JPH06510605A - 生物学系にある一酸化窒素、ニトロソニウム同等物、ｓニトロソチオールおよびｓニトロソ蛋白質を検出する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 生物学系にある一酸化窒素、ニトロソニウム同等物、Ｓニトロソチオールおよび Ｓニトロソ蛋白質を検出する方法この発明は、オゾンとの反応による化学発光よ り前に生物学的流体を光分解にかけることを含め、生物学的サンプルにある一酸 化窒素およびニトロソニウム同等物を検出する方法に関する。この発明は更に、 生物学的サンプルにあるＳニトロソチオールおよびＳニトロソ蛋白質を検出する 方法に関し、それは化学発光より前にサンプルを水銀および蛋白質沈殿剤でそれ ぞれ処理し、また前記処理を行っていないサンプルにより創出された化学発光シ グナルで比較することを含む。

背景技術の簡単な説明 内皮誘導弛緩因子（ＥＤＲＦ）は正常な内皮細胞の産物であり、血管拡張神経性 および抗血小板物性を有する（ファーチゴット、Ｒ，Ｆ、他ｒＮａｔｕｒｅＪ　 ２８８　：　３７３−３７Ｇ　（１９８０）；モンカーダ、Ｓ、他ｒＢｉｏｃｈ ｅｍ。

Ｐｈｒｍａｃｏｌ、Ｊ　２８：１７０９−１７１３　（１９８９）；東、Ｈ１他 、ｒＢｒｉｔ、Ｊ、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、Ｊ　８８：４１１−４１５　（１９８ ６）、およびラグムスキー、Ｍ、Ｗ他ｒＢｒｉｔ、　Ｊ、　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ 、　Ｊ　９２：６３９−６４２　（１９８７））。薬理学研究は、敗血症性ショ ック、ハイバーホモシスティネミア、アテローム硬化、低酸素誘導肺循環昇圧な どにより変化する病症は、血管環境のなかでＥＤＲＦの異常な濃度に関係してい ることがある（ヴエステンバーガー、Ｕ、他ｒＦｒｅｅ　Ｒａｄ、Ｒｅｓ、Ｃｏ ｍｍ、Ｊ　１１：１６７−１６８　（１９９０）、山本、Ｈ０他ｒＪ、Ｃ１ｉｎ 。

Ｉｎｖｅｓｔ、Ｊ　８１　：　１７５２−１７５８　（１９８８）。

ディンースーアン、Ａ、Ｔ、他ｒＥｎｇ１．Ｊ、Ｍｅｄ、Ｊ３２４：１５３９− １５４７　（１９９１））、この生物活性物質は、−酸化窒素あるいはその化学 的同類もしくはその付加物と同等のものであると考えられる（バーマー、Ｒ，Ｍ 、Ｇ、他ｒＮａｔｕｒｅＪ　３２７：５２４−５２５　（１９８７）；イニャー ロ、Ｌ、Ｆ、他ｒＰｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、Ｊ　８４　：　９３６５−９３６９　（１９８７）−一酸化窒素の生物 学的付加物として重要な種類の中で、Ｓニトロソチオールがあり、これはアミノ 酸、ペプチド、および蛋白質のスルフヒドリル基を持つ付加物である。

−酸化窒素および真正のＥＤＲＦは試験管内の生理的条件の下で遊離チオール基 と反応してＳニトロソ蛋白質を形成することが示されてきた。−酸化窒素付加物 は生物活性を有し、それは−酸化窒素に類似するがそれは時間のレベルの半減期 でＥＤＲＦのそれよりもかなり長いことを示す。（ステムラ−１Ｊ、　Ｓ、他ｒ Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ１．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、８９：４４４−４４８　（１９９２） ）。血清アルブミンにあられれる単一遊離システィン（システィン３２）は生理 的条件の下で窒素酸化物（もっともあり得るニトロソニウムイオン）に対し特に 反応性に冨み、これは主として異常に低いｐＫおよび血漿にそれが豊富なことの ためであり、血漿内でそれは約０．５ｍＭのチオール濃度を占めているからであ る。

正常な状況の下では、血液あるいは血漿内での一酸化窒素の濃度は（ｉｎＭの範 囲内で）きわめて低く、その半減期は０．１秒のレベルであると考えられている 。酸素およびレドックス金属に対する反応性の高さ、およびその極端に短い半減 期のため、化学発光分光学、電子常磁性共鳴分光学、あるいはヘモグロビンの示 差吸光度分光学などのような標準方法によって、正常および疾病状態両方でのそ の血液水準のルーチン測定をもっとも困難にさせている。（マーチン、Ｍ、Ｊ。

他ｒＡｎａｌｙｓｔＪ　１０１　：　７４２−７４８　（１９７６）：ケルム９ Ｍ、他、ｒｃｉｒｃ、Ｒｅｃ、４６６：１５６１−１５７５　（１９９０）：ア ローヨ、Ｃ，Ｍ、他、ｒＦｒｅｅ、Ｒａｄ、Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍ、Ｊ　１４：１４ ５−１５５（１９９１）およびゴレッキー、Ｊ、他＋　「Ｊ−Ｂ　ｚ　ｏ　ｌ　 。

