞
を除去するためにベルクロ（Ｖｅｌｃｒｏ：登録商標）
を用いる方法（レイシー．ピー．イーら（Ｌａｃｙ，
Ｐ．Ｅ．，ｅｔ ａｌ．），ダイアベティス（Ｄｉａｂ
ｅｔｅｓ），３１，Ｓｕｐｐｌ．４，１０９−１１１，
１９８２）、ローラーで物理的に分離して濾過する方法
（特開昭６２−２６５９８１号）、酵素液で膵臓を膨張
させた後に切断してスクリーンで濾過する方法（特開昭
６１−１８３２２６号）等の提案がなされている。

【０００５】これらの方法はいずれも、得られた膵臓組
織懸濁液から最終的には、密度勾配遠心法によってラ島
分画を得ている。

【０００６】従来、密度勾配遠心法では硬質の遠沈管が
用いられているが、特に、異なった比重液を重層する不
連続の密度勾配遠心法の場合は、液の界面が乱れやすい
ため重層が難しく、また、遠心後にラ島が含まれる分画
をピペット等で吸引回収する操作で、他の分画が混入し
易かった。このため、密度勾配遠心法によるラ島の分離
操作では、小容量の細い遠心管を用いて繰り返し操作を
行う必要があり、特に、大動物での膵臓からのラ島分離
においては、分離操作を行う者が反復操作によって処理
せざろう得ないため、得られるラ島の収率、純度が一定
せず、さらに、長い操作時間を要するため、得られるラ
島の機能、生存率が低下してしまうという問題があっ
た。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、このような
従来のラ島分離を目的とした密度勾配遠心法における問
題点に鑑みてなされたものであって、軟質バッグを用い
ることによって比重の異なる比重液の重層を液−液間の
界面を乱すことなく可能とし、また、遠心分離後のラ島
が含まれる分画を他の分画の混入を最小限にして純度良
く回収することを可能とする分離用容器を提供するもの
である。さらに、大量サンプルも滅菌状態で無菌的に処
理でき、しかも短時間で処理できるためラ島の生存率の
低下やインスリン分泌能の障害を最小限に抑えることが
できる分離器具を提供するものである。

【０００８】

【課題を解決するための手段】これらの諸目的は、膵臓
組織片懸濁液を導入する管状体を有する遠心分離用軟質
容器と、該遠心分離用軟質容器と比重液流通手段を介し
て連結される少なくとも１つの比重液用軟質容器よりな
るランゲルハンス島の分離用器具によって達成される。
また、これらの諸目的は、膵臓組織片懸濁液を導入する
管状体を有する遠心分離用軟質容器と、該遠心分離用軟
質容器と第一の比重液流通手段を介して連結される第一
の比重液用軟質容器と、該遠心分離用軟質容器と第二の
比重液流通手段を介して連結される第二の比重液用軟質
容器と、該遠心分離用軟質容器と第三の比重液流通手段
を介して連結される第三の比重液用軟質容器よりなるラ
ンゲルハンス島の分離用器具により達成される。本発明
で使用される比重液は、従来から使用されているもので
あればどのようなものでもよく、特に限定されないが、
コラーゲン誘導体が好ましい。コラーゲン誘導体として
は、ゼラチンが好ましい。本発明においてゼラチンと
は、コラーゲンを主成分とする結合組織を原材料として
過熱処理して得られるものであるが、さらにこのゼラチ
ンあるいあはその原材料を酸、アルカリ、タンパク質分
解酵素等によって、より低分子量化したものも含まれ
る。

【０００９】次に、図面を参照しながら本発明を具体的
に説明する。図１は、本発明によるラ島の分離用器具の
一実施例を示すもので、膵臓組織片懸濁液導入用管状体
１の一端は遠心分離用軟質容器２に接続されており、他
端は必要に応じて封止部材３等で封止されている。この
遠心分離用軟質容器２は、連結チューブ４、連結具５、
連結チューブ６により形成される第一の比重液流通手段
を介して第一の比重液用軟質容器７に接続されている。
一方、前記遠心分離用軟質容器２は、連結チューブ４、
連結具５、連結チューブ８、連結具９及び連結チューブ
１０により形成される第二の比重液流通手段を介して第
二の比重液用軟質容器１１に接続されている。また、前
記遠心分離用軟質容器２は、連結チューブ４、連結具
５、連結チューブ８、連結具９及び連結チューブ１２に
より形成される第三の比重液流通手段を介して第三の比
重液用軟質容器１３に接続されている。

