JPH06511390A - 抗核抗体検査用マクロファージ系細胞株、マクロファージ系細胞株を利用した抗体検出方法およびスライドの調製 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ｒ！ｃｔｘ抗体検査用マクロファージ系ｗｔｍ株、マクロファージ系細胞株を利 用した抗体検出方法およびスライドの調製発明の分野 本発明はマクロファージ系細胞株ＩＴ−１，ならびにこれを利用して抗核抗体（ ａｎｔｉ−ｎｕｃｌｅａｒ　ａｎｔｉｂｏｄｙ＋以下ｒＡＮＡＪ　と略称する） を検出する方法および抗核抗体検出用スライドを製作する方法に関する。

発明の背景 血清的自家抗体の存在を検査するＡＮＡ検査は、自家免疫疾患である全身性エリ テマトーデスＣｓｙｓｔｅｍｉｃ　１ｕｐｕｓ　ｅｒｙｔｂｅｍａｔｏｓｕｓ、 以下ｒｓＬＥＪ　と略称する）。

シェーグレン（Ｓｊｏｇｒｅｎ）症候群、硬皮症、混合性結合組織病、リウマチ 性関節炎、小児慢性多発性関節炎、その他の自己免疫性疾患などの全身性リウマ チ疾患に適用される。

ＡＮＡ検査によって一次的に自己免疫疾患と判定された患者は、ＤＮＡ、ヒスト ン、抽出性核抗原（ｅｘｔｒａｃｔａｂｌｅ　ｎｕｃｌｅａｒ　ａｎｔｉ（ａｎ ：　ＥＮＡ）たとえばＳｍ（Ｓｍｉｔｈ）、　ｎＲＮ　Ｐ（ｎｕｃｌｅａｒ　ｒ ｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｆｎ）、Ｓ　Ｓ　−Ａ（Ｓｊｏｇｒｅｎ　ａｓｓ ｏｃｉ≠狽■■ ａｎｔｉｇｅｎ　Ａ　）、５Ｓ−Ｂ、５ｃｌ−７０，Ｊｏ−１，ｒＲＮＰなとの 抗原に対する具体的な抗体検定試験を行なって、その病名を決定する。

抗体の特性と力価は、１９８２年にＡＦ−ＣＤＣ（ムｒｔｈｒｉｔｉｓ　Ｆｏｕ ｎｄａｔｆｏｎ−Ｃｅｎｔｅｒｇ　ｆｏｒ　Ｄｉｓｅａｓｅ　Ｃｏｎｔｒｏｌ） の「抗核抗体に関する血清標準化会議」［Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ　Ｒｈｅｕ＋＋、 　２５．１００３．１９８２］で開発した標準血清によって標準化され、同時に 、免疫蛍光方法を利用する検査において蛍光の等級がきめられたスライドを利用 することによって、蛍光顕微鏡の不一致または買的差が改善された。　また、フ ルオレシン・イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）と結合した抗血清の濃度。

蛍光物質と蛋白質との混合比なども改善された〔＾−，Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｐａ ｔｈｏｌ、　８２．５７゜１９８４）。

自己免疫疾患の診断において不可欠なＦ　Ａ　Ｎ　Ａ　（Ｆｌｕｏｒ＠５ｃｅｎ ｔ　Ａｎｔｉｎｕｃｌｅａｒａｎｔｉｂｏｄｙ）検査にとって最も重要なことは 、基質の選択である。　従来のＡＮＡ検査において、実験動物の肝臓、腎臓など 臓器の冷凍組織切片（ｃｒｙｏｉｔａｔ　ｔｉｓｓｕｅｇｅｃｃｉｏａ）が基質 として眉いられたが、最近は培養された人間由来細胞が主に使用され、ＨＥｐ− ２５１胞（ＡＴＣＣＣＣＬ−２３）がその代表である。　このようにして、種− 属の特異性や臓器の特異性を克服することができた。