Ｃｈｅｍ、　Ｊ　２６３　：　２３１６−２３２３　（１９８８）　）、実際、 そのような測定は現在用いられている方法では実行不可能であると、一般にこの 分野では考えられている。

ニトロソニウム（ＮＯ”ｌは、あまりにも不安定なため生物学系で遊離して存在 出来ない短命の種であり、化学発光では検出できないと考えられている。−酸化 窒素は、−酸化窒素としてではな（、ニトロソニウム同等物として、Ｓニトロソ チオール付加物に存在している。かくしてそれは、化学的にはＮｏ・（−酸化窒 素）よりもむしろＮｏ４にもっと密接に似た形で行動する。Ｓニトロソチオール は化学発光により検出されていないし、それは一般に、ニトロソニウムが生物学 的に関連する種であるという従来の技術では評価されていない。

化学発光分光学は特に−酸化窒素を試験管内でのＥＤＲＦの研究で検出するため に使用されてきた。しかし標準分析によって、テストされるサンプルは、ニトロ ソニウム、不安定な付加物から、あるいは窒素のより高次の酸化状態から、遊離 の一酸化窒素の識別を排除する広範な化学的前処理を受ける。生物学系において 、ＳニトロソチオールおよびＳニトロソ蛋白質などのような一酸化窒素付加物に トロソニウム付加物）の重要性が、これらの研究者によって証明されると、これ らの化合物を一酸化窒素から識別し、生物学的サンプルから、それらを検出し定 量することが出来る分析方法の必要性が存在する。

発明の概要 この発明は、生物学流体サンプルによる一酸化窒素およびニトロソニウムを検出 する方法に関する。それは下記のものよりなる。

ａ、前記サンプルが光分解を受ける す、前記サンプルにある一酸化窒素の量を化学発光反応により発生するシグナル により定量する。

この発明は、更に生物学的流体にある低分子量のＳニトロソチオールを検出する 方法に関し、更に下記のステップよりなる。

ａ、請求の範囲第１項記載の方法に従って、生物学的流体にある全一酸化窒素の 量を検出する。

ｂ、同等の生物学的流体の別のサンプル内で、チオールと関連するいずれの一酸 化窒素にもある化学発光シグナル発生能力を不活性化する。

Ｃ９請求の範囲第１項記載の方法に従って、ステップ（ｂ）で得られたサンプル ある一酸化窒素を検出する。および ｄ、チオール結合−酸化窒素の量を確認するために、ステップ（ａ）とステップ （ｃ）の量の差を確認する。

この発明は更に生物学的流体サンプルにあるＳニトロソ蛋白質を検出する方法に 関し、次のステップよりなる。

ａ、請求の範囲第１項記載の方法に従って、全一酸化窒素を検出する。

ｂ、同等の生物学的流体の別のサンプル内で蛋白質と関連する一酸化窒素の化学 発光シグナル発生能力を除去する。

Ｃ，ステップ（ｂ）で得られるサンプルの一酸化窒素を検出する。および ｄ、蛋白質結合−酸化窒素の量を確認するためにステップ（ａ）およびステップ （ｃ）の量の差を確認する。

この発明は、更に患者の生物学的流体にあるＳニトロソチオールおよびＳニトロ ソ蛋白質を検出するためのこの発明の方法を使って、−酸化窒素およびニトロソ ニウム同等物の異常なレベルを含む疾病状態の存在を決定する方法に関する。

この発明は、更に患者の生物学的流体にあるＳニトロソチオールおよびＳニトロ ソ蛋白質を検出するこの発明の方法を使って、−酸化窒素およびニトロソニウム 同等物の異常なレベルを含む疾病状態の範囲をモニターする方法に関する。特に 前記疾病は、敗血症性ショック、６源性ショック、循環血液量減少性ショック、 アテローム硬化、ハイバーホモシスティネミア、静脈血栓症、動脈血栓症、冠状 動脈閉塞、肺塞栓症、脳血管性偶発症候、血管繊維症、水晶体転位、骨粗髭症、 精神遅滞、骨格奇形、肺循環昇圧、悪性腫瘍、感染および中枢神経系疾患を含む グループから選択することが出来る。

この発明は更に生物学的流体サンプルが、血液、血清、脳を髄液、精液、関節液 、腹水、腸分泌液、痰、大便、唾液、角膜水、羊水および汗よりなるグループか ら選択される発明の方法に関する。

図面の簡単な説明 第１図　生物学的サンプル内のＳニトロソチオールを測定するために使用される ＧＣ／ＨＰＬＣ光分解−化学発光の図解表現。

ＨＣ＝ヘリウム・カニスター、ＨＰＬＣ＝高性能液体クロマトグラフィ・システ ム、ＧＣ＝ガスクロマドグラフィ・システム、ＰＭＴ＝光電子増倍管。

第２図　Ｌ　−Ｎ　Ｍ　Ｍ　Ａ　５０　ｍ　ｇ　／　Ｋ　ｇを静脈内に全量注入 で投与したウサギの１＝０から１８０分間までのＬ−ＮＭＭＡ投与の場合の平均 動脈圧（白日）および血漿Ｓニトロソチオール（黒用）の代表的応答。

