JPH06510851A - 酵素捕獲アッセイ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 酵素捕獲アッセイ 本発明は、サンプル中の酵素、特にヒト分泌アセチルコリンエステラーゼを測定 するための方法およびキットに関する。ヒト分泌アセチルコリンエステラーゼの 測定は、神経管欠損症またはアルツハイマー病の検出を可能にする。

神経管欠損症（ｌｌｅｕｒａｌ　Ｔｕｂｅ　Ｄｅｆｅｃｔｓ：　Ｎ　Ｔ　Ｄ　ｓ 　）は、ヒト胎児の中枢神経系（Ｃｅｎｔｒａｌ　ｎｅｒｖｏｕｓ　ｓｙｓｔｔ ａｍ：　ＣＮ　Ｓ　）の一群の構造異常である。ＮＴＤｓは、胚形成中に神経管 が正しく閉鎖しないことから生じる。ＮＴＤには主として三つの型がある。

（１）無脳症、この場合、閉鎖不全は神経管の上部で起きる。その結果、乳児は 死産になる。

（２）脳ヘルニア、これは比較的まれであり、閉鎖不全は神経軸の僅か下方で起 きる。乳児は殆ど麻痺を持たずに生き残るが、直管性で、発育が著しく遅れ、し ばしば１目である。

（３）を椎披裂：この場合、閉鎖不全は下方で起こり、その結果、乳児はを髄の 一部が露出した状態で生まれる。これは脚の痙！、失調、腰、膝および足の変形 を来す。これらの乳児の約９０％は、手術しないと死亡するだろう。

ＮＴＤの発生率は、世界中でかなり変動している。罹患率は、ヨーロッパでは出 産光１０，０００人につき６〜１３人である。ＮＴＤは現在、次の方法により診 断されている。

（１）遺伝カウンセリング・これは、夫婦が危険グループに入るかどうか、即ち 、彼らが以前に障害のある児あるいは親または近い親戚を持っているかどうかを 見出すために、家族歴を調べることによって行われる。この方法の欠点は、全Ｎ ＴＤｓの９６％以上が、この障害の危険があるとは予め考えられなかった夫婦に 起きることである。

（２）超音波走査（ＵＳ）・これは、多くの胎児異常を同定するのに極めて有用 であることが証明されている。しかし、以下の幾つかの欠点がある。

（ａｌＵｓは無脳症の検出には１００％の精度を有するが、を椎披裂には８０％ の精度しか有していない。

（ｂｌ　走査装置のすベレーターの経験に頼っている。

（ｃｌ　走査を極めて早期の妊娠齢で行うと、誤診が起きる。

（３）アルファーフェトプロティン（ＡＦＰ）・これは７０．０００ダルトンの 分子量を有する糖タンパク質である。これは通常は胚卵黄嚢により、後に胎児肝 臓により分泌される。これは羊膜液（Ａｍｎｉｏｔｉｃ　Ｆｌｕｉｄ：　Ａ　Ｆ 　）中に拡散し、次いで母体循環に拡散する。

ＡＦＰレベルは、ＮＴＤ胎児を持つ女性の母体血液中で１昇することが認められ た。現在、免疫アッセイによるその測定は、ＵＳと組み合わせて、ＮＴＤのため の主な診断試験である。

通常、ＡＦＰは母体血清で測定される。上昇した値は、ＵＳ走査により、次いで 羊水穿刺により追跡される。次いで羊膜液（ＡＦ）がＡＦＰについて試験される 。しかし、ＡＦＰには次の問題がある。

（ａｌＡＦＰの正常レベルは、母体血清中では妊娠齢によりかなり変動するので 、妊娠齢についての正確な知識が必要である。

ｆｂｌＡＦ中のＡＦＰレベルも妊娠齢により変動する。更に、ＡＦ中のＡＦＰの アッセイに関する主な問題は、ＡＦサンプルに胎児血液および／または母体血液 が夾雑するために、擬似陽性の可能性があることである。

英国の共同研究によれば、ＡＦＰ測定により僅か８０％のＮＴＤＬか検出されな いことが見出されている。

（４）神経−特異的アセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）：ＮＴＤの主な欠 損は神経管の不完全な閉鎖にあるので、多くの神経誘導タンパク質および他の成 分がＡＦ中に見出されること、また、母体血清中に拡散することが予想される。

従って、これらのものはＮＴＤに対する有力なマーカーであろう。１９７９年、 Ｓｍ１ｔｈ　ｅｔ　ａｌ。

（Ｌａｎｃｅｔ、　Ｌ、　６８５．１９７９１　は、ＮＴＤＩＩ＋）診断を向上 するたメツ補充試験として、ＡＦ中のＡＣｈＥの分析を提案した。コリンエステ ラーゼは、コリンエステルをコリンに加水分解する一部の酵素である。

血清、筋および脳に存在しているプソイド−コリンエステラーゼは、ブチリルコ リンに対して基質優先性を有する。アセチルコリンエステラーゼ（Ａ　Ｃｈ　Ｅ ）は、アセチルコリンに対して基質優先性を有する。二つの型は免疫学的および 生物化学的に異なっている。

ＡＣｈＥｓは、球形および非対称形の複数の形態を有する。後者は主として筋組 織中に見出されろ。球形のものは、主に中枢神経系および赤血球（ＲＢＣ）にあ る。これらは単量体、二量体または四量体として存在している。球形ＡＣｈＥは 膜に結合しているか、または可溶性である。

ヒトの脳では、約７０％のＡＣｈＥが膜に結合しており、１００％の赤血球ＡＣ ｈＥが膜に結合している。中枢神経系可溶性ＡＣｈＥはそれ自体、複数の形態を 有する。その大半は、界面活性剤の存在下でのその挙動によって示されるように 、膜−結合ＡＣｈＥから誘導されると考えられる。

神経性可溶性ＡＣｈＥの一つの型は、分泌ＡＣｈＥ　（ｓＡＣｈＥ）として知ら れている。これは神経細胞により分泌され、明確な電気泳動移動度を有し、鴫乳 動物脳を髄液（ｃｅｒｓｂｒｏｓｐｉｎａｌ　ｆｌｕｉｄ；Ｃ３Ｆ）中に見出さ れる唯一の形態であり、界面活性剤により影響されず、これがセブアロース（商 標）−４Ｂゲル上に固定された場合に、ＡＣｈＥ阻害荊である塩化エドロホニウ ムに特異的に結合する唯一の形態である。ヒト脳ＡＣｈＥの分泌形態の単離およ び部分的特性決定は文献に記載されている　ｆＧａｒｄｎｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、 Ｂｌｏｃｈｅｍ。

Ｓｏｃ、Ｔｒａｎｓ、、　１４．１２３４−１２３５．１９８６１゜羊膜液（Ａ Ｆ）には、プソイド−ＣｈＥに加えて、三つの形態のＡＣｈＥがある。単量体（ ４，０８１、二量体＋５．５　Ｓ＋および四量体ｆｉｏ、３　Ｓ＋である。最初 の二つの起源は明確でない。しかしこの二量体は、赤証球（ＲＢＣ）中に見出さ れる二量体膜−結合ＡＣｈＥと非常に類似している。四量体形は、神経−特異的 形態であり、分泌ＡＣｈＥ　（ｓＡＣｈＥ）　である。この形態ノ量はＮＴＤに おいて６２倍にまでなる。

ＡＦ中のＡＣｈＥは、現在、三つの方法で検出されている。即ち、（ａｔ　酵素 的・アッセイ用エステラーゼのための標準Ｅｌ１ｍａｎ試験を用いる。この試験 には、ＡＣｈＥとプソイド−ＣｂＥとを識別できるように、特異性の高い阻害剤 を使用する必要がある。その阻害剤は、ＡＣｈＥの異なる形態を職別できない。

従って、ＡＦサンプルに胎児または母体の血液が夾雑している場合には役に立た ない。

この試験の最近の変更は、蔗糖濃度勾配遠心分離、次いでＥｌｌ■ａｎ試験によ り、異なる分子形態を予め分離することを伴う。これには超遠心機および一昼夜 の回転が必要で、試験が複雑になる。更にこの方法は、５ＡＣｈＥと、類似の分 子量を有する他の脳由来ＡＣｈＥとを識別しない。

ｔｂ）　ゲル電気泳動および組織化学的染色：これは臨床実験室で現在採用され ている標準的な操作法である。これは５ＡＣｈＥの電気泳動移動度を頼りにして いる。ＡＦサンプルを６％アクリルアミドゲル上で電気泳動させ、次いでこのゲ ルをエステラーゼ活性について染色する。比ＡＣｈＥ活性は特異的阻害剤を用い て同定される。

英国の共同研究によれば、この試験が極めて有用であることが示され、ＡＣｈＥ レベルは、妊娠齢によってＡＦＰのように変動しないことが見出された。従って 、給児齢についての正確な知識は必要でない。

しかし、この操作法には下記のような多くの欠点がある。

（１）　これは定性的試験である。

ｆｉｉｌ　この試験は、ＡＦサンプルに胎児または母体の血液が夾雑している場 合は、血清プソイド−ＣｈＥおよびＲＢＣがゲル上の特異的５ＡＣｈＥバンドを マスクするので、役に立たない。

ｆｉｌｌｌ　この試験は、電気泳動および組織化学的染色を必要とするので、時 間を要する。

（ｉｖｌ　この試験には、操作中に羊水の採取が必要であり、これは流産（また は妊娠中絶）を引き起こす危険性を伴っている。

ｆｃ）免疫学的試験：異なる形態のＡＣｈＥに対して、ポリクローナルおよびモ ノクローナルの内方の多くの異なる抗体が作成されている。これらの多くはプソ イド−ＣｈＥと交叉反応しない。

Ｚａｎｅｔａ　ｅｔ　ａｌ、（ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ、１２９．　２９３．　１９ ８１１は、ラット脳膜ＡＣｈＥに対するウサギ抗血清を作成した。このウサギ抗 血清は、可溶性ＡＣｈＥとの低い交叉反応性しか有しない。Ｇａｎｎａｒｉ　ａ ｎｄＢｒｏｄｂｅｃｋ　ＩＪ、　Ｎｅｕｒｏｃｈｅｔ　４４．６９７．１９８５ １は、水溶性酵素に対するよりも界面活性剤可溶性酵素に対して中程度の優先性 を示したヒト脳からの界面活性剤可溶性ＡＣＩｉＥに対して作成された抗血清を 報告した。ウサギＡＣｈＥに対して作成された抗体は、可溶性形態の脳ＡＣｈＥ よりも、膜−結合形態の脳ＡＣｈＥと良く結合する（Ｒａｋｏｎｃｚａｙ　ａｒ ｉｄ　Ｂｒｌ＠１ｊｏｌｎ、　ＢＢＡ　岨２　１２７．１９８５）。

異なる組織のＡＣｈＥｓ間の免疫学的相違も明るみになってきている。Ａ　Ｃｈ 　Ｅ　１．：対して作成された殆どの抗体は、同じ種からの酵素および赤血球の 酵素に対して同等の親和性を示す。Ｒａｓ■ｕｓｓｅｎ　ｅｔａｌ、（Ｃ１ｉｎ 、Ｃｈｉｎ、Ａｃｔａ、１６６、　１７．　１９８７１は、　ヒトＲＢＣＡＣｈ Ｅに対して作成された１１のモノクローナル抗体を、ＲＢＣおよび脳の内方から のＡＣｈＥとの反応性について評価した。彼らは、これらのモノクローナル抗体 の一つが実際にヒト脳から精製された膜−結合ＡＣｈＥに対して優先性を示した が、全てのモノクローナル抗体がＲＢＣＡＣｈＥと反応したと主張した。

ＮＴＤの診断に際し、ＡＣｈＥの免疫アッセイを使用することについて２〜３の 報告がある。主な問題は、神経、より正確には分泌ＡＣｈＥに対する特異性を得 るのが困難なことである。報告されたアッセイは、ヒト脳ＡＣｈＥに対して作成 されたモノクローナル抗組清またはポリクローナル抗体のいずれかを用いること を頼りにしている。これらのアッセイには主に二つのタイプがある。

第一のアッセイのタイプでは、抗原であるＡＣｈＥを、二つのモノクローナル抗 体の間、または一つのモノクローナル抗体と一つのポリクローナル抗体との間に 挾む（Ｂｒｉｍｉｊｏｌｎ　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ。

１１ｅｕｒｏｃｈｅ■、す、　５５５．１９８７）。第二のタイプも抗原捕獲タ イプであるが、ＡＣｈＥ自体の酵素活性を頼りにしている。モノクローナル抗− ＲＢＣＡＣｈＥ抗体は固定化されたのち、試験サンプルと共にインキュベートさ れるう　結合したＡＣｈＥは、Ｅｌｌｓａｎ　試験を用いて検出される（Ｎｏｒ ｇａａｒｄ　Ｐｅｄｅｒｓｅｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｃ１１ｎ、Ｃｈｉｍ、２９゜ １０６１．１９８３＋。この第二のアプローチは、純粋なＡＣｈＥを必要としな い。これらのアッセイについては、ＮＴＤの診断に用いる場合、成功率が変動す ると報告されてい石（Ｎｏｒｇａａｒｄ　ｅｔ　ａｌ、、１９８３；Ｂｒｏｃｋ 　ａｎｄ　Ｂａｄｅｒ、Ｃｌ１ｎ、Ｃｈｉｎ、Ａｃｔａ　１２７　４１９．　１ ９８３；　Ｂｒ１ｍ１ｊｏ１ｎｅｔ　ａｌ、、　Ｆｅｄ、　Ｐｒｏｃ、　４６． ２５５７．１９８７；　Ｂｒｏｃｋ　ａｔ　ａｌ、、　Ｌａｎｃｅｔ　！。