培養された細胞は、冷凍組織の切片より通常核が大きく、＃定のｃＸ抗原の含有 量が多く多様であり、蛍光様相の判読がやさしいので、偽陰性判定の可能性を著 しく小さくする。　細胞株をスライドで培養すると分裂中の細胞が観察され、こ れによって拭動原体（ａｎｔｉ−ｃｅｎｔｒｏｍｅｒｅ）抗体、増殖細胞だけに 見られる抗ＰＣＮＡ　（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｌｎｇ　ｃｅｌｌ　ｎｕｃｌｅａ ｒ　ａｎｔｉｇｅｎ）抗体など、従来診断と鑑別がむずかしかった蛍光様相を、 より客観的かつ正確に判断できる。

しかしながら、ＨＥｐ−２細胞は人体に由来する細胞であるが、喉頭癌から分離 した履ａｒｔｓｓであるため、単純スライドに培養する際に、その付着率が思わ しくない、１１た、いわゆるＡＮＡ陰性狼蒼（ＡＮＡ　ｎｅｇａｔｉｖｅ　ｌｕ ｐｕｇ）と呼ばれる患者群からは、ＡＮＡが検出されない欠点がある。

以上の欠点を改良するために本発明者は、新しい基質の開発に着手した結果。

正常な人の骨髄から誘導したマクロファージ株（以下ｒＩＴ−ＩＪと略称する。

ＫＣＣＭ−１００３８）が、上記した欠点がなく、ＡＮＡ検査の基質として有用 であることを発見して本発明を完成するに至った。

ＡＮＡ検査用基質としてマクロファージを研究することになった理論的背景は次 のようである。

第一に、マクロファージは免疫反応で抗原伝達細胞Ｃａｎｔｉｇｅｎ　ｐｒｅｓ ｅｎｔｉｎｇ　ｃｅｌｌ）の作用をするので、自身（ｓｅｌｆ）と非０（ｎｏｎ −ｓｅｌｆ　）を区別するためにも自己免疫抗原を絢しくそして豊富に含有する 可能性が大なことである。

第二に、マクロファージはガラス付着率が高いので、基質用スライドの製作が簡 便で経済的なことである。

第三に、ＩＴ−１細胞が腫瘍に由来する細胞ではないので・ＡＮＡ検査の偽陰性 の可能性が減少できることである。

従来は、マクロファージは培養によっては細胞株として株立されないというのが 通説であった。　しかし１本発明者は後述する実施例にもみるように、細胞株の 株立に成功し本発明を完成した。

発明の要約 従って、本発明の目的は、ＡＮＡ検査で基質として用いられるマクロファージ系 Ｈｉ胞株を提供することである。

本発明のいまひとつの目的は、マクロファージ系細胞株を利用して抗核抗体を検 出する方法を提供することである。

本発明のなお別の目的は、マクロファージ系ｉｉｔｍ株を固定したＡＮＡ検査検 査ラスライド供することである。

本発明の他の目的および利点は、以下に詳細な記述が進むにつれて明らかになる であろう。

発明の詳細な説明 本発明において、マクロファージ系細胞株の株化に用いるマクロファージは。

正常な人の骨髄から無菌条件下、穿刺採取されたものである。

分離されたマクロファージは、５〜２０％の牛脂児の血清を補充したＲＰＭＩ− １６４０培地で継代培養することによって細胞株を確立できる。　また。

Ｈａｍ’ｓ　Ｆ、、Ｋｍ地またはＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅ ａｚｌｅ’ｓ培地においても培養が可能である。　とくにビタミンなどの添加剤 を要しないで、１０％牛脂児の血清を加えたＲＰＭＩ−１６４０でｌ　Ｘ　Ｉ　 Ｏ’ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度を保ち０．１ｍｌを接種すれば、５Ｂａには９芽が 密生し、その増殖力も旺盛である。