第３図　Ｌ−ＮＭＭＡ５０ｍｇ／Ｋｇを１＝０で投与した際のＳニトロソチオー ルの百分率変化。全ニトロソチオール（白棒線）、Ｓニトロソ蛋白質（黒棒＃ｌ ）、低分子量（ＬＭＷ）Ｓニトロソチオール（格子棒線）はＬ−ＮＭＭＡ注入後 １５分、３０分および６０分で測定され、１＝０のそれぞれの測定値に関してプ ロットされた。

望ましい実施例の説明 ＳニトロソチオールおよびＳニトロソ蛋白質は血管内皮細胞および白血球による 一酸化窒素の貯蔵所として役立つ、その結果、発明者は生物学的系にある遊離し た一酸化窒素二トロソニウム等価体、ＳニトロソチオールおよびＳニトロソ蛋白 質を検出する光分解化学発光法を発見した。

一つの実施例において、この発明は、オゾンを用いる化学発光より前にサンプル が光分解を受けることを含む生物学的流体における一酸化窒素を検出する方法に 関する。分析パラメーターおよび条件は、当業者により利用出来る決まった手法 により決定される。生物学的流体の例は、血液、血清、尿、脳を髄液、精液、関 節液、腹水、腸分泌液、痰、大便、唾液、角膜水、羊水および汗などを含む。

この発明のもう一つの実施例は、生物学的流体にある一酸化窒素同等物を検出す る方法に関し、これは光分解細胞が反応チャンバーおよび検出切片に直接結合し 、それにより熱分解器をバイパスする化学発光器を利用する。生物学的流体のサ ンプルは、直接、あるいは高活性液からのクロマトグラフィー流出液、あるいは 光分解細胞に結合するガスクロマトグラフィーとして、光分解細胞に注入される 。サンプルを光分解にかける前に、サンプルはヘモグロビンおよび他の血液成分 を除去するために遠心分離される。

このサンプルは次いで水銀蒸気ランプで照射され、一連のコールドトラップに向 けられ、ここで（硝酸塩および亜硝酸塩などの）−酸化窒素よりも揮発性の低い 液状あるいはガス状分画が除去され、細胞内には遊離−酸化窒素のみが残ること に成る。−酸化窒素は次いでガス状流体望ましくはヘリウムにより化学発光スペ クトル計に運ばれる。この代替案としては他の不活性ガスを利用することも出来 る。

一度化学発光分光計にあられれると、遊離−酸化窒素はオゾンとの化学反応で検 出され、その結果、シグナルが発生し、それはデジタル積分器で記録される。望 ましいモードにおいて、光分解細胞内で流量および照射レベルは、Ｓニトロソチ オール化合物内でのＳ−一酸化窒素結合の完全な光分解を生じるように設計され る。しかしどれが結合されるにしても、特殊な付加物と、−酸化窒素ニトロソニ ウムあるいはニトロキシルにトリル）との間の結合の最適な切断が行えるように 、流量および照射レベルは当業者により利用可能なルーチンの方法により調節す ることが出来る。

もう一つの実施例において、この発明は、生物学的流体にあるＳニトロソチオー ルの検出方法に関し、これは、前記サンプルにおいてチオールと関連する化学発 光、すべての−酸化窒素のシグナル発生能力を不活性化し、更に不活性化の後に 残存する全一酸化窒素と一酸化窒素の間の量的な差異を測定することにより、チ オール結合−酸化窒素の量を決定することよりなる。

この方法の特殊な実施例は、生物学的流体が第一水銀イオンで処理され、次いで 、大気培養され、これが−酸化窒素およびニトロソニウムを酸化し、その結果両 者を検出出来なくさせる方法に関する。前処理に適した化合物はＨｇ＊　Ｃ１ｘ および他の第一水銀イオン塩および遊離水銀を含む、処理されたサンプルは次い で光分解細胞に注入され、−酸化窒素は前記記載の化学発光で検出される。Ｓニ トロソチオールから特に誘導される一酸化窒素の量は、第一水銀イオン処理サン プルで発生した化学発光シグナルを、光分解細胞に注入する前に第一水銀イオン で処理されない同等の生物学的流体のサンプルで発生した化学発光シグナルと比 較することによって決定される。

請求される発明のもう一つの実施例は、生物学的流体にあるＳニトロソ蛋白質を 検出する方法に関する。この方法において、生物学的流体は蛋白質結合−酸化窒 素およびニトロソニウムを効率的に除去する蛋白質沈殿剤で処理される。適切な 蛋白質沈殿剤は、トリクロール酢酸、アセトン、フェノールおよび硫酸アンモニ ウムである。処理されたサンプルは、次いで光分解細胞に注入され、−酸化窒素 は前記記載の化学発光法によって検出される。Ｓニトロソ蛋白質から誘導される 一酸化窒素の量は、処理されたサンプルにより発生する化学発光シグナルを、光 分解に注入される前に蛋白質沈殿剤で処理されない同等の生物学的流体のサンプ ルにより発生する化学発光シグナルと比較することにより決定される。

