SE503876C2 - Detektion av inflammatoriska tillstånd i tarmkanalen genom att mäta kväveoxidhalten i ett prov taget ur tarmlumen - Google Patents

Description

20 25 30 503 876 2 i utandningsluft har lett till förslaget att NO härrör från lungan (Gustafsson, WO-A- 93/05709 och SE-A-9l032433).

Uppfmningens ändamål Det är ett ändamål med föreliggande uppfinning att tillhandahålla ett diagnostiskt förfarande för påvisning av inflammatoriska tillstånd i tarmarna, speciellt avseende korrelation mellan NO-produktion och dylika sjukdomstillstånd.

Beskrivning av uppfmningen Vi har nu lyckats mäta NO-koncentrationen i lumengas tagen från tjocktarm och/eller ändtarm på patienter med pågående inflammation i tjock- och ändtarm. Dessa koncentrationer har jämförts med NO-koncentrationer i tarmgas från friska kontroll- personer.

Vår upptäckt består utav att NO-nivåerna är förhöjda vid inflammatoriska tillstånd i tarmarna. Beteckningen “friska personer" avser personer utan inflammation i tarmslem- hinnan.

Förfarandet enligt uppfinningen karaktäriseras av följande steg: - ett gasprov uppsamlas från tarmlumen på en individ; - provets innehåll av NO bestäms; - det funna värdet jämförs med värden från friska individer eller med vården erhållna från samma individ vid ett annat tillfälle.

En ökad nivå jämfört med nivåer hos friska individer är en indikation på ett inflammatoriskt tillstånd i tarmarna på individen som provet har tagits ifrån. Om nivån jämförs med nivån i samma individ vid ett annat tillfälle, t ex ett tidigare tillfälle, och befinns vara förhöjt, är detta en indikation på att inflammationen har förvärrats. Omvänt betyder en sänkt nivå en förbättring av sjukdomstillståndet. Provtagnings- och analys- förfarandet skall naturligtvis vara väsentligen detsamma vid olika provtagningstillfällen för att erhållna värden skall kunna jämföras.

Gasprovet uppsamlas lämpligen efter det att .aktuellt tarmlumen har tömts på sitt innehåll, men en sådan procedur är eventuellt inte nödvändig. Provet kan t ex tas via en kateter som placeras i tex tjocktarmen och som ansluts till en spruta vari gasprovet samlas. Detta kan förslagsvis ske i samband med koloskopi eftersom koloskop normalt är utrustade med kanaler som möjliggör gasprovtagning ur tarmlumen. Prov kan också tas med den typ av instrument som beskrivits av Raab et al. , 87 (1992) 1453-1459). Se även Krog et al. (WO'-A-1080l3). Från ändtarmen kan gas samlas 10 15 20 25 30 503 876 3 direkt t ex genom att aspirera rektal luft in i en spruta. Prov kan också tas ifrån tunn- tarmens lumen genom att använda t ex den utrustning som beskrivits av Odlind et al. (EP- A-455,368). Metodiken som beskrivits av både Raab et al. och Krog et al. ger möjlig- heter att uppsamla prov från enskilda segment av tjock- och ändtarm.

NO-niväerna kan anges som en koncentration, antingen i form av absolutvärden eller relativt en intern eller extern standard. Nivåema kan t ex normaliseras mot kompo- nenter som normalt finns i tarmgas tillsammans med NO och vilka lämpligen föreligger i relativt konstanta nivåer (interna standarder). NO-produktionen kan också beräknas som mängd utsöndrad NO per tidsenhet om provtagningsflödet tas i beaktande. Om man använder ballongtelcnik enligt Krog et al. (WO-A-1080l3) eller Odlind et al. (EP-A- 455 ,368) kan NO-produktionen relateras till exponerad slemhinneyta.

För provtagning av tarmgas inom öppenvården är ändtarmsprover att föredra, även om detta inte utesluter andra typer av provtagning på denna patientgrupp. Gasprover från ändtarmen kommer att avspegla NO-produktion i både änd- och tjocktarm om gas tillåts sprida sig fritt mellan dessa delar. Genom att använda sig av den teknik om beskrivits av Krog et al. (WO-A-l080l3), kommer NO-värden att kunna erhållas som endast mäter inflammation i ändtarmen.