上記の方法によってつくられた細胞株を、ｒｌＴ−ＩＪと命名した。

マクロファージ細胞株は、ＡＮＡ検査に利用するとき、ガラススライドに固定す ることができる。１１定化の方法は通常のＮ胞担体固定化方法で実施することが できる。　たとえば、培養されたＩＴ−１細胞培養液を、牛脂児の血清を補った ＲＰＭＩ−１６４０培地で稀釈したのちスライドに接種し、３０〜４２℃の培養 器で１８〜３０時間はど培養し、有機極性溶媒たとえば、メタノール、エタノー ル、アセトンなどを使って固定化する。

マクロファージ細胞株ＩＴ−１を用いてＡＮＡ検査用スライドを製作すれば、ガ ラスへの付着性がすぐれ、不瓜品が減じ、接種細胞株と培養液の量および培養時 間が節約されるなど、多くの利点がある。

ＩＴ−１を用いたＡＮＡ検査は次のように実施することができる。すなわち。

ＩＴ−１と標準血清を接触させた後、ＦＩＴＣ−ラベル化した人のガンマグロブ リンに対して兎の抗体を反応させ、蛍光顕微鏡で観察する。

以下、本発明により提供されるＩＴ−１ｌｌ胞株の特性を記述する。

１、形態 原上皮細胞（ｅｐｉｔｈｓｌｏｌｄ）形態が主であり、マクロファージ形（ｍａ ｃｒｏｐｈａｇｅ−１１ｋｅ）および多核巨大細胞形態も時として見うけられる 。

２、サイズ ＨＥｐ−２細胞にくらべ１．５倍の大きさである６３、細胞化学検査（ｃｙｔｏ ｃｈｅｓｉｓｔｒｙ；　Ｃｏ１ｏｒ　Ａｔ１ａｓ　ｏｒ　Ｃ１１ｎｉｃａｌ　［ Ｉｅｍａｔｏｌｏｇｙ　ｓｏ。

Ｉｇａｋｕ−Ｓｈｏｉｎ、　１９８６１α−ナフチルアセテートエステラーゼ： 強い酸性定期的Ａｃ１ｄ−５ｃｈｌｆｆ　：陽性ナフトールＡＳＤクロロアセテ ートエステラーゼ：陰性ペルオキシダーゼ、陰性 スーダンブラックＢ、陰性 ４、リゾソーム活性能（ｌｙｓｏｓｏｓａｌ　ａｃｔｉｖｉｔｙ）アクリジンオ レンジ染色において、核の周辺に多数のオレンジレッド色のリゾソーム顆粒が観 察された（Ａｔｌａｓ　ｏｒ　Ｂｌｏｏｄ　Ｃｅ１ｌｓ　１９５．　Ｌｅａ　＆ 　Ｆｅｂｉｇｅｒ。

＋９８８）。

５、Ｆｃ収容体および責食作用（ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ）免疫グロブリンＧ （ＩｇＧ）でおおわれているラテックス粒子（Ｂｅｈｒｉｎｇ社。

ドイツ）とともに培養したところ、ＩＴ−１細胞の周辺に多数のラテックス粒子 が結合されることと、寅食されることが観察された。

Ｚｅｎａ　Ｗｅｒｂの分類法（Ｂａｓｉｃａｌ　ａｎｄ　Ｃｌ１ｎｉｃａｌ　ｌ ｓｓｕｎｏｌｏｇｙ＋　９８．＾ｐｐｌｅｔｏｎ　ａｎｄＬａｎｇｅ、　１９８ ７）によれば、ＩＴ−１はマクロファージ系列の細胞であることが明らかである 。

またラッキー社のガンマインターフェロン（ＬＢＤ−００１）が１０００単位／ ｍｌ添加された際、ＩＴ−１の増殖が停止し、ＨＬＡ−ＤＲの出現が増加するこ とが観察された。Ｂｅｃｋｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社のＡｎｔｉ−ＭＬＡ− ＤＲ−ＦＩＴＣ５ｊｌをＲＰＭＩ培地で１：１０の比で稀釈し、ＩＴ−１！Ｉ胞 浮蓄液５０ｇ１（ＩＸ　Ｉ　Ｏ’）に入れ、氷水浴の中で３０分間反応させ、Ｐ ＢＳ　（リン酸塩緩衝生理食塩水）で洗浄し、蛍光顕微鏡で観察。