請求される発明の更なる実施例において、前記の方法は、患者の生物学的流体に あるＳニトロソチオールおよびＳニトロソ蛋白質のレベルをモニターすることに より、異常なレベルの一酸化窒素および生物活性同等物を含む疾病の存在を決定 するのに利用することが出来る。発明者が提示してきたように、これらの−酸化 窒素付加物は生理系に存在する生物活性−酸化窒素のプールをあられす。従って 、病因が異常なレベルの一酸化窒素の結果から（る疾病においは、これらの方法 は医師が疾病の存在を決定し、その程度をモニターする手段を提供する。このよ うな疾病は必ずしもそれに限定されないが、敗血症性ショック、６源性ショック 、循環血液量減少性ショック、アテローム硬化、ハイパーホモシスティネミア、 静脈血栓症、動脈血栓症、冠状動脈閉塞、肺塞栓症、脳血管性偶発症候、血管繊 維症、水晶体転位、骨粗髭症、精神遅滞、骨格奇形、肺循環昇圧、悪性腫瘍、感 染および中枢神経系疾患を含む、更にこの方法の用途はそれらの疾病に限定され ない。この方法は、−酸化窒素が含まれるすべての器官にある生物活性−酸化窒 素同等物を検定するのに利用されるということが予言される。

この発明は、遊離の一酸化窒素、ニトロソニウム同等物、Ｓニトロソ蛋白質およ びＳニトロソチオールの血漿レベルの決定を可能にする分析方法を提供する。光 分解の使用はＮＯｏをＮｏ・　（−酸化窒素）に変換し、生物学系ににトロソチ ールの形で）ＮＯ′″の存在の証拠を提供する。かくしてこの方法は、ＮＯ′″ 同等物およびＳニトロソチオールを検出する新規な方法であり、またその著しい 感受性により、−酸化窒素同等物との区別が可能となり一酸化窒素を検出する。

ニトロソニウム検出の代替的な方法は、生物学的検定では必要な検出感受性を提 供しない。

この方法の適用で得られる結果は、Ｓニトロソチオールの濃度が咽乳類血漿にあ る遊離−酸化窒素の濃度より３〜４桁の度合で大きいことを示している。加えて 、Ｓニトロソチオール分画は主として血清アルブミンのＳニトロソチオール付加 物よりなる。更に行われた実験はＳニトロン血清アルブミンのレベルが血圧の変 化と共同して一酸化窒素の阻害について変化することを示している。この方法論 は、生物学的標本における、−酸化窒素、ニトロソニウム、同等物およびそのチ オール付加物の感度に富み、特異的で再生できる手段のための単純な方法を提示 する。

一般的にこの発明について説明したので、同じことは、説明により提供される下 記の実施例を参照することにより容易に理解されるであろうし、しかもこの発明 はこの発明を制限する意図はない。

前記および下記に引用のすべての引用された文献は参考としてここに組み込まれ ている。

実施例 実施例１．血漿内での一酸化窒素、Ｓニトロソチオール、およびＳニトロソ蛋白 質の検定 方法および結果 最初に、検出方法で使用される化学発光器を修飾するために、ホウケイ酸ガラス コイル（３ｍｘ０．６４ｃｍ、ｏ、ｄ、ｘｌａ＋＋ａｉ、　ｄ、　、　６ｃｍの 口径と１２ｃｍの幅に変えられたもの）およびパージ用として使われるヘリウム （５Ｌ／ｍ１ｎ）よりなる光分解細胞が化学発光器（モデル５４３．サーマルエ ナジーアナライザー、ターメディクス社、マサチューセッツ州つォバーン）の反 応チャンバーおよび検出部に直接結合され、従って熱分解器をバイパスした０次 いで５−１００μｍ量のサンプルが直接、あるいは添加された高性能液からクロ マトグラフィ流出液としであるいは光分解細胞へのクロマトグラフィ系としての いずれかで導入され、２００ワツトの水銀蒸気ランプ（テフロンタフの光分解コ イルの中心部に垂直に固定されたもの）で照射された。光分解からの流出液は一 連のコールドトラップに向けられ、ここで（亜硝酸塩および硝酸塩などの）−酸 化窒素より揮発分の少ない液状あるいはガス状分画は除去された。

一酸化窒素は次いでヘリウム流により化学発光分光器に移され、ここで遊離−酸 化窒素はオゾンとの反応で検出される。

シグナルはデジタル積分器（モデル３３９３Ａ、ヒユーレットバラカード社、ア メリカ合衆国、マサチューセッツ州アンドーバー）。光分解細胞の流量および照 射レベルは、標準方法（サヴイル、Ｂ、ｒＡｎａｌｙｓｔＪ　８３：６７０−６ ７２（１９５８））に従って、光分解細胞からの流出液の分析で確認されたよう に、Ｓ−酸化窒素結合の完全な光分解を生じるように設計された。

Ｓニトロソチオールから誘導された一酸化窒素の分画を決定するために、前記記 載の方法に、い（っがの追加ステップが含まれることになった。光分解細胞に注 入する前に、同一サンプルのアリクオツドが、ニトロソニウムに取り代わった一 酸化窒素を酸化しそれを検出しないようにさせるために、標準方法（サヴイル、 Ｂ、ｒＡｎａｌｙｓｔＪ　８３：６７０−６７２（１９５８））に従って、８　 、９　ｍＭ　Ｈｇ　Ｃｌ　ｍで処理され次いで空気乾燥された。Ｈｇ　Ｃｌ　ｍ で前処理を受け、あるいは受け取ったサンプルから得た一酸化窒素濃度は、検出 された一酸化窒素がＳニトロソチオールからどの程度特異的に誘導されたかを決 めるために比較された。同様に、確認の追加された手段として、Ｓニトロソチオ ールおよび遊離の一酸化窒素は、光分解照射にさらされあるいはさらされなかっ たサンプルにおける一酸化窒素の濃度を利用して比較された。

