JPH0654692A - プロモータのない外来遺伝子をオペロンに組込む方法 - Google Patents
プロモータのない外来遺伝子をオペロンに組込む方法Info
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- JPH0654692A JPH0654692A JP5116316A JP11631693A JPH0654692A JP H0654692 A JPH0654692 A JP H0654692A JP 5116316 A JP5116316 A JP 5116316A JP 11631693 A JP11631693 A JP 11631693A JP H0654692 A JPH0654692 A JP H0654692A
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- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【目的】 微生物（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈ
ｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ又はＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ
ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）に食品級遺伝子組込みおよび
発現系に関する。遺伝子の維持および発現はその天然生
息地、特に乳に細胞を単に生育させることにより間接的
に選択される。 【構成】 食品級の微生物のＤＮＡについて少なくとも
１つの必須のシストロンの手前のオペロンにプロモータ
のない外来遺伝子を組み込む方法において、この遺伝子
をオペロンの機能的部分として発現させ、かつ遺伝子を
標準培地で生育させて必須シストロンの正しい機能性に
ついて選択的圧力により安定的に維持、発現させる外来
遺伝子の組込み方法であって、組込みは微生物自身によ
り複製することができず、かつ必須シストロンの手前の
オペロンの機能的部分として外来遺伝子を有するドナー
プラスミドによりこの微生物を形質転換する。
ｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ又はＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ
ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）に食品級遺伝子組込みおよび
発現系に関する。遺伝子の維持および発現はその天然生
息地、特に乳に細胞を単に生育させることにより間接的
に選択される。 【構成】 食品級の微生物のＤＮＡについて少なくとも
１つの必須のシストロンの手前のオペロンにプロモータ
のない外来遺伝子を組み込む方法において、この遺伝子
をオペロンの機能的部分として発現させ、かつ遺伝子を
標準培地で生育させて必須シストロンの正しい機能性に
ついて選択的圧力により安定的に維持、発現させる外来
遺伝子の組込み方法であって、組込みは微生物自身によ
り複製することができず、かつ必須シストロンの手前の
オペロンの機能的部分として外来遺伝子を有するドナー
プラスミドによりこの微生物を形質転換する。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は微生物、特にＳｔｒｅｐ
ｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓまたはＬ
ａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓに食
品級遺伝子組込みおよび発現系に関する。任意の相同お
よび／または非相同遺伝子の維持および発現はその天然
生息地、特に乳に細胞を単に生育させることにより間接
的に選択される。
ｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓまたはＬ
ａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓに食
品級遺伝子組込みおよび発現系に関する。任意の相同お
よび／または非相同遺伝子の維持および発現はその天然
生息地、特に乳に細胞を単に生育させることにより間接
的に選択される。
【０００２】
【従来の技術】Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒ
ｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）は
食品の発酵に対し非常に重要な微生物である。乳製品の
発酵に主として使用され、特にスタータカルチャーとし
て、しばしば他の同種または異種発酵菌と組み合せてヨ
ーグルトおよびチーズの製造に使用される。ごく最近
に、この菌の遺伝学に進歩が見られた。接合〔参照文献
１、２〕、トランスフェクション〔参照文献３〕および
形質転換〔参照文献４、５〕としていくつかの遺伝子の
転移技術がこの種に対し報告されている。これまでは、
これは試験およびクローニングベクター〔参照文献３、
５〕および新しいベクター系〔参照文献６〕をデザイン
する初期として既存の細菌プラスミドの使用が可能とな
った。Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓの転写および翻訳
調節領域についてほとんど知られていないが〔参照文献
７〕、プラスミドに結合し、維持されたいくつかの非相
同遺伝子の発現は報告された〔参照文献８〕。しかし、
発現レベルは予測できないし、しばしば低いかまたは検
出しえない〔参照文献７〕。
ｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）は
食品の発酵に対し非常に重要な微生物である。乳製品の
発酵に主として使用され、特にスタータカルチャーとし
て、しばしば他の同種または異種発酵菌と組み合せてヨ
ーグルトおよびチーズの製造に使用される。ごく最近
に、この菌の遺伝学に進歩が見られた。接合〔参照文献
１、２〕、トランスフェクション〔参照文献３〕および
形質転換〔参照文献４、５〕としていくつかの遺伝子の
転移技術がこの種に対し報告されている。これまでは、
これは試験およびクローニングベクター〔参照文献３、
５〕および新しいベクター系〔参照文献６〕をデザイン
する初期として既存の細菌プラスミドの使用が可能とな
った。Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓの転写および翻訳
調節領域についてほとんど知られていないが〔参照文献
７〕、プラスミドに結合し、維持されたいくつかの非相
同遺伝子の発現は報告された〔参照文献８〕。しかし、
発現レベルは予測できないし、しばしば低いかまたは検
出しえない〔参照文献７〕。
【０００３】プラスミドは先天的に安定な仕方で分離さ
れず、そして非選択的生育條件下で失われる。これは特
に遺伝子工学で使われ、非相同ＤＮＡを有するプラスミ
ド系では真実である。プラスミド維持の確保に適用する
選択は大部分の場合抗生物質の耐性を参照して標識遺伝
子を使用する。実験室規模の試験では非常に有利である
が、このような選択システムは食品製造に適用できな
い。今日まで、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓに対し食
品級遺伝子転移系は報告されていない。
れず、そして非選択的生育條件下で失われる。これは特
に遺伝子工学で使われ、非相同ＤＮＡを有するプラスミ
ド系では真実である。プラスミド維持の確保に適用する
選択は大部分の場合抗生物質の耐性を参照して標識遺伝
子を使用する。実験室規模の試験では非常に有利である
が、このような選択システムは食品製造に適用できな
い。今日まで、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓに対し食
品級遺伝子転移系は報告されていない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】本発明の第１目的は食
品級微生物の染色体ＤＮＡ、特にＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃ
ｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓまたはＬａｃｔｏｂ
ａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓの染色体ＤＮＡ
に、その標準培地、特に乳に細胞を生育させ、間接選択
することにより遺伝子の維持および発現を確保するよう
な仕方で外来遺伝子を組込む方法を供することである。
品級微生物の染色体ＤＮＡ、特にＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃ
ｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓまたはＬａｃｔｏｂ
ａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓの染色体ＤＮＡ
に、その標準培地、特に乳に細胞を生育させ、間接選択
することにより遺伝子の維持および発現を確保するよう
な仕方で外来遺伝子を組込む方法を供することである。
【０００５】本発明の第２目的は食品級である（組込む
遺伝子を考慮せずに）組込み方法を供することである。
本発明の第３目的は構築方法の任意の工程で組込まれ、
発現する外来遺伝子の機能を直接選択するために必要と
しない組込み方法を供することである。
遺伝子を考慮せずに）組込み方法を供することである。
本発明の第３目的は構築方法の任意の工程で組込まれ、
発現する外来遺伝子の機能を直接選択するために必要と
しない組込み方法を供することである。
【０００６】本発明の第４目的はこれらの方法により得
た遺伝的に修飾された微生物を供することである。本発
明の第５目的はこれらの方法の実施に対し微生物の派生
コピーを供することである。本発明の第６目的はこれら
の方法の実施に対しドナープラスミドを供することであ
る。
た遺伝的に修飾された微生物を供することである。本発
明の第５目的はこれらの方法の実施に対し微生物の派生
コピーを供することである。本発明の第６目的はこれら
の方法の実施に対しドナープラスミドを供することであ
る。
【０００７】本発明の第７目的は食品級基質をこれらの
遺伝的に修飾した微生物により発酵させる、発酵方法を
供することである。本発明の第８目的はこれらの発酵方
法により得る食品または食品添加物を供することであ
る。
遺伝的に修飾した微生物により発酵させる、発酵方法を
供することである。本発明の第８目的はこれらの発酵方
法により得る食品または食品添加物を供することであ
る。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明によれば、食品級
微生物のＤＮＡ上の少なくとも１つの必須シストロンの
手前のオペロン中に、遺伝子がこのオペロンの機能部分
として発現し、遺伝子が安定に維持され、標準培地に生
育する場合必須シストロンの正しい機能性を選択的圧力
により発現するような仕方で、プロモータのない外来遺
伝子を組込む方法が供される。
微生物のＤＮＡ上の少なくとも１つの必須シストロンの
手前のオペロン中に、遺伝子がこのオペロンの機能部分
として発現し、遺伝子が安定に維持され、標準培地に生
育する場合必須シストロンの正しい機能性を選択的圧力
により発現するような仕方で、プロモータのない外来遺
伝子を組込む方法が供される。
【０００９】好ましくは、この方法は微生物中ではそれ
自体により複製できず、かつ必須シストロンの手前のオ
ペロンの機能部分として外来遺伝子を保持するドナープ
ラスミドにより微生物を形質転換することを含む。好ま
しくは、この方法はさらにプラスミド−ゲノムの共組込
み体を含む形質転換細胞を単離し、外来遺伝子の正しい
組込みを達成するために共組込み体を解離することを含
む。
自体により複製できず、かつ必須シストロンの手前のオ
ペロンの機能部分として外来遺伝子を保持するドナープ
ラスミドにより微生物を形質転換することを含む。好ま
しくは、この方法はさらにプラスミド−ゲノムの共組込
み体を含む形質転換細胞を単離し、外来遺伝子の正しい
組込みを達成するために共組込み体を解離することを含
む。
【００１０】また好ましくは、微生物は属Ｓｔｒｅｐｔ
ｏｃｏｃｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｌａｃｔｏ
ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ、Ｐｅｄｉ
