JPH06508753A - 核酸検定 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の名称、核酸検定 この発明は遺伝物質に関するホモジニアス核酸プローブに基づくテストを行なっ て、核酸ハイブリッドを形成することでシグナルまたはシグナルにおける変化を 作り出すシグナル生成部分または中間体を調節する方法に関する。特に、本願は 核酸ハイブリット形成により酵素または酵素中間体の活性を調節する方法に関す る。本願はまたこのようなホモジニアスな核酸に基づくテストに必要とされる物 質に関する。

現在の技術水準では、たとえば生体からの遺伝物質の検出のための実験核酸プロ ーブに基づく検定は通常そのような生体からの遺伝物質を精製して、その後典型 的にはニトロセルロース膜等の固相上に固定化することを必要とするゎそれから 、この膜は通常放射性部分（たとえばリン−３２）、酵素（たとえばアルカリホ スファターゼ）または他のシグナル生成部分もしくは中間体で標識したＤＮＡプ ローブとともにインキュベートされる。その後膜は膜に関連するシグナルの分析 のための適切なステップ（たとえばリン３２のオートラジオグラフィ、アルカリ ポスファターセのための酵素基質の添加）を行なう前にハイブリッド形成しなか ったＤＮＡプローブを取り除くために洗浄される。

このような検定の詳細なプロトコールについては、分子クローニング、実験７− １−　ユアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　Ａ　［、ａｂｏｒａｔ ｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、編集Ｓａｍｂｒｏｏｋ、　Ｆｒ１ｔｓｃｈおよびＭａｎ ｉａｔｉｓ。

Ｃｏ１ｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ、１９８９年）を参照してもよい。コノよ うな実験プローブに基づく検定は「ヘテロジニアスＤＮＡ′　プローブ検定」と 呼ぶことができ、これによりハイブリッ５　ト形成の後ハイブリッド形成された ＤＮＡプローブは、膜と結合するシグナルにより測定されるような特異的遺伝物 １　質の存在を決定するために、溶液相中でハイブリッド形成しなかったＤＮＡ プローブと分離されなければならない。

このようなヘテロジニアス核酸プローブに基づく検定には余分なプローブを取り 除くための固相の十分な洗浄を含む数多くの異なる操作ステップが必要である。

このような多数のステップにより自動化または日常的な利用が困難となり、ヘテ ロジニアス検定は分析に広く導入されていない（たとえばルーチンの臨床検査な どにおいて）。

シグナル発生のためにハイブリッド形成したＤＮＡプローブとハイブリッド形成 していないものとを分離する必要かない核酸プローブに基づく検定はＦボモジニ アスＤＮＡプローブ検定ｊと呼ぶことかできる。このような検定の主要な原則は 、ハイブリッド形成したプローブとしていないものとを分離する必要かないよう にハイブリッド形成したプローブがハイブリッド形成していないプローブとは違 うシグナルを生じさせるという点にある。すなわち、ハイブリッド形成により生 じる修飾されたシグナルの生成を測定するだけて遺伝物質の存在か判別できる。

したがって、このようなホモジニアス検定は分離や洗浄のステップの必要性かな くなるので、遺伝物質の適切な調製物を単に１つまたは２つ以上の試薬と混合し 、続いて最終的な１σ飾シグナルを生成することができる。このような分離ステ ップは検定結果におけるばらつきの主な原因であり、時間と労力を要するもので あり、また付加的な装置も必要となるのて、自動化をより困難で費用のかかるも のにする。将来的には、ホモシニアス核酸プローブ検定はルーチンの臨床テスト や他のルーチンの用途に用いられるよう十分簡単になるであろうし、かつたとえ ば分析器かホモジニアス検定からの最終修飾シグナルを測定することかできる場 合には既存の高スループツト臨床アナライザ等の自動化用途にも容易に使用され るようになるであろう。現在のところ簡単なホモジニアス核酸プローブに基づく 検定への要請は満たされていない。

ホモジニアスＤＮＡプローブ検定のためのいくつかの方法か特許または科学文献 に記載されている。例外なくこれらの方法は、ソゲナルが１つのプローブ上の分 子と他のプローブ上の分子との相互作用から発生する場合の検定かまたはハイブ リット形成のプロセスによりＤＮＡプローブに付与された１つまたは２つ以上の シグナル生成部分か影響を受けるかまたはこれらか作り出される場合の検定の２ つのカテゴ１ノに分類される。すなわちＭｉ　Ｉｅｓに譲渡されたＥＰ１４４９ １４は１つのＤＮＡプローブ上の分子と隣接してハイブリット形成するＤＮＡプ ローブ上の分子との相互作用を記載し、これによると分子は相互作用し酵素のチ ャネリングまたは蛍光エネルギ伝達によってシグナルを生成する。Ａｍｏｃｏに 譲渡されたＥＰ２３２９６７はＥＰ　１４４９１４の競合検定のバリエーション を提示しており、これによれば通常２つのＤＮＡプローブがともにハイブリット を形成してシグナルを生成するが、テスト核酸が１つのプローブとハイブリッド 形成のために競合して異なるシグナルを生成する（提示された例では蛍光）。Ｍ ｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓに譲渡されたＥＰ２２９９４３は隣接 してハイブリッド形成したプローブとの間の蛍光エネルギの伝達を含むＥＰ’１ ４４９１４のさらに特定的なバリエーションであると思われる。

シグナリングに影響を与えたりシグナリングを作り出したりする特許かＭｉ　Ｉ ｅｓに譲渡されたＥＰＩ４４９１３に代表されるが、それによると抗体により認 識される種は核酸プローブのその標的に対するハイブリッド形成により作り出さ れる。εｎｚｏに譲渡されたＥＰＣ２３１４９５はこの概念をより広くとらえて ハイブリッド形成の際にシグナルである「特性の変化Ｊを生成していると思われ る。１つの例は形成されたハイブリット内にインターカレートして修飾された蛍 光シグナルを与えるＤＮＡプローブに結合した色素の蛍光における変化である。

「変化」に関連する新しいハイブリッド形成かＶａｒｙ　により記載されており （Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、ｌ５（１９８７年）ｐ６８８３）　、それに よるとすてにＲＮＡストランドとハイブリット形成したＤＮＡプローブに標的Ｄ ＮＡをハイブリッド形成させることは単一ストランドのＲＮＡ種を作り出すＲＮ Ａストランドの置換によって可能である。このような単一ストランドのＲＮＡ種 はこれでポリヌクレオチドホスホリラーゼによる加水分解の影響を受けやすくな りＡＤＰを放出する。続いて、ＡＤＰは、ルシフェラーゼ触媒の化学発光作用に よる評価のためＡＴＰに変換され得る。

上記のホモジニアス核酸プローブ方法論の各々は概念は素晴らしいか未だ商業化 への適性は証明されていない。主な問題点には、非特異的ハイブリッド形成に関 連するシグナリング変化があり、また、適用可能な場合も、パックグラウンドお よびばらつきの問題かあり、特に他の蛍光を除去するために細かく限定された波 長での蛍光測定という一般的な制約かある。商業的な成功を収めた唯一のホモジ ニアスＤＮＡプローブ検定はＭＬ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｖｅｎｔｕｒｅｓに 譲渡されたＥＰ３０９２３０に開示されている。これはＧｅｎｐｒ。