Ｓニトロソチオールは、トリクロール酢酸を使って行われた蛋白質沈殿により除 去出来る全一酸化窒素の量を定量することにより検出された。酸沈膜の間にｐ） （が減少する結果としてＮＯ２から蛋白質を含むサンプルを蛋白質チオールにさ らす結果として形成されるＳニトロソ蛋白質の可能性を排除するために、アセト ン・フェノールおよび硫酸アンモニウムなどのような他の物質が、ｐＨ変更を誘 導しない沈殿蛋白質に使用された。あらゆる場合において、結果は酸沈膜で得ら れたものと同様であった。

Ｓニトロソ−Ｌ−システィン、Ｓニトロソグルタチオン。

Ｓニトロソ−Ｎ−アセチル−Ｌ−システィンおよびＳニトロソ牛血清アルブミン は従来の方法に従って、それぞれのチオールを酸化Ｎ　ａ　Ｎ　Ｏｘにさらすこ とによって合成された（ステムラ−、Ｊ、Ｓ、他ｒＰｒｏｃ、Ｎａｔ１．Ａｃａ ｄ。

Ｓｃｉ、Ｊ　８９：４４４−４４８　（１９９２））−同様に、標準曲線が酸化 Ｎ　ａ　Ｎ　Ｏｔあるいは空気密閉注射器で測定される前直前に連続して希釈さ れた一酸化窒素ガスの飽和溶液から得られた。濃度応答曲線は、すべての場合で 相関係数が≧０．９８で線型であった。感受性の限界は約０．１９Ｍで、また検 定内部の変異性は±３％であった。

０．１３Ｍクエン酸トリナトリウムで抗凝血化された血液サンプルは、正常なボ ランティア、および−酸化窒素シンセターゼ阻害剤、ＮＯ−モノメチル−Ｌ−ア ルギニン（Ｌ−ＮＭＭＡ）（５０ｍｇ／Ｋｇ、静脈内−皮投与）の静脈投与を、 前もって、および１５．３０．６０および１８０分続けて行ったウサギからの血 漿の分析のために得られた。

これらの血漿標本のそれぞれは、ＨＰＬＣを使わずに直接光分解細胞に注入され た。加えて、各サンプルは、（１）光分解照射を行わない測定、（２）蛋白質沈 殿後の決定および、（３）８．９ｍＭのＨｇＣ１□の追加の後の決定を含む対応 する対照で比較された。

Ｓニトロソチオールに対するこのシステムの応答は、Ｓニトロソ−Ｌ−システィ ンを標準にしてまず検討された。

一連の希釈液貯蔵溶液の濃度は、標準方法で決定され、また３４０ｎｍの光学密 度により確認された（サヴイル、Ｂ。

ｒＡｎａｌｙｓｔＪ　８３　：　６７０−６７２　（１９５８）、およびステム ラ−、Ｊ、Ｓ、ｒＰｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、Ｊ　８９：４４４−４４８　（１９９２））、連続希釈は１１００ＬＬ から０．１ｐＭまでにわたる濃度で用意された。

化学発光シグナルはこの濃度範囲にわたって線型であった。

（相関係数は≧０．９８）。

追加の対照であるＳニトロソ−グルタチオン、およびＳニトロソ−Ｎ−アセチル −Ｌ−システィンが更に合成され、応答が測定された。光分解が存在しない場合 、−酸化窒素シグナルは検出可能限度以下にあった。同様に、このサンプルの前 処理に続き、遊離−酸化窒素を酸化（し検出不能に）するため、大気保温すると 、すべての場合化学発光シグナルの９９％以上の損失を生じた。

５人の正常なボランティア（年令は３０±３才）の空腹時血清がこの実験記録で 一酸化窒素の測定のために得られた。

血液サンプルは、１３ｍＭのクエン酸トリナトリウムを含む空のサンプルチュー ブで得られ、７００ｇで１０分間遠心分離され、上澄み血漿は気密の注射器で、 検出システムに移すために取り去られた。第工表に示すように、平均血漿レベル （第１表）は７．１９±５．７３μＭであり、その１０．０１％のみがＨｇ４２ で置換されず、その０．０４７％は光分解なせずに検出出来た。更に（５％のト リクロール酢酸あるいは５０％のアセトンによる）蛋白質沈殿では、シグナルの ９６．２５％が損耗した。

生理条件の下でのＳニトロソ−アルブミンの形態は非常に安定しており、−酸化 窒素のための血漿内ではキャリア分子を表す。（ステムラ−、Ｊ、Ｓ、他ｒＰｒ ｏｃ、Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｊ　８９　：　４４４−４４８　（１９９２））従って、実 験は、血清アルブミンにより、ヒト血漿と結合しそれに運び込まれる一酸化窒素 の分画を決定するために行われた。血漿標本（３個）は、血清アルブミンおよび Ｓニトロソ血清アルブミンの双方が結合されるエコツバツク・ブルーフアイブー ｍ１カラムカートリツジ（バイオラット社、カリフォルニア州すッチモンド）を 使用してアフイニテイクロマトグラフイーな受けた。その結果、全（蛋白質）沈 殿−酸化窒素シグナルの８２％はこの方法で除去された。