ｏｃｏｃｃｕｓ、ＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓおよびＢｉ
ｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、およびＰｒｏｐｉｏｎ
ｉｂａｃｔｅｒｉｕｍおよびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃ
ｕｓから成る群から選択した乳酸菌である。さらに好ま
しくは、微生物はＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅ
ｒｍｏｐｈｉｌｕｓまたはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ
ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓである。また好ましくは、プラ
スミドはオペロン全部または部分を保有するプラスミド
由来である。
ｏｃｏｃｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｌａｃｔｏ
ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ、Ｐｅｄｉ
ｏｃｏｃｃｕｓ、ＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓおよびＢｉ
ｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、およびＰｒｏｐｉｏｎ
ｉｂａｃｔｅｒｉｕｍおよびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃ
ｕｓから成る群から選択した乳酸菌である。さらに好ま
しくは、微生物はＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅ
ｒｍｏｐｈｉｌｕｓまたはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ
ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓである。また好ましくは、プラ
スミドはオペロン全部または部分を保有するプラスミド
由来である。
【００１１】さらに、ドナープラスミドは好ましくは微
生物より別の宿主システムに単独で複製でき、さらに微
生物および他の宿主系で機能する選択できる標識遺伝子
を有する。他の宿主系は例えば、Ｅ．ｃｏｌｉであるこ
とができる。本発明の好ましい態様では、オペロンはｌ
ａｃオペロンであり、必須シストロンはｌａｃＺ遺伝子
である。この態様では、ドナープラスミドはｌａｃＳお
よびｌａｃＺ遺伝子間にＮｄｅＩ制限部位を形成するた
めにオペロンｌａｃの野生型配列を修飾し、形成Ｎｄｅ
Ｉ部位中に外来遺伝子を挿入することにより得ることが
できる。
生物より別の宿主システムに単独で複製でき、さらに微
生物および他の宿主系で機能する選択できる標識遺伝子
を有する。他の宿主系は例えば、Ｅ．ｃｏｌｉであるこ
とができる。本発明の好ましい態様では、オペロンはｌ
ａｃオペロンであり、必須シストロンはｌａｃＺ遺伝子
である。この態様では、ドナープラスミドはｌａｃＳお
よびｌａｃＺ遺伝子間にＮｄｅＩ制限部位を形成するた
めにオペロンｌａｃの野生型配列を修飾し、形成Ｎｄｅ
Ｉ部位中に外来遺伝子を挿入することにより得ることが
できる。
【００１２】本発明方法はエレクトロポレーションによ
り微生物を形質転換することを含むこともできる。本発
明の別の好ましい態様では、本方法はさらに必須シスト
ロン内に欠失を有する微生物の派生コピーを調整するこ
とを含むことができ、この欠失は形質転換中完了し、共
組込み体の解離を単純化できる。
り微生物を形質転換することを含むこともできる。本発
明の別の好ましい態様では、本方法はさらに必須シスト
ロン内に欠失を有する微生物の派生コピーを調整するこ
とを含むことができ、この欠失は形質転換中完了し、共
組込み体の解離を単純化できる。
【００１３】本発明の原理は食品級微生物、例えば特に
Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのゲノムの活力あるオペ
ロン中に、オペロンの正しい機能性、すなわち転写およ
び翻訳を保存し、オペロンの組込み、機能性部分として
非相同遺伝子を有するように外来遺伝子を組込むことで
ある。組込み遺伝子の正しい発現を確保するために、同
じオペロンの必須遺伝子（シストロン）の手前に入れる
べきである。標準培地、例えば乳で、通常條件下で細胞
の生育中、必須遺伝子上の選択的圧は組込み遺伝子の遺
伝的維持および発現を確保する。何がオペロンを運搬系
として選択するかによって、発現および／または調節可
能性の異るレベルを採用できる。
Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのゲノムの活力あるオペ
ロン中に、オペロンの正しい機能性、すなわち転写およ
び翻訳を保存し、オペロンの組込み、機能性部分として
非相同遺伝子を有するように外来遺伝子を組込むことで
ある。組込み遺伝子の正しい発現を確保するために、同
じオペロンの必須遺伝子（シストロン）の手前に入れる
べきである。標準培地、例えば乳で、通常條件下で細胞
の生育中、必須遺伝子上の選択的圧は組込み遺伝子の遺
伝的維持および発現を確保する。何がオペロンを運搬系
として選択するかによって、発現および／または調節可
能性の異るレベルを採用できる。
【００１４】本発明は食品級微生物、例えば特にＳ．ｔ
ｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓの報告された遺伝子転移系に関
して次の利点を有する： −純一発生で食品級である（発現する外来遺伝子を考慮
せずに）、 −ゲノム中に遺伝子の組込みは安定である。従って宿主
細胞ゲノムのコピー数がきびしく調節される、 −遺伝子の発現は宿主細胞固有のプロモータシステムに
より調節される、 −相同、非相同、または合成起源、またはその組合せの
任意の外来遺伝子は直接的選択、観察しうる表現型また
は生育培地の適応に対し要求なしに発現できる、 −遺伝子の維持および発現に関する選択はその標準培
地、例えば乳基準培地、特に乳、乳透過物またはホエイ
における細胞の生育について間接的である。
ｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓの報告された遺伝子転移系に関
して次の利点を有する： −純一発生で食品級である（発現する外来遺伝子を考慮
せずに）、 −ゲノム中に遺伝子の組込みは安定である。従って宿主
細胞ゲノムのコピー数がきびしく調節される、 −遺伝子の発現は宿主細胞固有のプロモータシステムに
より調節される、 −相同、非相同、または合成起源、またはその組合せの
任意の外来遺伝子は直接的選択、観察しうる表現型また
は生育培地の適応に対し要求なしに発現できる、 −遺伝子の維持および発現に関する選択はその標準培
地、例えば乳基準培地、特に乳、乳透過物またはホエイ
における細胞の生育について間接的である。
【００１５】本明細書および請求範囲を通して、「外来
遺伝子」とは例えば酵素のような任意の有用な生成物に
対しコードするＤＮＡの相同、非相同または人工的伸張
を意味するものと解される。
遺伝子」とは例えば酵素のような任意の有用な生成物に
対しコードするＤＮＡの相同、非相同または人工的伸張
を意味するものと解される。
【００１６】食品級微生物、例えば特にＳ．ｔｈｅｒｍ
ｏｐｈｉｌｕｓで組込み遺伝子発現を達成するために次
の工程によることができる： −ドナープラスミドの企画。Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌ
ｕｓへの組込みに対し直接選択するために、ドナープラ
スミドはそれ自体で複製すべきでない。Ｓ．ｔｈｅｒｍ
ｏｐｈｉｌｕｓで機能する選択できる標識遺伝子を保有
し、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓゲノムに相同のＤＮ
Ａの伸張部分を含有する。優先的に、ドナープラスミド
は有利な遺伝子工学およびプラスミド増殖に対しＳ．ｔ
ｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ以外の宿主系、例えばＥ．ｃｏ
ｌｉに複製できる。 −組込みの標的化。ドナープラスミドの組込みはドナー
プラスミドのＤＮＡの相同ストレッチとＳ．ｔｈｅｒｍ
ｏｐｈｉｌｕｓのゲノム間で組換えにより行なう。組込
む遺伝子を保有するドナープラスミドはオペロン中に遺
伝子の固有の組込みを確保するように工学処理されなけ
ればならない。組込みにより、共組込みとして示す遺伝
配置がゲノムとドナープラスミド間に形成される。 −Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓに対する形質転換方法
の最適化。検出しうる組込み結果を得るために、形質転
換頻度（すなわち、投入プラスミドＤＮＡμｇにつき形
質転換細胞数）は適度に高くなければならない。現在ま
で報告された形質転換方法は組込み結果を検出するのに
十分ではなかった。従って、エレクトロポレーション技
術を使用してＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓに対し方法
を最適化した。 −ゲノム組込み。Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのゲノ
ム上にドナープラスミドからの遺伝子またはその部分の
組込みはまだ報告されていない。本方法の最適化形質転
換プロトコルにより投入プラスミドＤＮＡ１μｇにつき
１〜１０組込み体を再現的に単離できた。各組込みの結
果は共組込み体を形成した。 −共組込み体の解離。プラスミド基準の選択系を解除す
ると、宿主細胞の適当な組換え系は共組込み構造を解離
し、従ってドナープラスミドのベクター本体を排除する
ようになる。Ｅ．ｃｏｌｉ由来のＤＮＡ配列および抗生
物質耐性標識は失われる。異る可能な解離最終生成物の
うち所望の最終構築を選ぶために、形質転換細胞の個々
の子孫はＤＮＡハイブリダイゼーション技術〔参照文献
９〕（例１）を使用して選別しなければならないか、ま
たはこれらは適当に指名した宿主菌株を組込みに使用し
て（例２）直接選択できる。
ｏｐｈｉｌｕｓで組込み遺伝子発現を達成するために次
の工程によることができる： −ドナープラスミドの企画。Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌ
ｕｓへの組込みに対し直接選択するために、ドナープラ
スミドはそれ自体で複製すべきでない。Ｓ．ｔｈｅｒｍ
ｏｐｈｉｌｕｓで機能する選択できる標識遺伝子を保有
し、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓゲノムに相同のＤＮ
Ａの伸張部分を含有する。優先的に、ドナープラスミド
は有利な遺伝子工学およびプラスミド増殖に対しＳ．ｔ
ｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ以外の宿主系、例えばＥ．ｃｏ
ｌｉに複製できる。 −組込みの標的化。ドナープラスミドの組込みはドナー
プラスミドのＤＮＡの相同ストレッチとＳ．ｔｈｅｒｍ
ｏｐｈｉｌｕｓのゲノム間で組換えにより行なう。組込
む遺伝子を保有するドナープラスミドはオペロン中に遺
伝子の固有の組込みを確保するように工学処理されなけ
ればならない。組込みにより、共組込みとして示す遺伝
配置がゲノムとドナープラスミド間に形成される。 −Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓに対する形質転換方法
の最適化。検出しうる組込み結果を得るために、形質転
換頻度（すなわち、投入プラスミドＤＮＡμｇにつき形
質転換細胞数）は適度に高くなければならない。現在ま
で報告された形質転換方法は組込み結果を検出するのに
十分ではなかった。従って、エレクトロポレーション技
術を使用してＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓに対し方法
を最適化した。 −ゲノム組込み。Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのゲノ
ム上にドナープラスミドからの遺伝子またはその部分の
組込みはまだ報告されていない。本方法の最適化形質転
換プロトコルにより投入プラスミドＤＮＡ１μｇにつき
１〜１０組込み体を再現的に単離できた。各組込みの結
果は共組込み体を形成した。 −共組込み体の解離。プラスミド基準の選択系を解除す
ると、宿主細胞の適当な組換え系は共組込み構造を解離