【００１０】図２は、本発明の他の実施例を示すもの
で、膵臓組織片懸濁液導入用管状体２１の一端は遠心分
離用軟質容器２２に接続されており、他端は必要に応じ
て封止部材２３等で封止されている。この遠心分離用軟
質容器２２は、連結チューブ２４より形成される第一の
比重液流通手段を介して第一の比重液用軟質容器２５に
接続されている。一方、前記遠心分離用軟質容器２２
は、連結チューブ２６により形成される第二の比重液流
通手段を介して第二の比重液用軟質容器２７に接続され
ている。また、前記遠心分離用軟質容器２２は、連結チ
ューブ２８により形成される第三の比重液流通手段を介
して第三の比重液用軟質容器２９に接続されている。

【００１１】本発明におけるラ島の分離用器具の各容器
は、通常、可塑化塩化ビニル樹脂、ポリウレタン樹脂、
ポリエチレン樹脂、エチレン−酢酸ビニル共重合体、エ
チレン−α−オレフィン共重合体等の軟質熱可塑性樹脂
で形成されているが、これらに限定されるものではな
く、医療用用途に用いられている軟質容器であればどの
ような材質の容器でも使用できる。また、各比重液流通
手段を形成する連結チューブ、連結具等も可塑化塩化ビ
ニル樹脂、ポリウレタン樹脂、ポリエチレン樹脂、エチ
レン−酢酸ビニル共重合体、エチレン−α−オレフィン
共重合体、ポリカーボネート、ポリエチレンテレフタレ
ート等の熱可塑性樹脂で形成されているが、これらに限
定されるものではない。また、各連結チューブには、必
要に応じて連通可能な流路閉鎖手段が設けられている。
連通可能な流路閉鎖手段としては、例えば、特開昭６２
−７４３６７号、特開昭６２−２５８３２２号、特開平
２−５７２５９号に開示されているような、通常は流路
を閉鎖しているが、必要に応じて閉鎖部材が開いて比重
液の流通が可能となる手段であれば、いずれのものでも
適用できる。さらに、各軟質容器には、特開昭６２−２
５８３２２号に開示されているような比重液等を注入す
ることができるポートを設けることもできる。

【００１２】次に、図１に示すラ島の分離用器具を用い
て本発明の大量分離用器具の使用方法について具体的に
説明する。膵臓組織片懸濁液導入用管状体１を介して遠
心分離用軟質容器２内にラ島を含む膵臓組織片懸濁液を
導入する。次に、この遠心分離用軟質容器２内に連結チ
ューブ６、連結具５、連結チューブ４により形成される
第一の比重液流通手段を介して第一の比重液を静かに導
入する。ついで、膵臓組織片懸濁液と第一の比重液が導
入されている前記遠心分離用軟質容器２内に、連結チュ
ーブ１０、連結具９、連結チューブ８、連結具５及び連
結チューブ４により形成される第二の比重液流通手段を
介して第二の比重液を静かに導入し重層する。さらに、
前記遠心分離用軟質容器２内に、連結チューブ１２、連
結具９、連結チューブ８、連結具５及び連結チューブ４
により形成される第三の比重液流通手段を介して第三の
比重液を静かに重層する。次に、ラ島の大量分離用器具
ごと遠心分離機にかけて遠心分離処理に供する。この遠
心分離処理によって、第三比重液と第二比重液の界面、
第二比重液と第一比重液の界面にラ島が分離される。次
に、これらの界面に分散しているラ島を回収するため
に、連結チューブ８をクレンメ（図示せず）で止め、遠
心分離用容器２を分離スタンド（テルモ社製）等で押圧
し、第三の比重液と第二の比重液の界面部分を残して、
第三の比重液を連結チューブ４、連結具５、連結チュー
ブ６により形成される第一の比重液流通手段を介して第
一の比重液用軟質容器７内に移し連結チューブ６をクレ
ンメ（図示せず）で止める。次に、連結チューブ８のク
レンメを外し、連結チューブ１２をクレンメ（図示せ
ず）で止め、第三の比重液と第二の比重液の界面部分を
連結チューブ４、連結具５、連結チューブ８、連結具９
及び連結チューブ１０により形成される第二の比重液流
通手段を介して第二の比重液用軟質容器１１内に採取し
連結チューブ１０をクレンメ（図示せず）で止める。次
に、連結チューブ８をクレンメ（図示せず）で止め、連
結チューブ６のクレンメを外して、第二の比重液と第一
の比重液の界面を残して、第二の比重液を連結チューブ
４、連結具５、連結チューブ６により形成される第一の
比重液流通手段を介して第一の比重液用軟質容器７内に
移し連結チューブ６をクレンメ（図示せず）で止める。
次に、連結チューブ８及び連結チューブ１２のクレンメ
を外し、第二の比重液と第一の比重液の界面部分を連結
チューブ４、連結具５、連結チューブ８、連結具９及び
連結チューブ１２により形成される第三の比重液流通手
段を介して第三の比重液用軟質容器１３内に採取し連結
チューブ１２をクレンメ（図示せず）で止める。連結チ
ューブ１０および連結チューブ１２を切り離すことによ
って、ラ島を得ることができる。