ｂｅ社に採用されて成功しており、それによるとＤＮＡプローブに付着した蛍光 アクリジニウムエステル部位が未ハイブリッド形成プローブにおいては選択的に 分解されるがアクリジニウム標識プローブにより形成されるハイブリッド中では 保護される。この蛍光検定はＣ，トラコーマ（Ｃ，ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）お よびＮ、淋病（Ｎ、　ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）等の微生物からの豊富なリポソ ームＲＮＡの検出に採用されて成功しているか、検定の感度か、他の多くのＤＮ Ａプローブへの応用、特に単一コピー唾乳類遺伝子の分析への応用を制限するこ とになる。抗体に基づく検定（すなわちイムノアッセイ）の前例から、より高い 感度を得るための決め手は、酵素精製物か蓄積されて余分の感度を与えるがまた はそれ自体か他の酵素活性の基質または補助因子となり得るような、酵素発生シ グナルを含む検定である。

ホモジニアス検定の概念についてはイムノアッセイ（すなわち抗体を含む検定） の分野では周知であり、それによると１つまたは２つ以上の抗体を特定の被検体 に結合することでシグナル生成部位の生成または修飾か生じる。しかしなから、 ホモジニアスイムノアッセイシステムは商業的に実行可能であることかわかって いるものはほとんどなく、とれも核酸プローブに基づく検定には容易に適用され ない。

５ｙｖａ社により商業化された、酵素で標識したシステム（Ｒｕｂｅｎｓｔｅｉ ｎ他、米国特許第３８１７８３７号、ＲｕｂｅｎｓｔｅｉｎとＵｌｌｍａｎの米 国特許第３８７５０１１号）には低分子重量の被検体を酵素に結合することによ って被検体に結合する抗体か酵素により生成されるシグナルを調節することを含 む。

これらおよび関連の５ｙｖａの特許（たとえば米国特許第３８１７８３７号、第 ３８５２１５７号、第３８７５０ＩＩ号、第３９０５８７１号、第３９６６５５ ６号、第４０３９３８５号、第４０４０９０７号、第４０４３８７２号、第４０ ４６６３６号、第４０６５３５４号、第４０６７７７４号、第４１７１２４４号 および第４１９１６１３号）はこれらの方法かとのように核酸ハイブリッド形成 へ適用されるかを教示しておらず、またこのような適用は自明ではない。Ａｍｅ ｓ社により商業化された基質で標識したシステム（Ｂｕｒｄ他、Ｃｌ１ｎ、　Ｃ ｈｅｍ、　２３（１９７７年）１４０２頁およびＡｎａｌ、　Ｂｉ。

ｃｈｅｍ、　７７（１９７７年）５６頁）は蛍光部位を生じさせる加水分解か被 検体に特異的な抗体によってブロックされ得る非蛍光被検体結合体の生成を含む 。このシステムはまた低分子重量の被検体に限定されており核酸ハイブリッド形 成への応用か明らかてはない。Ａｂｂｏｔｔ社により商業化された蛍光分極シス テム（Ｄａｎｄｌｉｋｅｒ他、免疫化学（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）１ ０（１９７３）２１９頁）は、被検体か、蛍光かその検体に特異的な抗体の結合 による極性の変化として直接的に修飾される蛍光分子に結合される点を除いては Ａｍｅｓのシステムに概念的には類似している。Ｋａｌｌｅｓｔａｄ　（Ｂａｃ ｑｕｅｔおよびＴｗｕｍａｓ　ｉのＡｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅ＋ｎ、　１３６（ １９８４年）４８７頁）の酵素抑制システムは、分析物か結合したアビジンによ るビオチン依存酵素の阻害とこの分析物に特異的な抗体によるこの阻害の解消と を含む。ＡｂｂｏｔｔおよびＫａｌｌｅｓｔａｔのシステム双方ともに感度が低 いこと（分析物の濃度は通常＞　Ｉ　Ｏ−”　Ｍ）　、低分子重量の分析物に適 用か限られること（通常＜１０００ダルトン）、および核酸ハイブリッド形成検 定には明らかな応用が示されていないことなとの欠点がある。

感度か改善されかつ大きな分子重量の分析物に対しても適用できる１つのホモシ ニアスイムノアッセイシステムの成功例はＭｉ　ｃｒｏｇｅｎ　ｉｃｓ社（Ｈｅ ｎｄｅｒｓｏｎ　、　ＥＰ　１９９８０１およびＰＣＴ８６１０２６６６　）に より商業化されているものである。これはその活性が酵素の不活性フラグメント の再結合により再構成され得るという比較的数少ない酵素の特徴に基づいている 。この検定システムでは、分析物はベータガラクトシダーゼからのペプチドフラ グメントに付着されて、このフラグメントは残りのベータガラクトシダーゼ蛋白 質と混合されるとその酵素活性を活性化し得る。分析物に特異的な抗体はこの再 結合に干渉して酵素の活性を阻害することか可能で、添加された分析物はペプチ ド−分析物フラグメントに結合する抗体に対し競合して分析物濃度に依存する形 で酵素を活性化する。この検定システムは低分子重量分析物に限定されておらず かつ感度も＞１０−”Ｍである。しかしながらＥＰ１９９８０１および関連の特 許からは、この検定システムを核酸ハイブリッド形成にとのようにして適用する かは明らかではない。実際のところ、分析物結合蛋白質に言及しているクレーム では、蛋白質は、ペプチド−分析物結合体を育するベータガラクトシダーゼ「酵 素受容体」　（すなわち不活性部分ベーターガラクトシダーゼ蛋白質）と直接競 争する。クレームも特許明細書もとのようにして核酸ハイブリッド形成のプロセ スが、ベータガラクトシダーゼペプチドで酵素活性の活性化に干渉し得るのかに ついて示していない。

イムノアッセイ分野からの先行技術にもかかわらず、酵素に基づくホモンニアス 核酸ハイブリット形成に基づく検定は文献には知られておらずかつしたかってこ のような検定は大変に必要てとされる。すなわち、本願は酵素活性の調節に基づ くホモジニアスな核酸プローブに基づくハイブリッド形成検定のための方法を含 む。本願に関する主要な発見は、核酸プローブか、それぞれ酵素活性化または酵 素活性を損なうことなく酵素を活性化する部位または酵素自体に直接的に付与さ れ得る点てありかつ原則的には酵素活性の阻害を抑制することなく酵素を阻害す る部位に付着され得る点である。この発明は誘導された核酸プローブのハイブリ ット形成によって酵素活性を調節し、それにより直接的または間接的にプローブ に付着された部位かそれぞれ酵素の活性、活性化または阻害に干渉する手段を提 供する。