し、従ってドナープラスミドのベクター本体を排除する
ようになる。Ｅ．ｃｏｌｉ由来のＤＮＡ配列および抗生
物質耐性標識は失われる。異る可能な解離最終生成物の
うち所望の最終構築を選ぶために、形質転換細胞の個々
の子孫はＤＮＡハイブリダイゼーション技術〔参照文献
９〕（例１）を使用して選別しなければならないか、ま
たはこれらは適当に指名した宿主菌株を組込みに使用し
て（例２）直接選択できる。
【００１７】上記方法の成否はＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ
ｌａｃｔｉｓプラスミドｐＮＺ１２〔参照文献１０〕
由来のプロモータのないクロラムフェニコールアセチル
トランスフェラーゼ（ｃａｔ）をＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈ
ｉｌｕｓのｌａｃオペロン中に２個の遺伝子ｌａｃＳお
よびｌａｃＺ〔参照文献１１−１３〕間に組込むことに
より実証された。初めのｌａｃオペロンをＳ．ｔｈｅｒ
ｍｏｐｈｉｌｕｓゲノム上で置換する修飾オペロンの遺
伝子形成は図１に示す。１００世代以上の間（クロラム
フェニコールで選択せずに）乳で生育後独立カルチャー
の分析によりｃａｔ遺伝子は永続的に維持されることが
示された。さらに、ｃａｔ遺伝子の発現および調節は
Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓの乳における生育に対し
活力のあるβ−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）遺伝子の
ものに平行することが示された。
ｌａｃｔｉｓプラスミドｐＮＺ１２〔参照文献１０〕
由来のプロモータのないクロラムフェニコールアセチル
トランスフェラーゼ（ｃａｔ）をＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈ
ｉｌｕｓのｌａｃオペロン中に２個の遺伝子ｌａｃＳお
よびｌａｃＺ〔参照文献１１−１３〕間に組込むことに
より実証された。初めのｌａｃオペロンをＳ．ｔｈｅｒ
ｍｏｐｈｉｌｕｓゲノム上で置換する修飾オペロンの遺
伝子形成は図１に示す。１００世代以上の間（クロラム
フェニコールで選択せずに）乳で生育後独立カルチャー
の分析によりｃａｔ遺伝子は永続的に維持されることが
示された。さらに、ｃａｔ遺伝子の発現および調節は
Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓの乳における生育に対し
活力のあるβ−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）遺伝子の
ものに平行することが示された。
【００１８】材料および方法細菌およびプラスミド ヨーグルト製造のスタータ菌株であるＳ．ｔｈｅｒｍｏ
ｐｈｉｌｕｓ ＳＴ１１は本発明者らのコレクションか
らのものである。ブダペスト條約に基づきＣｏｌｌｅｃ
ｔｉｏｎ Ｎａｔｉｏｎａｌ ｄｅ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ
ｄｅ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅ（ＣＮＣＭ）ｄ
ｅ １’Ｉｎｓｔｉｔｕｔ Ｐａｓｔｅｕｒ，２５ ｒ
ｕｅ ｄｅ Ｄｏｃｔｅｕｒ Ｒｏｕｘ，７５７２４
Ｐａｒｉｓ Ｃｅｄｅｘ １５，Ｆｒａｎｃｅに９３−
３−２９に寄託され、そこで番号ＣＮＣＭＩ−１２９２
を与えられた。使用Ｅ．ｃｏｌｉ菌株はＢＺ２３４（Ｂ
ｉｏ−Ｚｅｎｔｅｒ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｂ
ａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄからのコレクショ
ン）およびＪＭ１０８〔参照文献１４〕であった。プラ
スミドは次のものであった：ｐＶＡ８３８〔参照文献１
５〕、ｐＮＺ１２〔参照文献１０〕、ｐＧＥＭ−５２ｆ
（Ｐｒｏｍｅｇａ、米国）、ｐＵＣ−８３８−１（ｐＵ
Ｃ１８〔参照文献１４〕、平滑末端の、独特のＳｍａＩ
部位中に挿入したｐＶＡ８３８からのエリスロマイシン
耐性遺伝子（Ｅｍｒ）を有する１．７ｋｂ ＨｉｎｄＩ
ＩＩ−ＡＶＡ Ｉを有する）、ｐＧＥＭ５−８３８−２
（平滑末端の、独特のＥｃｏＲＶ部位中に挿入したＰＵ
Ｃ−８３８−１と同一の、ｐＶＡ８３８からの１．７ｋ
ｂ断片を有するｐＧＥＭ−５２ｆ）、ｐＤＰ２１１（ｐ
ＵＣ１９〔参照文献１４〕、独特のＰｓｔＩ部位（ｐＰ
Ｈ１１６と同様の構築〔参照文献１１〕にクローンした
Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＳＴ１１からのｌａｃ
Ｚ遺伝子を有する７．０ｋｂ ＰｓｔＩ断片）、ｐＤＰ
２２２（ＢｇｌＩＩにより切断され、次に再連結するこ
とにより欠失したｌａｃＺ内部１．３ｋｂＢｇｌＩＩ断
片を有するｐＤＰ２１１）、ｐＤＰ２２８（独特のＰｓ
ｔＩおよびＳｐｅＩ部位にクローンしたｐＤＰ２１１か
らの２．４ｋｂ ＰｓｔＩ−ＳｐｅＩ断片を有するＰＵ
Ｃ１９）およびｐＤＰ３０１（独特のＥｃｏＲＩ部位
（ｐＥＫＳ８と同じ構築〔参照文献１２〕）にクローン
ＳＴ１１からのｌａｃＳ遺伝子を有する４．２ｋｂＥｃ
ｏＲＩ断片を有するｐＫＫ２２３−３〔Ｐｈａｒｍａｃ
ｉａＩｎｃ．，米国〕）（図２）。プラスミドｐＵＣ−
８３８−１はＢ．Ｓｕｒｉ，Ｃｉｂａ−Ｇｅｉｇｙ Ｌ
ｔｄ．，スイスから受領し、プラスミドｐＧＥＭ５−８
３８−２、ｐＤＰ２１１、ｐＤＰ２２２、ｐＤＰ２２８
およびｐＤＰ３０１はＤ．Ｐｒｉｄｍｏｒｅ，Ｎｅｓｔ
ｃ Ｌｔｄ．，スイスから受領した。
ｐｈｉｌｕｓ ＳＴ１１は本発明者らのコレクションか
らのものである。ブダペスト條約に基づきＣｏｌｌｅｃ
ｔｉｏｎ Ｎａｔｉｏｎａｌ ｄｅ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ
ｄｅ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅ（ＣＮＣＭ）ｄ
ｅ １’Ｉｎｓｔｉｔｕｔ Ｐａｓｔｅｕｒ，２５ ｒ
ｕｅ ｄｅ Ｄｏｃｔｅｕｒ Ｒｏｕｘ，７５７２４
Ｐａｒｉｓ Ｃｅｄｅｘ １５，Ｆｒａｎｃｅに９３−
３−２９に寄託され、そこで番号ＣＮＣＭＩ−１２９２
を与えられた。使用Ｅ．ｃｏｌｉ菌株はＢＺ２３４（Ｂ
ｉｏ−Ｚｅｎｔｅｒ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｂ
ａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄからのコレクショ
ン）およびＪＭ１０８〔参照文献１４〕であった。プラ
スミドは次のものであった：ｐＶＡ８３８〔参照文献１
５〕、ｐＮＺ１２〔参照文献１０〕、ｐＧＥＭ−５２ｆ
（Ｐｒｏｍｅｇａ、米国）、ｐＵＣ−８３８−１（ｐＵ
Ｃ１８〔参照文献１４〕、平滑末端の、独特のＳｍａＩ
部位中に挿入したｐＶＡ８３８からのエリスロマイシン
耐性遺伝子（Ｅｍｒ）を有する１．７ｋｂ ＨｉｎｄＩ
ＩＩ−ＡＶＡ Ｉを有する）、ｐＧＥＭ５−８３８−２
（平滑末端の、独特のＥｃｏＲＶ部位中に挿入したＰＵ
Ｃ−８３８−１と同一の、ｐＶＡ８３８からの１．７ｋ
ｂ断片を有するｐＧＥＭ−５２ｆ）、ｐＤＰ２１１（ｐ
ＵＣ１９〔参照文献１４〕、独特のＰｓｔＩ部位（ｐＰ
Ｈ１１６と同様の構築〔参照文献１１〕にクローンした
Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＳＴ１１からのｌａｃ
Ｚ遺伝子を有する７．０ｋｂ ＰｓｔＩ断片）、ｐＤＰ
２２２（ＢｇｌＩＩにより切断され、次に再連結するこ
とにより欠失したｌａｃＺ内部１．３ｋｂＢｇｌＩＩ断
片を有するｐＤＰ２１１）、ｐＤＰ２２８（独特のＰｓ
ｔＩおよびＳｐｅＩ部位にクローンしたｐＤＰ２１１か
らの２．４ｋｂ ＰｓｔＩ−ＳｐｅＩ断片を有するＰＵ
Ｃ１９）およびｐＤＰ３０１（独特のＥｃｏＲＩ部位
（ｐＥＫＳ８と同じ構築〔参照文献１２〕）にクローン
ＳＴ１１からのｌａｃＳ遺伝子を有する４．２ｋｂＥｃ
ｏＲＩ断片を有するｐＫＫ２２３−３〔Ｐｈａｒｍａｃ
ｉａＩｎｃ．，米国〕）（図２）。プラスミドｐＵＣ−
８３８−１はＢ．Ｓｕｒｉ，Ｃｉｂａ−Ｇｅｉｇｙ Ｌ
ｔｄ．，スイスから受領し、プラスミドｐＧＥＭ５−８
３８−２、ｐＤＰ２１１、ｐＤＰ２２２、ｐＤＰ２２８
およびｐＤＰ３０１はＤ．Ｐｒｉｄｍｏｒｅ，Ｎｅｓｔ
ｃ Ｌｔｄ．，スイスから受領した。
【００１９】培地 Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ はＨＪＬ（３％トリプト
ン、１％酵母エキス、０．５％ＫＨ２ＰＯ４、０．５％
ビーフエキスおよび１％乳糖）、Ｍ１７ブロス（Ｄｉｆ
ｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）およびＭＳＫ（０．
１％酵母エキスを補充した９％再構成脱脂粉乳）に生育
させた。示す場合、培地は１％グルコース、１％乳糖ま
たは１％蔗糖を補充した。Ｅ．ｃｏｌｉ菌株はＬＢ
（０．５％ＮａＣｌ、１％トリプトン、１％酵母エキ
ス）に生育させた。培地は平面培養に対し１．５％寒天
を添加して固化した。エリスロマイシン、クロラムフェ
ニコール、アムピシリン、Ｘ−ガル（５−ブロモ−４−
クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシ
ド）およびＩＰＴＧ（イソプロピルβ−Ｄ−チオガラク
トピラノシド）は示すように個個に添加した。ＤＮＡの調製 １） Ｅ．ｃｏｌｉからのプラスミドＤＮＡＥ．ｃｏｌｉ からプラスミドＤＮＡを単離し、必要の場
合Ｍａｎｉａｔｉｓら〔参照文献１６〕に従ってＣｓＣ
ｌ勾配で精製した。 ２） Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓからのゲノムＤＮ
Ａ 細胞は１％グルコースを補充した１５ｍｌのＨＪＬブロ
スに４２℃で嫌気状態（Ａｎａｅｒｏｂｉｃ Ｓｙｓｔ
ｅｍｓ、ＢＢＬ ＧａｓＰａｋ、ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋ
ｉｎｓｏｎ ＆ Ｃｏ．）で一夜生育させた。次に細胞
は遠心分離により採取し、１Ｍ ＮａＣｌで１度洗浄し
た。ゲノムＤＮＡをＤｅｌｌｅｙら〔参照文献１７〕が
報告したように単離し、４℃で貯蔵した。Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＳＴ１１に対する形質
転換方法 Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＳＴ１１に対し形質転
換を最適化するために使用したプラスミドはｐＶＡ８３
８およびｐＭＺ１２であった。これらは双方共Ｅ．ｃｏ
ｌｉおよびＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓに複製し、そ
の抗生物質耐性マーカー、エリスロマイシンおよびクロ
ラムフェニコールはそれぞれ適当な選択に対し双方の宿
主系で機能する。形質転換方法としてエレクトロポレー
ションを使用した。次のパラメータを考慮し、最適化し
た：宿主細胞の生育、細胞の調製、電気パルスのパラメ
ータ、パルスに対するバッファ組成物、形質転換細胞の
発現および平板培養。最適化方法は下記する。
ン、１％酵母エキス、０．５％ＫＨ２ＰＯ４、０．５％
ビーフエキスおよび１％乳糖）、Ｍ１７ブロス（Ｄｉｆ
ｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）およびＭＳＫ（０．
１％酵母エキスを補充した９％再構成脱脂粉乳）に生育
させた。示す場合、培地は１％グルコース、１％乳糖ま
たは１％蔗糖を補充した。Ｅ．ｃｏｌｉ菌株はＬＢ
（０．５％ＮａＣｌ、１％トリプトン、１％酵母エキ
ス）に生育させた。培地は平面培養に対し１．５％寒天
を添加して固化した。エリスロマイシン、クロラムフェ
ニコール、アムピシリン、Ｘ−ガル（５−ブロモ−４−
クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシ
ド）およびＩＰＴＧ（イソプロピルβ−Ｄ−チオガラク
トピラノシド）は示すように個個に添加した。ＤＮＡの調製 １） Ｅ．ｃｏｌｉからのプラスミドＤＮＡＥ．ｃｏｌｉ からプラスミドＤＮＡを単離し、必要の場
合Ｍａｎｉａｔｉｓら〔参照文献１６〕に従ってＣｓＣ
ｌ勾配で精製した。 ２） Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓからのゲノムＤＮ
Ａ 細胞は１％グルコースを補充した１５ｍｌのＨＪＬブロ
スに４２℃で嫌気状態（Ａｎａｅｒｏｂｉｃ Ｓｙｓｔ
ｅｍｓ、ＢＢＬ ＧａｓＰａｋ、ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋ
ｉｎｓｏｎ ＆ Ｃｏ．）で一夜生育させた。次に細胞
は遠心分離により採取し、１Ｍ ＮａＣｌで１度洗浄し
た。ゲノムＤＮＡをＤｅｌｌｅｙら〔参照文献１７〕が
報告したように単離し、４℃で貯蔵した。Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＳＴ１１に対する形質
転換方法 Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＳＴ１１に対し形質転
換を最適化するために使用したプラスミドはｐＶＡ８３
８およびｐＭＺ１２であった。これらは双方共Ｅ．ｃｏ
ｌｉおよびＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓに複製し、そ
の抗生物質耐性マーカー、エリスロマイシンおよびクロ
ラムフェニコールはそれぞれ適当な選択に対し双方の宿
主系で機能する。形質転換方法としてエレクトロポレー
ションを使用した。次のパラメータを考慮し、最適化し
た：宿主細胞の生育、細胞の調製、電気パルスのパラメ
ータ、パルスに対するバッファ組成物、形質転換細胞の
発現および平板培養。最適化方法は下記する。
【００２０】Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＳＴ１１
をグルコースを補充したＨＪＬ培地に４２℃で一夜生育
させた。翌日、３３ｍｌの同じ新鮮培地に７００μｌの
一夜カルチャーを接種し、１−３世代（最高ＯＤ６００
＝０．３）の間４２℃で生育させた。細胞は遠心分離
（５分、２０００ｇ）により採取し、５ｍＭ ＫＰＯ４
バッファ（ｐＨ７）で一度洗浄し、新しく調製した氷冷
ＥＰＭに０．９の正確なＯＤ６００まで穏かに再懸濁し
（ＥＰＭ：０．３Ｍラフィノース、５ｍＭ ＫＰＯ４バ
ッファー（ｐＨ６．１）、０．５ｍＭ ＭｇＣｌ２）、
次いで０℃で氷上に保持した。２００μｌの細胞サスペ
ンジョンを１μｇのプラスミドＤＮＡを含有する予冷
（０℃）した０．２ｃｍエレクトロポレーションキュー
ベットに添加し、混合し、Ｇｅｎｅパルサー装置（Ｂｉ
ｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＵＳＡ）によ
り２５μＦ、４００Ωおよび２．０５ｋＶでエレクトロ
ポレーションした。パルスの直後に、蔗糖を補充した１
ｍｌの１．２倍濃縮Ｍ１７をキューベットに添加し、細
胞と混合し、無菌管に移し、４２℃で４時間インキュベ
ートした。次に４ｍｌの溶融軟質寒天（蔗糖および０．
６％寒天を補充したＭ１７）をカルチャーに添加し、混
合物は蔗糖および２．５μｇ／ｍｌエリスロマイシン
（プラスミドｐＶＡ８３８に対し）または２．５μｇ／
ｍｌのクロラムフェニコール（プラスミドｐＮＺ１２に
対し）を含有するＭ１７寒天プレート上に平板培養し
た。プレートは４２℃で２〜３日嫌気條件下でインキュ
ベートした（ＢＢＬ ＧａｓＰａｋ、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄ
ｉｃｋｉｎｓｏｎ ＆ Ｃｏ．）。
をグルコースを補充したＨＪＬ培地に４２℃で一夜生育
させた。翌日、３３ｍｌの同じ新鮮培地に７００μｌの
一夜カルチャーを接種し、１−３世代（最高ＯＤ６００
＝０．３）の間４２℃で生育させた。細胞は遠心分離
（５分、２０００ｇ）により採取し、５ｍＭ ＫＰＯ４
バッファ（ｐＨ７）で一度洗浄し、新しく調製した氷冷
ＥＰＭに０．９の正確なＯＤ６００まで穏かに再懸濁し
（ＥＰＭ：０．３Ｍラフィノース、５ｍＭ ＫＰＯ４バ
ッファー（ｐＨ６．１）、０．５ｍＭ ＭｇＣｌ２）、
次いで０℃で氷上に保持した。２００μｌの細胞サスペ
ンジョンを１μｇのプラスミドＤＮＡを含有する予冷
（０℃）した０．２ｃｍエレクトロポレーションキュー
ベットに添加し、混合し、Ｇｅｎｅパルサー装置（Ｂｉ
ｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＵＳＡ）によ
り２５μＦ、４００Ωおよび２．０５ｋＶでエレクトロ
ポレーションした。パルスの直後に、蔗糖を補充した１
ｍｌの１．２倍濃縮Ｍ１７をキューベットに添加し、細
胞と混合し、無菌管に移し、４２℃で４時間インキュベ
ートした。次に４ｍｌの溶融軟質寒天（蔗糖および０．
６％寒天を補充したＭ１７）をカルチャーに添加し、混
合物は蔗糖および２．５μｇ／ｍｌエリスロマイシン
（プラスミドｐＶＡ８３８に対し）または２．５μｇ／
ｍｌのクロラムフェニコール（プラスミドｐＮＺ１２に
対し）を含有するＭ１７寒天プレート上に平板培養し
た。プレートは４２℃で２〜３日嫌気條件下でインキュ
ベートした（ＢＢＬ ＧａｓＰａｋ、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄ
ｉｃｋｉｎｓｏｎ ＆ Ｃｏ．）。
【００２１】ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーション Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ のゲノムＤＮＡは適当な
制限酵素により消化し、アガロースゲル電気泳動により
分画し、ＧｅｎｅＳｃｒｅｅｎ膜に移送した。サザンブ
ロットハイブリダイゼーションはサザン〔参照文献９〕
が記載したように行なった。ＤＮＡプローブはランダム
プライミング方法〔１６〕により３２Ｐ標識した。別法
では、ＤＮＡプローブに対し非放射性の、増強された化
学ルミネッセンス標識方法が使用された（ＥＣＬシステ
ム、Ａｍｅｒｓｈａｍ）。ハイブリダイゼーションおよ
びブロットの洗浄はきびしい條件下で行った。
制限酵素により消化し、アガロースゲル電気泳動により
分画し、ＧｅｎｅＳｃｒｅｅｎ膜に移送した。サザンブ
ロットハイブリダイゼーションはサザン〔参照文献９〕
が記載したように行なった。ＤＮＡプローブはランダム
プライミング方法〔１６〕により３２Ｐ標識した。別法
では、ＤＮＡプローブに対し非放射性の、増強された化
学ルミネッセンス標識方法が使用された（ＥＣＬシステ
ム、Ａｍｅｒｓｈａｍ）。ハイブリダイゼーションおよ
びブロットの洗浄はきびしい條件下で行った。
【００２２】他のＤＮＡ操作 アガロースゲル電気泳動、制限酵素による消化、連結、
アルカリリン酸塩処理およびＥ．ｃｏｌｉ菌株の形質転
換は標準方法に従って行った〔参照文献１６〕。合成オ
リゴヌクレオチドはＤ．Ｐｒｉｄｍｏｒｅ（Ｎｅｓｔｅ
ｃ Ｌｔｄ．，スイス）によりＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏ
ｊｙｓｔｅｍｓ ３８０Ｂ ＤＮＡシンセサイザー上で
調製し、Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢからＮａｐ−１０
ゲル濾過カラム上で精製した。ＰＣＲはＳａｉｋｉらに
従って行った〔参照文献１８、１９〕。
アルカリリン酸塩処理およびＥ．ｃｏｌｉ菌株の形質転
換は標準方法に従って行った〔参照文献１６〕。合成オ
リゴヌクレオチドはＤ．Ｐｒｉｄｍｏｒｅ（Ｎｅｓｔｅ
ｃ Ｌｔｄ．，スイス）によりＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏ
ｊｙｓｔｅｍｓ ３８０Ｂ ＤＮＡシンセサイザー上で
調製し、Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢからＮａｐ−１０
ゲル濾過カラム上で精製した。ＰＣＲはＳａｉｋｉらに
従って行った〔参照文献１８、１９〕。
【００２３】例１ ｌａｃオペロン中にｃａｔ遺伝子の組込み Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ のｌａｃオペロンは細菌
ゲノム上に位置し、２つの遺伝子、ラクトースパーミア
ーゼ（ｌａｃＳ）およびβ−ガラクトシダーゼ（ｌａｃ
Ｚ）遺伝子から成る。これらは３ｂｐによってのみ分離
される〔参照文献１２〕。「外来」遺伝子をこのオペロ
ンに、ｌａｃＳおよびｌａｃＺ遺伝子間で３つの遺伝子
それぞれの間で同じ間隔、すなわち３ｂｐを有するよう
に組込み、こうしてオペロンの性質を保存することが本
発明の目的である。ｌａｃＺ遺伝子の発現に対する選択
的圧力は他の２つの遺伝子の発現を保証する。さらに、
「外来」遺伝子の遺伝子座内または、における宿主仲介
自然欠失または転移は多くの場合オペロンの正しい機能
性に影響し、こうしてｌａｃＺ活性に対し選択により除
去される。
ゲノム上に位置し、２つの遺伝子、ラクトースパーミア
ーゼ（ｌａｃＳ）およびβ−ガラクトシダーゼ（ｌａｃ
Ｚ）遺伝子から成る。これらは３ｂｐによってのみ分離
される〔参照文献１２〕。「外来」遺伝子をこのオペロ
ンに、ｌａｃＳおよびｌａｃＺ遺伝子間で３つの遺伝子
それぞれの間で同じ間隔、すなわち３ｂｐを有するよう
に組込み、こうしてオペロンの性質を保存することが本
発明の目的である。ｌａｃＺ遺伝子の発現に対する選択
的圧力は他の２つの遺伝子の発現を保証する。さらに、
「外来」遺伝子の遺伝子座内または、における宿主仲介
自然欠失または転移は多くの場合オペロンの正しい機能
性に影響し、こうしてｌａｃＺ活性に対し選択により除
去される。
【００２４】組込みに対するモデル遺伝子として、クロ
ラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ｃａ
ｔ）遺伝子を選択する。この遺伝子の組込み遺伝子発現
は宿主細胞、すなわちＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓを
抗生物質クロラムフェニコールに耐性にする。これは異
る試験工程に沿って容易に試験し、監視できる。さら
に、有利なアッセイが発現したクロラムフェニコールア
セチルトランスフェラーゼ〔参照文献２０〕量を定量的
に測定するために存在する。
ラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ｃａ
ｔ）遺伝子を選択する。この遺伝子の組込み遺伝子発現
は宿主細胞、すなわちＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓを
抗生物質クロラムフェニコールに耐性にする。これは異
る試験工程に沿って容易に試験し、監視できる。さら
に、有利なアッセイが発現したクロラムフェニコールア
セチルトランスフェラーゼ〔参照文献２０〕量を定量的
に測定するために存在する。
【００２５】適当な遺伝構築を行なうために、ｌａｃＳ
およびｌａｃＺ遺伝子の結合領域を有するｌａｃオペロ
ンの一部を単離し、Ｅ．ｃｏｌｉにクローニングした。
ＰＣＲ工学を使用して試験管内突然変異誘発によりＮｄ
ｅＩ制限部位を導入し、これはＡＴＧ出発コドンと重な
り、ｌａｃＺ遺伝子の手前右側でＣＡ／ＴＡＴＧ配列を
認識する（図３ａ）。２つの遺伝子の間隔はもとのまま
で、配列の変向は間隔領域内であり、遺伝子の一時配列
に影響を与えなかった。ＰＣＲは最初にＮｄｅ１部位を
導入し、ＡＴＧ出発コドンと重なるプライマーによりＬ
ｃ．ｌａｃｔｉｓプラスミドｐＮＺ１２からｃａｔ遺伝
子を増幅し、遺伝子の末端でＴＡＡ終始コドン直後に位
置した。増幅ｃａｔ遺伝子は新しいＮｄｅＩ部位でｌａ
ｃＳおよびｌａｃＺ遺伝子間の新しく創ったＮｄｅＩ部
位中に挿入し、こうして３つの完全に配列された遺伝子
から成る所望する新しいオペロン構造が形成された（図
３ｂ）。
およびｌａｃＺ遺伝子の結合領域を有するｌａｃオペロ
ンの一部を単離し、Ｅ．ｃｏｌｉにクローニングした。
ＰＣＲ工学を使用して試験管内突然変異誘発によりＮｄ
ｅＩ制限部位を導入し、これはＡＴＧ出発コドンと重な
り、ｌａｃＺ遺伝子の手前右側でＣＡ／ＴＡＴＧ配列を
認識する（図３ａ）。２つの遺伝子の間隔はもとのまま
で、配列の変向は間隔領域内であり、遺伝子の一時配列
に影響を与えなかった。ＰＣＲは最初にＮｄｅ１部位を
導入し、ＡＴＧ出発コドンと重なるプライマーによりＬ
ｃ．ｌａｃｔｉｓプラスミドｐＮＺ１２からｃａｔ遺伝
子を増幅し、遺伝子の末端でＴＡＡ終始コドン直後に位
置した。増幅ｃａｔ遺伝子は新しいＮｄｅＩ部位でｌａ
ｃＳおよびｌａｃＺ遺伝子間の新しく創ったＮｄｅＩ部
位中に挿入し、こうして３つの完全に配列された遺伝子
から成る所望する新しいオペロン構造が形成された（図
３ｂ）。
【００２６】組込みｃａｔ遺伝子を有する構造を含むプ
ラスミドをＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ中に形質転換
した。プラスミドはこの宿主系に自律的に複製できない
ので、これらはプラスミドとして維持できず、不稔であ
った。しかし適当な選択を行なうと、宿主細胞ゲノム中
にプラスミドのまれな組込みが得られ、これらが維持さ
れ、受動的に複製される場合、観察し、単離することが
できた。組込み結果の選択はエリスロマイシン耐性遺伝