５、１９８５：　５ｏｒｅｎｓｅｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｅｎａｔ、　Ｄｉａ ｇ、　７．７５．１９８７；　ｌ１ａｌｄ　ａｔａｌ、、Ｐｒｅｎａｔａｌ　Ｄ ｌａｇｎｏｓｌｓ　９．　８１３−８２９．　１９８９；　Ｒａｓｍｕｓｓ＠ｎ 　ａｔ　ａｌ、。

Ｐｒｅｎａｔａｌ　Ｄｌａｇｎｏｓｌｓ　１０．４４９−４５９．１９９０Ｌ　 Ｌかし、これらのアッセイは、赤血球エステラーゼが、比較的少量でも存在して いると正しく働かない。

異常妊娠の羊膜液中の５ＡＣｈＥの上昇したレベルは、循環母体血清中での上昇 として現れる可能性がある。母体血清中の測定は。

羊膜液中の測定に対して多くの利点を有する。なぜならば、羊膜液の採取は重大 な流産の危険を引き起こすすからである。この物質の測定は、特異的なアッセイ を好適に工夫するのが困難なため、最近になるまで記載されなかった。

Ｊｅｈａｎｌｉ、　ｌ１ｃＢｒｉｄｅ　ａｎｄ　Ｂｒｅｎｎａｎｄ　ｆｗ０９１ １０８３０２］による最近の研究は、５ＡＣｈＥに対して特異的な抗体をどのよ うに用いれば赤血球エステラーゼが存在しているサンプル液中でも、即ちヒト叙 情および羊膜液中でも５ＡＣｈＥを検出することができるかを示した。

Ｅｌｅｃｔｒｏ　ｈｏｒｕｓ　ｅｌｅｃｔｒｉｃｕｓ　（ウナギ）の電画（ｅｌ ｅｃｔｒｏｐａｘ）がらのＡＣｈＥは、アルギニン−セファロースおよびエドロ ホニウムーセファロースの同友に結合することが示されている（Ｓｍａｌｌ　ａ ｔ　ａｌ、。

Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ　２１．９９１−９９６．１９８７１゜幾つかのソー ス（ウナギの電極器官およびウシ胎児血清）から精製されたＡＣｈＥが、プロテ アーゼ活性を有するという証拠もある（Ｓｍａｌｌ　ａｔ　ａｌ、、１９８７　 ａｎｄＳｍａｌｌ、　１９８９　Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ　Ｌｅｔｔ、　９５ ．３０７−３１２．１９８９１゜この研究は、幾つかのＡＣｈＥがプロテアーゼ のチモーゲン（即ち不活性前駆体）であるかも知れないという示唆を導いている （Ｓ■ａｌｌ　Ｄ、１１．。

Ｎｅｕｒｏｓｃｌｅｎｃｅ　２９．２４１−２４９．１９８９１゜ペプチジル− リジン構造およびペプチジル−アルギニン構造の以前の分子モデリングは、正電 荷の中・シ・に関し、アセチルコリンのエステル結合へのＣ−末端ペプチド結合 のオリエンテーシ町ンにおいて起こり得る類似性を示した。このことがら、ある モデル（これによってＣ−末端のアルギニン残基またはりジン残基が、アセチル コリンの加水分解に用いられる活性部位ポケットと同じＡＣｈＥの活性部位ポケ ット内で付着するかも知れない）が幾つかのＡＣｈＥのたメニ示唆されティる（ Ｓｍａｌｌ　１９９０　Ｔｒ＠ｎｄｓ　Ｂｉｏｃｈ＠ｔ　Ｓｃｉ　ｉｓ、　２１ ３−２１６）。しかしこの研究の著者は、ＡＣｈＥのがなりの構造上の多形性を 認めており、それらの多くの異なる形態は、分子量、溶解性およびアミノ酸シー クエンスが変動している。従って、前記のモデルは一般的に適用できると考える ことができない。

膜間アミロイド（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ　ａｍｙｌｏｉｄ）前駆体タンパ ク質（ＡＰＰ）の正常な開裂は、このタンパク質のβＡ４Ａ４シーフェンスノリ ジン１たはその付近で起きる（Ｅｓｃｈ、Ｆ、Ｓ、、Ｋｅｌｎ、Ｐ、Ｓ、。

Ｂｅａｔｔｉｅ、　Ｅ、Ｃ，、Ｂｌａｃｈｅｒ、　Ｒ，Ｗ、、　Ｃｕｌｗｅｌｌ 、　Ａ、Ｒ，、０１ｔｅｒｓｄｏｒｆ、　Ｔ、。

１１ｃＣ１ｕｒｅ、　Ｄ、、　ａｎｄ　Ｗａｒｄ、　Ｐ、Ｊ、　５ｃｉｅｎｃｅ 　２４８　１１２２−１１２４．１９９０１゜この正常な開裂は、アミロイドを 産生するβＡ４フラグメントの形成を阻害し、従ってアルツハイマー病患者の脳 中に見出されるアミロイド沈着の発生を阻害する。以前に示されなかったが、こ の開裂に必要なプロテアーゼは、　ｒＡＰＰセクレターゼｊと呼ばれている。

Ｓｍａｌｌ、　Ｄ、Ｈｏ、　Ｍｏ１ｒ、　Ｒ，Ｄ、、　Ｆｕｌｌｏｒ、　Ｓ、Ｊ 、、　１ｌｉｃｈａｅｌｓｏｎ、　Ｓ、。

Ｂｕｓｈ、　Ａ、１．、　Ｑｉａｏ−Ｘｉｎ　Ｌｉ、　ｌｌｌｌｌｗａｒｄ、　 Ｅ、、　Ｈｌｌｂｌｃｈ、　Ｃ，、ｌｌｌｅｉｄｅｍａｎｎB Ａ、、Ｂｅｙｒｅｕｔｈｅｒ、Ｋ、、ａｎｄ　Ｍａｓｔｅｒｓ、　Ｃ，Ｌ、は、 Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　３０゜１０７９５−１０７９９．１９９１において 、エドロホニウムーセファロースヵラムを用いる方法により、ヒト脳から５ＡＣ ｈＥを精製した。彼らは、この精製物質なＡＣｈＥ−会合プロテアーゼ（ＡＣｈ Ｅ−ＡＰ）と呼び、これが欠如　（■ｉｓｓｉｎｇｌ　ｒ　Ａ　Ｐ　Ｐセクレタ ーゼｊの機能を有することを示した。彼らは、このように精製されたヒトＡＣｈ Ｅ−ＡＰが、βＡ４タンパク質シークエンスを、βＡ４Ａ４シーフェンスジン１ ６付近で開裂したことを示した。

この研究はまた、ペプチジル−リジンが酵１ｓＡｃｈＥの基質であることを示し ている。この研究は、アルツハイマー病において、５ＡＣｈＥ活性の損失または この酵素レベルの不足が、どのようにして、βＡ４Ａ４シーフェンスＡＰＰを開 裂する能力の局部的損失を来たしうるかをも示している。このこと自体は、ＡＰ Ｐの全長状形態濃度の増加につながり、従ってアミロイド沈着形成の可能性が高 くなることにつながるであろう。ＡＰＰのタンパク分解は、５ＡＣｈＥ自体を阻 害しろるかも知れないクニツッｆＫｕｎｉｔｚｌ型プロテアーゼを保持している かも知れない１００〜１１０にのエフトドメインの分泌を招来する。これは、５ ＡＣｈＥ活性が脳の局在化領域で低下される代替ルートであるかも知れない。５ ＡＣｈＥの交替（恐らく。

異常府警に対するタンパク分解開裂による）は、活性損失をも説明するかも知れ ない。最近、ＡＣｈＥの異常分子形態が、アルツハイマー病徹者の脳を髄液中で 実証されたｆＮａｖａｒａｔｎａｗ＋、　Ｄ、Ｓ、、　Ｐｒ１ｄｄｌｅ。

Ｊ、Ｄ、、　ＭｃＤｏｎａｌｄ　Ｂ、、　Ｅｓ１ｒｉ、　Ｍ、Ｍ、、　Ｒｏｂｌ ｎｓｏｎ、　Ｊ、Ｒ，、ａｎｄ　Ｓｍ１ｔｈ。

Ａ、Ｄ、　Ｌａｎｃｅｔ　３３７．４４７−４５０．１９９１）。

アルツハイマー病の診断には、現在いずれのインビトロ診断試験も利用できない 。このような試験は、痴呆を取り扱う臨床家にとって価値のない手段であろう。

本発明によれば、ヒト分泌アセチルコリンエステラーゼ（ｓＡＣｈＥ）と結合す ることができる、抗体ではないリガンドをサンプルと接触サセ、次いでヒト５Ａ ＣｈＥが上記のリガンドと結合しているかどうかを測定することを特徴とする、 試験サンプル中のヒト分泌アセチルコリンエステラーゼの測定方法が提供される 。

また、本発明によれば、 （１）サンプルと、固体担体またはマトリックス担体の表面上に固定化されたリ ガンドとを接触させ、 このリガンドが ｔａｌｌｌｌの基質または基質類縁体、［ｂｌ　酵素のエフェクターまたはエフ ェクター類縁体、（ｃｌ　ａ素のコファクターまたはコファクター類縁体、＋ｄ ｌ酵素の補酵素または補酵素類縁体、またはｔｅｌ酵素の補欠分子団または補欠 分子団類縁体であり、（１１）酵素がリガンドと結合しているかどうかを測定す ることを特徴とする、試験サンプル中の酵素を測定する方法が提供される。

更に、本発明によれば、 ｆａｌ　サンプルと、リガンドに予め結合された５ＡＣｈＥとを接触させ、そし て ＋ｂｌ結合された抗体を測定することを特徴とする、試験サンプル中の５ＡＣｈ Ｅに対する抗体を測定するための方法が提供される。

これは、例えば血清中の抗体または細胞株により分泌されたモノクローナル抗体 を測定するための試験であってよい。この試験におけるリガンドは、例えば従来 の方法に用いられる任意のリガンドであってよい。

上記の方法における「抗体ｊなる用語は、免疫反応性の抗体フラグメント、例え ばＦａｂフラグメントを包含する。

本発明による酵素捕獲アッセイは、生体液および他のサンプル中の酵素、特にヒ ト５ＡＣｈＥのレベルを測定するために使用できる。

このアッセイは、その第一段階として、酵素１例えば５ＡＣｈＥが活性に結合す ることのできるリガンドの固体担体またはマトリックス担体上にカップリングま たは結合させることを含んでいる。これは、酵素が溶液または生体液から活性に 結合できるようにする。検出段階からなるもう一つの工程を含めることにより（ 即ち、酵素捕ＩＩＥＬＩｓＡのためには、酵素に結合できる抗体を介して）、サ ンプル、溶液または生体液中の酵素、例えば５ＡＣｈＥのレベルを定量的に測定 することのできるアッセイが提示される。

本発明の方法は、５ＡＣｈＥに適用する場合、ＮＴＤｓ、および特に無脳症、脳 ヘルニアおよびを椎披裂の診断に使用できる。本方法は請ヘルニア、胃壁披裂、 子宮内死亡、食道動脈、無心胎児の双生児妊娠、正常乳児、奇形腫、腹水、氷嚢 胞、心および肺の形成不全、総排泄腔外反、塞丸瘤、水痘性表皮剥離症、先天性 皮膚欠損、並びに他の神経変性障害、例えば老人性痴呆症、パーキンソン病およ びアルツハイマー病の診断に使用することができる。本方法は、ダウン症の診断 にも使用できる。それぞれの場合、診断は、５ＡＣｈＥの検出および測定による ことができる。これらの病状を診断するために、リガンドは胎児形態または成人 形態のいずれかのＡＣｈＥ、あるいは間者に結合しなければならない。

本発明の方法は、例えば胎児の神経管欠損症の診断に使用でき石。

神経管欠損症の存在は、例えば羊膜液、母体血清または脳髄液中の５ＡＣｈＥの 増加によって示される。本方法はまた、例えば成人のアルツハイマー病の診断に も使用できる。アルツハイマー病の存在は、例えばヒト血清中の５ＡＣｈＥの減 少、または脳髄液中の５ＡＣｈＥの異常なレベルによって示される。

本発明の方法は、測定される酵素、例えばヒ）ｓＡＣｈＥに対して特異的なモノ クローナル抗体が産生される間のスクリーンとして用いることもできる。

従って本発明の方法を用いて、酵素、例えばヒト成人または胎児の５ＡＣｈＥを アッセイすることができる。この酵素を含有していそうなサンプルを、リガンド と接触させる。このサンプルは、生体液、例えば脳を髄液、あるいは羊膜液また はヒト血清であってよい。

サンプルは、緩衝液、例えば燐酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に希釈すること ができる。界面活性剤、例えばツイーンを存在させてもよい。

酵素、例えば５ＡＣｈＥを高レベルで含有しているサンプルと、正常サンプルと を識別するアッセイの能力を増大するために、サンプルをイオン強度の高い緩衝 液と混合することができる。従ってサンプルを、生理食塩水のイオン強度より高 いイオン強度を有する緩衝液と混合してもよい。この溶液の導電率は、生理食塩 水の導電率よりも高くてよい。少なくとも０．１５１　！ＩａＣ１と同様の高い イオン強度を有するＰＢＳを使用できる。イオン強度は０．１５〜ＩＭ、好まし くは０、１５−０．５Ｍ、更１：　好ｔ　Ｌ　＜　ｌｔＯ，２−０，４１１ノＮ ａＣｌノイｔ　ン’ｍ度テ４　ッテよい。Ｔｒｉｓ　（商標）緩衝液を用いる場 合は、少なくとも２５簡ＩＩ　Ｔｒｉｓ緩衝液が好ましい。