【００１３】なお、ラ島を採取する際、上記のラ島が存
在する界面を別々の比重液用軟質容器に採取方法ではな
く、一つの比重液用軟質容器にまとめて採取しても良
い。しかし、純度の良いラ島が必要な場合、別々の比重
液用軟質容器に採取する方が、純度の良いものを選択し
用いることができ好ましい。

【００１４】以上、図１のラ島の大量分離用軟質器具に
ついて説明したが、第２図のラ島の大量分離用軟質器具
についても同様な操作を行ってラ真を分離回収すること
ができる。また、比重液用軟質容器は、１.０４０〜１.
１２０ｇ/ｍｌの濃度範囲内で異なる濃度の比重液を用
いれば、２個、あるいは４個以上付けることもでき、そ
の数は特に限定しない。その際のラ島の分離は同様の操
作で行うことができる。

【００１５】更に、本発明は、リコルディ、ラシー、シ
ャープの方法（ＣＡＭＩＬＬＯ ＲＩＣＯＲＤＩ，ＰＡ
ＵＬ Ｅ，ＬＡＳＹ，ＡＮＤ ＤＡＶＩＤ Ｗ．ＳＣＨ
ＡＲＰ，ダイアベティス（Ｄｉａｂｅｔｅｓ），３８，
Ｓｕｐｐｌ．１，ＪＡＮＵＡＲＹ １９８９，１４０−
１４２）と組み合わせて用いることにより、膵臓の摘出
時以外は完全に外気に触れず無菌状態でラ島を精製でき
る。

【００１６】次に、実施例を挙げて本発明をさらに詳細
に説明する。

【００１７】

【実施例】

（実施例１）ランゲルハンス島の大量分離用器具の作成 図１に示すようなランゲルハンス島の大量分離用器具を
可塑化塩化ビニル樹脂で作成し、第一の比重液用軟質容
器にはｐＨ７.４で塩化ナトリウムを加え電気伝導率を
８.４ｍｓ/ｃｍに調整した３５％ゼラチン水溶液（比重
１.１０５ｇ/ｍｌ）１００ｍｌを封入した。第二の比重
液用軟質容器には、ｐＨ７.４で塩化ナトリウムを加え
電気伝導率を８.４ｍｓ/ｃｍに調整した２５％ゼラチン
水溶液（比重１.０７５ｇ/ｍｌ）１００ｍｌを封入し
た。第三の比重液用軟質容器には、ｐＨ７.４で塩化ナ
トリウムを加え電気伝導率を８.４ｍｓ/ｃｍに調整した
１５％ゼラチン水溶液（比重１.０４５ｇ/ｍｌ）１００
ｍｌを封入した。ゼラチンは、新田ゼラチン社製水溶性
ゼラチンＵタイプを使用した。