子をコードしたプラスミドを基準とし、細菌ゲノムと単
一組換えにより形成されるプラスミド間に共組込み体を
単離した（図４ａ）。エリスロマイシン選択圧の解除に
より共組込み体の適当な解離（第２組換え）はドナープ
ラスミド上に導入されたものにより初めのｌａｃ領域の
完全な置換を生じた（４ｂ）。組込みｃａｔ遺伝子の発
現レベルおよび安定性は直接試験できる。
ラスミドをＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ中に形質転換
した。プラスミドはこの宿主系に自律的に複製できない
ので、これらはプラスミドとして維持できず、不稔であ
った。しかし適当な選択を行なうと、宿主細胞ゲノム中
にプラスミドのまれな組込みが得られ、これらが維持さ
れ、受動的に複製される場合、観察し、単離することが
できた。組込み結果の選択はエリスロマイシン耐性遺伝
子をコードしたプラスミドを基準とし、細菌ゲノムと単
一組換えにより形成されるプラスミド間に共組込み体を
単離した（図４ａ）。エリスロマイシン選択圧の解除に
より共組込み体の適当な解離（第２組換え）はドナープ
ラスミド上に導入されたものにより初めのｌａｃ領域の
完全な置換を生じた（４ｂ）。組込みｃａｔ遺伝子の発
現レベルおよび安定性は直接試験できる。
【００２７】ドナープラスミドの構築 ｉ） ｐＢＭ２０、ｐＢＭ２６およびｐＢＭ３３ 切形のｌａｃＺ遺伝子を有するｐＤＰ２２２のＰｓｔＩ
−ＳｐｅＩ断片はその独特のＰｓｔＩおよびＳｐｅＩ部
位で線状化したベクターｐＧＥＭ５−８３８−２中に連
結し、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＺ２３４に対し形質転換した。
細胞は１ｍｇ／ｍｌエリスロマイシンを補充したＬＢプ
レート上で平板培養し、３７℃で一夜生育させた。１個
のコロニーを単離し１００μｇ／ｍｌアンピシリンを補
充したＬＢに生育させた。プラスミドＤＮＡを抽出し、
制限部位マッピングにより分析した。正しい断面を保有
するプラスミドを確認し、ｐＢＭ２０と命名した（図
５）。ベクター本体を短縮し、アンピシリン耐性遺伝子
を除去するために、ｐＢＭ２０はＦｓｐＩ（これはｐＧ
ＥＭ５の１６１７および２８４３の位置で切断〔Ｐｒｏ
ｍｅｇａ、ＵＳＡ〕）により消化し、再連結し、ＢＺ２
３４に対し形質転換した。選択は上記のように同じＬＢ
エリスロマイシンプレート上であった。１．２ｋｂＦｓ
ｐＩ欠失を有するプラスミドを確認し、ｐＢＭ２６と命
名した。
−ＳｐｅＩ断片はその独特のＰｓｔＩおよびＳｐｅＩ部
位で線状化したベクターｐＧＥＭ５−８３８−２中に連
結し、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＺ２３４に対し形質転換した。
細胞は１ｍｇ／ｍｌエリスロマイシンを補充したＬＢプ
レート上で平板培養し、３７℃で一夜生育させた。１個
のコロニーを単離し１００μｇ／ｍｌアンピシリンを補
充したＬＢに生育させた。プラスミドＤＮＡを抽出し、
制限部位マッピングにより分析した。正しい断面を保有
するプラスミドを確認し、ｐＢＭ２０と命名した（図
５）。ベクター本体を短縮し、アンピシリン耐性遺伝子
を除去するために、ｐＢＭ２０はＦｓｐＩ（これはｐＧ
ＥＭ５の１６１７および２８４３の位置で切断〔Ｐｒｏ
ｍｅｇａ、ＵＳＡ〕）により消化し、再連結し、ＢＺ２
３４に対し形質転換した。選択は上記のように同じＬＢ
エリスロマイシンプレート上であった。１．２ｋｂＦｓ
ｐＩ欠失を有するプラスミドを確認し、ｐＢＭ２６と命
名した。
【００２８】別法では、ベクターｐＵＣ−８３８−１は
上記のように消化し、再連結し、ＢＺ２３４に形質転換
したＦｓｐＩであった。ｐＢＭ３１と命名した形成ベク
ターはその独特のＥｃｏＲＩ部位、挿入反応による平滑
末端〔参照文献１６〕で線状化し、連結し、ＢＺ２３４
に対し形質転換した。ｐＢＭ３２と命名した新しいベク
ターはその独特のＰｓｔＩおよびＢａｍＨＩ部位で線状
化し、アガロースゲル電気泳動により精製した１．５５
ｋｂのｐＢＭ２０からのＰｓｔＩ−ＢｇｌＩＩ断片に連
結した。連結混合物はＢＺ２３４に対し形質転換し、細
胞はＬＢエリスロマイシン（１ｍｇ／ｍｌ）寒天プレー
ト上で平板培養し生育させた。１個のコロニーのプラス
ミド含量を分析し、正しいクローンを確認し、ｐＢＭ３
３と命名した（図５）。
上記のように消化し、再連結し、ＢＺ２３４に形質転換
したＦｓｐＩであった。ｐＢＭ３１と命名した形成ベク
ターはその独特のＥｃｏＲＩ部位、挿入反応による平滑
末端〔参照文献１６〕で線状化し、連結し、ＢＺ２３４
に対し形質転換した。ｐＢＭ３２と命名した新しいベク
ターはその独特のＰｓｔＩおよびＢａｍＨＩ部位で線状
化し、アガロースゲル電気泳動により精製した１．５５
ｋｂのｐＢＭ２０からのＰｓｔＩ−ＢｇｌＩＩ断片に連
結した。連結混合物はＢＺ２３４に対し形質転換し、細
胞はＬＢエリスロマイシン（１ｍｇ／ｍｌ）寒天プレー
ト上で平板培養し生育させた。１個のコロニーのプラス
ミド含量を分析し、正しいクローンを確認し、ｐＢＭ３
３と命名した（図５）。
【００２９】ｉｉ） ｐＢＭ３９およびｐＢＭ４２ ｌａｃ ＳとｌａｃＺ遺伝子間のＮｄｅＩ制限部位は図６
に概説したように精製した。ｌａｃＳのＣ−末端を有す
る約９００ｂｐの長い断片はＦｓｐＩ線状化ｐＤＰ２２
８から増幅したＰＣＲであった。プライマーとして使用
した合成オリゴヌクレオチドは５′−ＧＧＴＴＴＴＣＣ
ＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣ（プライマー１、ベクターｐＵＣ
１９にハイブリダイジング）および５′−ＧＴＣＡＴＧ
ＴＴＣＡＴＡＴＧＴＴＡＴＴＣＴＣＣＴＴＴ（プライマ
ー２、ＮｄｅＩ部位を導入）であった。増幅した断片は
ＰｓｔＩおよび消化したＮｄｅＩであり、ＰｓｔＩおよ
びベクターｐＧＥＭ−５２ｆを消化したＮｄｅＩに連結
し、ＢＺ２３４に対し形質転換し、細胞はＬＢアンピシ
リン（１００ｕｇ／ｍｌ）プレート上で生育させるため
選択した。１個のコロニーのプラスミド含量を分析し、
９００ｂｐ断面を有する正しいクローンを確認し、ｐＢ
Ｍ３７と命名した。第２ＰＣＲは線状化ｐＤＰ２２８か
ら合成オリゴヌクレオチド５′−ＡＡＡＧＧＡＧＡＡＴ
ＡＡＣＡＴＡＴＧＡＡＣＡＴＧＡＣ（プライマー３）お
よび５′−ＴＴＧＧＧＡＧＣＴＣＴＣＣＣＴＴＡＡＣＡ
ＡＡＧＡＧＡ（プライマー４、ＢｇｌＩＩの次にＳａｃ
Ｉ部位を含有）を使用して取り出した。約７００ｂｐの
増幅した断片はＳａｃＩおよびＮｄｅＩにより消化し、
ＳａｃＩおよびｐＢＭ３７を消化したＮｄｅＩ中に連結
した。連結混合物はＢＺ２３４に形質転換し、細胞はＬ
Ｂアンピシリン（１００ｕｇ／ｍｌ）プレート上で生育
させた。１個のコロニーのプラスミド含量を分析し、挿
入体を含有する正しいクローンを確認し、ｐＢＭ３８と
命名した。
に概説したように精製した。ｌａｃＳのＣ−末端を有す
る約９００ｂｐの長い断片はＦｓｐＩ線状化ｐＤＰ２２
８から増幅したＰＣＲであった。プライマーとして使用
した合成オリゴヌクレオチドは５′−ＧＧＴＴＴＴＣＣ
ＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣ（プライマー１、ベクターｐＵＣ
１９にハイブリダイジング）および５′−ＧＴＣＡＴＧ
ＴＴＣＡＴＡＴＧＴＴＡＴＴＣＴＣＣＴＴＴ（プライマ
ー２、ＮｄｅＩ部位を導入）であった。増幅した断片は
ＰｓｔＩおよび消化したＮｄｅＩであり、ＰｓｔＩおよ
びベクターｐＧＥＭ−５２ｆを消化したＮｄｅＩに連結
し、ＢＺ２３４に対し形質転換し、細胞はＬＢアンピシ
リン（１００ｕｇ／ｍｌ）プレート上で生育させるため
選択した。１個のコロニーのプラスミド含量を分析し、
９００ｂｐ断面を有する正しいクローンを確認し、ｐＢ
Ｍ３７と命名した。第２ＰＣＲは線状化ｐＤＰ２２８か
ら合成オリゴヌクレオチド５′−ＡＡＡＧＧＡＧＡＡＴ
ＡＡＣＡＴＡＴＧＡＡＣＡＴＧＡＣ（プライマー３）お
よび５′−ＴＴＧＧＧＡＧＣＴＣＴＣＣＣＴＴＡＡＣＡ
ＡＡＧＡＧＡ（プライマー４、ＢｇｌＩＩの次にＳａｃ
Ｉ部位を含有）を使用して取り出した。約７００ｂｐの
増幅した断片はＳａｃＩおよびＮｄｅＩにより消化し、
ＳａｃＩおよびｐＢＭ３７を消化したＮｄｅＩ中に連結
した。連結混合物はＢＺ２３４に形質転換し、細胞はＬ
Ｂアンピシリン（１００ｕｇ／ｍｌ）プレート上で生育
させた。１個のコロニーのプラスミド含量を分析し、挿
入体を含有する正しいクローンを確認し、ｐＢＭ３８と
命名した。
【００３０】プラスミドｐＢＭ３８をＢｓｔＥＩＩおよ
びＤｒａＩＩＩにより消化し、ｌａｃＳおよびｌａｃＺ
遺伝子間に新しい結合を有する形成６５０ｂＰ断片をア
ガロースゲル電気泳動により単離した。同様に、ｐＢＭ
３３およびｐＢＭ２６はＢｓｔＥＩＩおよびＤｒａＩＩ
Ｉにより消化し、ベクター主体を有するこれらの一層大
きい断片を単離し、ｐＢＭ３８からの６５０ｂｐ断片に
それぞれ連結した。連結混合物はＢＺ２３４に形質転換
し、ＬＢエリスロマイシン（１ｍｇ／ｍｌ）プレート上
に平板培養し、３７℃でインキュベートした。１個のコ
ロニーのプラスミド含量を分析し、ｐＢＭ３８から転移
した挿入ＮｄｅＩ部位を有する正しいクローンを確認し
た。ｐＢＭ３３およびｐＢＭ２６由来のプラスミドはそ
れぞれｐＢＭ３９およびｐＢＭ４２と命名した（図５）
びＤｒａＩＩＩにより消化し、ｌａｃＳおよびｌａｃＺ
遺伝子間に新しい結合を有する形成６５０ｂＰ断片をア
ガロースゲル電気泳動により単離した。同様に、ｐＢＭ
３３およびｐＢＭ２６はＢｓｔＥＩＩおよびＤｒａＩＩ
Ｉにより消化し、ベクター主体を有するこれらの一層大
きい断片を単離し、ｐＢＭ３８からの６５０ｂｐ断片に
それぞれ連結した。連結混合物はＢＺ２３４に形質転換
し、ＬＢエリスロマイシン（１ｍｇ／ｍｌ）プレート上
に平板培養し、３７℃でインキュベートした。１個のコ
ロニーのプラスミド含量を分析し、ｐＢＭ３８から転移
した挿入ＮｄｅＩ部位を有する正しいクローンを確認し
た。ｐＢＭ３３およびｐＢＭ２６由来のプラスミドはそ
れぞれｐＢＭ３９およびｐＢＭ４２と命名した（図５）
【００３１】ｉｉｉ）ｐＢＭ４０、ｐＢＭ４３およびｐ
ＢＭ４５ その独特のＳａｌＩ部位で最初に線状化したｐＮＺ１２
からのｃａｔ遺伝子は増幅したＰＣＲであった。ｃａｔ
遺伝子の初めと終りにＮｄｅＩ部位を形成するためにプ
ライマーとして使用した合成オリゴヌクレオチドは５′
−ＡＴＡＴＣＡＴＡＴＧＡＡＣＴＴＴＡＡＴＡＡＡＡＴ
ＴＧＡＴおよび５′−ＡＴＴＡＴＣＡＴＡＴＧＴＴＡＴ
ＡＡＡＡＧＣＣＡＧＴＣＡＴＴＡＧであった。約６７０
ｂｐの長さの増幅断片はＮｄｅＩにより消化し、その独
特のＮｄｅＩ部位で線状化したｐＢＭ３９中に結合し、
アルカリリン酸塩処理をした。連結混合物はＢＺ２３４
に形質転換し、ＬＢエリスロマイシン（１ｍｇ／ｍｌ）
プレート上に平面培養し、３７℃でインキュベートし
た。個個のコロニーのプラスミド含量を分析し、正しい
配 向で挿入したＮｄｅＩ断片、すなわちｌａｃＳおよ
びｌａｃＺと同じ方向で読むｃａｔ遺伝子を有するクロ
ーンを確認し、ｐＢＭ４０と命名した（図５）。
ＢＭ４５ その独特のＳａｌＩ部位で最初に線状化したｐＮＺ１２
からのｃａｔ遺伝子は増幅したＰＣＲであった。ｃａｔ
遺伝子の初めと終りにＮｄｅＩ部位を形成するためにプ
ライマーとして使用した合成オリゴヌクレオチドは５′
−ＡＴＡＴＣＡＴＡＴＧＡＡＣＴＴＴＡＡＴＡＡＡＡＴ
ＴＧＡＴおよび５′−ＡＴＴＡＴＣＡＴＡＴＧＴＴＡＴ
ＡＡＡＡＧＣＣＡＧＴＣＡＴＴＡＧであった。約６７０
ｂｐの長さの増幅断片はＮｄｅＩにより消化し、その独
特のＮｄｅＩ部位で線状化したｐＢＭ３９中に結合し、
アルカリリン酸塩処理をした。連結混合物はＢＺ２３４
に形質転換し、ＬＢエリスロマイシン（１ｍｇ／ｍｌ）
プレート上に平面培養し、３７℃でインキュベートし
た。個個のコロニーのプラスミド含量を分析し、正しい
配 向で挿入したＮｄｅＩ断片、すなわちｌａｃＳおよ
びｌａｃＺと同じ方向で読むｃａｔ遺伝子を有するクロ
ーンを確認し、ｐＢＭ４０と命名した（図５）。
【００３２】プラスミドｐＢＭ４０はＢｓｔＥＩＩおよ
びＤｒａＩＩＩにより消化し、ｃａｔ遺伝子を有する
１．３ｋｂの断片をアガロースゲル電気泳動により単離
した。同様に、ｐＢＭ２６はＢｓｔＥＩＩおよびＤｒａ
ＩＩＩにより消化し、ベクター本体を有する断片を単離
した。２つの単離断片は相互に連結し、ＢＺ２３４に形
質転換し、細胞はＬＢエリスロマイシン（１ｍｇ／ｍ
ｌ）プレート上に生育させた。１個のコロニーのプラス
ミド含量を分析し、正しいクローンを確認し、ｐＢＭ４
３と命名した（図５）。
びＤｒａＩＩＩにより消化し、ｃａｔ遺伝子を有する
１．３ｋｂの断片をアガロースゲル電気泳動により単離
した。同様に、ｐＢＭ２６はＢｓｔＥＩＩおよびＤｒａ
ＩＩＩにより消化し、ベクター本体を有する断片を単離
した。２つの単離断片は相互に連結し、ＢＺ２３４に形
質転換し、細胞はＬＢエリスロマイシン（１ｍｇ／ｍ
ｌ）プレート上に生育させた。１個のコロニーのプラス