Ｌ−ＮＭＭＡは一酸化窒素シンセターゼの特異的な競合阻害剤であり、Ｌ−アル ギニンから一酸化窒素を精密化する原因となる酵素の系統群に属する。Ｌ−ＮＭ ＭＡの注入は、ウサギおよび犬の血圧上昇を引き起こすことを示し、血圧を維持 するＥＤＲＦの定常状態レベルの役割を意味していた。（リーズ。

Ｄ、Ｄ、他、ｒＰｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｊ８６　：　３３７５ −３３７８　（１９８９）　、およびチュー、Ａ。

他、ｒＡｍ、Ｊ、Ｐｈｙｓｉｏｌ、Ｊ　２５８：Ｈ１２５０−１２２５４（１９ ９０））。

一酸化窒素は血管の正常状態の調節従って血圧の調節に重要な役割を果たしてい る。かくして実験は血圧および血漿Ｓニトロソチオールの消耗の間の関係を確認 するよう行われ、Ｌ　−Ｎ　Ｍ　Ｍ　Ａ　５０　ｍ　ｇ　／　Ｋ　ｇが３−４Ｋ ｇのメス・ニューシーラントホワイトラビット３匹の静脈に注入された。第■表 に示されるように、（大腿動脈に設置されたカニユーレで測定された）平均血圧 は１５分間で（６４±５から７４±６ｍｍＨｇ、ｐｒ０．０５に）１６％上昇し 、１時間後には、平均血圧は（７８±１１．ｐ＜０．０５に）２２％上昇した。

この血圧上昇に附随して、血漿内の全Ｓニトロソチオールは注入後１５分間で（ １，２９±０．５７μＭから１．１１±０．５１μＭへと）１４％減少し、１時 間後には（０，７８±０．２６１ＬＭ、ｐ＜０．０２）４０％減少した。これら の変化は血漿のＳニトロソ蛋白質分画に主として生じ、Ｌ−ＮＭＭＡの注入前に は全Ｓニトロソチオールは９４．６％見出されたが、注入後１時間で９２．９％ に下がった。典型的な実験の時間経過が第２図で示され、ここで平均血圧および 全ニトロソチオールの変化がグラフの形でプロットされている。

もともとＬ−ＮＭＭＡの投与の後、平均動脈圧は、血漿Ｓニトロンチオールの補 完的減少に類似した時間経過で増加した。ピークの結果（それぞれ最大値および 最小値）は６０分および１８０分であり、両方のパラメーターは前処理の値にま で戻った。重要なことは交差点が３０分および１２０分（内挿）であり、これは 機械的関連が両パラメーターの間にあることを示唆している。もう一つ注目すべ きは全化学発光シグナルの僅か０．２６％のみが遊離−酸化窒素により占められ ることが出来た、ということであった。

興味深いのは、全Ｓニトロソチオール、Ｓニトロソ蛋白質および低分子量Ｓニト ロソチオールの百分率変化がこれらの実験で比較される時、第３図で示されるよ うに低分子量Ｓニトロソチオールの一過性増加が１５分間で生じたことであった 。

これらのデータは、−酸化窒素（多分ニトロソニウムイオンとして）の転位は、 ＥＤＲＦ生産が減少するにつれて、チオールブールの間での一酸化窒素の再平衡 の経過の間にＳニトロソ蛋白質から低分子量チオールに生じることを示すもので ある。

重要なことは、試験管実験は、低分子量チオールが、−酸化窒素をＳニトロソチ オールから遊離しやすくさせ、それにより蛋白質結合−酸化窒素の血管拡張神経 あるいは血小板阻害活性を高めるということであった。例えばリン酸塩緩衝食塩 水。

ｐＨ７，４に１モル過剰のＳニトロソウシ血清アルブミンを含む溶液に加えられ たグルタチオンは、化学量論的濃度のＳニトロソグルタチオンを急速に形成し、 これは酸あるいはアセトン溶解Ｓニトロソチオールによって光分解化学発光法に よって測定された。

この結果、正常なヒト血漿は約７μＭ、Ｓニトロソチオールを含み、その内９６ ％はＳニトロソ蛋白質であり、その８２％はＳニトロソ血清アルブミンよりなる ことが示された。対照的に、循環水準にある遊離−酸化窒素は僅か３ｎＭの範囲 にあるに過ぎない。ウサギでは血漿ニトロソチオールは約１μＭであられれてい る。Ｌ　−Ｎ　Ｍ　Ｍ　Ａ　５０　ｍ　ｇ　／　ｍ　１投与して６０分後にＳニ トロソチオールは約４０％減少しくその内９５％以上がＳニトロソ蛋白質で占め られ、またその約８０％はＳニトロソ血清アルブミンであった）、また平均動脈 血圧が付随的に２２％増加した。