【００１８】（実施例２） 膵臓組織片懸濁液の調整 雑種成犬（体重１０Ｋｇ）を麻酔死させて摘出した膵臓
をコラゲナーゼで消化した。コラゲナーゼ（新田ゼラチ
ン社製、２８０Ｕ／ｍｇ）濃度は６００ｍｇ/ｄｌと
し、３７℃で約３０分間消化した。消化された膵臓組織
片を、Ｈａｎｋｓ液に分散し、導入用管状体を介して遠
心分離用軟質容器内に導入した。次に、容器ごと４００
×ｇ、５分間遠心分離処理して、上清を廃棄することに
よって膵臓組織片を回収した。

【００１９】（実施例３）ランゲルハンス島の分離 次に、第一の比重液用軟質容器を押圧して、遠心分離用
軟質容器内に第一の比重液を導入し、膵臓組織片を懸濁
した。次に、第二の比重液用軟質容器を押圧して、第二
の比重液を前記遠心分離用軟質容器内に静かに導入し重
層した。さらに、第三の比重液用軟質容器を押圧して、
前記遠心分離用軟質容器内に、第三の比重液を静かに導
入した重層した。次に、ラ島の大量分離用器具ごと遠心
分離機にかけて８００×ｇで２０分間遠心分離処理を行
った。次に、連結チューブ８をクレンメで止め、遠心分
離用軟質容器を分離スタンドで押圧し、第三の比重液の
大部分を第一の比重液用軟質容器内に移し、連結チュー
ブ６をクレンメで止めた。次に、連結チューブ８のクレ
ンメを外し、連結チューブ１２をクレンメで止め、第三
の比重液と第二の比重液の界面部分を第二の比重液用軟
質容器内に採取し連結チューブ１０をクレンメで止め
た。次に、連結チューブ８をクレンメで止め、連結チュ
ーブ６のクレンメを外して、第二の比重液の大部分を第
一の比重液用軟質容器内に移し連結チューブ６をクレン
メで止めた。次に、連結チューブ８及び連結チューブ１
２のクレンメを外し、第二の比重液と第一の比重液の界
面部分を第三の比重液用軟質容器内に採取し連結チュー
ブ１２をクレンメで止めた。

【００２０】連結チューブ１０および連結チューブ１２
を切り離すことによって、充分な量のラ島を分離するこ
とができた。得られたラ島の懸濁液に染色液（ジフェニ
ルチオカルバゾン１０ｍｇ/３ｍｌジメチルスルホキシ
ド）を滴下して染色した後光学顕微鏡で確認したとこ
ろ、従来の方法より不純物が少ない状態でラ島が得られ
ていることが確認できた。

【００２１】

【発明の効果】本発明のラ島分離用器具は、軟質容器を
使用しているために、必要とする比重液を重層する際
に、軟質容器に連結しているチューブを介して液の注入
が可能であるため、液−液間の界面を乱すことなく容易
に重層することができる。また、遠心後に必要な界面を
回収する場合に、容器の下部を緩やかに押すことによっ
て、他の分画が混入することなく回収することができ
る。また、軟質の容器であることから、操作中や遠心中
に容器が破損する虞れが少ないため、確実に必要な処理
を行うことができる。さらに、軟質容器は完全に密封さ
れているため、クリーンルームなどの無菌的な施設が無
い場合でも操作が可能であり、安全に実験や移植等の治
療に用いることができる。

【００２２】また、大量のサンプルを同時に処理できる
ことで処理時間の短縮が可能となり、ラ島の生存率の低
下と細胞の機能障害を低く抑えることができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、本発明に係わるランゲルハンス島の分
離用器具の一実施例を示すものでる。

【図２】図２は、本発明に係わるランゲルハンス島の他
の実施例を示すものである。 符号の説明 １・・・膵臓組織片懸濁液導入用管状体、２・・・遠心
分離用軟質容器、７，１１，１３・・・比重液用軟質容
器

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 膵臓組織片懸濁液を導入する管状体を有
   する遠心分離用軟質容器と、該遠心分離用軟質容器と比
   重液流通手段を介して連結される少なくとも１つの比重
   液用軟質容器よりなるランゲルハンス島の分離用器具。