ミド含量を分析し、正しいクローンを確認し、ｐＢＭ４
３と命名した（図５）。
【００３３】プラスミドｐＤＰ２１１はＢｇｌＩＩによ
り消化し、１．３ｋｂのｌａｃＺ内部断片はアガロース
ゲル電気泳動により単離した。この断片はｐＢＭ４３に
連結し、これは最初にそのＢｇｌＩＩ部位で線状化し、
アルカリリン酸塩処理をした。連結混合物はＪＭ１０８
に形質転換し、１ｍｇ／ｍｌエリスロマイシン、４０μ
ｇ／ｍｌＸ−ガルおよび１ｍＭ １ＰＴＧを補充したＬ
Ｂプレート上で平板培養した。細胞は３７℃で一夜生育
させた。個個の青色コロニー（ＬａｃＺ＋；〔参照文献
２１〕）のプラスミド含量を単離し、分析した。全体の
ｌａｃＺ遺伝子を保有する正しいクローンを確認し、ｐ
ＢＭ４５と命名した（図５）。
り消化し、１．３ｋｂのｌａｃＺ内部断片はアガロース
ゲル電気泳動により単離した。この断片はｐＢＭ４３に
連結し、これは最初にそのＢｇｌＩＩ部位で線状化し、
アルカリリン酸塩処理をした。連結混合物はＪＭ１０８
に形質転換し、１ｍｇ／ｍｌエリスロマイシン、４０μ
ｇ／ｍｌＸ−ガルおよび１ｍＭ １ＰＴＧを補充したＬ
Ｂプレート上で平板培養した。細胞は３７℃で一夜生育
させた。個個の青色コロニー（ＬａｃＺ＋；〔参照文献
２１〕）のプラスミド含量を単離し、分析した。全体の
ｌａｃＺ遺伝子を保有する正しいクローンを確認し、ｐ
ＢＭ４５と命名した（図５）。
【００３４】ＳＴ１１のゲノム中にｃａｔ遺伝子の組込
み ｉ） 共組込み体の形成 プラスミドｐＢＭ４５は上記のように最適化した形質転
換方法を使用してＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＳＴ
１１中に形質転換した。１％蔗糖および２．５ｕｇ／ｍ
ｌエリスロマイシンを補充したＭ１７寒天プレート上で
選択する場合、１ｕｇの形質転換プラスミドにつき約１
〜１０コロニーが４２℃で２〜３日の嫌気インキュベー
ション後形成された。１個のコロニーを単離し、新鮮寒
天プレート上で精製し、１％蔗糖および２．５ｕｇ／ｍ
ｌエリスロマイシンを補充したＭ１７ブロスに生育させ
た。細胞は遠心分離により採取し、そのゲノムＤＮＡは
上記のように抽出した。ゲノムＤＮＡを消化したＰｓｔ
Ｉ、ＣｌａＩ、ＮｄｅＩおよびＰｓｔＩ−ＢｇｌＩＩの
サザン法を行なった。標識ＤＮＡプローブとしてプラス
ミドｐＢＭ４５、ｐＢＭ３２およびｃａｔ遺伝子を含む
ｐＢＭ４０からの６７０ｂｐ ＮｄｅＩ断片をそれぞれ
使用した。異るサザン法の分析によりプラスミドと細菌
ゲノム間に共組込み体の形成が確証された。すべての分
析の場合、プラスチックの組込みはプラスミドとゲノム
間の相同性ＤＮＡ伸張で普遍的組換えにより仲介して行
った。
み ｉ） 共組込み体の形成 プラスミドｐＢＭ４５は上記のように最適化した形質転
換方法を使用してＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＳＴ
１１中に形質転換した。１％蔗糖および２．５ｕｇ／ｍ
ｌエリスロマイシンを補充したＭ１７寒天プレート上で
選択する場合、１ｕｇの形質転換プラスミドにつき約１
〜１０コロニーが４２℃で２〜３日の嫌気インキュベー
ション後形成された。１個のコロニーを単離し、新鮮寒
天プレート上で精製し、１％蔗糖および２．５ｕｇ／ｍ
ｌエリスロマイシンを補充したＭ１７ブロスに生育させ
た。細胞は遠心分離により採取し、そのゲノムＤＮＡは
上記のように抽出した。ゲノムＤＮＡを消化したＰｓｔ
Ｉ、ＣｌａＩ、ＮｄｅＩおよびＰｓｔＩ−ＢｇｌＩＩの
サザン法を行なった。標識ＤＮＡプローブとしてプラス
ミドｐＢＭ４５、ｐＢＭ３２およびｃａｔ遺伝子を含む
ｐＢＭ４０からの６７０ｂｐ ＮｄｅＩ断片をそれぞれ
使用した。異るサザン法の分析によりプラスミドと細菌
ゲノム間に共組込み体の形成が確証された。すべての分
析の場合、プラスチックの組込みはプラスミドとゲノム
間の相同性ＤＮＡ伸張で普遍的組換えにより仲介して行
った。
【００３５】ｉｉ）共組込み体の解離 ｐＢＭ４５組込み由来の共組込み体を保有する精製ＳＴ
１１菌株の一夜カルチャーは１００ｕ１のカルチャーを
有し、１％乳糖を含有し、エリスロマイシンを含有しな
い４０ｍｌの新鮮Ｍ１７を接種して二次培養し、４２℃
でインキュベートした。細胞の生育が飽和に達した後、
カルチャーの二次培養を同様に反復し、細胞は再び４２
℃で飽和まで生育させた。この二次培養方法を全体で１
５回反復し、その後細胞は稀釈し、Ｍ１７プレート上に
伸ばし、４２℃でインキュベートした。翌日、個個のコ
ロニーは５ｕｇ／ｍｌのエリスロマイシンを含み、およ
び含まない新しいＭ１７プレートに転移し、４２℃で一
夜インキュベートした。エリスロマイシン感受性コロニ
ーからの細胞はＭ１７ブロスに移し、４２℃で生育さ
せ、前記部分で記載したようにそこからゲノムＤＮＡを
抽出した。ゲノムＤＮＡはＰｓｔＩ、ＮｄｅＩおよびＰ
ｓｔＩ−ＢｇｌＩＩにより消化し、アガロースゲル電気
泳動によりサイズ分画し、ＧｅｎｅＳｃｒｅｅｎハイブ
リダイゼーション膜に移した。サザン〔参照文献９〕に
よるＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーションはＤＮＡプ
ローブとしてｐＢＭ３２、ｐＢＭ４５またはｃａｔ遺伝
子を保有する６７０ｂｐ ＮｄｅＩのいずれかを使用し
て行なった。結果から共組込み体の解離はそのエリスロ
マイシン耐性遺伝子を含むプラスミド本体の完全な消失
および相同性反復ＤＮＡ配列の１コピーを生ずることが
確証された。第２組換え体の位置により、ｌａｃオペロ
ンはその始めの野生型配置に再構成されるか、または移
入された新オペロン構造により置換された（図７）。新
オペロン構造、すなわち、ｌａｃＳとｌａｃＺ遺伝子間
に組込まれたｃａｔ遺伝子を含む上記のように単離し、
確認した菌株は本明細書を通してＳＴ１１−Ｃａｔと命
名され、Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｎａｔｉｏｎａｌ ｄ
ｅ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｄｅ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉ
ｓｍｓ（ＣＮＣＭ）ｄｅ １′Ｉｎｓｔｉｔｕｔ Ｐａ
ｓｔｅｕｒ、２５ ｒｕｅ ｄｅ Ｄｏｃｔｅｕｒ Ｒ
ｏｕｘ、７５７２４ Ｐａｒｉｓ Ｃｅｄｅｘ１５、Ｆ
ｒａｎｃｅにブタペスト條約に基づいて０２、０４、９
２に寄託され、番号１−１１９０を与えられた。
１１菌株の一夜カルチャーは１００ｕ１のカルチャーを
有し、１％乳糖を含有し、エリスロマイシンを含有しな
い４０ｍｌの新鮮Ｍ１７を接種して二次培養し、４２℃
でインキュベートした。細胞の生育が飽和に達した後、
カルチャーの二次培養を同様に反復し、細胞は再び４２
℃で飽和まで生育させた。この二次培養方法を全体で１
５回反復し、その後細胞は稀釈し、Ｍ１７プレート上に
伸ばし、４２℃でインキュベートした。翌日、個個のコ
ロニーは５ｕｇ／ｍｌのエリスロマイシンを含み、およ
び含まない新しいＭ１７プレートに転移し、４２℃で一
夜インキュベートした。エリスロマイシン感受性コロニ
ーからの細胞はＭ１７ブロスに移し、４２℃で生育さ
せ、前記部分で記載したようにそこからゲノムＤＮＡを
抽出した。ゲノムＤＮＡはＰｓｔＩ、ＮｄｅＩおよびＰ
ｓｔＩ−ＢｇｌＩＩにより消化し、アガロースゲル電気
泳動によりサイズ分画し、ＧｅｎｅＳｃｒｅｅｎハイブ
リダイゼーション膜に移した。サザン〔参照文献９〕に
よるＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーションはＤＮＡプ
ローブとしてｐＢＭ３２、ｐＢＭ４５またはｃａｔ遺伝
子を保有する６７０ｂｐ ＮｄｅＩのいずれかを使用し
て行なった。結果から共組込み体の解離はそのエリスロ
マイシン耐性遺伝子を含むプラスミド本体の完全な消失
および相同性反復ＤＮＡ配列の１コピーを生ずることが
確証された。第２組換え体の位置により、ｌａｃオペロ
ンはその始めの野生型配置に再構成されるか、または移
入された新オペロン構造により置換された（図７）。新
オペロン構造、すなわち、ｌａｃＳとｌａｃＺ遺伝子間
に組込まれたｃａｔ遺伝子を含む上記のように単離し、
確認した菌株は本明細書を通してＳＴ１１−Ｃａｔと命
名され、Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｎａｔｉｏｎａｌ ｄ
ｅ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｄｅ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉ
ｓｍｓ（ＣＮＣＭ）ｄｅ １′Ｉｎｓｔｉｔｕｔ Ｐａ
ｓｔｅｕｒ、２５ ｒｕｅ ｄｅ Ｄｏｃｔｅｕｒ Ｒ
ｏｕｘ、７５７２４ Ｐａｒｉｓ Ｃｅｄｅｘ１５、Ｆ
ｒａｎｃｅにブタペスト條約に基づいて０２、０４、９
２に寄託され、番号１−１１９０を与えられた。
【００３６】組込み遺伝子の安定性 １％乳糖を補充したＭ１７培地に生育した菌株ＳＴ１１
−Ｃａｔの一夜カルチャー８０μｌを使用して８０ｍｌ
の滅菌ＭＳＫに接種し、４２℃でインキュベートした。
細胞の生育が飽和に達した後、カルチャーの二次培養は
連続的に１５回反復し、各回共８０μｌの均質化乳カル
チャーを８０ｍｌの新鮮ＭＳＫ培地に移し、４２℃で細
胞を生育させた。全体で約１５０世代の生育に相当する
これらの転移後、細胞は１％乳糖を補充したＭ１７寒天
プレート上で平面培養し、４２℃でインキュベートし
た。３００の各個コロニーは４ｕｇ／ｍｌクロラムフェ
ニコールを補充したＭ１７寒天プレート上に採り、４２
℃でインキュベートした。すべての分析コロニーはクロ
ラムフェニコールプレート上で生育でき、こうして永続
的にｃａｔ遺伝子が遺伝した。
−Ｃａｔの一夜カルチャー８０μｌを使用して８０ｍｌ
の滅菌ＭＳＫに接種し、４２℃でインキュベートした。
細胞の生育が飽和に達した後、カルチャーの二次培養は
連続的に１５回反復し、各回共８０μｌの均質化乳カル
チャーを８０ｍｌの新鮮ＭＳＫ培地に移し、４２℃で細
胞を生育させた。全体で約１５０世代の生育に相当する
これらの転移後、細胞は１％乳糖を補充したＭ１７寒天
プレート上で平面培養し、４２℃でインキュベートし
た。３００の各個コロニーは４ｕｇ／ｍｌクロラムフェ
ニコールを補充したＭ１７寒天プレート上に採り、４２
℃でインキュベートした。すべての分析コロニーはクロ
ラムフェニコールプレート上で生育でき、こうして永続
的にｃａｔ遺伝子が遺伝した。
【００３７】組込みｃａｔ遺伝子の活性 ＳＴ１１および菌株ＳＴ１１−ｃａｔを４２℃で一夜Ｍ
ＳＫに生育させた。翌日、１００ｕｌの各カルチャーを
５０ｍｌのＭＳＫおよび１０ｕｇ／ｍｌクロラムフェニ
コールを補充した５０ｍｌ ＭＳＫに移し、４２℃でイ
ンキュベートした。２４時間後、ＳＴ１１およびＳＴ１
１−Ｃａｔの双方の菌株はＭＳＫで生育し、乳を凝固し
たが、菌株ＳＴ１１−Ｃａｔのみはクロラムフェニコー
ルを含むＭＳＫに生育でき、乳を凝固することができ
た。ＳＴ１１は４２℃で３日の長いインキュベーション
後でさえ生育できなかった。結果は表１に要約する。
ＳＫに生育させた。翌日、１００ｕｌの各カルチャーを
５０ｍｌのＭＳＫおよび１０ｕｇ／ｍｌクロラムフェニ
コールを補充した５０ｍｌ ＭＳＫに移し、４２℃でイ
ンキュベートした。２４時間後、ＳＴ１１およびＳＴ１
１−Ｃａｔの双方の菌株はＭＳＫで生育し、乳を凝固し
たが、菌株ＳＴ１１−Ｃａｔのみはクロラムフェニコー
ルを含むＭＳＫに生育でき、乳を凝固することができ
た。ＳＴ１１は４２℃で３日の長いインキュベーション
後でさえ生育できなかった。結果は表１に要約する。
【表１】
【００３８】ＳＴ１１およびＳＴ１１−Ｃａｔは１％乳
糖、１％蔗糖または１％グルコースを補充し、０．５％
ガラクトースを添加し、または添加しない３０ｍｌのＭ
１７ブロスに生育させた。細胞は中間対数相まで生育さ
せ、遠心分離により収穫し、２回ＴＥ（５０ｍＭトリス
ＨＣｌ ｐＨ７．８、２ｍＭＥＤＴＡ）で洗浄し、１ｍ
ｌのＴＥに再懸濁した。細胞サスペンジョンは氷上に保
持し、４℃で１時間渦装置でガラスビーズ（４２５〜６
００ｕｍ）により細胞を摩砕して抽出物を得た〔参照文
献２２〕。細胞砕片およびガラスビーズは遠心分離（４
℃で１５分 １３０００ｇ）により沈澱させ、細胞を含
まない上澄はＷ．Ｖ．Ｓｈａｗが記載したアッセイ〔参
照文献２０〕に従って特定のクロラムフェニコールアセ
チルトランスフェラーゼ活性を測定するために使用し
た。結果は表２に示す。酵素活性は全タン白ｍｇにつき
ユニットとして示す。
糖、１％蔗糖または１％グルコースを補充し、０．５％
ガラクトースを添加し、または添加しない３０ｍｌのＭ
１７ブロスに生育させた。細胞は中間対数相まで生育さ
せ、遠心分離により収穫し、２回ＴＥ（５０ｍＭトリス