アッセイは、定性的、半定量的または定量的に行うことができる。

種々のアッセイフォーマットを採用できる。これらは、同時または朋次のアッセ イフォーマットであってよい。溶液がら酵素、例えば成人または胎児ヒト５ＡＣ ｈＥを、この溶液から分離できる表面、例えば固体表面上またはマトリックス上 で選択的に捕獲してこの酵素を選択的に標識するために、あるいはこのタンパク 質を捕獲し、かつ標識するために、リガンドを用いることができる。リガンドは また、種々の均質アッセイフォーマットに用いてもよく、このフォーマットでは 、酵素は溶液中で相分離することなく検出される。

溶液から酵素を捕獲するためにリガンドを用いるアッセイの型には、表面上にリ ガンドを固定化することが必要である。この表面は、洗浄することができるべき である。使用できる表面の種類としては、次のものが挙げられる。種々のタイプ のポリマー〔マイクロタイター（Ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ、商標）　ノウエル：　 ヒ−Ｘ　：　テ４７　フＸ　ｆ　７　り：アスビレーシ鱈ンチップ、電極：およ び光学デバイスに成形〕、毛細育充填機器、カーボンディスク（電気化学的酵素 イムノアッセイ用）、粒子〔例えばラテックス、安定化赤血球（ｅｒｙｔｈｒｏ ｃｙｔｅｓ）　；バクテリア細胞または真菌細胞、スターバーストデンドリマー ス；胞子、金または他の金属のゾルあるいは金属含有ゾル；有機ゾル：およびタ ンパク質性コロイド、粒子の通常の大きさｏ、　ｏｏｓ〜５ミクロン、例えば０ ．１〜５ミクロン〕、膜（例えばニトロセルロース、紙；ｅ１１セルロース：　 ｌ１ｌｌｌｐｏｒｅ　Ｉｍ−ｏｂＨｏｎ　（商標）またはＰａ１ｌ　Ｂｌｏｄｙ ｎｅ（商標）のような化学的に活性化した膜、および有機物質または無機物質の 高多孔性／高表面積膜〕。

表面へのりガントの結合は、界面活性剤、溶剤、塩および／またはカオトロピツ クを含むことができる溶液からの受動吸着によって、あるいは化学的活性結合に よって行うことができる。活性結合は、表面に露出することのできる種々の反応 性または活性化可能な官能基（例えば縮合剤、活性エステル、酸ハロゲン化物、 無水物、アミノ基、ヒドロキシル基またはカルボキシル基、スルフヒドリル基、 カルボニル基、ジアゾ基、エポキシ基、不飽和基）を介して行うことができる。

本発明の一般的なアッセイ法において、酵素と結合させるために用いられるリガ ンドは、基質または基質類縁体、エフェクター〔例えば阻害物質（競争的または 非競争的）、または例えば競争的部位、アロステリック部位またはイソステリッ ク部位の活性化物質〕またはエフェクター類縁体、コファクターまたはコファク ター類縁体、補酵素または補酵素類縁体、あるいは酵素の補欠分子団または補欠 分子団類縁体である。これらの類縁体は、例えば合成の類縁体であってもよい。

ヒ）ｓＡＣｈＥまたは５ＡＣｈＥに対する抗体を測定するために使用できるリガ ンドは、典型的には、ヒト５ＡＣｈＥの陰イオン遺伝子座に結合しうる正に荷電 した化合物、または正に荷電可能な化合物である。リガンドは、例えばヒト５Ａ ＣｈＥに対しては、上記のような基質、エフェクター、コファクター、補酵素ま たは補欠分子団、あるいはそれらの類縁体であってよく、殊にヒト５ＡＣｈＥに 対しては、基質、阻害物質または活性化物質であってよい。エステラーゼ活性の 阻害物質、例えば塩化エドロホニウムを用いることができる。あるいはりガント は、正に荷電しうるアミノ酸、例えばアルギニン、ヒスチジン、リジンまたはオ ルニチンを含むことができる。リガンドは、２個以上のこのようなアミノ酸を、 例えば二量体または他のポリマーとして含んでいてもよい。アミノ酸はＤ型また はＬ型であってよい。

有用なりガントは、正に荷電しうるアミノ酸のポリマーであり、典型的にはホモ ポリマーである。従って、リガンドは、ポリーＬ−アルギニン、ポリーＬ−ヒス チジン、ポリーＤ−リジン、ポリーＬ−リジンまたはポリーＬ−オルニチンから 選択することができる。このようなリガンドの２種以上の混合物を用いることも できる。このようなポリアミノ酸は３５０〜ｔ、ｏｏｏ、ｏｏｏの分子量、例え ば４，０００〜３００，０００の分子量を有することができる。ポリアミノ酸は 、プラスチック表面上に容易に吸着され、リガンドの提示（ｐｒｅｓｅｎｔａｔ ｌｏｎ）を促進させる。また、５ＡＣｈＥを結合するために、リガンド（即ち、 アミノ酸）の多数のコピーが同時に提示される。

リガンドを有する表面を試験サンプルと接触（反応）させた後、反応時間だけ放 置し、必要に応じて各稚の手段（洗浄、遠心分離、濾過、磁場の適用、毛管作用 ）のいずれかによって過剰のサンプルを分離または除去した後、捕獲された酵素 は検出可能なシグナルを与える手段によって検出される。例えば、これは、捕獲 酵素と反応する上記のような分子、特にモノクロナール抗体またはポリクロナー ル抗体、あるいは粒子を用いることによって達成することができる。抗体は結合 しうるものであり、典型的には、酵素、例えばヒト５ＡＣｈＥに対して特異的で ある。分子または粒子は標識されていてもよいし、または標識されることが可能 なものであってもよい。

例えば、酵素、例えばヒ）　５ＡＣｈＥに結合しうる第１の未標識抗体を用い、 次いでこの第１の抗体と結合しうる標識された第２の抗体を用いてもよい。その 代わりに、固定化酵素、例えばＡＣｈＥの活性をアッセイすることができる。

モノクローナル抗体は、ある酵素に対して特異的であるが、他の型の酵素と交叉 反応性を示さないモノクローナル抗体に対して、例えば１０９１１０８３０２に よるヒト５ＡＣｈＥに対して特異的であるが、他の型のヒトＡＣｈＥと交叉反応 性を示さないものであってよい。従って、モノクローナル抗体は、ヒト赤血球Ａ ＣｈＥと反応性を示さず、好ましくはヒト血清Ａ　Ｃｈ　Ｅ、ヒト膜−結合神経 性Ａ　Ｃｈ　Ｅ。

ヒト筋肉ＡＣｈＥおよび神経性−可溶性非分泌ＡＣｈＥと交叉反応性を示さない ものである。抗体はヒト直情プソイド−ＣｈＥとも交叉反応しない。モノクロー ナル抗体は、ヒト胎児５ＡＣｈＥまたはヒト成人ｓＡｃｈＥ１ｍ％異的であって よい。モノクローナル抗体は、Ｉｇ＾、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧまたはＩｇＭで あってもよい。これは、任意の動物種のモノクローナル抗体、゛例えば哺乳類の モノクローナル抗体、例えばラット、マウスまたはヒトのモノクローナル抗体で あってもよい。ヒト５ＡＣｈＥに対して特異的なポリクローナル抗体を、モノク ローナル抗体の代わ怜に用いることができる。ポリクローナル抗体は、適切な動 物、典型的には哺乳動物、例えばマウス、ラット、ヒツジ、ヤギまたはウサギ中 で産生させることができる。

検出可能なシグナルは、光学的または放射性、または物理化学的であってよく、 また例えば染料、放射性標識、電子活性種、磁気共鳴種または蛍光体を用いて、 分子または粒子、殊に抗体を直接に標識することによって、あるいはある種の測 定可能な変化を生じさせることのできる酵素自体を用いて、分子または粒子を間 接的に標識することによって提供することができる。一方、検出可能なシグナル は、例えば関わっているいずれかの表面が粒子の形であるときに生じる凝集反応 、回折効果または複屈折効果によるものであってもよい。　。

好ましいアッセイのフォーマットは、サンドイッチアッセイである。試験サンプ ルを、酵素、例えばヒト胎児５ＡＣｈＥと結合することができ、かつ、そのサン プルから分離可能な担体、例えば固体担体りに固定化されたリガンドと接触させ ることができる。リガンドは、試験サンプル中の酵素を担体上で捕獲し、そして 酵素と結合しつる抗体は、この捕獲された酵素を標識する。抗体はモノクローナ ル抗体でも、ポリクローナル抗体でもよい。捕獲および標識の操作は、任意の順 序で、あるいは同時に行うことができる。抗体は、アルカリホスファターゼまた はペルオキシダーゼまたはβ−ガラクトシダーゼ等の酵素を用いてａ！＠するこ とができる。

有用なサントイブチアッセイは、以下の工程から構成される。

（＋）サンプルと、固体担体の表面、ヒに固定されたリガンドとを接触させ、 （１１）固体担体の表面を洗浄し、 （ｉｌｌ）この洗浄された表面と、酵素、例えばヒト５ＡＣｈＥと結合しうる標 識されていない第１の抗体とを接触させ、（ｉｖ）さらに固体担体の表面を洗浄 し、（Ｖ）この洗浄された表面と、標識されかつ上記第１の抗体と結合しうる第 ２の抗体とを接触させ、 （ｖｉ）さらにこの固体担体の表面を洗浄し、（ｖｉｉ　）この洗浄された表面 に、第２の抗体のラベルが存在するがどうかを検出する。

他の有用なサンドイッチアッセイのフ寸−マットは、試験サンプルと酵素標識抗 体とを接触させ、固体表面上で生成した免疫複合物を、酵素、例えばヒト５ＡＣ ｈＥと結合しうるリガンドを用いて捕獲し、過剰の標識抗体を除去し、酵素標識 抗体中の酵素ラベルに対する基質を加えることからなる。酵素、例えばヒト５Ａ ＣｈＥサンプルの存在は、このようにして明らかにされる。

採用できる他のフォーマットは、（１）例えばポリスチレンラテックスの粒子上 に吸着されたリガンドを用いる凝集、　（２）マイクロタイタープレート中で行 われる酵素−結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、　（３）リガンド被覆ディ ツブステックを用いるディツプスチックＥＬＩＳ＾、および（４）抗体と一緒に リガンドで被覆された磁性小粒子、あるいは着色粒子または発色しうる粒子のい ずれかを用いて、または酵素または蛍光体を用いて標識されたリガンドで被覆さ れた磁性小粒子を含む、アッセイに適したい任意のフォーマットであってよい。

サンプル中の酵素、例えばヒト５ＡＣｈＥの測定に用いるのに適した試験キット は、上記のリガンド、および酵素、例えばヒト５ＡＣｈＥを、そのリガンドに結 合したときに検出するための手段からなる。従って、用いられるリガンドが酵素 、例えばヒト５ＡＣｈＥに結合するかどうかを測定するための手段が提供される 。

このキットの特定の成分は、上記のものであってよい。これらのキットは、１種 以上のコントロール、１種以上の緩衝剤および１種以上の希釈剤を含む１種以上 の追加成分を含んでいてもよい。

酵素イムノアッセイに用いるキットは、典型的には、酵素で標識された試薬およ びこの酵素ラベルのための基質を含む。酵素ラベルは、捕獲された酵素、例えば ヒト５ＡＣｈＥに結合しうるリガンド、あるいは捕獲された酵素１例えばヒト５ ＡＣｈＥに結合しうるポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のいずれか と結合させることができる。従って、リガンドに結合した酵素、例えばヒト５Ａ ＣｈＥを検出するための手段は、酵素で標識された抗体（これは、その酵素、例 えばヒト５ＡＣｈＥに結合しうる）、および酵素で標識された抗体中の酵素ラベ ルのための基質から構成することができる。あるいは、リガンドに結合した酵素 、例えばヒト５ＡＣｈＥを検出するための手段は、酵素、例えばヒト５ＡＣｈＥ に結合しろる標識されていない第１の抗体、第１の抗体と結合しうる酵素で標識 された第２の抗体、および酵素で標識された第２の抗体中の酵素ラベルのための 基質から構成することができる。

以下の実施例により本発明を説明する。２つの参考例も提供される６　添付の図 面において、 第１図は、実施例４の酵素捕獲ＥＬＩＳＡの結果を示し、この国において、添加 した塩化ナトリウムの密度（Ｍ）　（ｘ−軸）は、４０５ｎ−における光学密度 に対してプロットされており、・は脳を髄液（Ｃ５Ｆ）を示し、◆はを椎披裂血 清Ａを示し、傘は無脳症血清Ｃを示し、ムは正常血清Ｅを示し、■は正常戯清り を示し、マは溶解正常血清を示す。

第２［！Ｉは、実施例６に用いた典型的な脳を髄液の基準白線を示し、この図に おいて、５ＡＣｈＥ単位（Ｘ−軸）は、４０５ｎ■における光学密度に対してプ ロットされている。

第３図は、正常妊娠の５ＡＣｈＥレベルを示す（Ｓｏｕｔｈａｍｐｔｏｎサンプ ル）。結果は、平均値＋２倍標準偏差として表される。各群のサンプル数を括弧 内に示す。妊娠齢の退散（Ｘ−軸）は、５ＡＣｈＥ単位（ｙ−軸）に対してプロ ットされている。

第４図は、中央値の倍数として表されるＮＴＤケースにおける５ＡＣｈＥ　（上 の線）およびＡＦＰ　（下の線）の結果を示す。■は無脳症を示し、・はを椎披 裂を示す。

第５図は、４３５単位と等しい正常の上限に対するＮ　′ｒ　Ｄ妊娠の５ＡＣｈ Ｅレベル（単位）（平均＋２倍標準偏差、または９７．５センチル（ｃｅｎｔｌ ｌｅｌ　）である。記号は第４図と同じである。