この発明の一実施例は核酸ハイブリッド形成により活性酵素の再構成を調節する 手段を提供する。この「ホモジニアスＤＮＡプローブに基づく酵素活性化検定」 の展開における主要な発見は、核酸かある方法により不活性ペプチドの能力を阻 害することなく酵素の不活性ペプチド成分に付与されて酵素活性を活性化できる という点である。もう１つの主要な発見は、この核酸ペプチド結合体に未修飾の 核酸のみをハイブリッド形成することか、酵素活性化を完全に阻害するには十分 てはない点である（しかしながら大きな核酸分子は活性化を低減することかでき る）。すなわち、ＥＰＩ９９８０１に記載されるイムノアッセイのシステムとは 違い、核酸プローブに基づく検定における「分析物」（核酸）−ペプチド結合体 は、相補的サンプル由来の核酸分析物分子とのハイブリッド形成により酵素活性 の再構成を直接的に抑制され得ない。ＥＰ１９９８０１のイムノアッセイシステ ムにおいて、分析物−ペプチド結合体は、分析物−ペプチド結合体の形のものか または遊離の分析物としての分析物に結合する「分析物結合蛋白質」、例外なく 抗体、により酵素活性の再構成を抑制される。遊離の分析物がテストサンプル中 に導入されると、ある割合の抗体が遊離の分析物への結合へ転じ、酵素活性を自 由に再構成するある割合の分析物−ペプチド結合体か残される。核酸へ直接適用 されるこのシステムにとっては、遊離核酸とともに核酸−ペプチド結合体を認識 する分析物結合蛋白質か必要であろう。特異的核酸配列に高度な特異性を存する 抗体（または他の蛋白質）の開発は大変難しくかっしたがってＥＰ１９９８０１ のこのシステムを核酸に適用するには他の自明でない方法か必要であることがわ かる。本願の発明にあたっては、核酸−ペプチド結合体のものに相補的なヌクレ オチド配列を有する合成核酸分子が酵素活性の再構成を抑制するかもしれないと いう可能性を考慮し、また一方、合成核酸分子を核酸−ペプチド結合体からそら すと考えられる合成核酸分子と同じかまたは類似する配列を育するテストサンプ ルからの遊離核酸を導入することにより、二の抑制かくつかえされ得るかもしれ ない点も考慮した。すなわち、合成核酸分子か、テストサンプル分析物により隔 離されるまで酵素活性の再構成を阻害することによりＥＰＩ９９８０１における 分析物結合蛋白質に類似した態様で作用し得ると考えた。しかしなから、合成相 補型核酸分子は、相補型サンプル核酸分子と同様、酵素活性の再構成を効率的に 抑制しないことかわかった。核酸−ペプチド結合体のものに相補的なヌクレオチ ド配列を育する合成核酸分子か、酵素活性の再構成を効果的に抑制するある方法 により、修飾され得ることかわかった。好ましい方法は、おそらくは立体障害に より再構成を抑制する抗体によって後に結合される合成核酸上に、リガント分子 を置くことである。イムノアッセイの例とは違い、核酸ハイブリッド形成の場合 の抗体は、分析物−ペプチド結合体に直接的に結合しない。

他の方法は、核酸−ペプチド結合体に結合して酵素活性の再構成を抑制すること になる単一ストランドの核酸に特異的な抗体または核酸結合蛋白質（または他の 分子）を使用することである。核酸−ペプチド結合体に対し相補的なテスト核酸 をハイブリッド形成することて、抗体または蛋白質の結合を阻害して、酵素の再 構成を可能にすることかできる。イムノアッセイの例とは違い、核酸ハイブリッ ド形成の場合の抗体（または結合部位）は、サンプルからの分析物への結合によ ってではなくむしろ結合体内の核酸か二重ストランドになることによって分析物 −ペプチド結合体からそらされる。もう１つの方法は、修飾された合成核酸ペプ チド結合体を使用して、それにより抗体がその特異的修飾物に結合して酵素活性 の再構成を抑制する一方、それによって核酸ペプチド結合体と相補的なテスト核 酸のハイブリッド結合が抗体または蛋白質の結合を阻害して、酵素の再構成を可 能にする。もう１つの方法は、修飾された合成核酸分子を使用し、この分子は核 酸ペプチド結合体に直接的にハイブリッド形成する代わりに標的核酸の隣接する ストランド上の核酸−ペプチド結合体に隣接してハイブリッド形成を行ない、そ れにより好ましい方法にあるように、抗体が、修飾された核酸分子上のリガンド に結合しかつ核酸−ペプチド分子による酵素再構成を抑止することができる。

この発明のさらなる実施例は、核酸ハイブリッド形成により酵素活性を直接的に 調節する手段を提供する。「ポモジニアスＤＮＡプローブに基づく直接酵素抑制 検定」の開発における主要な発見は、核酸が、ある方法により酵素活性の完全な 抑制をもたらすことなく活性酵素に結合され得るという点である。もう１つの主 要な発見は、この核酸−酵素結合体に未修飾の核酸をハイブリッド形成するだけ ては、抗体を結合体に直接結合することによって酵素活性が調節される等価なイ ムノアッセイ（たとえばＵＳ　３８７５０１１）における場合とは違い、酵素活 性を調節するには十分ではないという点である。代わりに、この場合のハイブリ ッド形成核酸は、酵素活性を調節（たとえば抑制）するために、ある方法によっ て修飾される必要かあるということか認識された。好ましい方法は、酵素活性の 抑制に導く、抗体か後に結合されるハイブリッド形成核酸上に、リガンド分子を 置くことである。イムノアッセイの例における場合とは違い、核酸ハイブリッド 形成の場合、抗体は分析物−酵素結合体に直接的に結合しない。

この発明のさらなる実施例は核酸ハイブリッド形成により間接的に酵素阻害を調 節するための手段を提供する。核酸は、ある方法により、評価できる程度までに は酵素活性の阻害を低減することなく、酵素阻害部位（たとえばアビジン）に結 合され得るよってある。抗体の結合体への直接的な結合によって酵素活性の抑制 が阻害される、等価なイムノアッセイ（たとえばＢａｃｑｕｅｔおよびＴｗｕｍ ａｓｉ　）の場合と違い、未修飾の核酸を核酸−蛋白質結合体とハイブリット結 合させるだけでは酵素活性の抑制を低減するには十分でないようである。代わり に、この場合のハイブリッド形成核酸は酵素活性の阻害をくつがえすためにある 方法により修飾する必要があるようである。好ましい方法は、酵素上の阻害サイ トへの阻害部分のアクセスを妨げ得る抗体か後で結合するハイブリッド形成核酸 上にリガンド分子を置くことである。イムノアッセイの例の場合とは違い、核酸 ハイブリッド形成の場合の抗体は分析物−蛋白質結合体に直接的に結合しない。

この発明のさらなる実施例は、酵素活性を調節しく活性化、阻害または阻害因子 をブロックすることにより）、それにより、２つの核酸プローブのハイブリッド 形成は、プローブに結合された２つの成分を併置することにより結合部位の形成 をもたらす。好ましい結合部位は抗体可変領域結合部位であり、それによって、 抗体分子の重鎮および軽鎖可変領域フラグメントが相補型ＤＮＡプローブの５′ および３′末端にそれぞれ付与されて、ハイブリッド形成の際にこの２つの可変 領域フラグメントを併置して抗原結合種を生成する。この抗原結合種は、たとえ ば酵素に直接的に結合して酵素活性を抑制するか、酵素の活性化部位に結合する か、または酵素の抑制部位に結合することができる。

当業者においては、少なくとも１つの修飾された核酸プローブを伴う核酸ハイブ リッド形成のプロセスが直接的または間接的に酵素活性を調節し得る分子種をつ くり出す様々な方法において使用され得ることが理解されるであろう。

この発明の特定的な実施例についてここで添付の図面を参照して例示する。

図１から３．１２およびＩ３、ならびに１４およびＩ５はシグナルが酵素の活性 化により生成される、ホモジニアスＤＮＡプローブに基づく酵素活性化検定を示 す図である。

図４から６はシグナルか酵素の抑制により生成される、ホモジニアスＤＮＡプロ ーブに基づく直接酵素抑制検定を示す図である。

図７から図９は、シグナルか酵素の抑制を干渉することにより生成される、ホモ ジニアスＤＮＡプローブに基づく間接酵素抑制検定を示す図である。

図１Ｏおよび１１はハイブリッド形成による結合蛋白質の形成によりシグナルが 生じるホモジニアスＤＮＡプローブに基づく検定を示す図である。

図１６は以下に説明する例１および２において使用されるようなベーターガラク トシダーゼの合成「システィン／ペプチド」のアミノ酸配列を示す図である。

図１７および図１８は例ｒ、ｒｖおよびＩＶＩそれぞれにおいて記載される酵素 活性化検定に対するサンプルのヒトのＣＦＴＲ遺伝子ｒＰＣＲフラグメント」の 影響を示す図である。