ＨＣｌ ｐＨ７．８、２ｍＭＥＤＴＡ）で洗浄し、１ｍ
ｌのＴＥに再懸濁した。細胞サスペンジョンは氷上に保
持し、４℃で１時間渦装置でガラスビーズ（４２５〜６
００ｕｍ）により細胞を摩砕して抽出物を得た〔参照文
献２２〕。細胞砕片およびガラスビーズは遠心分離（４
℃で１５分 １３０００ｇ）により沈澱させ、細胞を含
まない上澄はＷ．Ｖ．Ｓｈａｗが記載したアッセイ〔参
照文献２０〕に従って特定のクロラムフェニコールアセ
チルトランスフェラーゼ活性を測定するために使用し
た。結果は表２に示す。酵素活性は全タン白ｍｇにつき
ユニットとして示す。
【表２】
【００３９】例２ ｌａｃオペロン中にｃａｔ遺伝子の組込み： 正しい共組込み体の解離に対し別の選択系 例１では、ゲノム−プラスミド共組込み体構造の適当な
解離は選別消費時間および本来エリスロマイシン耐性形
質転換細胞のエリスロマイシン感受性子孫の分析により
見出すことができる。この試験工程は例２で実証するよ
うに改良できる。プラスミド組込みおよび解離の同じ方
法により、ＳＴ１１の野生型ｌａｃＺ遺伝子を、遺伝子
の始め（ＮｄｅＩ部位）と欠失したその最初のＥｃｏＲ
Ｉ部位（ヌクレオチド位置３１９で〔参照文献２３〕間
にＤＮＡの伸張を有する派生コピーと置換した（図
８）。形成ｌａｃＺマイナス菌株、ＳＴ１１−Δｌａｃ
Ｚは形質転換に対する新しい宿主細胞として供した。組
込みに対するドナープラスミドとして、ｐＢＭ４０に類
似の構築を使用した。これは斜めの組込み（すなわち、
最初の組換え体）に対しこの位置で優先的に起こるよう
に延びたｃａｔ遺伝子の上流で相同領域を有する。
解離は選別消費時間および本来エリスロマイシン耐性形
質転換細胞のエリスロマイシン感受性子孫の分析により
見出すことができる。この試験工程は例２で実証するよ
うに改良できる。プラスミド組込みおよび解離の同じ方
法により、ＳＴ１１の野生型ｌａｃＺ遺伝子を、遺伝子
の始め（ＮｄｅＩ部位）と欠失したその最初のＥｃｏＲ
Ｉ部位（ヌクレオチド位置３１９で〔参照文献２３〕間
にＤＮＡの伸張を有する派生コピーと置換した（図
８）。形成ｌａｃＺマイナス菌株、ＳＴ１１−Δｌａｃ
Ｚは形質転換に対する新しい宿主細胞として供した。組
込みに対するドナープラスミドとして、ｐＢＭ４０に類
似の構築を使用した。これは斜めの組込み（すなわち、
最初の組換え体）に対しこの位置で優先的に起こるよう
に延びたｃａｔ遺伝子の上流で相同領域を有する。
【００４０】新しい宿主は構築したプラスミドにより形
質転換し、適当なＸ−ガルプレート上でｌａｃＺマイナ
ス表面型を示すエリスロマイシン耐性コロニーを単離
し、分析した。組込みプラスチックの形成共組込み体構
造は図９に示す。適当な解離（ｃａｔ遺伝子の下流の第
２組換え体）はゲノムに挿入したｃａｔ遺伝子を保持
し、エリスロマイシン耐性遺伝子を有するベクタープラ
スミド本体を除去し、先端を切ったｌａｃＺ遺伝子を再
構成する（図９）。従って、正しい解離は乳糖含有培
地、例えば乳でエリスロマイシンを存在させずに共組込
み体保有細胞を生育させることにより選択できる。全体
の試験方法に対し、組込まれる遺伝子、すなわち、本例
ではｃａｔ遺伝子が有無活性に対し選択または選別する
必要はなかった。従って、統一発生、異種発生または人
工遺伝子は形成する表現型に関係なくこの方法で組込
み、発現できる。安定して維持され、その発現は適当な
生育條件により調節できる。
質転換し、適当なＸ−ガルプレート上でｌａｃＺマイナ
ス表面型を示すエリスロマイシン耐性コロニーを単離
し、分析した。組込みプラスチックの形成共組込み体構
造は図９に示す。適当な解離（ｃａｔ遺伝子の下流の第
２組換え体）はゲノムに挿入したｃａｔ遺伝子を保持
し、エリスロマイシン耐性遺伝子を有するベクタープラ
スミド本体を除去し、先端を切ったｌａｃＺ遺伝子を再
構成する（図９）。従って、正しい解離は乳糖含有培
地、例えば乳でエリスロマイシンを存在させずに共組込
み体保有細胞を生育させることにより選択できる。全体
の試験方法に対し、組込まれる遺伝子、すなわち、本例
ではｃａｔ遺伝子が有無活性に対し選択または選別する
必要はなかった。従って、統一発生、異種発生または人
工遺伝子は形成する表現型に関係なくこの方法で組込
み、発現できる。安定して維持され、その発現は適当な
生育條件により調節できる。
【００４１】ドナープラスミドの構築 ｉ） ｐＢＭ４６ プラスミドｐＤＰ３０１はＡｃｔＩＩにより消化し、平
滑末端し〔参照文献２４〕、次にＢｓｔＥＩＩにより消
化した。ｌａｃＳ遺伝子の部分を保有する約１６９０ｂ
Ｐ断片はアガロースゲル電気泳動により単離した。同様
に、ｐＢＭ４０はＰｓｔＩにより消化し、平滑末端とし
〔参照文献２４〕、さらにＢｓｔＥＩＩにより消化し、
ベクター本体を含む一層大きい断片をアガロースゲル電
気泳動により単離した。２つの単離断片は標準方法〔参
照文献１６〕に従って相互に連結し、ＢＺ２３４に形質
転換し、ＬＢエリスロマイシン（１ｍｇ／ｍｌ）プレー
ト上に加えた。３７℃でインキュベーション後、１個の
コロニーを単離し、そのプラスミド含量を分析した。正
しいクローンはｐＢＭ４６と命名した（図８）。
滑末端し〔参照文献２４〕、次にＢｓｔＥＩＩにより消
化した。ｌａｃＳ遺伝子の部分を保有する約１６９０ｂ
Ｐ断片はアガロースゲル電気泳動により単離した。同様
に、ｐＢＭ４０はＰｓｔＩにより消化し、平滑末端とし
〔参照文献２４〕、さらにＢｓｔＥＩＩにより消化し、
ベクター本体を含む一層大きい断片をアガロースゲル電
気泳動により単離した。２つの単離断片は標準方法〔参
照文献１６〕に従って相互に連結し、ＢＺ２３４に形質
転換し、ＬＢエリスロマイシン（１ｍｇ／ｍｌ）プレー
ト上に加えた。３７℃でインキュベーション後、１個の
コロニーを単離し、そのプラスミド含量を分析した。正
しいクローンはｐＢＭ４６と命名した（図８）。
【００４２】ｉｉ）ｐＢＭ４９ プラスミドｐＢＭ４６はＥｃｏＲＩおよびＮｄｅＩによ
り消化し、平滑末端とし〔参照文献２４〕、ベクター本
体を含む最大断片をアガロースゲル電気泳動により単離
した。次にそれ自体で再連結し、ＢＺ２３４に形質転換
し、細胞はＬＢエリスロマイシン（１ｍｇ／ｍｌ）プレ
ート上で平面培養した。インキュベーション後、１個の
コロニーのプラスミド含量を分析し、正しいクローンは
ｐＢＭ４９と命名した（図８）。
り消化し、平滑末端とし〔参照文献２４〕、ベクター本
体を含む最大断片をアガロースゲル電気泳動により単離
した。次にそれ自体で再連結し、ＢＺ２３４に形質転換
し、細胞はＬＢエリスロマイシン（１ｍｇ／ｍｌ）プレ
ート上で平面培養した。インキュベーション後、１個の
コロニーのプラスミド含量を分析し、正しいクローンは
ｐＢＭ４９と命名した（図８）。
【００４３】ＳＴ１１−ΔｌａｃＺの構築 プラスミドｐＢＭ４９は上記最適形質転換方法を使用し
てＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＳＴ１１中に形質転
換した。１％蔗糖および２．５ｕｇ／ｍｌエリスロマイ
シンを補充したＭ１７寒天プレート上で選択すると、変
質転換プラスミドｕｇにつき約１−１０コロニーを４２
℃で２−３日の嫌気的インキュベーション後形成した。
１個のコロニーを単離し、新鮮な寒天プレート上で精製
し、エリスロマイシンを含まないＭ１７蔗糖ブロスに生
育させた。一夜カルチャーを新鮮な同じブロスに稀釈し
（１：５０）、再び飽和まで生育させた。この二次培養
は数回反復し、エリスロマイシンを存在させずに３０世
代以上細胞の生育を確保した。その後、細胞は４０ｕｇ
／ｍｌ Ｘ−ガルを含有するＭ１７蔗糖プレート上で平
板培養し、微好気條件下（ＢＢＬ ＣａｍｐｙＰａｋ、
Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＆ Ｃｏ．）でイ
ンキュベーションした。１個の白色コロニー（ｌａｃＺ
マイナス：〔参照文献２１〕）を採取し、寒天プレート
上で少なくとも３回再線状し、生育させることにより精
製した。次に、これらは２．５ｕｇ／ｍｌエリスロマイ
シンを含有するＭ１７蔗糖プレート上に再線条してエリ
スロマイシン感受性を試験した。ｌａｃＺマイナスおよ
びエリスロマイシン感受性表現型の細胞を確認し、その
ゲノムＤＮＡを単離し、サガン法により分析した。図９
ａに示したその予期遺伝子型を確証し、新しい菌株はＳ
Ｔ１１−ΔｌａｃＺと命名した。ブダペスト條約に基づ
いてＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｎａｔｉｏｎａｌｄｅ Ｃ
ｕｌｔｕｒｅｓ ｄｅ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ
（ＣＮＣＭ）ｄｅ １′Ｉｎｓｔｉｔｕｔ Ｐａｓｔｅ
ｕｒ、２５、ｒｕｅ ｄｅ Ｄｏｃｔｅｕｒ Ｒｏｕ
ｘ、７５７２４ Ｐａｒｉｓ Ｃｅｄｅｘ １５、Ｆｒ
ａｎｃｅに２９．０３．９３に寄託し、番号ＣＮＣＭ１
−１２９３を与えられた。
てＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＳＴ１１中に形質転
換した。１％蔗糖および２．５ｕｇ／ｍｌエリスロマイ
シンを補充したＭ１７寒天プレート上で選択すると、変
質転換プラスミドｕｇにつき約１−１０コロニーを４２
℃で２−３日の嫌気的インキュベーション後形成した。
１個のコロニーを単離し、新鮮な寒天プレート上で精製
し、エリスロマイシンを含まないＭ１７蔗糖ブロスに生
育させた。一夜カルチャーを新鮮な同じブロスに稀釈し
（１：５０）、再び飽和まで生育させた。この二次培養
は数回反復し、エリスロマイシンを存在させずに３０世
代以上細胞の生育を確保した。その後、細胞は４０ｕｇ
／ｍｌ Ｘ−ガルを含有するＭ１７蔗糖プレート上で平
板培養し、微好気條件下（ＢＢＬ ＣａｍｐｙＰａｋ、
Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＆ Ｃｏ．）でイ
ンキュベーションした。１個の白色コロニー（ｌａｃＺ
マイナス：〔参照文献２１〕）を採取し、寒天プレート
上で少なくとも３回再線状し、生育させることにより精
製した。次に、これらは２．５ｕｇ／ｍｌエリスロマイ
シンを含有するＭ１７蔗糖プレート上に再線条してエリ
スロマイシン感受性を試験した。ｌａｃＺマイナスおよ
びエリスロマイシン感受性表現型の細胞を確認し、その
ゲノムＤＮＡを単離し、サガン法により分析した。図９
ａに示したその予期遺伝子型を確証し、新しい菌株はＳ
Ｔ１１−ΔｌａｃＺと命名した。ブダペスト條約に基づ
いてＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｎａｔｉｏｎａｌｄｅ Ｃ
ｕｌｔｕｒｅｓ ｄｅ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ
（ＣＮＣＭ）ｄｅ １′Ｉｎｓｔｉｔｕｔ Ｐａｓｔｅ
ｕｒ、２５、ｒｕｅ ｄｅ Ｄｏｃｔｅｕｒ Ｒｏｕ
ｘ、７５７２４ Ｐａｒｉｓ Ｃｅｄｅｘ １５、Ｆｒ
ａｎｃｅに２９．０３．９３に寄託し、番号ＣＮＣＭ１
−１２９３を与えられた。
【００４４】ＳＴ１１−ΔｌａｃＺのゲノム中にｃａｔ
遺伝子の組込み ｉ） 共組込み体の形成 手順は例１の共組込み体の形成に対し記載したものと同
じである。しかし、ドナープラスミドとしてｐＢＭ４６
（ｐＢＭ４５の代りに）および宿主細胞としてＳＴ１１
−ΔｌａｃＺ（ＳＴ１１の代りに）を使用した。エリス
ロマイシン耐性形質転換細胞は１％蔗糖および４０ｕｇ
／ｍｌ Ｘ−ガルを含有するＭ１７寒天プレート上で測
定したようにｌａｃＺマイナスであった。 ｉｉ）共組込み体の解離 １個のコロニーはｐＭＢ４６の形質転換後最初の選択プ
レート（蔗糖およびエリスロマイシンを含むＭ１７寒
天）から直接採取し、各１％の蔗糖および乳糖を補充、
エリスロマイシンを含まない１０ｍｌのＭ１７培地に生
育させた。１ｍｌの飽和カルチャーを１００ｍｌ ＭＳ
Ｋに接種するために使用し、次に４２℃で１−２日イン
キュベートした。生育後、細胞は１％蔗糖、１％乳糖、
および４０ｕｇ／ｍｌ Ｘ−ガルを含有するＭ１７寒天
プレート上に線条し、４２℃で微好気條件下でインキュ
ベートした。大部分ないしすべてのコロニーは青色、す
なわちｌａｃＺプラスであった。
遺伝子の組込み ｉ） 共組込み体の形成 手順は例１の共組込み体の形成に対し記載したものと同
じである。しかし、ドナープラスミドとしてｐＢＭ４６
（ｐＢＭ４５の代りに）および宿主細胞としてＳＴ１１
−ΔｌａｃＺ（ＳＴ１１の代りに）を使用した。エリス
ロマイシン耐性形質転換細胞は１％蔗糖および４０ｕｇ
／ｍｌ Ｘ−ガルを含有するＭ１７寒天プレート上で測
定したようにｌａｃＺマイナスであった。 ｉｉ）共組込み体の解離 １個のコロニーはｐＭＢ４６の形質転換後最初の選択プ
レート（蔗糖およびエリスロマイシンを含むＭ１７寒
天）から直接採取し、各１％の蔗糖および乳糖を補充、
エリスロマイシンを含まない１０ｍｌのＭ１７培地に生