参　例１：ヒト成人岨支１１　ｋ　’ｔ！　ｓ　Ａ　Ｃｈ　Ｅの単離および部分 的■ １　左肱王月 １丑 全ての化学物質は、分析等級のものであり、Ｓｉｇｍａ　Ｃｏ、、　Ｐｏｏｌｅ 。

Ｕ、ｌｆから購入した。

生体材料 脳を髄液（Ｃ３Ｆ）およびヒト成人層は、Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｃ１ｉ ｎｉｃＣ１１ｎｉｃａｌＣｈｅ、　Ｓｏｕｔｈｍｅａｄ　ｔｌｏｓｐｉｔａｌ、 　Ｂｒ１ｓｔｏｌ、　Ｕ、に、から得られた。ヒト胎児脳は、１２〜１８週齢の 流産胎児から摘出した。いずれの場合も、組織は摘出の１時間以内に一７０℃で 凍結した。

組織ホモジネートの調製 脳細胞を解凍し、４℃でＩｌａｒｉｎｇプレンダー（５ｘ３０ｓ）中で、２Ｍ賛 のＥＤＴＡを含む氷冷した０、３Ｍの蔗糖１重量につき１０容量（成人層）また は５容量（胎児脳）中でホモジネートすることにより、可溶性ＡＣｈＥの抽出を 行った。このホモジネートに、凍結および解凍の２サイクルを施して膜を粉砕し 、次いで４℃、１００．０００　Ｘ　ｇで９０分間遠心分離した。上澄み液を除 去し、等分し、必要となるまで＝７０℃で保存した。

訊織土澄み液のゲル濾過 ゲル濾過を、４℃でセファクリル（商標）　Ｓ　−２００（Ｐｈａｒｉａｃｉａ 。

＋１ｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）上で行った。上澄み液サンプル（４０ｍＭ） を、００２％のＷａＷ３を含有するホスフェート緩衝生理食塩水、ｐＨ７，３［ ホスフェート緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、１４２ｍＭ　ＮａＣ１，２，７ｗＭ　 ＫＣＩ、８■賛Ｎａ２ＨＰ０１．１．４７ｍＭ　ＫＦＩ２ＰＯａｌで平衡化した ２、５ｃｍ　ｘ　１００ｃｍのカラムにかけた。溶離は、５０■ｌ／ｈの速度の 上昇流で行った。フラクション（５曹ｌ）を集め、　（ｉ　）　２ｇ０ｎ−にお ける光学密度を測定することによってタンパク質含有量を、また（ｌｉ）　Ｅｌ １ｍａｎアフセイ（アッセイ）によりアセチルコリンエステラーゼ活性を監視し た。カラムはＰｈａｒｖａｃｌａ　Ｉｌ［１ｇｈ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｗｅｉ ｇｈｔ　ｌ［ｉｔで測定した。

５ＡＣｈＥのアフィニティー精製 ゲル濾過溶離液中の５ＡＣｈＥを、Ｈｏｄｇｓｏｎ　およびＣｈｕｂｂ　（Ｊ。

１１ｅｕｒｏｃｈｅｍ、、　４１．６５４−６６２．１９８３）に従って調製し た塩化エドロホニウムーエポキシーセフ７０−スゲル（Ｐｈａｒ■ａｃｉａ）の カラムの上でのアフィニティークロマトグラフィーにより更に精製した。サンプ ル（２５■ｌ）を、ＰＢＳ中で平衡化した１ｃｍＸ４ｃ園のカラムを通して、１ ５■ｌ／ｈの流量、４℃で２４時間リサイクルした。未結合物を、０．５１１１ のＮａＣ１ｆ４０■ｌ）を含むＰＢＳを用いて溶離した。この未結合物を、１２ ■関の塩化エドロホニウム（２５■ｌ）を含む同じ緩衝液で溶離した。塩化エド ロホニウムを、アンモニウムアセテート溶液ｆ５（ｌｕｌｌで平衡化したセファ デックス（商標）　−Ｇ５０　ｆｉｎｓ　（Ｐｈａｒｍａｃ１ａ＋　カラＡ　（ ２，５ｃｍＸ５０ｃ璽）土でゲル濾過して除去した。Ｅｌ１ｍａｎアフセイにア ッセイしたＡＣｈＥ活性を有するフラクションをプールし、凍結乾燥し、ＰＢＳ 　（２曹ｌ）中で再構築し、必要になるまでアリコートを一２０℃で凍結した。

酵素アッセイ コリンエステラーゼ活性を、Ｅｌ■ａｎ　ｅｔ　ａｌユの方法（Ｂｉｏｃｈｅｍ 。

Ｐｈａｒｓ、、　’Ｚ、　８Ｂ−９５，１９６１）の方法により、３０℃で測定 した。酵素活性は、ＩＵ（１分間当りに形成されるマイクロモル生成物）として 表される。ヨウ化アセチルチオコリン（１１）を基質として用いた。

１．５−ビス−（４−アリルジメチル−アンモニウムフェニル）−ペンタン−３ −オンージブロマイド（ＩＩｎ　２８４　Ｃ５１；１．５μ賛）によって阻害さ れた活性を、ＡＣｈＥ活性としたが、プソイドコリンエステラーゼ（ＰｓＣｈＥ ）活性は、一方はエセリン（２０μｍ）を含み、他方はＢＷ　２８４　Ｃ５１（ Ｃ５１（Ｂｏｄ　ａｎｄ　Ｃｈｕｂｂ、　１９８３）を含む２つの反応混合物間 の差と推定した。

ＡＣｈＥ　性のゲル電　折 異なるサンプル中のＡＣｈＥ活性を、基質としてヨウ化アセチルチオコリンイオ ダイド（４ｍＭ）を用いて、Ｃｏｕｐｌａｎｄ　ａｎｄ　ｔｌｏｌｍｅｓの組織 化学的方法（Ｑ、　Ｊ、　Ｍｌｃｒｏｓｃ、　Ｓｃｉ、、　９！ＬＬ３２７−３ ３０．１９５７）により、６％ポリアクリルアミドスラブゲル（８ｃ■Ｘ８ｃ■ ）上で突き化メタ。ＡＣｈＥ活性ノ活性性特異性Ｗ　２８４　Ｃ５１（１，５Ｘ １０−’Ｍ）　テノ阻害によって確立された。

Ｓ　Ｄ　Ｓ　−ｙｌｊ　’Ｊ　７−り」土ＬＬ工１’　＋ｋ　１ｊＪＣＳ　Ｄ　 Ｓ　−Ｐ　Ａ　Ｇ　ＥＳＤＳ−ＰＡＧＥを、８％ポリアクリルアミドスラブゲル （１６ｃ■Ｘ　１ｇｃｍ）を用いて、本質的にＬａｅｍｍｌｌ（Ｎａｔｕｒｅ、 　２２７．６８０−６８５．１９７０）に従って行った。タンパク質を銀で染色 した（Ｎｉｅｌｓｅｎ　ａｎｄ　Ｂｒｏｗｎ。

Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　Ｌす、、　３１１−３１５．１９８４１゜用 いた分子量参照標準は、β−ガラクトシダーゼ＋１２０．０００１、ホスホリラ ーゼｂ　（９７，０００＋、ヒトＩｇｌ１１　μ鎖（７４，０００１、ウシ血清 アルブミン（６５，０００）、ヒトＩｇＧ　＠ｔ５０，０００１、アルドラーゼ （４０，０００１、カルボニックアンヒドラーゼ＋２９．０００１およびヒト軽 鎖（２３，０００１であった。

蔗糖　配゛心　離 ５ＡＣｈＥ（３００μｌ）の沈降係数を、沈降マーカーとしてβ−ガラクトシダ ーゼ＋１５．９　ｓｌ、カタラーゼＨ１，３ｓｌおよびグルコースオキシダーゼ ＋７．９　ｓｌ　を用いて、５ｏ■属のリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８，０） 中ノ４−２０％（ｗ／ｖ）蔗糖勾配（５ｍｌ）　中テ評価シ１．−０遠心分離を 、５Ｗ５ｏローターを有するＢａｃｋｍａｎ　Ｌ５−５０超遠心分離器（１５０ ，０ＯＯＸ　ｇで１５時間）中、４℃で行った。フラクシヨン（２５０μｌ）を グラジェントから回収し、Ｅｌｌ腸８ｎアフ七イによりＡＣｈＥ活性をアッセイ した。

１９７１１により記載されたようにして、５％ポリアクリルアミド−０，５％ア ガロース筒状ゲルｔｏ、　４ｃ■×８ｃ１上、１０ｔで行った。用いた同性電解 質のｐＨ範囲は３〜１ｏおよび４〜６のＬＫＢであった。電気泳動に続いて、上 記のようにして、ゲルを酵素活性に対して組織化学的に染色した。酵素のｐＩを 、既知のｐｌを有する多数のマーカータンパク質ｆＩＥＦ検量キット、ｓ１ｇ■ ａｃｏ、ｌを電気泳動することにより作成された標準プロットから決定した。

と久土ヱ亙澄 ５ＡＣｈＥとレクチンとのインタラクシランを、アガロース−結合レクチン土の アブィニティークロマトグラフィーにょや調べた。

次の樹脂（Ｓｉｇｍａ　Ｃｏ、］を用いた・アガロース−コンカナバリンＡ型ｌ ｌｌ−＾、　１０１ｇレクチン／冒ｌゲＪし：アガロースーレンズクリナリスｆ Ｌｅｎｓｃｕｌｉｎａｒｉｓｌ、２．５ｍｇレクチン／＋＋１ゲル、およびアガ ロースーリシヌスコムニス（ｒｉｃｌｎｕｓ　ｃｏｗ鳳ｕｎｉｓｌ、２．５冒ｇ レクチン／■ｌゲル。ゲル＋１００μｌ　）を、ＮａＣ１０，３Ｍ、並びに次の 塩：　ＣａＣｌ２、ＭｇＣｌ２、ＭｎＣｌ２およびＺｎＣｌ２をそれぞれ２５■ 間含有する５０１１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７，０を用いて遠心により洗 浄した（３回、各１ｍ１）。同じ緩衝液（４００μＩ　ｌに、ｓ　Ａ　Ｃｈ　Ｅ 　（１０ｍ単位）を加え、懸濁液を温和に混合しながら４℃で４時間インキュベ ートした。ゲルを遠心により洗浄しく３回、各０５會ｌ）、未結合物質の酵素活 性を、Ｅｌｆ■ａｎアフセイにより測定した。非−特異的結合を、アガロース− 結合ヤギ免疫グロブリンＧゲル（Ｓｉｇ■ａｃｏ、ｌを用いて決定した。

タンパク質の評 タンパク質濃度を、変更したローライアッセイ（Ｍａｒｋｗｅｌｌ　ｅｔ　ａｌ 、。

Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｗ＋、、　８７．２０６−２１０．１９７８］を用い て決定した。ウシ胎児血清アルブミンを、標準として用いた。

成人層および胎児脳におけるａＡＣｈＥ活性の２０〜３０％は、高速上澄み液に 回収された。酵素活性およびタンパク質含有量を表１に示す。

［ヒト脳　上澄み　のＡＣｈＥおよびタンパク成人層　１．４　４３＋０　０． ０３１　１１．０　０．００８胎児脳　２．１　４２．６　０．０２０　３４． ４０　０．０１６ＡＣｈＥおよびＣｈＥの活性を、基質としてア七チルチオコリ ンヨー　Ｆ（１ｍｌ）オ！ヒＡｃｈ　Ｅ阻ＩＦ剤トＬテＢ１１２８４　Ｃ５１（ １，５ｍｌ＋ヲ用いるＥｌ１ｍａｎアッセイにより測定した。タンパク濃度は、 ローリイ（Ｌｏｗｒｙ）法により評僅した。タンパク質濃度および酵素活性は、 異なる標本間で＜２０％だけ変化した。

ＦＡＤＥによる酵素活性の分析は、両方の上澄み液がエステラーゼ活性の三つの バンド、即ちＢｌｌ　２８４　Ｃ５１によって阻害されないゆっくり移動するＰ ｓＣｈＥバンド、中程度に移動するＡＣｈＥバンドおよび速く移動するＡＣｈＥ バンド（これら両方は、ＢＷ　２８４　Ｃ５１によって阻害された）を含むこと を示した。

脳上澄み液を、セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）　Ｓ−２００カラム上での ゲルろ過により分別した。三つの主タンパク質ピーク、即ち分子量がそれぞれ≧ ２５０，０００　（空隙率）、ｓｏ、　ｏｏｏ〜６０．０００および＜１０，０ ００で溶離するビークが得られた。内方の脳上澄み液におけるＡＣｈＥ活性を、 ２つの良く分解したピーク、即ちそれぞれ２２０．０００〜２４０．０００ダル トンおよび４５．０００〜ｓｓ、ｏｏｏダルトンの近似分子量に相当する溶離容 積を有するＰｌおよびＰ２に分別した。各ピークに相当するフラクションをプー ルした。成人層上澄み液では、適用したＡＣｈＥ活性は、同様に二つのピークに 分けられたが、胎児上澄み液ＡＣｈＥ活性の〉７０％はピークＰ１に現れた。Ｐ ＡＧＥによるエステラーゼ活性の分析は、Ｐｌが大部分のゆっくり移動するＡＣ ｈＥ　（ＣＳＦ中の５ＡＣｈＥに相当する）並びにＰｓＡＣｈＥ、および少量の 速く移動するＡＣｈＥを含むことを示した。Ｐ２は少量のｓ　Ａ　Ｃｈ　’Ｅ、 無視しうる量のＰｓＡＣｈＥおよび大部分の速く移動するＡＣｈＥを含んでいた 。