図１を参照して、酵素活性化検定のあるものは、核酸プローブ２に結合するペプ チドにより活性化されて酵素活性を再構築し得る不活性酵素フラグメント１を含 む。図２を参照して、リガンドが付与されてリガンド−特異的抗体４の会合をも たらす第２の核酸プローブ３のハイブリッド形成によって、ペプチド結合核酸プ ローブ２による酵素フラグメント１の活性化が抑制される。図３を参照して、テ スト核酸５による、リガンド結合プローブ３とのハイブリッド形成に関する競合 により、プローブ３とプローブ２とのハイブリッド形成の程度は低減され、ある 割合のプローブ２はハイブリッド形成されないままになり、かつこうして酵素フ ラグメント１を活性化することができる。

図１２を参照して、酵素活性化検定の他のものは、核酸プローブ２に結合するペ プチドにより活性化されて酵素活性を再構成することができる図１から３に示さ れるものと同じ不活性酵素フラグメントｌを含む。この場合、単一ストランドの 核酸特異的抗体２０（または他の配列特異的または適切な結合特異性を伴う非特 異的分子）が含まれ、これがペプチド結合核酸２に結合して酵素の活性化を抑制 する。図■３に示されるとおり、ペプチド結合された核酸２が標的核酸５とハイ ブリッド形成したとき、特定の抗体２０（または池の分子）は逆に核酸２と結合 できなくなり、その結果、ペプチド結合核酸は自由になり、酵素フラグメント１ を活性化する。

図１４を参照して、酵素活性化検定のもう１つのものは、核酸プローブ２に結合 されるペプチドにより活性化されて酵素活性を再構成することができる図１から ３に示されるものと同じ不活性酵素フラグメントｌを含む。この場合には、第２ の核酸プローブ２１が含まれ、これはペプチド−核酸２には非相補的てありかつ リガンドが付与され、このリガンドはりガント−特異的抗体４の結合をもたらす 。しかしながら、図１５に示されるとおり、核酸−ペプチド分子２とリガンド由 来の核酸２１とか標的核酸５に隣接してハイブリッドを形成し、それによりリガ ンド−特異的抗体４の結合が、核酸−ペプチド２による酵素フラグメントｌの活 性化に干渉する場合にのみ、酵素の活性化は阻害される。

ベーターガラクトシダーゼに代えて、他の酵素を使用してもよく、その場合、ペ プチドをはずして酵素活性を失わせることかでき、その後酵素活性は、不活性な 酵素フラグメントとペプチドの相互作用により自動的に再構成されることか当業 者において理解されるであろう。たとえば、ＲＮＡアーセＳのＮ−末端ペプチド フラグメントは取り除かれかつ再び加えられて完全な酵素活性を再構成すること かてきる。

図４を参照して、酵素阻害検定は、核酸プローブが付与される酵素６を含む。図 ５を参照して、プローブは６に付与され、それにより、リガントか付与された第 ２の核酸プローブ７によるハイブリッド形成が起こり、かつこのプローブに後に リガンド特異的抗体８か結合することにより酵素活性の抑制かもたらされる。図 ６を参照して、テスト核酸９によるプローブ７とのハイブリッド形成に関する競 合により、プローブ７の酵素結合プローブ６との／％イブリット形成は抑制され て、酵素結合プローブは、リガンド特異的抗体８から遊離し、したかって活性と なる。

当業者においては、核酸プローブと抗体等のある他の分子との組合せかＧ６ＰＤ 等の酵素の活性を直接的に抑制することかできるという本願の発見はたとえばベ ーターガラクトシダーゼといった他の酵素にも幅広く適用され得ることを理解さ れたい。この抑制は、核酸分子を酵素の活性部位付近に付与することにより相補 的リガンド結合プローブのハイブリッド形成およびそれに続く抗リガンド抗体の 付与の際に、酵素活性か抑制されることにより実現され得る。

この抑制は、リガンド結合プローブに関する標的遺伝物質の競合により、このプ ローブが酵素活性部位の付近で／’％イブグツド形成をすることができないよう にすることでくつがえし得る。

図７を参照して、アビジン結合核酸プローブ１０は酵素のためのビオチン補助因 子との相互作用によりビオチン依存酵素１１（たとえばピルビン酸デカルボキシ ラーゼ）を抑制する。図８を参照して、この抑制は、リガンド基か付与された相 補型核酸プローブ１２のハイブリッド形成を行ない、今度はこのリガンド基をリ ガンド特異的抗体１３と結合状態にすることによってくつがえし得る。抗体をア ビジン分子に間接的に付与することでアビジン分子の酵素へのアクセスに干渉し て、それによりアビジンによる抑制を逆転する。図９を参照して、プローブ１２ と競合してアビジン結合プローブ１０に標的核酸１４かハイブリッド形成するこ とで、それに続く抗体Ｉ３による結合が避けられ、アビジンのピルビン酸デカル ボキシラーゼ分子への自由な作用が可能となる。当業者においては、酵素の活性 を間接的に調節する代替的部位で本明細書中に記載の例におけるアビジンを置換 え得るかもしれない点を理解されたい。アビジンの代替物として、たとえば、ア ロステ１ルンク部位または酵素活性部位の付近の領域に結合して酵素の活性を調 節する抗体か酵素抑制部位となるかもしれない。

図１０を参照して、核酸プローブ結合抗体重鎮可変（ＶＨ）領域１５は、ハイブ リッド形成により相補型プローブ結合軽鎖可変（ＶＬ）領域１６と結合し、抗体 の重鎮と軽鎖との結合によって抗原結合部位を生成することか可能である。抗原 結合部位か酵素活性化ペプチド１７に結合する場合、不活性酵素フラグメント１ ８の活性化か低減され得る。図１１を参照して、たとえば標的核酸１９かプロー ブＩ５と競合してプローブ１６とノ＼イブリッド形成をすることにより、可変領 域の結合かなくなって、それにより酵素活性化ペプチド１７か酵素フラグメント １８を活性化することかできる。

当業者においては、他の分子または分子の部分を誘導し互いにハイブリットを形 成する２つの核酸プローブへのこれらの分子の共同的付着により相互作用を引き 起こす可能性かあることを理解されたい。これら２つの分子の結合がたとえば第 ３の分子に結合する蛋白質を生成するかもしれない。本明細書中に記載の例では 、２つの分子は抗体分子の可変領域を含み、すなわち一方が重鎮可変領域を有し かつ他方か軽鎖可変領域を有して、これらの結合したものか酵素のペプチド活性 化因子に結合する。核酸プローブのハイブリツド形成は、このようにペプチドに 結合する抗体可変領域を形成して酵素の活性化を抑制する。この抑制は、核酸プ ローブの一方または双方に対する標的遺伝物質の競争により反転され得る。抗体 可変領域の形成も、活性部位またはその付近での結合によってか、酵素の補助因 子への結合によってか、または酵素活性を調節するもう１つの分子への結合によ って、酵素活性を直接的に調節するために使用されるかもしれない。本明細書中 に記載したホモジニアス核酸プローブに基づく検定は、特に固相を使用しないこ とによって、実用的なハイブリッド形成検定を行なう上での多くの困難を回避す る。検定は、標的遺伝物質の希釈物を核酸プローブ、酵素および抗体試薬と共に 混合しかつ特定の時点での酵素活性を記録することにより行なうことかできる。