上記のすべての記述により、ＩＴ−１は増殖能力のある反応性マクロファージ細 胞であることが確認される。

図面の簡単な説明 第１図は１本発明により提供されるＩＦスライドを実寸大で示す、　図において 、Ａはガラス板をあられし、Ｂ（小円で示した）はスライド上に固定されたマク ロファージ系細胞をあられす。

以下実施例を示して本発明をより詳しく説明する。　ただし本発明はこれらの例 に限られるものではない。

実　施　例 ＬＩＬ五上　マクロファージ細胞の分離および細胞株の株化正常な人の骨髄を無 −条件下に穿刺して骨髄細胞を採取し、シグマ社のヒストバク（Ｈｉｓｔｏｐａ ｑｕｅ）　１０７７を入れである遠心分離チューブに注ぎ、２０℃の温度と４０ ０Ｇの速度で３０分間遠心分離し、単核細胞だけを得た。　この単核細胞を、１ ０％の牛胎児血清を加えたＲＰＭＩ−１８４０ＣＧｉｂｃｏ社製品）１５ｓｌを 含有している７５ａｄの培養フラスコに接種し、５％の炭酸ガスを含むように調 整された３７℃の培養器で３日間培養したのち、付着しないリンパ球などの細胞 を培養液で洗浄して取り除いた。　培養器に付着した細胞は、２０％の牛胎児血 清を添加したＲＰＭＩ−１６４０で継続的に増殖し、７日後トリプシンを用いて 処理した。　培養増殖は２個のフラスコで繰返えされ、５日目の終りごろ二度目 のトリプシン処理を行ない、４個の培養器に９株して培養した。　培養液を３日 ごとに換え、２８日経通後は牛胎児の血清濃度を１０％に減じた培養液で培養し た。　この方法でマクロファージ系細胞株ＩＴ−１を得る二とができた。

二の細胞株は１９９２年７月１５日付で韓国種菌協会（Ｋｏｒｅａｎ　Ｆｅｄｅ ｒａｔｉｏｎ　ｏｆＣｕＵｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　ｏｒ　Ｍｉｃｒｏ− ｏｒｇａｎｉｓｍ）にＫＦＣＣ−１０７７２号で寄託された。　この寄託は、１ ９９３年７月１４日付でブタベスト条約にもとづく国際寄託に切換えられ、ＫＣ ＣＭ−１００３８の受託番号が与えられた。

寒凰更主　スライドの準備 培養されたＩＴ−１細胞液を２　Ｘ　１０’ｃｅｌｌ／ｍｌになるように１０％ の牛胎児血清を加えたＲＰＭＩ−１６４０培地で稀釈し、免疫蛍光法に用いるた めのスライド（以下「工Ｆスライド」と略称する）を滅菌し、孔ごとに糟釈液３ ０＃Ｉを接種した。　５％炭酸ガスに調整された３７℃の培養器で２４時間培養 した。　各スライドから培養液を除き、ＰＢＳで洗浄し、９５％メタノール中に １０分間浸して細胞を固定した。　このように調製したスライドは、４℃で一年 はど保存することができた。

１１１１　ＨＥｐ−２１１胞を利用したスライドの準備市販されているＡＮＡ検 査用スライドがＨＥｐ−２細胞を用いているので、この細胞株を培養してスライ ドを調製する方法を比較例にとりあげた。

ＨＥｐ−２細胞をｌ　Ｘ　Ｉ　Ｏ’″ｃｅｌｌ／ｍｌになるように仔牛の１０％ 血清が添加されたＲＰＭＩ−１８４０培地で稀釈した後、ＩＦスライドに３０ｉ １を接種した。

細胞が沈んで付着した時、１２０１の培地な答礼に９株してスライドの表面が培 地でおおわれるようにし、５％炭酸ガスに調整された３７℃培養器で４８時間培 養した。　培地を取り除いた後、ＰＢＳで洗浄し、９５％メタノールに１０分間 浸して固定した。