加えて、発明者は、］、　ｍ　ｇ　／　ｍ　ｌのＬＰＳで刺戟されたヒトマクロ ファージ細胞系列（０９３７細胞）で、約１μＭ（７）Ｓニトロソ蛋白質の形成 があることを証明した。この重要な証明は、ヒトマクロファージ細胞系列化−酸 化窒素を検出することに当業者が失敗したことを説明することができる。血漿に おいて同じように、−酸化窒素は、細胞内でチオールに結合するニトロソニウム 同等物として細胞内で生物活性形態で存在する。

これらのデータは、自然に産出した一酸化窒素が血漿内で主としてＳニトロソチ オール種と複合して循環し、そのＳニトロソチオール種の主なるものは、Ｓニト ロソ血清アルブミンである。この豊富に存在し、相対的に長命の付加物は、−酸 化窒素の貯蔵所として役立ち、ここで血漿レベルの反応性の高い短命の遊離−酸 化窒素が、血管の正常状態の維持のために調節されることが出来るのである。

討議 現在利用可能な分析方法は、生物学的流体にある遊離−酸化窒素を検出すること は出来ないし、また−酸化窒素、ニトロソニウム同等物および重要な生物活性− 酸化窒素付加物を識別することが出来ない。現在の方法論の制約は、−酸化窒素 が代謝して不活性でより高次の窒素酸化物に変り、他の生物関連形態では存在し ないという一般的な合意で正当化されてきた。

これらの研究者は（ここで示されるように）、−酸化窒素が生物学的体に蛋白質 のＳニトロソ付加物として優勢に存在しており、この付加物のなかで一酸化窒素 成分は化学的にニトロソニウムとして行動することを最近確認した。これらの付 加物は生物学的に活性であり、ユニークな薬理性を有する。現在の方法論の深刻 かつ重大な制約を考慮して、発明者は生物学的流体にある一酸化窒素の検出を可 能にし、また、Ｓニトロソ蛋白質およびＳニトロソチオールなどの一酸化窒素付 加物を遊離−酸化窒素から、識別することも出来る新しい方法を開発した。

この方法を使って得られた結果は下記の項を立証する＝（１）−酸化窒素および その関連生物活性付加物は、生物学的流体で、最小の調製サンプルを使って簡単 に測定することが出来る。（２）Ｓニトロソチオールは血漿内を循環し、細胞内 で主としてＳニトロソ蛋白質として知られるものを形成し、その血漿内の主要な 種は、Ｓニトロソ血清アルブミンである。

（３）−酸化窒素発生を調節する薬理介入はＳニトロソチオールの血漿レベルを 変化させる。また（４）ニトロソニウムの形態をとる一酸化窒素同等物が生物学 的に存在する。

Ｓニトロソチオールが血漿内に豊富に存在するのに対比して、遊離−酸化窒素は ３桁か４桁低い濃度で存在するに過ぎないが、これは血漿Ｓニトロソチオールが 、効率的にその濃度を緩衝化し、−酸化窒素の貯蔵所として役立っていることを 示唆している。−酸化窒素の蛋白質チオール付加物は特にこの役割に適している が、それは、生理的条件の下で、遊離−酸化窒素に比較して相対的に長い半減期 を持っているためである。

（ステムラ−、Ｊ、Ｓ、他１’Ｐｒｏｃ、Ｎａｉ　１．Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、Ｊ　８９　：　４４４−４４８　（１９９２））Ｓ−Ｚトロソ蛋白質貯 蔵所からの一酸化窒素あるいはニトロソニウムの放出は、低分子量チオールを用 いる混合ジスルフィドの形成により、あるいは蛋白質チオールから低分子量チオ ールへの転移により促進されてもたらされることが出来る０例えば、グルタチオ ンは生理的条件の下で特にこの機能に有効である。

前記の通り、ＳニトロソチオールおよびＳニトロソ蛋白質などの生物学的−酸化 窒素付加物は、生理系の維持に関し直接の役割を持つ生物活性−酸化窒素プール をあられす、かくして、各種の生理学的状態（運動あるいは食事の摂取など）に おいて、あるいは各種の病態生理学的状態（敗血症性ショック、アテローム硬化 、あるいは血圧抗進症など）においてこれらの付加物が果たす重大な役割は、医 師が、血管環境および他の器官における真の一酸化窒素の生物活性レベルをモニ ター出来る方法が必要であることを余儀なくさせている。この発明の前記記載の 方法は、この目標を達成するための一つの有効な手段を提供する。