代替的には、サンプルと試薬とを適当な商業的に入手可能な臨床分析装置内にロ ードして希釈、混合および光学的密度測定を機械を使って行なってもよい。

この発明は以下に例として述へる詳細な説明によりよりよく理解され得るか、こ れらは発明の範囲を限定するものとしては解釈されない。

例１−ＣＦＴＲ遺伝子に関するホモジニアス酵素活性化検定 この例では、図１から３および１２から１５を参照して酵素活性化検定かヒトＤ ＮＡ中のＣＦＴＲ（のう胞性繊維症）の検出に関し適用された。図面のペプチド −核酸プローブ結合体２は以後「アクチヘータ（活性因秀才リゴヌクしオチド」 と呼び、図面のリガンド結合核酸プローブ３はこれ以後「ブロッカ−（阻害因子 ）オリゴヌクレオチド」と呼ぶことにする。使用した酵素系は、アルファペプチ ドがこの酵素のＭ１５変異体を補完して（Ｕｌ　１ｍａｎｎ他Ｊ、Ｍａｌ。

Ｂｉｏｌ、　、　２４（１９６７年）３３９頁）ベータガラクトシダーゼ活性を 再構成するベータガラクトシダーゼてあった。

■、アクチベータオリゴヌクレオチドの調製アクチベータオリゴヌクレオチドブ ローブには以下のヌクレオチド配列が含まれた。

ＣＦ　Ｔ　Ｒ（Ａ）　−５’　−ＡＡＴＡＴＣＡＴＣＴＴＴＧＧＴＧＴＴＴＣ− ３’ＣＦ　Ａ　５０８　（Ａ）　−５’　−ＧＡＡＡＡＴＡＴＣＡＴＣＧＧＴＧ ＴＴＴＣ−３すへてのオリゴヌクレオチドはアブライトバイオシステムズ（Ａｐ ｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）　３８０　Ａシンセサイザ上でヌクレオシ ドホスホルアミダイトを用いて合成された。ＣＦＴＲ（Ａ）とＣＦＡ５０８　（ Ａ）とは、各々Ｃｒｕａｃｈｅｍ　（英国）より供給される３′−アミノ−ＯＮ 　ＣＰＧ支持体上で、製造者の説明書を使用して合成することにより第一３′脂 肪族アミンを用いて合成された。すべてのオリゴヌクレオチドはユニメトリック ス（Ｕｎｉｍｅｔｒｉｃｓ）　５　ｕ　ＲＰ　−８カラム上でｌｏＯｍＭ酢酸ナ トリウム中７−３５％アセトニトリルの直線勾配を使用して逆相ＨＰＬＣにより 精製された。ＣＦＴＲ（Ａ）およびＣＦＡ５０８　（Ａ）の各々１１００ｕが、 酵素について推奨される条件下で、０．１ｕＣｉ　３２ＰＡＴＰ（Ａｍｅｒｓｈ ａｍ、３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ　）を使用した微量の３２Ｐと２００μｌ中１０ ０ユニツトのＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）で５′− 末端標識さ加熱され、緩衝平衡フェノール（Ｇｉｂｃｏ　ＢＲＬ　）とクロロホ ルム（１：　１）とて２回抽出され、クロロホルムで一度抽出され、酢酸ナトリ ウムｐＨ５，２中で０．３Ｍにされがつ２倍容量の冷エタノールで沈澱された。

ペレットは７０％エタノールで一度洗浄し凍結乾燥した。

２つの代替的な形態のベーターガラクトシダーゼペプチドが使用され、すなわち １つは図１６に詳細に示すアミノ酸配列を有する、Ｎ−末端システィンを有する ４３残基フラグメントであり（ここではシスティン／ペプチドと呼ぶ）を含みか つ他方は以下に説明するとおりバクテリア細胞から分離されるＮ−末端メチオニ ンを有するプラスミド由来のアルファーペプチドを含んでおり、これをここでは メチオニン／ペプチドと呼ぶことにする。システィン／ペプチドは、製造者の試 薬とプロトコールを使用してアブライドバイオシステムダ４３１Ａペプチドシン セサイザ上で合成され、かっこのペプチドはアブライドバイオシステムズＡＢＳ １５１Ａ分離システムを使用して精製された。ペプチドはそれから１ｍＭ重炭酸 アンモニウム／１ｍＭメルカプトエタノール中で透析されかつ凍結乾燥された。

メチオニン／ペプチドは、（英国サラサンプトンのＣＰラボラトリーズ（Ｓｏｕ ｔｈａｍｐｔｏｎ、　ＵＫ）から人手の）プラスミドｐＵＣ８を保有するＥ、ｃ ｏｌｉ　ＴＧＩ細胞（英国コベントリ、ワーウィック大学生物科学部（Ｄｅｐｔ 、　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　５ｃｉｅｎｃｅｓ、　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ 　Ｗａｒｗｉｃｋ、　Ｃｏｖｅｎｔｒｙ、　ＩＪＫ）のＧｅｏｒｇｅＳａ１ｍｏ ｎｄ博士から入手）から分離された。細胞は、１１００ｕ／ｍｌアンピシリン（ 塩化ナトリウム、Ｓｉｇｍａ　、　Ｐｏｏｌｅ、ＵＫ）と０，０２％ｗ／ｖグル コースとを含むＭ９培地（モレキュラークローニング、上記）で増殖された。Ａ ａｏｏｎｍ＝＝ｏ、４で、ＩＰＴＧ（イソプロピルチオガラクトピラノシド、Ｓ ｉｇｍａ　）力月ｍＭｊ！！終濃度まで添加され、細胞はＡ６００＝０．９まで 増殖され、細胞はペレットにされかつｌｏｍｌの緩衝液Ａ（０，０５ＭトリスＨ ＣＩ、ｐＨ７，５、Ｏ，ＩＭ　ＮａＣｌ　Ｏ，ＯＩＭ　ＭｇＣ１２）に再懸濁さ れた。懸濁液は、モデルＸＬ２０Ｄウルトラソニケータ（米国、ニューヨーク、 ファーミングデール、ヒートシステム社（Ｈｅａｔ　Ｓｙｓｔｅｍｓ　Ｉｎｃ、 　Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ、　ＮｅｗＹｏｒｋ、　ＵＳＡ）を使用して６ｕピー クツーピーク、６０秒間隔、２０秒５回のパルスで氷上において音波処理された 。

細胞の破片は、４°Ｃ１４８０００ｇ２０分間の遠心分離で除去された。透明な 上澄みは、固体硫酸アンモニウムで５０％飽和にまでされかつ１８０００ｇで１ ０分間遠心分離されて分画された。結果として得られた硫酸アンモニウムペレッ トは、２．５ｍｌの緩衝液Ａ中に再懸濁されかつ得られた溶液は、緩衝液Ａで平 衡されたＰＤＩＯカラムに与えられた（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　、　Ｍｉｌｔｏｎ 　Ｋｅｙｎｅｓ、　ＵＫ　）　ｏ溶出フラクションを含む蛋白質はプールされて ２ｍ１ＡＰＴＧ−アガロースカラム（Ｐ−アミノフェニル　ベーターＤ−チオガ ラクトピラノシド　アガロース、Ｓｉｇｍａ　）にロードされかつ０．１ホウ酸 ナトリウムｐＨ１０，５で溶出された。