ＡＣｈＥのアフィニティークロマトグラフィー成人および胎児のＰＩおよびＰ２ を、エドロホニウムーセファロースゲル上でアフィニティークロマトグラフィー 処理した。使用したサンプル、未結合フラクションおよび塩化エドロホニウム溶 離フラクション中のＡＣｈＥ活性を、Ｅｌ１ｍａｎアッセイにより測定した。

アブィニティーカラムに結合したＰｌ中のＡＣｈ　Ｅ活性の６０〜８０％のうち 、４０〜５０％を塩化エドロホニウムで溶離できたが、Ｐｚ中のＡＣｈＥ活性の ３％以下が結合した。ＰＡＧＥによる塩化エドロホニウムー溶離フラクションの 分析は、酵素活性を有する一つのバンドの存在を示した。このバンドは、Ｂ＠　 ２８４　Ｃ５１により完全に阻害され、Ｃ５Ｆ中に存在する５ＡＣｈＥに相当す る電気泳動移動度を有していた。ＰＡＧＥのタンパク質染色は、ＡＣｈＥのタン パク質に相当する塩化エドロホニウムフラクション中に−っのバンドがあること を示した。この塩化エドロホニウムフラクシッンは、以下に、５ＡＣｈＥと呼ば れる。セファデックスＧ５０カラム上で脱塩した後の精製酵素の比活性は、成人 および胎児の５ＡＣｈＥについて、それぞれ５００〜８００単位／ｍｇおよび９ ００〜１５００単位／■ｇであった。しかし、両方の標本は急速に失活した。従 って凍結乾燥し、ＲＢＳ中で再構築した後、比活性は５０〜１００単位／■ｇに 低下した。活性のこの低下は、−２０℃で保存しても続いた。精製の際の酵素の 同様の不活性化は、ウシ胎児血清ｓ　Ａ　Ｃｈ　Ｅ　［Ｃｈｕｂｂ　ｅｔ　ａｌ 、、！１ｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ、１０Ｔ４１゜１３６９−１３７７、　１９８ ３１および脳Ａ　Ｃｈ　Ｅ　（Ｇｏｒｄｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｂｉｏｃｈｅｍ 、　Ｊ、。

１５７、６９−７６、１９７６１についても報告された。

種々のヒト生物学的サンプル中のＡＣｈＥおよびＰｓＣｈＥの活性を表２にまと めて示す。この表には、エドロホニウムーセファロースが種々のＡＣｈＥ標本に 結合する能力も示されている。

ｉス 穫々の抗原溶液の活性、およびＥｌ１ｍａｎアッセイを　いて測　されたエドロ ホニウムーセファロースによ　されたＡＣｈＥの％カラム 成人層　４３．０　１１．０　− 胎児１１ｉ　４２．６　コ４．０　６１ｔ　ＡＣｈＥＣＳＦ　１２０．０　５０ ．０　８５＆　ＡＣｈＥ界面活性剤　８２０．０　４Ｂ、２　０％　ＡＣｈＥ可 溶性ＡＣｈＥ （胎児） ヒト血清　２２４．０　１９７０．０　０ｔ　ＡＣｈＥ正ｔｋ＞血清　５：１． ０　６５Ｂ、６　０％　ＡＣｈＥ還元性条件下での５ＤＳ−ＰＡＧＥによる成人 および胎児の５ＡＣｈＥの分析１±、Ｍ、６６、．０００に主要バンドがあるこ とを示した。

成人と胎児との酵素間に、分子量の差はなかった。

蔗糖−艷１笠（産皇立１ 成人ｓ　Ａ　Ｃｈ　Ｅ　＋ｆ、１５．３５ａＩＩオヨヒ１０．４　Ｓａｗ１’沈 降すル二つ）主要形態を現した。前者は多分、凝集物質である。６．２５５ａＩ Ｉの沈降係数を有する小さい方のピークも現れた。胎児５ＡＣｈＥも、ＡＣｈＥ 活性の三つの形態を現したが、相対的分布は１５．ＯＳａｕ、１０．５５ａＩＩ および６．ｌ５４ｗで、異なっていた。両方の場合の６．１〜６．２ｓ形態は、 −２０℃で保存しても増大した。ＡＣｈＥの成人形態と胎児形態との沈降係数の 相違は、有為でなかった。

５ＡＣｈＥの等電点型　泳 ３〜１０および４〜６のｐＨ範囲を有する両性電解質を用いて、精製５ＡＣｈＥ の電気泳動を行った。酵素染色ゲルは一つの活性バンドを現した。このバンドは 、Ｂｌｌ　２８４　Ｃ５１により完全に阻害された。得られたｐｒ値ｆｎ　＝　 １０、平均上Ｓ、Ｄ、ｌは、成人５ＡＣｈＥで５４７±０．２２、胎児５ＡＣｈ Ｅで５４７±０．１７であった。

レクチン結合　□ 成人または胎児の５ＡＣｈＥ（各１０ｍ単位）を、レクチンアガロースと４℃で ４時間混合した。洗浄した後、溶離液中の未結合酵素の量をＥｌ１ｍａｎアッセ イにより測定した。その結果を表３に示す。数値は、括弧内の範囲にある５回の 実験の平均である。

青−）−とクチンを之−今□−□全一の５ＡＣｈＥの　−Ｉ旦Ｗ口し笈 レクチ７　１見１　炙ム盈（ル　稚叉盈穎１Ｃｏｎ−Ａ　？ンノースおよびグル コース　９２（８５−９８１９５＋８４−９７）Ｌｅｎｔｉｌ　マンノースおよ びグルコース　９７（８３−９９１９８（９５−９９１Ｒ１ｃｉｎｕｓ　ガラク トース　８２（７５−８９１８８（８０−９０１ＩｇＧ　なし　６（３−８１５ （３−９１表３は、成人５ＡＣｈＥおよび胎児５ＡＣｈＥの間者の８０％以上が レクチン樹脂に吸着されたことを示している。この相互反応１よ、アガロース− ＩｇＧ樹脂に結合しないことによって示されるように、特異的であった。レクチ ンへの５ＡＣｈＥの結合は極めて強力であり、結合した酵素の５０％以下は対応 するリガンドｔ０．５Ｍのａ−メチルグルコシド、Ｏ，ＳＷのσ−メチルマンノ シドおよび０２５Ｍのβ−メチルガラクトシド）で脱着することができなかった 。

１μ ｍ　彬μ マイクロタイタープレートとして、Ｇｉｂｃｏ　（英国）製ｒＩｍｍｕｎｏｐｌ ａｔｅ　ＩＩＪを用い、モノクローナル抗ウサギイムノグロブリン−アルカリホ スファターゼ結合クローンＲＧ−１６は、Ｓ１ｇ■ａＣｈｅ＋＋１ｃａｌ　Ｃｏ 、　Ｌｔｄ、　（英国）製であった。

カゼイン（淡白色可溶性）は、Ｂ、Ｄ、ＩＩ製であり、全ての他の試薬は、分析 用であって、Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、　Ｌｔｄ、　（英国）、Ｆ Ｓ、＾。

（英国）またはＢ、Ｄ、Ｈ，（英国）製であった。

２・　」 烹すクローナル抗血１１ 完全フロインドアジュバント（ＦＣ＾）中の５ＡＣｈＥ　（５０ｐ　ｇ　）を筋 肉注射することによって、ウサギ（Ｒｂ３５）を免疫した。４週間後、このウサ ギを、不完全フロインドアジュバント中の５ＡＣｈＥ　（５０ｐｇ　）の注射に よって追加免疫し、５週間後に採凱した。抗血清を調製し、−２０℃でアリコー トとして保存した。正常ウサギ血清を、免疫されていないウサギから調製した。

５ＡＣｈＥに対する　出のエリザ ツイーン２０（ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート）を用いる場合に は、００５％の濃度とした。すべてのインキュベーシッン工程において、各ウェ ル毎に１００μｌのアリコートを用いた。洗浄工程では、各ウェル毎に１５０　 ｐ　ｌのアリコートを用いた。全ての洗浄工程およびインキュベーシッン工程間 において、ウェルは速やかにＭ！ｌ乾燥した。マイクロタイターウェルを、ｐＨ ９，６の０．０５Ｍ重炭酸塩／炭酸塩緩衝液中の５ＡＣｈＥ　（５００％ｇ／■ ｌ）で、室温にて、−昼夜被覆した。次に、ウェルを、ＰＢＳ／ツイーンにて合 計３回洗浄し、最終洗浄は、３７℃で３０分間放置した。ＰＢＳ／ツイーン７１ ％カゼイン中で、１／１０００に希釈したウサギ抗血清を、３７℃で２時間、ウ ェル中でインキュベートした。ウェルを、ＰＢＳ／ツイーンで５回洗浄した。

ＰＢＳ／ツイーン／１％カゼイン中で、　１　／　１０００に希釈したモノクロ ーナル抗つサギイムノグロブリンーアルカリホスホターゼ結合体を、３７℃で１ ５時間、ウェル中でインキュベートした。ウェルを、ＰＢＳ／ツイーンで５回洗 浄した。基質溶液（ｐＨ９，６の０．０５Ｍ重炭酸塩／炭酸塩緩衝液中のｐ−ニ トロフェニルホスフェート２■ｇ／　ｍｌ）を、３０分間インキュベートした。

基質反応を、５ｏｐｌのＬＭ水水酸化ナトリウム製添加より停止し、光学密度示 教を、Ｔｉｔｅｒｔｅｋ　Ｍｕｌｔｌｓｃａｎ　ＭＣＣプレートリーダーを用い て４０５ｎ冒で測定した。

３　枚重 被覆抗原として５ＡＣｈＥを用いたエリザを行ない、抗−５ＡＣｈＥ抗血清の反 応性を試験し、正常ウサギ血清と比較した。結果を表４に示す。

表４は、５ＡＣｈＥで免疫したウサギからの血清が、直接エリザにおいて５ＡＣ ｈＥに結合可能な抗体を含み、正常ウサギ血清が含まないことを示している。

人１」Ｕ− １焦ｙ マイクロタイタープレートとして、Ｇｉｂｃｏ　（英国）製ｒ　Ｉｍｍｕｎｏｐ ｌａｔｅ　ＩＩ　Ｊ　を用い、ポリアミノ酸は、Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ 　Ｃｏ。

Ｌｔｄ、　（英国）製であり、モノクローナル抗ウサギイムノグロブリン−アル カリホスファターゼ結合クローンＲＧ−１６は、Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ、　Ｌｔｄ、　（英国）製であった。

カゼイン　（淡白色可溶性）は、Ｂ、　Ｄ、　Ｈ，製であった。全ての他の試薬 は、分析用であって、３１ｇ＋＋ａ　Ｃ１１ｎｉｃａｌ　Ｃｏ、　Ｌｔｄ、　（ 英国）、Ｆ、Ｓ、Ａ。

（英国）またはＢ、Ｄ、Ｈ，（英国）製であった。

サンプル ヒト血清サンプルおよび脳を髄液（ＣＳＦ）を以下の施設から得たブリストル、 サウスミード（Ｓｏｕｔｈｍｅａｄ）　ａ合病院、臨床化学部ｆｔｈｅ　Ｄｅｐ ａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｃ１１ｎｉｃａｌ　Ｃｈｅ＋１ｉｓｔｒｙｌ（Ｂｌｌ； 　サザンプトン（Ｓｏｕｔｈａｓｐｔｏｎ）総合病院、内分泌学部（ｔｈｅ　Ｄ ｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆＥｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ）　（Ｓｔ）　；　サザ ンプトン総合病院、ウエセックス局部免疫学（Ｒｅｇｉｏｎａｌ　Ｉｍｍｕｎｏ ｌｏｇｙ）　（Ｂ２）　；　またはサザンプトン総合病院、微生物学０（Ｂ３） 。

２・　π１ ４１片見易ＣｈＥＩ）ｎｍ：　参考例１に説明されている。

ポリクローナル抗血清の製造、参考例２に説明されたウサギ血清。

サンプル を椎披裂血清Ａは、Ｂ１からのサンプルであり、を椎披裂陽性胎児を妊娠した母 親からの、同一の比率での４つの血清のプールであった。を椎披裂血清Ｂは、ｓ ｌがらのサンプルであり、を椎披裂陽性胎児を妊娠した母親からの、同一の比率 での５つの血清のプールであった。無脳症血清Ｃは、Ｓｌからのサンプルであり 、無脳症陽性胎児を妊娠した母親からの、同一の比率での５つの血清のブーンレ であった。正常ヒト血清りおよびＥは、Ｓ３からのサンプルであり、各々が、妊 娠した母親の正常プールからの、同一の比率での５つの血清のプールであった。

Ｃ３Ｆは、Ｓ２からのサンプルであり、同一の比率での２０のＣ３Ｆサンプルの プールであった。

ｉ１１夏五ユ！（Ｅｎｚｙｍｅ　Ｃａｐｔｕｒｅ　ＥＬＩＳ＾）ツイーン２０（ ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート）を用いる場合には、００５％の 濃度とした。すべてのインキュペーション工程において、各ウェル毎に１００μ ｌのアリコートを用いた。洗浄工程では、各ウェル笹に１５０μｌのアリコート を用いた。全ての洗浄およびインキュベーシッン段階間において、ウェルは速や かに震盪乾燥した。マイクロタイターウェルを、ポリーＬ−ＩＪジン溶液（ＰＢ Ｓ中、ボ’Ｊ　−Ｌ−’Ｊジン（分子量１５０，０００−ａｏｏ、ｏｏｏ）　ｓ ａｐ　ｇ　／ｍｌ）　テ、４℃にて、−ａ夜被覆した。コントロールウェルは、 ＰＢＳのみを用いてインキュベートした。次に、ウェルを、ＰＢＳ／ツイーンに て合計５回洗浄し、最終洗浄は、３７℃で３０分間放置した。ＰＢｓ　／ツイー ン中で、適度に希釈したヒト血清サンプルまたは脳を髄液（Ｃ３Ｆ　）を、３７ ℃で２時間、ウェル中でインキュベートした。ウェルを、ＰＢＳで５回洗浄した 。ＰＢＳ／１％カゼイン中で、　１／１０００に希釈したウサギ抗５ＡＣｈＥ血 清を、３７℃で２時間、ウェル中でインキュベートした。ウェルな、ＰＢＳで５ 回洗浄した。ＰＢＳ／　１％カゼイン中で、ｌ／１０００に希釈したモノクロー ナル抗ウサギイムノグロブリン−アルカリホスファターゼ結合体を、３７℃で１ ．５時間、ウェル中でインキュベートした。ウェルを、ＰＢＳで５回洗浄した。