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Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. １．生物学的流体サンプルに存在する低分子量Ｓニトロソチオールを検出する一 つの方法であって、下記のステップよりなる方法。 （ａ）前記サンプルが光分解を受ける。 （ｂ）前記サンプルに存在する一酸化窒素の量を、一酸化窒素およびオゾンの間 の化学反応により発生する化学発光シグナルを測定することにより定量する。 （ｃ）前記生物学的流体の別のサンプルにおいて、チオールと結合する一酸化窒 素の化学発光シクナル発生能力をいずれも不活性化する。 （ｄ）ステップ（ａ）および（ｂ）を用いてステップ（ｃ）で得られるサンプル に存在する一酸化窒素を検出する。 および （ｅ）前記生物学的流体サンプルにあるＳニトロソチオールの量を確認するため にステップ（ｂ）および（ｄ）で検出される一酸化窒素の間の量的差異を確認す る。
2. ２．請求の範囲第１項記載の方法であって、ここで前記一酸化窒素の化学発光シ グナル発生能力が前記サンプルを第一水銀イオンで不活性化する方法。
3. ３．生物学的流体サンプルに存在するＳニトロソ蛋白質を検出する一つの方法で あって、下記のステップよりなる方法。 （ａ）前記サンプルが光分解を受ける。 （ｂ）前記サンプルに存在する一酸化窒素の量を、一酸化窒素およびオゾンの間 の化学反応により発生する化学発光シクナルを測定することにより定量する。 （ｃ）前記生物学的流体の別のサンプルにおいて、蛋白質と結合する一酸化窒素 の化学発光シクナル発生能力をいずれも不活性化する。 （ｄ）ステップ（ａ）および（ｂ）を用いてステップ（ｃ）で得られるサンプル に存在する一酸化窒素を検出する。 および （ｅ）前記生物学的流体サンプルにあるＳニトロン蛋白質の量を確認するために ステップ（ｂ）および（ｄ）で検出される一酸化窒素の間の量的差異を確認する 。
4. ４．請求の範囲第３項記載の方法であって、ここで前記一酸化窒素の化学発光シ クナル発生能力が前記蛋白質を蛋白質沈殿剤で処理することにより除去される方 法。
5. ５．請求の範囲第４項記載の方法であって、ここで前記蛋白質沈殿剤がトリクロ ール酢酸、アセトン、フェノールおよび硫酸アンモニウムよりなるクループから 選択される方法。
6. ６．生物学的流体に存在する一酸化窒素およびニトロソニウム同等体を検出する 一つの方法であって、下記のステップよりなる方法。 （ａ）前記サンプルからヘモグロビンおよび他の血液成分を除去する （ｂ）前記サンブルが光分解を受ける、および（ｃ）前記サンプルにある一酸化 窒素の量を、一酸化窒素およびオゾンの間の化学反応により発生する化学発光シ クナルを測定することにより定量する。
7. ７．一酸化窒素およびニトロソニウム同等体の異常なレベルを含む疾病状態をモ ニターする一つの方法であって、患者から得られた生物学的流体サンプルに存在 するＳニトロソチオールの量を検出し、前記検出は下記のステップよりなる一つ の方法。 （ａ）前記サンブルが光分解を受ける。 （ｂ）前記サンプルにある一酸化窒素を、一酸化窒素およびオゾンの間の化学反 応により発生する化学発光シクナルを測定すことにより定量する。 （ｃ）前記生物学的流体の別のサンプルにおいて、チオールと結合する一酸化窒 素の化学発光シグナル発生能力をいずれも不活性化する。 （ｄ）ステップ（ａ）および（ｂ）を用いて、ステップ（ｃ）で得られるサンプ ルにある一酸化窒素を検出する。および、 （ｅ）前記生物学的流体サンプルにあるＳニトロソチオールの量を確認するため にステップ（ｂ）および（ｄ）で検出される一酸化窒素の間の量的差異を確認す る。
8. ８．一酸化窒素およびニトロソニウム同等体の異常なレベルを含む疾病状態をモ ニターする一つの方法であって、患者から得られた生物学的流体サンプルに存在 するＳニトロソ蛋白質の量を検出し、前記検出は、下記のステップよりなる一つ の方法。 （ａ）前記サンプルが光分解を受ける。 （ｂ）前記サンプルにある一酸化窒素の量を、一酸化窒素およびオゾンの間の化 学反応により発生する化学発光シクナルを測定することにより定量する。 （ｃ）前記生物学的流体の別のサンプルにおいて、蛋白質と結合する一酸化窒素 の化学発光シクナル発生能力をいずれも不活性化する。 （ｄ）ステップ（ａ）および（ｂ）を用いてステップ（ｃ）で得られるサンプル に存在する一酸化窒素を検出する、および、 （ｅ）前記生物学的流体サンプルにあるＳニトロソ蛋白質の量を確認するために 、ステップ（ｂ）および（ｄ）で検出される一酸化窒素の間の量的差異を確認す る。
9. ９．請求の範囲第７項および同第８項記載の方法であって、ここで前記疾病が、 敗血症性ショック、心源性ショック、循環血液減少性ショック、アテローム硬化 、ハイバーホモシスティネミア、静脈血栓症、動脈血栓症、冠状動脈閉塞、肺塞 栓症、脳血管性偶発症候、血管繊維症、水晶体転位、骨粗鬆症、精神遅滞、骨格 奇形、肺循環昇圧、悪性腫瘍、感染および中枢神経疾患よりなるクループから選 択される方法。
10. １０．請求の範囲第７項および同第８項記載の方法であって、患者がヒトである 方法。
11. １１．請求の範囲第９項の方法であって、患者がヒトである方法。
12. １２．請求の範囲第１項ないし同第８項のいずれか一つの方法であって、ここで 前記生物学的流体サンプルが、血液、血清、尿、脳脊髄液、精液、関節液、腹水 、痰、腸分泌液、角膜水、羊水、大便、唾液および汗よりなるクループから選択 される方法。
13. １３．請求の範囲第９項記載の方法であって、ここで、前記生物学的流体サンプ ルが、血液、血清、尿、脳脊髄液、精液、関節液、腹水、痰、賜分泌液、角膜水 、羊水、大便、唾液、および汗よりなるクループから選択出来る。