フラクションを含む蛋白質は、プールされ、緩衝液Ａ中０゜７５ｍｇ／ｍｌ　ｏ −二トロフェニルーベーターＤ−ガラクトピラノシド（ＯＮＰＧ、Ｓｉｇｍａ） 　１　ｍ　ｌに２５ｕ１のフラクションを添加し、３７℃で３０分間インキュベ ートしかっ４１４ｎｍで光学吸収を測定することによりベーターガラクトシダー ゼ活性についてテストされた。フラクションを含むベーターガラクトシダーゼは 、８ｍｏｌ／ｆの尿素で処理されてその後１０−１５％５ＤＳ−ポリアクリルア ミド勾配ゲル上に流された。１４ｋＤを下回るゲルスライスは切除されかつ物質 が緩衝液Ａ内に溶出された。フラクションは、１ｍＭ硫酸マグネシウム、０．１ ８ｍＭ硫酸マグネシウム、１ｍＭエチレンジアミン四酢酸酢酸び０．５Ｍリン酸 ナトリウム緩衝液、ｐＨ７中で、２５ｕ１アリコートを２５ｕｌ　（１２５ｐモ ル）のベーターガラクトシダーゼＭ１５変異体（Ｌａｎｇｌｅｙ他による方法で 調製した、Ｊ、　Ｂｉｏｆ　Ｃｈｅｍ、　ｖｏｌ、　２５０（１９７５年）２５ ８７頁−２５９２頁）と混合することにより、メチオニン／ペプチドの存在につ いてテストした。混合物は３７°Ｃで３０分間インキュベートして、４１４ｎｍ での光学吸収を測定した。

オリゴヌクレオチドのラスティン／ペプチドへの結合のため各３′−アミノーオ リゴヌクレオチド１１００ｕと５ｍｇのＭ−マレイミドヘンシイルーＮ−ヒドロ キシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ　、　Ｐｉｅｒｃｅ）か１ｍｌの無水テト ラヒドロフラン中に溶解された。この溶液にｌ　Ｏｍｇの炭酸ナトリウムを添加 しかつ３０分間反応させた。混合物は、０．２Ｍリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７ 中１：１で希釈され、かつランニングバッファとして０．１Ｍリン酸ナトリ、ラ ム、ｐＨ７を使用して２０ｍ１セフアデツクス（５ｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ２５カラ ム（Ｐｈａｒｍａｃ　ｉａ　）に与えられた。ビーク３２Ｐ−標識フラクション をプールし、酢酸ナトリウムｐＨ５，２中て０．３Ｍにしかつ２倍容量の冷エタ ノールで沈澱させた。ペレットは７０％エタノール中で一度洗浄されて凍結乾燥 された。２００ｕｌのＯ，１Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ７中で、マレイミド−す りゴヌクレオチドにｌＯｕｇのシスティン／ペグ升ドが添加された。この混合物 は室温て１時間攪拌されかつオリゴヌクレオチド−ペプチド結合体か、デュポン 社ゾルパックス（Ｚｏｒｂａｘ）　Ｇ　Ｆ　２５０カラムおよび０．２Ｍリン酸 カリウム、ｐＨ７の溶出緩衝液を使用して陰イオン交換ＨＰＬＣにより精製され た。

オリゴヌクレオチドのメチオニン／ペプチドへの結合に関して、２５ｕｌのＯ１ ＩＭホウ酸ナトリウムｐＨ９，３中に各３′−アミノーオリゴヌクレオチド１１ ００ｕか溶解されかつｌ　Ｏｍｇのジイソチオシアナート（Ｄ［ＴＣＰｉｅｒｃ ｅ、０．５ｍｌジメチルホルムアミドに溶解）が添加された。この混合物は暗所 で２時間優しく振とうされかつさらに６ｍｌの５０％（Ｖ／Ｖ）ブタン−１−オ ールと混合された。この混合物は激しく振とうされかつ３０００ｇで５分間遠心 分離された。活性化されたオリゴヌクレオチド溶液は、さらにブタン−１−オー ルで抽出され、容量をく５０μ】まで減らされかつ乾燥させられた。メチオニン ／アルファペプチドはミニコン（Ｍｉｎｉｃｏｎ　）　ＣＳ　１５濃縮装置（Ａ ｍｉｃｏｎ）を使用して０．１Ｍホウ酸ナナトリウムｐＨ９３中に濃縮された。

１００ｕｇ　（５０ｕ　１）が活性化されたオリゴヌクレオチド調製物と混合さ れて暗所で１８時間インキュベートされた。摘出され、緩衝液Ａ内へ溶出されて 緩衝液Ａ中で透析された結合体のバンドを同定するために、微量の５’−３２Ｐ 標識オリゴヌクレオチド（モレキュラクローニング、同上）を使用して１２．５ ％Ｓｗａｎｋ　Ｍｕｎｋｒｅｓ　５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（Ａｎａｌ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、　、９９（１９７９年）１７０頁）上で、ペプチド／オリゴヌ クレオチド結合体は電気泳動により精製された。

Ｉｌ、ブロッカ−オリゴヌクレオチドの調製ブロッカ−オリゴヌクレオチドは、 対応するアクチベータオリゴヌクレオチド（Ｃ：ＦＴＲ（Ｂ）およびＣＦＡ５０ ８（Ｂ））に相補的で、かつアクチベータオリゴヌクレオチド（ＣＦＴＲ（Ｃ） に相補的なものに隣接するＣＦＴＲ遺伝子上の部位に相補的な以下のオリゴヌク レオチド配列を含んでいた。

ＣＦＴＲ（Ｂ）　−５’　−ＧＡＡＡＣＡＣＣＡＡＡＧＡＴＧＡＴＡＴＴ−３’ ＣＦ　Ａ　５０８　（Ｂ）　−５’　−ＧＡＡＡＣＡＣＣＧＡＴＧＡＴＡＴＴＴ ＴＣ−３ＣＦ　Ｔ　Ｒ（Ｃ）　−５’　−ＣＴＡＴＧＡＴＧＡＡＴＡＴＡＧＡＴ ＡＣＡ−３’これらのオリゴヌクレオチドは、５−プロモデオキシウリジンシア ノエチルホスホルアミジト（Ｃｒｕａｃｈｅｍ）を合成に組み入れることにより ５′−ブロモデオキシウリジンヌクレオシドを用いて合成された。

１１１、標的ＤＮＡの調製 ＤＮＡサンプルが、非変異ＣＦＴＲ（のう胞性繊維症トランスレギュレータ）遺 伝子に対してホモ接合の正常な個体から、およびＣＦＴＲ遺伝子中のコドン５０ ８のホモ接合欠損のためにのう胞性繊維症を患う固体から得られた。

ＤＮＡは、殺菌した爪楊枝で頬の内層をやさしくこすることによりこれらの被検 者から得られた頬の細胞に由来した。

頬の細胞は１０ｕｌ殺菌水に懸濁され、２０ｕｌＯ，１Ｍ水酸化カリウムおよび ０１％トリトン−Ｘ−１００て６５°Ｃにおいて２０分間加水分解され、かつ２ ０ｕ１のＯｌＩＭ　ＨＣＩと０．１％ｌ・リドン−Ｘ−１００で中和された。

ＣＦＴＲ遺伝子の領域はＥＰ２００３６２　（Ｃｅｔｕｓ社）に記載されるよう なポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法により増幅された。５ｕｌのヒト細胞溶解 産物か、９４°Ｃて３分間変性され、かつ５ｕｌの２０ｍＭ１’リスＨＣＩ、Ｉ ）Ｈ８，３，１００ｍＭ塩化カリウム、３ｍＭ塩化マグネシウム、２０ｎｇ／ｍ ］ウシ血清アルブミン（フラクションＶ、Ｓｉｇｍａ）、４００ｕＭデオキシリ ボヌクレオチド混合物（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　）　、０．　１％トリトン−Ｘ− １００Ｓ　０゜０５ユニツトのサームス・アクアティクス（Ｔｈｅｒｍｕｓ　ａ ｑｕａｔｉｃｕｓ　）　ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ）およ び０゜５ｕＭオリゴヌクレオチド増幅プライマー（５’　−ＣＡＧＴＧＧＡＡＧ ＡＡＴＧＧＣＡＴＴＣＴＧＴＴ　−３’および５　’　−ＧＧＣＡＴＧＣＴＴＴ ＧＡＴＧＡＣＧＣＴＴＣＴＧ　−３’　）中に混合された。増幅は、９３°Ｃで １分間、５５°Ｃで１．５分間および７３°Ｃで３分間の連続するステップを含 む増幅がサーマルサイクラ−（Ｔｅｃｈｎｅ、モデルＰＨＣ−２）中で４０サイ クルで行なわれた。さらにポリメラーゼ０．０５ユニツトが２０サイクルの段階 で添加された。