Förfaranden för att bestämma NO i gasfas är väl kända. P g a de låga nivåer som det handlar om i dessa situationer är analysatorer för NO-gas, vilka baseras på kemilumi- niscensteknik att föredra vid tiden för inlämning. Se t ex Archer, FASEB J., 7 (1993) 349-60 och Alving et al., WO 95/02181.

Försöksresultat Patienter med ulcerös kolit I samband med koloskopi aspirerades lumengas (60 ml under 5 s) via en tunn kateter in i en spruta från olika delar av tjock- och ändtarmen på 6 patienter med akut ulcerös kolit (ålder 27-48 år, medelvärde 38) och från 12 kontrollpatienter med icke inflammerad tarmslemhinna (ålder 26-68 år, medelvärde 59) som undergick koloskopi p g a misstänkt malignitet eller polyper. Inflammationsstatus veriflerades histologiskt i varje patient. Två av patientema med ulcerös kolit behandlades med perorala kortikosteroider och salicylater, 2 patienter med enbart salicylater och resterande 2 hade ingen medicinering vid tiden för studien. Rutinförberedelser före koloskopi, som bl a bestod av vattenenema och intag av isoton polyetylenglykol (Laxabone°, TIKA, Lund, Sverige), gjordes på alla individer. 10 15 20 25 30 35 503 876 4 Aspirerad gas injicerades omedelbart i en NO-analysator med kemiluminiscens- teknik (CLD 700, Eco Physics, Dürnten, Schweiz) och toppnivàer av NO registrerades.

Detektionsgränsen för NO var l part per billion (ppb) och analysatom kalibrerades med kända koncentrationer av NO i N2 med användande av en elektromagnetisk flödes- kontrollenhet (Environics Inc., Middleton, CT, USA). NO-värdena var stabila i sprutan i mer än 3 min vid olika koncentrationer (5-25 000 ppb) av NO i luft. Kemiluminiscens- metoden är mycket speciñk för NO och det finns ingen interferens med andra kväveoxider (Archer, FASEB J., 7 (1993) 249-60). NO-nivàerna i omgivningsluft var under 4 ppb.

Statistisk analys gjordes med Mann-Whitney U-test.

Intraluminala NO-nivåer i tjocktarmen var mer än 100 gånger högre (p = 0.0001) på patienter med ulcerös kolit (7741 i 1910 ppb) jârnfört med kontroller (45 j; 7), när individuella värden sattes som ett medelvärde beräknat utifrån nivåer på 4 olika ställen i tjocktarmen (sigmoideum, descenderande tjocktarm, transversum och ascenderande tjocktarrn). Medelvärden för de enskilda mâtstâllena i tjocktann samt ändtarm visas i tabellen.

Tabell: Medelnivåer för NO-koncentration i luminal gas samlad från olika ställen i tjock- och ändtarm på kontroller och patienter med ulcerös kolit.

Kontroller (n = 12) Ulcerös kolit (n = 6) Ändmm 27 2125 Sigmoideum ' 32 3912 Descenderande tjocktarrn 46 10125 Transversum 71 10475 Ascenderande tjocktarm 65 10900 Det fanns ingen överlappning mellan de två grupperna vid något av mätställena.

NO-nivåerna var förhöjda i hela tjocktarmen på patienter med akut ulcerös kolit. Även om de högsta NO-nivåema påvisades i gas samlad från de mest inflammerade partiema av tarmen, så var nivåema signiñkant förhöjda också i delar av tarmen som inte visade något tecken på inflammation. NO-koncentrationerna i tarmlumen på patienter med ulcerös kolit som behandlades med kortikosteroider eller salicylater var fortfarande klart förhöjda 10 15 20 25 30 503 876 5 jämfört med kontroller, och slciljde sig inte från de patienter med ulcerös kolit, vilka inte hade någon behandling för tillfället.

Crohns sjukdom I två patienter med akut Crohns sjukdom hittades NO-nivåer på ungefär 1000 ppb i tjocktarmen med användande av samma förfarande som ovan. Denna sjukdom verkar alltså uppvisa intermediära nivåer av NO i tarmlumen.