基質溶＊（ｐＨ９，６のＯ，０５Ｍ重炭酸塩／炭酸塩緩衝液中のｐ−ニトロフェ ニルホスフェ−）２ｍｇ／■ｌ）を、６分間インキュベートした。基質反応を、 ５０μｌの１Ｍ水酸化ナトリウムの添加によや停止し、光学密度単数を、Ｔｉｔ ｅｒｔｅｋ　Ｍｕｌｔｉｓｃａｎ　ＭＣＣプレートリーダーを用いて４０５ｎ− で測定した。

３、板玉 酵素捕獲エリザを捕獲試薬としてのポリーＬ−リジンと、検出試薬としてのウサ ギ抗−５ＡＣｈＥ抗血清を用いて行なった。

結果を表５に示した。表５は、ポリーＬ−リジンを用いずにマイクロタイタープ レートウェルを被覆した場合には、アッセイの結果得られた光学密度単数は、無 視できることを示している。これは、このような場合には、ウェルは、サンプル から５ＡＣｈＥを特異的に吸収する能力がなく、従って検出値が観察されなかっ たことを示す。ポリーＬ−リジンを用いてウェルを被覆した場合には、ＣＦＳと ともに、３つの疾患陽性血清へ、旦およびｐで、有意な陽性のシグナルが得られ 、正常の血清で比較的低いシングナルが得られた。これは、捕獲サンプルとして ポリーＬ−リジンを用いたアッセイが、５ＡＣｈＥレベルがより高いサンプル（ 即ち、Ｃ５Ｆまたはを椎披裂あるいは無脳症の胎児を妊娠した母親の血清）と、 ５ＡＣｈＥレベルがより低いが無視できるサンプル（正常な妊娠を□した母親の プールからの血清）とを弁別できることを示している。

テストサンプルの代わりに、ＰＢＳ／ツイーンコントローＪしを用Ｉ／また場合 には、結果として得られたシグナルは無視できた。この結果１ｉ、ＰＢＳ／ツイ ーンを用い、これに次いで抗体検出段階でＰＢＳ／　１％カゼインを用いた予備 ブロック工程が、これら試薬による有意な非特異的結合をブロックするのに充分 であることを示してりする。

スーｍｍ−貧 実施例１に説明されている。

２　」 竺−し糊萼１＾助−ト旦ｕ１：参考例１に説明されている。

も丈−色−ｙニナ温１１遣！Ｊ１．参考例２に説明されている。

４ｆ　＞　７上　実施例１に説明されている。

」」１１と丈！− ツイーン２０（ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート）を用いる場合に は、００５％の濃度とした。すべてのインキュページ冒ン工程において、各ウェ ル毎に１００μｌのアリコートを用いた。洗浄工程では、各ウェル毎に１５０ｐ ｌのアリコートを用いた。全ての洗浄工程およびインキュベーション工程間にお いて、ウェルは速やかに震盪乾燥した。マイクロタイターウェルを、ポリーＬ− リジン溶液（ＰＢＳ中、ホ’）　−Ｌ−’Ｊ　シン（分子量１５０，０００−３ ００．０００）　Ｓｏｐ　ｇ　／　ｍｌ）で、４℃にて、−ｉ夜被覆した。次に 、ウェルを、　ＰＢＳにて合計３回洗浄し、ＰＢＳ／ツイーンにて、３７℃で３ ０分間ブロックした。ウェルを、ＰＢＳにて３回洗浄した。４つの溶液（ＰＢＳ 、ＰＢｓ／ツイーン、ＰＢＳプラス０．３５Ｍ塩化ナトリウムまたはｐＢｓ／ツ イーンプラス０．３５Ｍ塩化ナトリウム）のいづれかで、適度に希釈したヒト血 清サンプルまたは脳を髄液（Ｃ８Ｆ）を、３７℃で２時間、ウェル中でインキュ ベートした。

ウェルを、ＰＢＳで５回洗浄した。ＰＢＳ／１％カゼイン中で、１／ＩＣ１００ に希釈したウサギ抗５ＡＣｈＥ血清を、３７℃で１１０分間、ウェル中でインキ ュベートした。ウェルを、ＰＢＳで５回洗浄した。ＰＢＳ／１％カゼイン中で、 　１．／１０００に希釈したモノクローナル抗つサギイムノグロブリン〜アルカ リホスファターゼ結合体を、３７℃で８０分間、ウェル中でインキュベートした 。ウェルを、ＰＢｓで５回洗浄した。基質溶液（ｐｆＩ９．６の０．０５Ｍ重炭 酸塩／炭暖塩緩衝液中のｐ−二トロフェニルホスフエート２璽ｇ／ｍＬ）を、５ 分間インキュベートした。基質反応を、５０μｌの１Ｍ水酸化ナトリウムの添加 により停止し、光学密度信号を、Ｔｉｔｅｒｔｅｋ　Ｈｕｌｔｉｓｃａｎ　ＭＣ Ｃプレートリーダーを用いて４０５ｎｔｔ’濶定した。

３　リ 酵素捕獲エリザを、捕獲試薬としてのポリーＩ、−リジンと、検ｔＢ！ｃ薬とし てのウサギ抗−５ＡｃｈＥｔ＆血清を用いて行なった。

結果を表６に示した。表６から、テストしたサンプルが、４種の異なる溶液（Ｐ ＢＳ、ＰＢＳ／　７　イー　ン、ＰＢＳ））Ｘｏ、３５Ｍａ化す）　ＩＪ　ウＡ またはＰＢＳ　／ツイーンプラス０．３５Ｍ塩化ナトリウム）中で負荷された（ ｌｏａｄｅｄ）場合には、異なるサンプルから結果として得られたシグナル間に 、明らかな違いが観察されることが判る。したがって、このアッセイにおいて、 ５ＡＣｈＥレベルが高いサンプル（サンプルＡ。

Ｂ、ＣおよびＣ８Ｆ　）には、より高い光学密度値が観察され、５ＡＣｈＥレベ ルが低いサンプル（正常血清）には、非常により低い光学密度値が観察される。

ＰＢＳ　／ツイーン７０．３５Ｍ塩化ナトリウムは、正常叙情には無視し得る光 学密度信号を与える一方で、ＣＦＳ、あるいはを椎披裂または無脳症の胎児を妊 娠した母親がらのＣＦＳおよび血清は、陽性シグナルを示すことがら、サンプル を負荷するもっとも良い溶液であるようである。

Σ １胤鼻１ 実施例１に説明されてνする。

２、ｉ！ 見上亙Ａ１咳［然！１゛参考例−二説明されてしする。

ポリクローナル抗血清の製造：参考例２に説明されてＩ＃する。

サンプル＋　ＣＦＳは実施例１１：説明されてｂする。

ＩＬＬ葺１三ニジ− ツイーン２０（ポリオキシエチレン゛ノンレビタンモノラウレート）を用いる場 合には、００５％の濃度とした。

すべてのインキュペーシツン工程番；おり１て、各ウニＪしｔｇｔ二１００μｌ のアリコートを用νまた。洗浄工程で１よ、各ウニ２等番二１５０μｌの７１ノ コートを用いた。全ての洗浄工程およびインキュベーシジン工程間において、ウ ェルは速や力・番二震盪乾燥した。

マイクロタイターウニＪしを、ポ’Ｊ−Ｌ−１ノジン溶液（ＰＢＳ中、ポＩＪ− Ｌ−リジン、　分子量　ｔｓｏ、ｏｏｏ〜ａｏｏ、ｏｏｏ、　５０μｇ／璽ｌ） で、　４℃各二で、−昼夜Ｎ！覆した。次に、ウェルを、ＰＢＳｊ：、て合１ｔ ３回洗浄し、ＰＢＳ／ツイーンにて、３７℃で３０分間ブロックした。ウエンレ をＰＢＳ／”ツイーンで５回洗浄した。サンプｌし段階で、ＰＢＳＢ／　’ツイ ーン７０．３５Ｍ塩化ナトリウム中の１／６希釈のＣＦＳを、５ＡｃｈＥｊｌと して用Ｖ）、３７℃で２時間、全てのウェル中でインキュベートした。ウェルを 、ＰＢＳ／”クイーンで５回洗浄した。ｐａｌｓ７１％カゼイン中で、１　／　 １０００ｉ：希釈した正常ウサギ血清またはウサギ抗５ＡｃｈＥ＆清を、３７℃ で２時間、ウェル中でインキュベートした。ウェルを、ＰＢＳ／ツイーンで５回 洗浄した。

ＰＢＳ／　１％カゼイン中で、１７１０００に希釈したモノクローナル抗ウサギ イムノグロブリン−アルカリホスファターゼ結合体を、３７℃で１５時間、ウェ ル中でインキュベートした。ウェルを、ＰＢＳで５回洗浄した。基質溶液（ｐＨ ９，６の０．０５Ｍ重炭酸塩／炭酸塩緩衝液中のｐ−ニトロフェニルホスフェー ト２層ｇ／ｍｌ）を、５分間インキュベートした。基質反応を、５０μｌの１Ｍ 水酸化ナトリウムの添加により停止し、光学密度示教を、Ｔｌｔｅｒｔｅｋ　Ｍ ｕｌｔＬｓｃａｎ　ＭＣＣプレートリーダーを用いて４０５ｎ■で測定した。

３．１ 酵素捕獲エリザを捕獲試薬としてのポリーＬ−リジンと、検出試薬としてのウサ ギ抗−５ＡＣｈＥ抗血清を用いて行なった。

結果を表７に示した。表７から、正常ウサギ血清は、プレート上のポリーＬ−リ ジンによって捕獲されたＣ８Ｆから５ＡＣｈＥを認識して結合することができず 、アッセイの結果得られた光学密度が、血清の１／４００希釈でたった００２０ であることが判る。しかしながら、抗５ＡｃｈＥ＆清は、捕獲された５ＡＣｈＥ に特異的に結合でき、したがってｌＩｌ素捕獲エリザにおける陽性シグナルが得 られ、１　／３６００の希釈で、０．３４９の光学密度が観察された。

［ ４０５ｎｍで示された光学密度値 ウサギ血清の希釈度 血清１！！　Ｌ／４００　１／１２００　１／３６００　１／１０Ｂ００大」１ １土 ヒト給Ｉ　５ＡＣｈＥの　！！：　参考例ＩＩ；記載した。

ボリクｈナル抗血清の精製；　参考例ｚ１；記載した。

サンプル 実施例１に記載した。

溶解した正常ヒト血清は、妊娠してν１なり１女性力・らのものである。

ｔｔｔｒ−去ヱ。

ツイーン２０（ポリオキシエチレン゛ノルビタンモノラウレート）を用いる場合 は、濃度０．０５％とした。全てのインキュベーシジン工程において、ウェル当 たり、１ｏｏＰｔの溶液アＩノコートを用−また。洗浄工程では、ウェル当たり 、１５０μｌのアリコートを用いた。全ての洗浄段階と培養段階との間で、ウェ ルを速やかに震盪乾燥した。

マイクロタイターウェルを、４℃にて４８時間、ポリ−し一リジン溶液（５０μ ｇ／ｍｌ　ポリーＬ−リジン、ｔｓｏ、　ｏｏｏ−ａｏｏ、　ｏｏｏ、ＰＢＳ中 ）で被覆した。

次いでウェルをＰＢＳ−ツイーンにて計３回洗浄し、最終洗浄では３７℃で３０ 分間放置した。その後、ＰＢＳ／ツイーンでさらに２度洗浄した。

ＰＢＳ／ツイーン＋多様な添加塩化ナトリウム濃厚液で、１／１００に希釈した ヒト血清サンプルまたは１／３に希釈した脳を髄液（ＣＦＳＩを、ウェル中で、 ３７℃にて２時間インキュベートした。ウェルなＰＢＳ　／ツイーンにて５回洗 浄した。ＰＢＳ／ツイーン／１％カゼインで１／１０００に希釈したウサギ抗− ５ＡＣｈＥ血清をウェル中で、３７℃にて２時間インキュベートした。ウェルを ＰＢＳ／ツイーンにて５回洗浄した。

ＰＢＳ／ツイーン／１％カゼインで１／１０００に希釈したモノクローナル抗ウ サギ免疫グロブリン−アルカリホスファターゼ結合体を、ウェル中で、３７℃に て１．５時間インキュベートした。ウェルをＰＢＳ　／ツイーンにて５回洗浄し た。基質溶液（ｐ−ニトロフェニルフォスフェート２−ｇ／ｍｌ、００５賛の重 炭酸塩／炭酸塩緩衝液ｐＨ９，６中）を１５分間インキュベートした。ＩＭ水酸 化ナトリウム５０μｍを加え、基質反応を停止し、　Ｔｌｔｅｒｔｅｋ　Ｍｕｌ ｔｌｓｃａｎ　ＭＣＣｐｌａｔｅ　ｒｅａｄｅｒ　を用い、４０５ｎｍ　（二で 、光学密度示教を測定した。