ＩＶ、高アクチベータ抗体でのハイブリッド形成分析ハイブリッド形成分析は図 １２および１３に示されるように行なわれた。ハイブリッド形成反応物は、オリ ゴヌクレオチドの組み合わせＣＦＴＲ（Ａ）およびＣＦＴＲ（Ｂ）とともに、上 記のＩＩＩで記載されたように調製された正常な被検者（確認されたホモ接合の 野性型ＣＦＴＲ遺伝子）由来のＤＮＡの混合物を含んでいた。さらに、対照は、 ヒトのＤＮＡを含まない混合物を含んでいた。ハイブリッド形成のため、１０μ モルのメチオニンペプチド／オリボヌクレオチド結合体は、５０ｕ１の５％ホル ムアミド、０．６Ｍ塩化ナトリウムおよび０．０６Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ ７中の標的ヒトＤＮＡ　ＣまたはＰＣＲ緩衝液ブランク）希釈液と混合されかつ 混合物は３７°Ｃて３０分間インキュベートされた。抗単−ストランドＤＮＡ抗 体（クローン番号１６１９、バイオジエネシス、ボーンマウス、英国（Ｂｉｏｇ ｅｎｅｓｉｓ、Ｂｏｕｒｎｅｍｏｕｔｈ）　）の、０．１５Ｍ　ＮａＣ１および ０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ８、中１・５の希釈液５０ｕｌが添加さ れかつインキュベーションはさらに３０分間続けられた。

ベーターガラクトシダーゼ活性が以下のとおり測定された。上記の混合物に、１ ｍｇ／ｍ１ＯＮＰＧ、１ｍＭ硫酸マグネシウム中１２５ｐモルのＭ１５調製物、 ０．１８ｍＭ硫酸マンガン、１ｍＭエチレンジアミン四酢酸酢酸び０゜５Ｍリン 酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７を含む混合物９００ｕ１が添加された。この混合物 は３７°Ｃで３０分間インキュベートされて、４２０ｎｍでの光学吸収が測定さ れた。

結果を図１７に示すが、ヒトＤＮＡの導入によって対照におけるものよりもベー タガラクトシダーゼ活性が増大していることがわかる。

ハイブリッド形成分析は図２および３に示されるとおり行なわれた。ハイブリッ ド形成反応物は、オリゴヌクレオチドの組み合わせＣＦＴＲ（Ａ）およびＣＦＴ Ｒ（Ｂ）または組み合わせＣＦＡ５０８　（Ａ）およびＣＦＡ５０８（Ｂ）のい ずれかとともに、正常な固体またはのう脆性繊維症を患う固体に由来し、上記Ｉ ＩＩに記載されるとおりに調製されたＤＮＡの混合物を含んでいた。また、対照 はヒトＤＮＡを含まない混合物を含んでいた。ハイブリッド形成のため、１０ｐ モルのシスティンペプチド／オリゴヌクレオチド結合体が、２０ｐモルのブロッ カ−オリゴヌクレオチドならびに５％ホルムアミド、０．６Ｍ塩化ナトリウムお よび０．０６Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７の５０ｕｌにおけるヒトＤＮＡ　（ またはＰＣＲ緩衝液ブランク）２ｕｌと混合され、混合物は３７℃で３０分間イ ンキュベートされた。１０ｕｌ　Ｏ，６Ｍ塩塩化ナトリウム中口：２希釈された 抗ブロモデオキシウリジン抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ）２０ｕ１が添加されかつイ ンキュベーションはさらに３０分間続けられた。

ベーターガラクトシダーゼ活性は以下のとおり測定された。上記の混合物に、１ ｍｇ／ｍ１ＯＮＰＧＳ　１ｍＭ硫酸マグネシウム中Ｍ２５調製物１２５ｐモル、 ０．１８ｍＭ硫酸マンガン、１ｍＭエチレンジアミン四酢酸酢酸び０゜５Ｍリン 酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７を含む混合物４４０ｕ１が添加された。この混合物 は、３７°Ｃで３０分間インキュベートされ、光学吸収が４１４ｎｍで測定され た。結果は、ブロッカ−オリゴヌクレオチドがない状態でＣＦＴＲ（Ａ）アクチ ベータを用いたものに対するベータガラクトシダーゼ（ベーターｇａ　１）活性 のパーセンテージで表わし、以下のとおりである。

ＣＦＴＲ（Ａ）／無　無　１００　（Ａ４１４＝１．１６）ＣＦＡ５０８（Ａ） ／無　無　８９ ＣＦＴＲ（Ａ）／ＣＦＴＲ（Ｂ）　無　８ＣＦＡ５０８（Ａ）／ＣＦＡ５０８（ Ｂ）　無　４ＣＦＴＲ（Ａ）／ＣＦＴＲ（Ｂ）　正常　６６ＣＦＴＲ（Ａ）／Ｃ ＦＴＲ（Ｂ）　のう脆性繊維症　２８ＣＦＡ５０８（Ａ）／ＣＦＡ５０８（Ｂ） 　正常　３３ＣＦＡ５０８（Ａ）／ＣＦＡ５０８（Ｂ）　のう脆性繊維症　７４ これらの結果は、簡単なホモジニアスベータガラクトシダーセ活性化検定による 正常なりＮＡとのう脆性繊維症のＤＮＡとの差を示す。

ハイブリッド形成分析は図１４および１５に示されるように行なわれた。ハイブ リッド形成反応物は、上記の１１１で記載されるとおりに調製された正常なヒト ＤＮＡ　（確認されたホモ結合ＣＦＴＲ遺伝子）とオリゴヌクレオチドの組み合 わせＣＦＴＲ（Ａ）およびＣＦＴＲ（Ｃ）との混合物を含んでいた。さらに、対 照はヒトＤＮＡを含まない混合物を含んでいた。ハイブリッド形成のため、１０ ９モルのシスティンペプチド／オリゴヌクレオチド結合体ＣＦＴＲ（Ａ）が、１ ０９モルのブロッカ−オリゴヌクレオチドＣＦＴＲ（Ｃ）および５％ホルムアミ ド、０．６Ｍ塩化ナトリウムおよび０．０６Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７の５ ０ｕ１におけるヒトＤＮＡ　（またはＰＣＲ緩衝ブランク）希釈液と混合され、 かつ混合物は３７°Ｃで３０分間インキュベートされた。１０ｕｌ　０．６Ｍ基 塩化ナトリウム中、２て希釈された抗ブロモデオキシウリジン抗体（Ａｍｅｒｓ ｈａｍ）　２０　ｕ　Ｉが添加されかつインキュベーションはさらに′３０分間 継続された。

ベーターガラクトシダーゼ活性は上記Ｖで記載されたように測定されかつ結果は 図１８に示されるとおり、ヒトＤＮＡの導入が、量に依存するベーターガラクト シダーゼ活性の減少をもたらすことがわかる。

例２−ｐ５３遺伝子のためのホモジニアス酵素活性化検定この例では、図１から ３を参照しかつ例１に記載されたような酵素活性化検定がヒトのｐ５３抗癌遺伝 子の検出に適用された。