Immunohistokemisk analys av NO-syntas Vid koloskopi på kontroller och patienter med kronisk inflammatorisk tarm- sjukdom (IBD) utfördes en slemhinnebiopsi för att med hjälp av immunohistokemiska metoder bestämma närvaro-och lokalisering av NO-syntas. Biopsiproverna fixerades och frystes, varefter de snittades i 14 jam tjocka snitt. Nârvaron av inducibelt NO-syntas bestämdes med hjälp av polyklonala antikroppar från kanin som förut har visats reagera i med epitelet i bronkslemhinnan på astmatiker men inte kontroller (Hamid et al., _Lan_c_e_t, 342 (1993) 1510-1513). För visualisering användes en get-anti-kanin IgG-antikropp som var konjugerad med en fluorescerande markör (FITC). Med detta förfarande kunde induci- belt NO-syntas påvisas i tarmepitel på patienter med ulcerös kolit och Crohns sjukdom, men inte kontroller. i Diskussion NO påvisat i gas från tarmlumen har troligen producerats i tjocktarmens slemhinna, eftersom förhöjd NO-syntasaktivitet har beskrivits där vid ulcerös kolit (Boughton-Smith et al., _La_ngc;t, 342 (1993) 338-340). Det kan ännu inte helt uteslutas att en del NO i tarmlumen har bakteriellt ursprung, eftersom vissa bakteriestammar har förmåga att omvandla nitrit till NO (Ji et al., Biochem. Arch., 5 (1989) 61-66). I denna studie är dock sannolikheten liten för en större bakteríell komponent eftersom alla patienter preparerades rutinmässigt och ingen avföring kunde ses vid koloskopin. En mer vanligt förekommande förmåga hos bakterier är att kunna reducera nitrat till nitrit. Både nitrat och nitrit återfinns dessutom i vissa födoämnen. Därför är nitrit och nitrat ej specifika markörer för lokal NO-produktion i tarmen. De höga NO-nivåer som återfanns i lumengas frän oinflarnmerade delar av tarmen pä patienter med inflammatorisk tarm- sjukdom beror troligen på att tjocktarmen, vid dessa tillstånd, är relaxerad och utspänd.

Detta leder i sin tur till att de olika delama av tjocktarmen kan kommunicera och tarmgas kommer att fördela sig jämnt. 10 15 20 25 30 503 876 6 Det är ett välkänt problem att histologisk analys av inflammation efter en biopsi av tarmslemhinnan ej nödvändigtvis kommer att ge en rättvisande bild av tarminflamma- tionen i stort. Eftersom NO i gasform kommer att vara mer jämnt fördelat kommer detta förfarande möjligen att korrelera bättre med sjukdomstillståndet, dvs den totala slem- hinneyta som är inflammerad samt graden av inflammation i de påverkade regionema. De lägre nivåer av NO som sågs vid Crohns sjukdom kan vara ett utslag av detta förhållande eftersom en betydligt större yta av tarmepitelet vanligtvis är inflammerad vid ulcerös kolit jämfört med Crohns sjukdom. Både direkta mätningar av NO i intakt tjocktarm och indirekta mätningar av NO-syntasaktivitet i tarmvâggsvâvnad (Middleton et al., La_ri_ogt, 341 ( 1993) 465-466; och Boughton-Smith et al., Lang, 342 (1993) 338-340) visar att NO-produktionen är mycket högre hos patienter med inflammatorisk tarmsjukdom ån i kontroller.

Emellertid så är den påvisade skillnaden i NO-produktion mellan de två patient- kategoriema (ulcerös kolit och kontroller) mycket större för det direkta förfarandet jämfört med det indirekta förfarandet (100 gånger i stället för 4-8 gånger). När man mäter NO- produktion i tarmvägg med det indirekta förfarandet så kommer normal NO-produktion i alla delar av tarmväggen att bidra, vilket leder till högre bakgrundsnivåer och mindre skillnader mellan grupper. Mätningar av NO i tannlumen kan å andra sidan eventuellt reflektera NO-produktion endast i de mest ytliga delarna av tannslemhinnan, eftersom NO producerat i djupare liggande strukturer troligen kommer att fångas upp av bl a annat hemoglobin i slemhinnans blodkärl, och därför inte kommer att nå tarmlumen. Detta indikerar alltså att de förhöjda nivåer av NO som återfanns i tarmgas vid inflammatorisk tarmsjukdom härrör sig till största delen från mycket ytliga delar av slemhinnan. Sålunda kommer kanske NO-mätningar i tarmgas att kunna utgöra ett känsligt förfarande för att upptäcka inflammation, eftersom någon NO-produktion normalt inte skall äga rum i tarmepitelet.