ｍユ　細胞株を用いたＡＮＡ検査 ＡＦ−ＣＤＣ標準血清＃１．＃２．＃３．＃６を２倍ずつに稀釈して、１２０〜 ｌ　：１２８０の比の血清溶液とした。　それぞれ３０ｊｌをＩＴ−１およびＨ Ｅｐ−２スライドに与え、高湿度下、３０分間、室温で反応させた。　反応後、 ＰＢＳを満たしたコブラン瓶に入れ、シェーカーにより２００　ｒｐｍで振とう し。

洗浄して乾燥した。　１：４０に稀釈されたＦＩＴＣラベル化のヒトガンマグロ ブリンに対する兎の抗体（Ｄａｋｏ社製品）３０ｓｌを各スライドに適用して、 高湿度下、室温で３０分間反応させた。　ＰＢＳで１０分間洗い、０．２エバン スブルー溶液（防腐剤を加えて４℃で保管する）でカウンター染色を施し、再び ＰＢＳで洗浄した。　残ったＰＢＳを濾紙で吸い取り、グリセロール−ＰＢＳ溶 液を用いて蛍光顕微鏡下で４００倍で観察した。

顕微鏡で観察した蛍光様相は、標準血清＃１においては休息細胞と分裂細胞が。

核全体または周囲だけを染められ、標準血清＃２と＃３は部分的に染められない ところのある斑点的形態であり、標準血清＃６においては核小体（ｎｕｃｌｅｏ ｌａｒ）型に着色されていた＋　標準血清＃２．＃３．＃ｆ３の上記結果は、休 息細胞において観察されたことである。　これらの結果は、ＡＰ−ＣＤＣで提示 した蛍光様相と一致する。

さらに、蛍光の強度をつぎのように区分して、稀釈倍率に伴う力価を比較した。

結果を表１に示す。

等級　蛍光の強度 ４＋　強い ３＋　十分 ２＋　識別可能 １＋　かろうじて識別可能 表１によれば、ＨＥｐ−２細胞の場合、標準血清＃１と＃２．＃６は、１：３２ ０、＃３はＬ　：　６４０の稀釈比率において充分な蛍光を発し、ＩＴ−１の場 合も同じ様相を示した。　ＡＦ−ＣＤＣでは、標準血清＃１．＃３に対して１： １６０〜ｌ：６４０、＃２と＃６に対してはｌ：８０〜ｌ：３２０の患者血液稀 釈比を推めている。　ＨＥｐ−２１１胞およびＩＴ−１細胞の両細胞とも、ＡＦ −ＣＤＣ推薦の範囲内に入った。

表Ｉ　ＡＦ−ＣＤＣ標準血清に対するタイターの比較ＡＦ−ＣＤＣ標準血清 稀釈倍率　１１　＃２　＃３　＃６ ■と２　ＩＴゴ　魅と２　ＩＴユ　匹と２　１Ｔ−１町１ゴエ　■ユ１：２０　 ４＋　４＋　４＋　４＋　４＋　４＋　４＋　４＋１：４０　４＋　４＋　４＋ 　４＋　４＋　４＋　４＋　４十１８０　４＋　４＋　４・ト　４＋　４＋　４ ＋　４＋　４＋１＋１６０　４＋　４＋　４＋　４＋　４＋　４＋　３＋　４＋ １＋３２０　４＋　３＋　３＋　３＋　４＋　３＋　３＋　３＋に６４０　１＋ 　２＋　１＋　２＋　３＋　３＋　２＋　２＋１：＋２８０　−　１＋　１＋　 −２＋　１＋　１＋　１＋その他の標準血清（ＡＦ−ＣＤＣ標準血清＃４．＃５ ．＃７．＃８および＃９）をＩＴ−１スライドに適用し各血清に関しあられれた 蛍光パターンを、上記と同様にして観察した。　この試験においては、ＡＦ−Ｃ ＤＣ＃４と＃５は１：１２８０まで斑点形態、＃７は１：３２０まで斑点形態、 ＃８は１：１２８０まで分散的斑点形態で分裂細胞にも陽性を示し、＃９はｌ： ６４０まで斑点形態であった。