捕獲剤としてポリーＬ−リジンを用い、検出剤としてウサギ抗−５ＡＣｈＥ血清 を用いて酵素捕獲エリザを行った。

結果を図１に示す。図１より、添加した塩化ナトリウム濃度の全範囲にわたって 、ＣＦＳと疾病陽性血清が、正常血清よりも相当に高い光学密度値を与えること が判明した。しかしながら、塩化ナトリウム濃度の増加につれて、疾病陽性血清 により与えられる信号に対する正常血清の光学密度値の比は減少する。したがっ て、サンプル緩衝液としてのＰＢＳ　／ツイーンへの０．４Ｍを超える塩化ナト リウムの添加は、疾病陽性血清と正常血清とを区別するアッセイ能をさらに増加 させる。

Ｘ」ｕ艷ｊ ｔ　Ｌｎ：　実施例１に一部記載。

ポリーＬ−リジンは、分子量１５０，０００−３００，０００　ｆ３００Ｋｌお よび４，０００−１５．０００　＋１５に＋のものであった。

ポリ−ローリジンは、分子量１５０．０００−３００，０００のものであった。

ポリーＬ−アスパラギンは、分子量ｓ、　ｏｏｏ−ｉｓ、　ｏｏｏのものであっ た。

ポリーＬ−グルタメートは、分子量ｓｏ、ｏｏｏ−ｔｏｏ、ｏｏｏのものであっ た。

ポリーＬ−ヒスチジンは、分子量ｔｓ、ｏｏｏ−ｓｏ、ｏｏｏのものであった。

ポリーＬ−オルニチンは、分子量１００，０００−２００，０００のものであっ た。

ポリ−ローアルギニンは、分子量７０，０００−１５０，０００のものであった 。

ポリーＬ−アスパルテートは、分子量１５、ｏｏｏ−ｓｏ、　ｏｏｏのものであ った。

２　九−韮。

ヒト給１５ＡＣｈＥの精製：　参考例１に記載した。

烹□男シη」１ニナル抗血清の製造　ウサギ抗−５ＡＣｈＥは、参考例２に記載 した。

土２二乙ヱ： この研究で用いられたＣＳＦは、Ｗｅｓｓｅｘ　Ｒｅｇｉｏｎａｌ　Ｉｍｗｕｎ ｏｌｏｇｙ。

Ｓｏｕｔｈａｗｐｔｏｒ＋　Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｈｏ５ｐｉｔａｌより得た２０の Ｃ５Ｆサンプルをプールすることにより製造した。

！】１」獲］ゲＬｆ ツイーン２０（ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート）を用いる場合は 、濃度００５％とした。

全ての培養工程において、ウェル当たり、１００μｌの溶液アリコートを用いた 。洗浄工程では、ウェル当たり、１５０μＩのアリコートを用いた。全ての洗浄 段階と培養段階との間で、ウェルを速やかに買置乾燥した。

マイクロタイターウェルを、４℃にて一晩、ポリ−アミノ酸溶液（５０μｇ／＋ ＊ｌ　ポリ−アミノ酸、ＰＢＳ中）で被覆した。次いでウェルをＰＢＳ　／ツイ ーンにて計５回洗浄し、最終洗浄では３７℃で１時ＩＩＩ！放置した。Ｃ３Ｆの ｌ／４、ｌ　／１６１　タハ１　／６４希釈液（ＰＢＳ／　ｙ　イー　ン＋　０ ．３５１１１＠化ナトリウム）をウェル中で３７℃にて２時間インキユベートシ た。ウェルなＰＢＳ／ツイーンにて５回洗浄した。ＰＢＳ／ツイーン／１％カゼ インで１／１０００に希釈したウサギ抗−５ＡＣｈＥ血清をウェル中で、３７℃ にて２時間インキュベートした。ウェルをＰＢＳ／ツイーンにて５回洗浄した。

ＰＢＳ／ツイーン７１％カゼインでｔ　／１ｏｏｏに希釈したモノクローナル抗 ウサギ免疫グロブリン−アルカリホスファターゼ結合体を、ウェル中で、３７℃ にて１．５時間インキュベートした。

ウェルをＰＢＳ／ツイーンにて５回洗浄した。基質溶液（ｐ−ニトロフェニルホ スフェート２嘗ｇ／■ｌ、０．０５買の重炭酸塩／炭酸塩緩衝液ｐＨ９，６中） を１５分間インキュベートした。１真水酸化ナトリウム５０μｍを加え、基質反 応を停止し、Ｔｉｔｅｒｔｅｋ　Ｍｕｌｔｉｓｃａｎ　ＭＣＣｐｌａｔｅ　ｒｅ ａｄｅｒを用い、４０５ｎ−にて、光学密度単数を測定した。

３　緻−１ 捕獲剤として多種のポリーアミノ陵な用い、検出剤としてウサギ抗−５ＡＣｈＥ 血清を用いて酵素捕獲エリザを行った。結果を表８に示す。

表８より、ポリーＬ−リジン　＋３００！１１、ポリーＬ−リジン　＋１５に＋ 、ポリ−ローリジン、ポリーＬ−ヒスチジン、ポリーＬ−オルニチンおよびポリ −ローアルギニンは、全て５ＡＣｈＥに対するリガンドとして作用し、結合して 酵素捕獲エリザにおいて陽性の光学密度値を与えることが判明した。

しかしながら、ポリーＬ−アスパラギン、ポリーＬ−グルタメートおよびポリー Ｌ−アスパルテートは、ポリ−アミノ酸の代わりにＰＢＳを用しまたとき（すな わち、コントロールウェル）と同程度の最終光学密度値を与えるのみであり、し たがって、５ＡＣｈＥによって結合させることはできなかった。

青−１ 夾】Ｃ１互 ポリクローニｊ二上」Ｌ血１ｏ１１：　ウサギ抗−５ＡＣｈＥは、実施例１に記 載した。

血清サンプルおよびＣ３ＦＪ！ 血清サンプルは、Ｓｏｕｔｈａｍｐｔｏｎ　Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｈｏ５ｐｉｔａｌ の内分泌学部より入手し、凍結して搬送し、−２０℃にて保存した。血清サンプ ルには、全て最小回数の凍結／解凍サイクルによる同じ処理を施した。

この研究に使用されたサンプルを表９にまとめて示す。

週妊娠齢の判明している正常妊婦　８３無Ｐｉｓ症　４ 閾口性を椎披裂　１７ 他の妊娠合併症　１５ 増加したＡＦＰ／正常結果　１３ この研究で用いられたＣＦＳ標準は、＠ｅｓｓｅｘ　Ｒｅｇｉｏｎａｌ　Ｉｍｍ ｕｎｏｌｏｇｙ。

Ｓｏｕｔｈａｍｐｔｏｎ　Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｂｏｓｐｌｔａｌより得た２０のＣ ５Ｆサンプルをプールすることにより製造した。

鼠】」１獲１ゲＬ里＝ ツイーン２０（ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート）を用いる場合は 、濃度００５％とした。

全てのインキュベーシジン工程において、ウェル当たＱ、１００μｌの溶液アリ コートを用いた。洗浄工程では、ウェル当たり、１５０μｌのアリコートを用い た。全ての洗浄段階と培養段階との間で、ウェルを速やかに重量乾燥した。

マイクロタイターウェルを、４℃にて一晩、ポリーＬ−リジン溶液（５０μｇ／ ■ｌ　ポリーＬ−リジン、１５０．０００−３００．０００、ＰＢＳ中）で被覆 した。

次いでウェルをＰＢＳ　／ツイーンにて計５回洗浄し、最終洗浄では３７℃で１ 時間放置した。ヒト血清サンプルを１　／　３００に希釈して用い、全てのサン プルに対して３回のアッセイを行なった。全てのプレートにおいで、Ｃ５Ｆ標準 の希釈曲線が含まれており、各希釈液は重複してアッセイした。３つの内！１１ 標準証清を、各プレートに重複して含ませた。これらの標準血清は、１の高陽性 血清、１の中隔性血清および１の低正常血清を含んでいた。全ての血清サンプル およびＣ３Ｆを、ＰＢｓ／ツイーン／　０．３５Ｍ塩化ナトリウムで希釈した。

ウェルは、該当する試験血清、標準曲線希釈液または内部標準を入れて、３７℃ にて２時間インキュベートした。ウェルをＰＢＳ／ツイーンにて５回洗浄した。

ＰＢＳ　／ライ−フッ１％カゼインで１７１０００に希釈したウサギ抗−５ＡＣ ｈＥ血清をウェル中で、３７℃にて２時間インキュベートした。ウェルをＰＢＳ ／ツイーンにて５回洗浄した。ＰＢＳ／ツイーン／１％カゼインで１／１０００ に希釈したモノクローナル抗ウサギ免疫グロブリン−アルカリホスファターゼ結 合体をウェル中で、３７℃にて１．５時間インキュベートした。ウェルをＰＢＳ ／ツイーン　にて５回洗浄した。基質溶１（ｐ−ニトロフェニルホスフェートＺ ｍｇ／■ｌ、０．０５１１の重炭酸塩／炭酸塩緩衝液ｐＨ９，６中）を１５分間 インキュベートした。

１閾の水酸化ナトリウム５０μｍを加えて基質反応を停止し、Ｔｉｔｅｒｔｅｋ ！１ｌｕｌｔｉｓｃａｎ　ＭＣＣプレートリーダーを用い、４０５ｎ−にて、光 学密度示教を測定した。

結果の起、舞 酵素捕獲エリザにより決定される５ＡＣｈＥのレベルは、各ケース毎に行なわれ る標準曲線対照Ｃ５Ｆに対する任意の単位として表される。すなわち、単位は以 下のように定義される“１／３　２００．００ １／６　１００．００ １／１２　ｓｏ、ｏ。

１／２４　２５．００ １７４Ｂ　１２．５０ １／９６　６．　２５ １７１９２　３．１３ Ｃ５Ｆの１／６希釈度が最高対照標準であるプレート上の初期試験に続いて、１ ００単位を超える値を有する血清は、１／３に希釈したＣ３Ｆ（すなわち２００ 単位）が最高対照値であるプレート上で再アブセイした。典型的なＣ５Ｆ対照標 準白線を図２に示す。

妊娠齢の判明している正常妊婦からの計８３個のサンプルを分析した。これらの 結果（表１０および図３）は、１５〜２０週の妊娠齢では、比較的一定した平均 値を示した。１４週についての５つの結果は、１５〜２０週のレベルよりも有意 に高く、これらのレベルは全対照範囲には包まれなかった。１５〜２０週妊娠齢 から７８サンプルの結果を組み合わせて、全対照範囲とした。これは、中央値２ ６　（２１０１１−５２１、平均値２Ａ１．６７％、および正常値の９７．５セ ンチルｆｃｅｎｔｉｌｅｌ　上限値（平均＋２ＳＤ）　４３．５％を有していた 。

次いで、異常妊娠がらのＳｏｕｔｈａｍｐｔｏｎサンプルについての結果を、二 つの異なる判定基準によって検査した。

ｉ）　中央値の２倍よりも大きな結果　（５２）ｉｌｌ　平均値中２ＳＤよりも 大きな結果　（４３，５１青」−立 正常妊娠サンプル　（Ｓｏｕｔｈａｍｐｔｏｎ）ＡＣｈＥ 妊娠齢（週）　Ｎ　平均値　中央値　平均値＋２ＳＤ１Ｂ、５　８　２２，９　 ２０，１　３５．３集計データ 中地のデータよりも有意に高く、全範囲の計算には含めなかった。

Ｂ　神　損妊娠　（Ｓｏｕｔｈａ＋＋　ｔｏｎ）無脳症４ケースおよび開口性背 椎披裂１７ケースからなる計２１の血清を分析した。２　ＭＯＮ　（ｍｕｌｔｉ ｐｌｅｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　５ｅｄＬａｎ、中央値の倍ＩＥ）（５２）を１限に用 いると、酵素捕獲エリザは、２１の神経管欠損妊娠の２０を明確に同定し、無脳 症１ケースのみが、この切り捨て値よりも低いレベルを有していた（表１１）。

同じサンプル力１らのアルファフェトプロティン（ＡＦＰ）の結果に同じ基準を 適用すると、ＡＦＰ結果は、２１のケースの１９をピックアップし、を椎披裂２ ケースが２１ＢＭより僅かに低かった。図４は、５ＡＣｈＥおよびＡＦＰレベル の分布を、それぞれの誦０舅として示す。ここで特筆すべき番よ、神経管欠損妊 娠における５ＡＣｈＥ結果のＭｏｌ範囲が、ＡＦＰの範囲と殆ど同じ広さであり 、さらに、ＡＦＰスクリーニングにより看過された二つのを椎披裂ケースが５Ａ ｃｈＥｉ＝対する酵素捕猾エリザで正しく同定されたことである。結果が、平均 値＋２ＳＤ　（９７，５センチル）よりも大き１１１力１否力亀の第２の基準を 用いると、この場合にも５ＡｃｈＥに対する酵素捕獲エリザは、２１の神経欠損 妊娠の２０を異常と分類した（図５）。

このようなサンプル１３個を分析したところ、９個は２　ＭＯＩＩよりも大きな ５ＡＣｈＥ　レベルを有し、１２個は９７．５センチルよりも大きなレベルを有 していた。

ｉｌｌ　縫Ｌ」すｉＨ［ 羊水過少症、腎発育不全症および胃壁披裂のケースからのサンプルは、増加した ５ＡＣｈＥレベルを有し、双生児妊娠からの３つのサンプルの４つ、そして流産 ／精留流産または子宮内死亡６ケースの３つで、同じことが起こった（表１２） 。