Aktiv ulcerös kolit förknippas med en ökning av aktivitet hos det inducibla NO- syntaset. Detta stämmer uppenbarligen inte med den klassiska beskrivningen av inducibelt NO-syntas, nämligen den att det skall vara steroid-känsligt (Moncada et al., @, 43 (1991) 109-141) eftersom vår studie, samt en tidigare studie (Boughton-Smith et al., Lancet, 342 (1993) 338-340) visade, att de patienter som behandlades med kortiko- steroider inte skiljde sig från obehandlade patienter vad gäller NO-produktion. Om detta återspeglar en ofullständig distribution av steroider till NO-producerande celler i tarm- 10 15 20 5 Û 3 8 7 6 7 slemhinnan eller närvaron av ett steroid-okånsligt NO-syntas återstår att visa. I vår studie verkade inte heller salicylater påverka NO-produktion. Det skall emellertid påpekas att alla patienter som behandlades med salicylater hade akut exacerbation av ulcerös kolit trots pågående behandling. Vi kan alltså inte utesluta, att salicylater kan påverka NO- produktion i andra patienter där behandlingen är mer framgångsrik och där inga akuta anfall ses. Eftersom behandlingen uppenbarligen har misslyckats i dessa patienter med akuta symptom och samtidiga höga NO-nivåer, kan kanske NO-mätningar i tarm, bli användbara vid utprovning av nya läkemedel.

Det är fortfarande oklart om en ökad NO-produktion hos patienter med inflam- matorisk tarmsjukdom är bra eller dåligt för slemhinnan. NO eller senare bildade reaktiva ämnen kan ha cytotoxiska egenskaper på värdceller om de produceras i överskott (Tepperman et al., Am. J. Physiol., 265 (1993) G2l4-G218). Å andra sidan återfinns höga koncentrationer av NO normalt i tex de övre luftvâgarna (Lundberg et al., LL R_es_p_1,, 7 (1994) 1501-1504) och i magen (Lundberg et al., @t, 35 (1994) 1543-1546) utan att orsaka lokal vävnadsskada. Dessutom har NO föreslagits ha en viktig roll i primärt immunförsvar p g a dess bakteriostatiska egenskaper (Moncada et al., Pharmacol. lich, 43 (1991) 109-141). Detta stöds också av den tidigare upptäckten, att patienter med akut ulcerös kolit har ett reducerat antal bakterier i ândtarmsslemhinnan jämfört med patienter med inaktiv sjukdom och kontroller (Hartley et al., J. Medical. Microbiol., 36 (1992) 96-103.

Claims (7)

10 15 505 876 8 Patentkrav

1. Förfarande vid diagnos av inflarnmatoriska tillstånd i tarmkanalen hos människor, k ä n n e t e c k n a t av, att NO-nivån i ett prov taget ur tarmlumen jämförs med nivån hos friska individer eller en nivå uppmätt vid ett annat tillfälle för samma individ.

2. Förfarande enligt krav 1, k â n n e t e c k n at av, att ett gasprov är taget ur lumen och att NO mäts i provet.

3. Förfarande enligt något av krav 1 - 2, k ä n n e t e c k n at av, att provet är taget ur lumen i en tömd tarm.

4. Förfarande enligt något av krav 1 - 3, k ä n n e te c k n a t av, att provet är uppsamlat ur tjocktarmslumen.

5. För-farande enligt något av krav 1 - 4, k ä n n e te c k n at av, att provet är uppsamlat ur ändtarmslumen.

6. Förfarande enligt något av krav 1 - 5, k ä n n e t e c k n at av, att en förhöjd NO-nivå tages som en indikation på ulcerös kolit.

7. Förfarande enligt något av krav l - 5, k ä n n e t e c k n a t av, att en förhöjd nivå tages som en indikation på Crohns sjukdom.