また、　Ｉ闘ｕｎｏｖｉｉｉｏｎ社の標準血清中、抗Ｊｏ−１は１°３２０まで 、抗ｒＲＮＰは１：６４０までみな１ｉＩｌ！！買（ｃｙｔｏｐｌａｓ＋＋ｉｅ ）型が観察された。

顕微鏡で観察する時、スライドの１２個の孔にすべて細胞が付着していれば判読 が容易であるが、はがれていった不良率は、ＩＴ−１細胞においては９／６０ｏ 、ＨＥｐ−２１１胞において９５／６００であった。　これによって付着率が優 秀であることが知られる。　かつ、スライドの上に接種する細胞の数と培養液を １１５に、また培養時間も半分に減らすことができた。

去息五土　臨床実験での応用結果 ＡＮＡ検査において偽陰性を示す傾向のある、抗５Ｓ−Ａ／Ｒｏ抗体だけをもっ ている患者６７名（二重免疫拡散法で確１りの血清を採取して実験したところ。

ＩＴ−１においては１００％、ＨＥｐ−２１１胞においては８８％のＡＮＡ陽性 亭を示した。

患者群　ＳＬＥ！ＰＰ＠６１名（グループＡ）、全身性硬化症患者２０名（グル ープＢ）、混合性結合組織病１８名（グループＣ）、を対象にして実験したとこ ろ、ＨＥｐ−２においてそれぞれ９５％、８５％、１００％の陽性、ＩＴ−１に おいてはそれぞれ１００％、９５％、１００％の陽性を示し、本発明の細胞株を 用いた場合には正確なＡＮＡ検査が可能であることを証明した。

本明細書に記載された実施例および実施態様は単に例示的なものであって、本発 明が属する技術分野で通常の知識を有する者であれば、これらの例を基礎にして 多くの変形と変更を加えることができようが、このような変形と変更は、本発明 の要旨および範囲と、添付の特許請求の範囲内に含まれるものである。

フロントページの続き （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＰＴ、ＳＥ） 、０Ａ（ＢＦ、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、　ＣＩ、　ＣＭ、　ＧＡ、　ＧＮ、　ＭＬ、 　ＭＲ，ＮＥ、　ＳＮ。

ＴＤ、　ＴＧ）、　ＡＵ、　ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＣＡ、　ＣＺ。

Ｆ　Ｉ、　ＨＵ、Ｊ　Ｐ、　ＬＫ、　ＭＧ、　ＭＮ、　ＭＷ、　Ｎｏ、　ＮＺ、 　ＰＬ、　ＲＯ，ＲＵ、　ＳＤ、　ＳＥ、　ＳＫ、　ＵＡ、　ＵＳ

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. １．抗核抗体を検出するために使用するマクロファージ系細飽体。
2. ２．マクロファージ系細飽株がＩＴ−１（ＫＣＣＭ−１００３８）であることを 特徴とする請求の範囲第１項のマクロファージ系細飽株。
3. ３．マクロファージ系細飽株を被験対象から採取した体液試料と接触させ、次い でフルオレシンイソチオシアネートと反応させることを特徴とする、体液中の抗 核抗体を検出する方法。
4. ４．マクロファージ系細飽株がＩＴ−１（ＫＣＣＭ−１００３８）であることを 特徴とする請求の範囲第３項の方法。
5. ５．被験対象が自己免疫疾患を保有するものであることを特徴とする請求の範囲 第３項の方法。
6. ６．孔（Ｗｅｌｌ）に固定されたマクロファージ系細飽株を含むことを特徴とす る、抗核抗体検出用のスライド。
7. ７．マクロファージ系細飽株がＩＴ−１（ＫＣＣＭ−１００３８）であることを 特徴とする請求の範囲第６項のスライド。