Ｕ 症−８Ｏｕｔｈａ璽ｔＯｎサンプル 監呈皇 １　１７．５　２７４　６．２９　６９．４　２＋６７２　１６　９７　２．７ ９　４０．６　Ｌ５６３　１７．５　２８７　７．０Ｂ　１４２　５．４６４　 １６．５　１２０　３．２　１７２　６．６２３ｙｊコ０（１覧 １　１６．５　１５６　４＋１７　９２．５　３．５Ｇ２　１６．５　１７５　 ４．６８　１０７　４．１２３　１７　１９５　４．８０　１０Ｂ　４．１５４ 　１５．５　１１６　３．５９　２０．５　７．８８５　１７　１３１　３．２ ３　１６４＋５　６．３３６　１７．５　１３９　３．：Ｌ９　２０５　７．８ ８７　１：ｌ　１０７　４．１２　１５２．５　５．８６８　１４　２４９　８ ．８９　１７８　６．８５９　１５．５　１０２　３．１５　９９．６　３．８ ３１０　１７．５　８３　１９　９３．１　３．５Ｆ３１１　１６　２６２　７ ．５２　１０２　３．９２１２　１７　４０２　９．９２　１２８　４．９２１ ３　１Ｂ、５　３６２　７．１６　ｉｌｌ　４．２７１４　１９．５　１２９　 ２．２　１１５５　５．９６１５　１３　５０　１９２　１０８　４．１５１６ 　１６．５　１２０　３．２　１７２　ｇ、６２１７　１５．５　１１４　３． ５　１４７　５．６５中該当する週妊娠齢の中央値を用いて算出した。

４　（小人症）　１９　１３５　９７．８５（胃壁披裂）　１６．５　１９２　 ．６７Ｄ　５ＡＣｈＥレベルとＡＦＰレベルとの全体的相関関係５ＡＣｈＥレベ ルと＾ＦＰレベルとは両者とも神経管欠損ケースにおし１て増加したが、５ＡＣ ｈＥとＡＦＰとの相ｌ′ＩＣ関係を、絶対値またはＭＯＭ結果のり）ずれかによ って評価したところ、二つの試験の間には何の相関関係も見出せなかった。

ＮＴＤサンプルについて　［５ｏｕｔｈａ■）旭１１　５ＡｃｈＥｆ単位）対Ａ ＦＰ　＋ＫＵ／　Ｌｌ＝相関係数ｔｒｉ−０，０７５１有意性なし）２１　ｓＡ ＣｈＥ（ＭＯＭＩ対ＡＦＰ（ＭＧＭＩ−相関係数（ｒｌ＝０．０２８１有意性無 し）ｋ嶌貫ユ １　止−上 マイクロタイタープレートは、Ｇｉｂｃｏ　（ｔｌＫｌの”Ｉｍｍｕｎｏｐｌａ ｔｅ　ＩＩ＋であった。

ポリーＬ−リジン臭化水素酸塩ｃａｔ、　ｎｏ、　Ｐ−１３９９、分子量２８９ ，０００は、Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、　Ｌｔｄ　ｆＵＫｌ　製で あった。

モノクローナル抗ウサギ免疫グロブリン−アルカリホスファターゼ結合体（クロ ーンＲＧ−１６１は、Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、　Ｌｔｄ　ｆＵＫ ｌ製であった。

ウサギ（Ｒｂ３５１抗−３ＡＣｈＥは、参考例２に記載したものである。

全テノ他の薬品は、分析線であり、Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、　Ｌ ｔｄ（ｔｌＫｌ、Ｆ、Ｓ、Ａ、（ｔｉｘｌ　ｔタハＢ、Ｄ、ｌ＋、＋ＩＪＫＩ　 カｌ−＋入手シタ。

サンプル ヒト血清サンプルは、Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ　ｆｏｒ　ｔｈｅ 　Ｃａｒｅ　ｏｆ　ｔｈｅＥｌｄｅｒｌｙ、　Ｓｔ　Ｍａｒｔｉｎｓ　Ｈｏ５ｐ ｉｔａ１．　Ｂａｔｈ、　ＢＡ２５ＲＰ　ｆＲＩｃＥｌ　がら得た。

想定されるアルツハイマー症を、ＤＳｌｌ１３Ｒ基準および！ＩＩＩＩｃＤｓ　 ＡＤＩＩＤ＾基準ｆＭｃＫｈａｎｎ、　Ｇ、、　Ｄｒａｃｈｍａｎ、ＤｌＦｏｌ ｓｔｅｉｎ、　Ｍ、、Ｋａｔｚｍａｎ、　Ｒ，。

Ｐｒ１ｃｅ、　Ｄ、、　ａｎｄ　５ｔａｄｌａｎ、　Ｅ、Ｍ、、　！ｌｅｕｒｏ ｌｏｇｙ、　３４．９３９−９４４．　Ｊｕｌｙ１９８４１を用いて、患者にお いて診断した。

正常血清は、神経変性症の疑いのないドナーから得た。

ツイーン２０（ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート）を、濃度００５ ％で使用した。全てのインキュベーション工程において、ウェル当たり１００ｐ ｌの溶液アリコートを用いた。洗浄工程では、ウェル当たり１５０μｍのアリコ ートを用いた。全ての洗浄段階と培養段階との間で、ウェルを速やかに重量乾燥 した。マイクロタイターウェルを、　４℃にて一晩、ポリーＬ−リジン溶液（５ ０ｐ　ｇ／脂ｌポリ−Ｌ−リジン、ＰＢＳ中）で被覆した。次いでウェルをＰＢ Ｓ／ツイーン　にて計５回洗浄し、最終洗浄では３７℃で１時間放置した。ヒト 血清サンプルを１／１０に希釈して用い、全てのサンプルに対して重複してアッ セイを行なった。プレートにおいて、Ｃ３Ｆの希釈曲線をプレートに含め、各希 釈液を重複してアッセイした。

１／１０の希釈度の全ての血清サンプルおよびＣ３Ｆは、ＰＢＳ／ツイーン１０ ３５閾塩化ナトリウムで希釈した。ウェルは、該当するサンプルを入れて、３７ ℃にて１５時間インキュベートした。ウェルをＰＢＳ／ツイーンにて５回洗浄し た。

ＰＢＳ／ツイーン／１％カゼインで１／１０００に希釈したウサギ抗−５ＡＣｈ Ｅ血清を、ウェル中で３７℃にて１５時間インキュベートした。

ウェルなＰＢＳ／ツイーンにて５回洗浄した。

ＰＢＳ／ツイーン／１％カゼインで１／１０００ｊ二希釈したモノクローナル抗 ウサギ免疫グロブリン−アルカリホスファターゼ結合体を、ウェル中で３７℃に て１５時間インキュベートした。ウニλしをＰＢＳ　／ツイーンにて５回洗浄し た。基質溶液（ｐ−ニトロフェニルレフオスフェート２ｍＢ１飄ｌ、０．０５Ｍ の重炭酸塩／炭酸塩緩衝液ｐＨ９，６中）全室Ｔ鼠番二で１時間インキコベート した。ＩＭの水酸化ナトリウム５０ｐ１を７１０えて基質反応を停止し、Ｔｌｔ ｅｒｔｅｋ　Ｍｕｌｔｉｓｃａｎ　ＭＣＣプレート１ノーダーを用い、４０５ｎ −にて、光学Ｚ度単数を測定した。

蝮」Δｙ膚 実施例６と同様。実施例６での使用に続いてＣ３Ｆをさら４１３回凍結・解凍し 、さらに９力月貯蔵した。したがって、活性（よ低下し、この実施例からの定義 単位は、実施例６からの標準曲線の定義単位と直接には比較できない。しかし、 実施例６と同様の任意単（ｉ２定義を用いた。

椿−−！ １７のコントロール＋ｍ？＋！（神経変性症の判っていないドナーからの年令の 揃ったヒト血清）は、３７．８５ＡＣｈＥ単位の平均値を与えた。

アルツハイマー症の薬物治療を受けていない、アルツハイマー症が想定されると 診断された９人の患者は、３０．８８５ＡＣｈＥ単位の平均値を勺えた。これは 、母集団において、重大な差異である。

診断に用いられた基準の有効性は、８０％になると推定された（Ｄｒ　ＲＪｏｎ ｅｓ　ＲＩＣＥによる私信１゜想定されるアルツハイマー症サンプルの一つは、 ７０．５ｓＡＣｈＥ単位の値、即ち他のｔ者よりも極めて高い値を与えた。この 値は、患者の平均値を２５．９５ＡＣｈＥ単位から３０．８８５ＡＣｈＥ単位に 変える。この患者は、血清採取の時点で、抗つツ病薬治療を受けた唯一の人であ った。

積−□練 これは予備的実験に過ぎないが、患者がアルツハイマー症を有する可能性を診断 するために、５ＡＣｈＥレベル測定により診断できることを示した。さらに、こ の予備的実験は、二つの集団、即ちコントロール対アルツハイマー症を職別する ように最適化されるだろう。

国際調査報告

Claims (21)

【特許請求の範囲】
1. １．ヒト分泌アセチルコリンエステラーゼ（ｓＡＣｈＥ）と結合でき、しかも抗 体ではないリガンドをサンプルと接触させ、次いでヒトｓＡＣｈＥが上記リガン ドと結合しているかどうかを測定することを特徴とする 試験サンプル中のヒト分泌アセチルコリンエステラーゼの測定方法。
2. ２．前記リガンドが固体担体またはマトリックス担体上に固定されている請求項 １に記載の方法。
3. ３．ヒトｓＡＣｈＥと結合しうる抗体を、ヒトｓＡＣｈＥが前記リガンドに結合 したかどうかを測定する際に用いる請求項１または２に記載の方法。
4. ４．前記抗体が酵素でラベル化されている請求項３に記載の方法。
5. ５．（ｉ）サンプルと、固体担体の表面上に固定されたリガンドとを接触させ、 （ｉｉ）固体担体の表面を洗浄し、 （ｉｉｉ）この洗浄された表面と、ヒトｓＡＣｈＥと結合しうるラベル化されて いない第１の抗体とを接触させ、（ｉｖ）さらに固体担体の表面を洗浄し、（ｖ ）この洗浄された表面と、ラベル化されかつ上記第１の抗体と結合しうる第２の 抗体とを接触させ、（ｖｉ）さらにこの固体担体の表面を洗浄し、（ｖｉｉ）こ の洗浄された表面上に第２の抗体のラベルが存在するかとうかを検知する ことを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
6. ６．試験サンプルが、０．１〜０．５Ｍの塩化ナトリウム溶液と混合された生体 液のサンプルである上記の請求項のいずれかに記載された方法。
7. ７．前記リガンドが正に帯電しうるアミノ酸である上記の請求項のいずれかに記 載された方法。
8. ８．前記アミノ酸がアルギニン、ヒスチジン、リジンまたはオルニチンである請 求項７に記載の方法。
9. ９．前記リガンドが、ポリ−Ｌ−アルギニン、ポリ−Ｌ−ヒスチジン、ポリ−Ｄ −リジン、ポリ−Ｌ−リジンおよびポリ−Ｌ−オルニチンあるいはこれらの２つ 以上の混合物から選択される請求項８に記載の方法。
10. １０．胎児中の神経管欠陷を診断するための上記請求項のいずれかに記載された 方法。
11. １１．アルツハイマー症を診断するための上記請求項１〜９のいずれかに記載さ れた方法。
12. １２．（ｉ）サンプルと、固体担体またはマトリックス担体の表面上に固定され たリガンドとを接触させ、 このリガンドが （ａ）酵素の基質または基質類縁体、 （ｂ）酵素のエフェクターまたはエフェクター類縁体、（ｃ）酵素のコファクタ ーまたはコファクター類縁体、（ｄ）酵素の補酵素または補酵素類縁体、または （ｅ）酵素の補欠分子団または補欠分子団類縁体であり、（ｉｉ）この酵素がリ ガンドと結合しているかどうかを測定することを特徴とする 試験サンプル中の酵素を測定する方法。
13. １３．ｓＡＣｈＥと結合できかつ抗体ではないリガンドと、リガンドに結合した 場合にヒトｓＡＣｈＥを検知するための手段とからなることを特徴とする 試験サンプル中のヒトｓＡＣｈＥを測定するために用いるのに適した試験キット 。
14. １４．前記リガンドが固体担体またはマトリックス担体上に固定されている請求 項１３に記載のキット。
15. １５．リガンドに結合されたヒトｓＡＣｈＥを測定するための手段が、ヒトｓＡ ＣｈＥと結合しうる酵素でラベル化された抗体と、この酵素の基質とからなる請 求項１３または１４に記載のキット。
16. １６．リガンドに結合したヒトｓＡＣｈＥを測定するための手段が、ヒトｓＡＣ ｈＥに結合しうるラベルされていない第１の抗体と、この第１の抗体に結合しう る酵素でラベルされた第２の抗体と、この酵素ラペルの基質とからなる請求項１ ３または１４のキット。
17. １７．前記リガンドが正に帯電しうるアミノ酸からなる請求項１３〜１６のいず れかに記載のキット。
18. １８．前記アミノ酸がアルギニン、ヒスチジン、リジンまたはオルニチンである 請求項１７に記載のキット。
19. １９．前記リガンドが、ポリ−Ｌ−アルギニン、ポリ−Ｌ−ヒスチジン、ポリ− Ｄ−リジン、ポリ−Ｄ−リジンおよびポリ−Ｌ−オルニチンあるいはこれらの２ つ以上の混合物から選択される請求項１８に記載のキット。
20. ２０．請求項１２で規定されかつ固体担体またはマトリックス担体上に固定され しかも前記酵素と結合しうるリガンドと、リガンドに結合された場合に酵素を検 知しうる手段とからなることを特徴とする 試験サンプル中の酵素を測定する際に用いるのに適した試験キット。
21. ２１．（ａ）サンプルと、リガンドに予め結合されたｓＡＣｈＥとを接触させ、 そして （ｂ）結合された抗体を測定することを特徴とする試験サンプル中のｓＡＣｈＥ に対する抗体を測定するための方法。