育させた。１ｍｌの飽和カルチャーを１００ｍｌ ＭＳ
Ｋに接種するために使用し、次に４２℃で１−２日イン
キュベートした。生育後、細胞は１％蔗糖、１％乳糖、
および４０ｕｇ／ｍｌ Ｘ−ガルを含有するＭ１７寒天
プレート上に線条し、４２℃で微好気條件下でインキュ
ベートした。大部分ないしすべてのコロニーは青色、す
なわちｌａｃＺプラスであった。
【００４５】１個の青色コロニーを採取し、２．５ｕｇ
／ｍｌエリスロマイシンまたは１０ｕｇ／ｍｌクロラム
フェニコールを含有する寒天プレート上で生育に対し試
験した。すべての試験したコロニーはエリスロマイシン
感受性であり、クロラムフェニコール耐性であった。こ
れらのゲノムＤＮＡのサザン法による分析を行い、ＳＴ
１１−ｃａｔからのＤＮＡと直接比較した。すべての結
果からこの方法で得た細菌菌株はＳＴ１１，ｃａｔと同
一であることが確証された。
／ｍｌエリスロマイシンまたは１０ｕｇ／ｍｌクロラム
フェニコールを含有する寒天プレート上で生育に対し試
験した。すべての試験したコロニーはエリスロマイシン
感受性であり、クロラムフェニコール耐性であった。こ
れらのゲノムＤＮＡのサザン法による分析を行い、ＳＴ
１１−ｃａｔからのＤＮＡと直接比較した。すべての結
果からこの方法で得た細菌菌株はＳＴ１１，ｃａｔと同
一であることが確証された。
【図１】Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのｌａｃオペロ
ンの遺伝子構成であって、ａは野生型ＳＴ１１のｌａｃ
オペロンを表わし、ｂはＳＴ１１−ｃａｔのものを表わ
す。ｌａｃＳおよびｌａｃＺはそれぞれラクトースパー
ミアゼおよびβ−ガラクトシダーゼをコードする遺伝子
を示す。プロモータよびターミネータを示す。
ンの遺伝子構成であって、ａは野生型ＳＴ１１のｌａｃ
オペロンを表わし、ｂはＳＴ１１−ｃａｔのものを表わ
す。ｌａｃＳおよびｌａｃＺはそれぞれラクトースパー
ミアゼおよびβ−ガラクトシダーゼをコードする遺伝子
を示す。プロモータよびターミネータを示す。
【図２】ｌａｃオペロンの部分を保有するクローンの物
理的マップである。クローニングに使用した制限部位を
示す。
理的マップである。クローニングに使用した制限部位を
示す。
【図３】遺伝子構築を示す説明図であって、ａはｌａｃ
ＳおよびｌａｃＺ遺伝子間にＮｄｅＩ制限部位を形成す
る修飾を示す。＊印は突然変異した塩基対を示す。ｂは
形成したＮｄｅＩ部位にｃａｔ遺伝子の試験管内挿入を
実証する。
ＳおよびｌａｃＺ遺伝子間にＮｄｅＩ制限部位を形成す
る修飾を示す。＊印は突然変異した塩基対を示す。ｂは
形成したＮｄｅＩ部位にｃａｔ遺伝子の試験管内挿入を
実証する。
【図４】染色体組込みと解離を示す説明図であってａは
相同性組換えにより染色体にプラスミドの組込みを示
し、ｂは相同性組換えにより染色体の共組込み体の解離
を示し、染色体にオペロンの修飾コピーを残す。プラス
ミド本体に位置するエリスロマイシン耐性標識、ｅｒｙ
ｒを示す。
相同性組換えにより染色体にプラスミドの組込みを示
し、ｂは相同性組換えにより染色体の共組込み体の解離
を示し、染色体にオペロンの修飾コピーを残す。プラス
ミド本体に位置するエリスロマイシン耐性標識、ｅｒｙ
ｒを示す。
【図５】構築プラスミドの物理的マップである。制限部
位を示す。角型かっこ内のＢｇｌＩＩ部位はベクタープ
ラスミドのＢａｍＨＩ部位にクローニングすることによ
り先端を切ったことを示す。ｃａｔ遺伝子の配向は矢で
示す。
位を示す。角型かっこ内のＢｇｌＩＩ部位はベクタープ
ラスミドのＢａｍＨＩ部位にクローニングすることによ
り先端を切ったことを示す。ｃａｔ遺伝子の配向は矢で
示す。
【図６】ｐＢＭ３８の構築の概略図である。ＰＣＲに対
し使用したプライマーは拡大して示す。クローニングに
対し使用した制限部位を示す。
し使用したプライマーは拡大して示す。クローニングに
対し使用した制限部位を示す。
【図７】ｐＢＭ４５共組込み体および解離最終生成物の
物理的マップであって、ａはＳＴ１１のｌａｃオペロン
の制限マップを示し、ｂは２つの可能な確認された共組
込み体のものを示し、ｃは双方の共組込み体からの２つ
の可能な確認された解離最終生成物のものを示す。Ｅ．
Ｃｏｌｉ由来のベクタープラスミドＤＮＡは単純な線と
して示す。制限部位は：Ｂ，ＢｇｌＩＩ；Ｃ，Ｃｌａ
Ｉ；Ｎ，ＮｄｅＩ；Ｐ，ＰｓｔＩ；およびＳ，ＳｐｅＩ
である。
物理的マップであって、ａはＳＴ１１のｌａｃオペロン
の制限マップを示し、ｂは２つの可能な確認された共組
込み体のものを示し、ｃは双方の共組込み体からの２つ
の可能な確認された解離最終生成物のものを示す。Ｅ．
Ｃｏｌｉ由来のベクタープラスミドＤＮＡは単純な線と
して示す。制限部位は：Ｂ，ＢｇｌＩＩ；Ｃ，Ｃｌａ
Ｉ；Ｎ，ＮｄｅＩ；Ｐ，ＰｓｔＩ；およびＳ，ＳｐｅＩ
である。
【図８】構築プラスミドクの物理的マップである。制限
部位は：Ａ，ＡａｔＩＩ；Ｐ，ＰｓｔＩ；Ｅ，ＥｃｏＲ
Ｉ；Ｓ，ＳｐｅＩ；Ｂ，ＢｇｌＩＩ；Ｎ，ＮｄｅＩであ
る。ｐＢＭ４９の構築に使用したＥｃｏＲ１のみを示
す。角型かっこ内に示す制限部位はクローニング方法に
より先端を切った。
部位は：Ａ，ＡａｔＩＩ；Ｐ，ＰｓｔＩ；Ｅ，ＥｃｏＲ
Ｉ；Ｓ，ＳｐｅＩ；Ｂ，ＢｇｌＩＩ；Ｎ，ＮｄｅＩであ
る。ｐＢＭ４９の構築に使用したＥｃｏＲ１のみを示
す。角型かっこ内に示す制限部位はクローニング方法に
より先端を切った。
【図９】ＳＴ１１−ΔｌａｃＺのゲノムにｃａｔ遺伝子
の組込みを示す図である。Ａは相同性組換えによりＳＴ
１１−ΔｌａｃＺのゲノムにプラスミドｐＢＭ４６の組
込みを示す。この第１組換えの遺伝子座は（ｉ）＋字で
印す。Ｂは形成する共組込み構造を示す。プラスミド主
体の配列は波状線として示し、エリスロマイシン耐性遺
伝子を示す（ｅｒｙｒ）。角型かっこは（ｉｉ）共組込
み構造の解離に導く第２組換えを示す。Ｃは解離後の組
込まれたｃａｔ遺伝子および再構成ｌａｃＺ遺伝子を示
す。制限部位は図８に示したものと同じである。
の組込みを示す図である。Ａは相同性組換えによりＳＴ
１１−ΔｌａｃＺのゲノムにプラスミドｐＢＭ４６の組
込みを示す。この第１組換えの遺伝子座は（ｉ）＋字で
印す。Ｂは形成する共組込み構造を示す。プラスミド主
体の配列は波状線として示し、エリスロマイシン耐性遺
伝子を示す（ｅｒｙｒ）。角型かっこは（ｉｉ）共組込
み構造の解離に導く第２組換えを示す。Ｃは解離後の組
込まれたｃａｔ遺伝子および再構成ｌａｃＺ遺伝子を示
す。制限部位は図８に示したものと同じである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:46） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:225） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:44） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:01） (72)発明者 ベト モレ スイス国モリ − マルゴ，ルート ドゥ モリ −マルゴ（番地なし)
Claims (26)
- 【請求項１】 食品級の微生物のＤＮＡについて少なく
とも１つの必須シストロンの手前のオペロンにプロモー
タのない外来遺伝子を組込む方法において、この遺伝子
をオペロンの機能的部分として発現させ、かつ遺伝子を
標準培地で生育させて必須シストロンの正しい機能性に
ついて選択的圧力により安定的に維持、発現させること
を特徴とする、上記外来遺伝子の組込み方法。 - 【請求項２】 微生物自身により複製することができ
ず、かつ必須シストロンの手前のオペロンの機能的部分
として外来遺伝子を有するドナープラスミドによりこの
微生物を形質転換させる、請求項１記載の方法。 - 【請求項３】 プラスミド−ゲノム共組込み体を含む形
質転換体を単離し、そしてこの共組込み体を解離して外
来遺伝子の正しい組込みを行う、請求項２記載の方法。 - 【請求項４】 微生物はＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、
Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕ
ｓ、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕ
ｓ、ＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓおよびＢｉｆｉｄｏｂａ
ｃｔｅｒｉｕｍ属、およびＰｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍおよびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属の食品
級菌株からなる群から選択した乳酸菌である、請求項１
記載の方法。 - 【請求項５】 微生物はＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ
ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓまたはＬａｃｔｏｂａｃｉｌ
ｌｕｓ ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓである、請求項１記載の
方法。 - 【請求項６】 標準培地は乳主体の培地、特に乳、乳透
過液またはホエイである、請求項１記載の方法。 - 【請求項７】 外来遺伝子は相同、非相同または合成起
源のもの、あるいはその組合せである、請求項１記載の
方法。 - 【請求項８】 ドナープラスミドはオペロンの全部また
は一部を有するプラスミド由来のものである、請求項２
記載の方法。 - 【請求項９】 ドナープラスミドはその微生物より他の
宿主系でそれ自体複製することができ、そしてまた微生
物および他の宿主系で機能的である選択可能な遺伝子マ
ーカーを有する、請求項２記載の方法。 - 【請求項１０】 他の宿主系はＥ．ｃｏｌｉである、請
求項９記載の方法。 - 【請求項１１】 オペロンはｌａｃオペロンである、請
求項１記載の方法。 - 【請求項１２】 必須のシストロンはｌａｃＺ遺伝子で
ある、請求項１１記載の方法。 - 【請求項１３】 ドナープラスミドはプラスミドｐＤＰ
２１１、ｐＤＰ２２２、ｐＤＰ２２８および／またはｐ
ＤＰ３０１由来のものである、請求項２または１１記載
の方法。 - 【請求項１４】 ドナープラスミドはオペロンｌａｃの
野生型配列を修飾してｌａｃＳおよびｌａｃＺ遺伝子間
にＮｄｅＩ制限部位を得、ついでこの外来遺伝子を得た
ＮｄｅＩ部位に挿入することにより得られる、請求項２
または１１記載の方法。 - 【請求項１５】 ドナープラスミドはｐＢＭ４５であ
る、請求項１４記載の方法。 - 【請求項１６】 微生物をエレクトロポレーションによ
り形質転換させる、請求項２記載の方法。 - 【請求項１７】 必須シストロン内に欠失をもつ微生物
の派生コピーを調整し、この欠失は形質転換中に完成さ
れるものであり、ついで共組込み体を単純解離させる、
請求項３記載の方法。 - 【請求項１８】 欠失はｌａｃＺ遺伝子の初めとその最
初のＥｃｏＲＩ部位間に供される、請求項１１または１
７記載の方法。 - 【請求項１９】 派生コピーはＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉ
ｌｕｓ ＣＮＣＭＩ−１２９３菌株である、請求項１７
記載の方法。 - 【請求項２０】 ドナープラスミドはｐＢＭ４６であ
る、請求項１７記載の方法。 - 【請求項２１】 請求項１から２０のいずれか１項に記
載の方法により得た遺伝的に修飾した微生物。 - 【請求項２２】 請求項２から１６のいずれか１項に記
載の方法を行うための微生物の派生コピー。 - 【請求項２３】 このコピーはＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉ
ｌｕｓ ＣＮＣＭＩ−１２９３菌株である、請求項２２
記載の派生コピー。 - 【請求項２４】 請求項２から２０のいずれか１項に記
載の方法を行うためのドナープラスミド。 - 【請求項２５】 食品級の基質を請求項２１記載の微生
物により発酵させる、発酵方法。 - 【請求項２６】 請求項２５記載の発酵方法により得ら
れる食品または食品添加物。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP92105973A EP0569604A1 (en) | 1992-04-07 | 1992-04-07 | Integrative gene-expression in Streptococcus salivarius ssp.thermophilus |
| AT92105973.9 | 1992-04-07 |
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