■、アクチベータオリゴヌクレオチドの調製アクチベータオリゴヌクレオチドブ ローブは以下のヌクレオチド配列を含んていた。

ｐ　５３　（Ａ）　−５’　−ＧＧＣＡＴＧＡＡＣＣＧＧＡＧＧＣＣＣ−３’ｐ ５３ｍｕ　ｔ　（Ａ）　−５’　−ＧＧＣＡＴＧＡＡＣＣＡＧＡＧＧＣＣ：Ｃ− ３’オリゴヌクレオチドは上記例１にあるとおり合成されかつシスティン／ペプ チドに結合された。

ＩＩ　ブロッカ−オリゴヌクレオチドの調製ブロッカ−オリゴヌクレオチドは対 応するアクチベータオリゴヌクレオチドに相補的な以下のようなオリゴヌクレオ チド配列を含んでいた。

ｐ　５３　（Ｂ）　−５’　−ＧＧＧＣＣＴＣＣＧＧＴＴＣＡＴＧＣＣ−３’ｐ 　５３ｍｕ　ｔ　（Ｂ）　−５’　−ＧＧＧＣＣＴＣＴＧＧＴＴＣＡＴＧＣＣ− ３’これらのオリゴヌクレオチドは例１にあるとおり５′ブロモデオキシウリジ ンヌクレオチドを用いて合成された。

Ｔ　Ｉ　１．標的ＤＮＡの調製 ＤＮＡサンプルは、上記ｐ５３（Ａ）とＣＢ）とに相補な微量のｐ５３配列に関 してホモであるヒトリンパ腫細胞系ＲＡ、　Ｊ　Ｉ　（ＡＴＣＣ７９３８）から 入手した。１０４細胞ハ１００ｕｌの滅菌水に懸濁され、２００ｕｌの０．１Ｍ 水酸化カリウムおよび０．　１％トリトン−Ｘ−１００とで６５°Ｃにおいて２ ０分間加水分解され、かつ２００ｕｌの０．１ＭＨＣｌおよび０．１％トリトン −Ｘ−１００で中和された。

ｐ５３遺伝子の領域は例１に記載されたようなポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ） により増幅された。５ｕｌのヒト細胞溶解産物が９４°Ｃで３分間変生されかつ ２０ｍＭトリスＨＣ］ｐＨ８，３，１００ｍＭ塩化カリウム、３ｍＭ塩化マグネ シウム、２０ｎｇ／ｍｌウシ血清アルブミン（フラクションＶ、　Ｓｉｇｍａ　 ）　、４００ｕＭデオキシリボヌクレオチド混合物（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　）　 、０．　１％トリトン−Ｘ−１００，０，０５ユニツトのサームス・アクアティ クスＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ）ならびに０．５ｕＭオリ ゴヌクレオチド増幅プライマ（５’　−ＡＴＧＣＧＡＡＴＴＣＣＣＣＴＧＣＣＣ ＴＣＡＡＣＡＡＧＡＴ−３’および５　’　−ＴＡＴＡＧＧＡＡＴＴＣＧＴＧＧ ＴＧＡＧＧＣＴＣＣＣＣＴＴ−３’　）の５ｕｌに混合された。９４°Ｃで１分 間、５５°Ｃで２分間および７２°Ｃで３分間の連続するステップを含む増幅が 、サーマルサイクラ−（Ｔｅｃｈｎｅ、モデルＰＨＣ−２）内で３５サイクル行 なわれた。

ハイブリッド形成分析は図２および３に示されるとおり行なわれた。ハイブリッ ド形成反応物は、オリゴヌクレオチドの組み合わせｐ５３（Ａ）およびｐ５３（ Ｂ）、組み合わせｐ　５３ｍｕ　ｔ　（Ａ）およびｐ　５３ｍｕ　ｔ　（Ｂ）ま たはアクチベータオリゴヌクレオチドのみのいずれかとともに、上記のＩＩＩに 記載されるように調製されたＤＮＡの混合物を含んでいた。さらに、対照はヒト ＤＮＡを含まない混合物を含んでいた。ハイブリッド形成のため、１０Ｐモルの システィンペプチド／オリゴヌクレオチド結合体が、２０Ｐモルのブロッカ−オ リゴヌクレオチドおよび２ｕｌのヒトＤＮＡ　（またはＰＣＲバッファブランク ）と混合された。ハイブリッド形成条件、抗ブロモデオキシウリジン抗体の添加 およびベーターガラクトシダーゼ活性の測定については上記の例１のとおりであ る。結果は以下のとおりｐ５３（Ａ）／ｐ５３（Ｂ）　２　ｕ　Ｉ　Ｏ、９６ｐ ５３（Ａ）／ｐ５３（Ｂ）　無　０．１６ｐ５３（Ａ）　２ｕｌ　１．　２３ ｐ５３（Ａ）　無　１．３３ ｐ５３ｍｕｔ（Ａ）／ｐ５３ｍｕｔ（Ｂ）　２　ｕ　１　０　、　３８ｐ５３ｍ ｕｔ（Ａ）／ｐ５３ｍｕｔ（Ｂ）　無　０．１８ｐ５３ｍｕｔ（Ａ）　２　ｕ　 １　０．　９４ｐ５３ｍｕｔ（Ａ）　無　１．１７ これらの結果は、簡単なホモジニアスベータガラクトシダーセ活性化検定により 正常なｐ５３抗癌遺伝子（ｐ５３（Ａ）と（Ｂ）オリゴヌクレオチドの組合せ） の検出を示す。

例３−ＣＦＴＲ遺伝子のためのホモジニアス酵素阻害検定この例ては、図４から ６を参照する酵素阻害検定が、ヒ）４）ＮＡ中ののう飽性繊維症遺伝子の検圧に 関して適用された。出発オリゴヌクレオチドは例１で使用されたアクチベータお よびブロッカ−オリゴヌクレオチドと同してありかつのう飽性繊維症遺伝子の検 出のため同様に使用された。

酵素グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤＨ１Ｓｉｇｍａイース トタイプＶ）がこの検定では使用された。

１、オリゴヌクレオチド−０６ＰＤＨ結合体の調製アクチヘータオリゴヌクレオ チドは例Ｉに示すとおり３２Ｐ−標識しかつＬｉ他により記載されるように（Ｎ ｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、１５（１９８７年）第５２７５頁−５２８７頁） ３′末端でチオール化された。２０ｎモルサンプルの合成３’ＮＨ２−オリゴヌ クレオチドが凍結乾燥されかつ２５０ｕｌの０．　２Ｍ　ＨＥＰＥＳ　（Ｎ−２ −ヒドロキシルエチルピペラジン−Ｎ’−エタンスルホン酸、Ｓｉｇｍａ　）　 ｐ　Ｈ７，９中に溶解された。この混合物に、４ｍｇのジチオ−ビス−プロピオ ニ−ルーＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（Ｓｉｇｍａ）を含む１５０ｕ ｌジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ，Ａｌｄｒｉｃｈ）が添加され、かつ混合物 は１晩室温でインキュベートされた。沈澱した物質は遠心分離により取り除がれ かっ沈澱物は１５０ｕｌの０．２ＭトリスＨＣｌｐＨ８，５で２度洗浄された。

上澄み液と２つの洗浄物とを混合して３７°Ｃにおいて１５分間隔で３０ｕ１の １Ｍジチオトレイトール（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　）を３回連続して添加すること で処理した。

混合物は１ｍＭトリスＨＣｌｐＨ７緩衝液を使用して２ｍ１セフアデツクス０２ ５カラムを介して脱塩され、かつ３′−チオール化されたオリゴヌクレオチドフ ラクションがプールされ、凍結乾燥されかっ２０ｕｌの水に溶解された。

５ｕｌジメチルホルムアミド中１２ｍｇＭＢ５溶液が０゜７ｍｌの０．０５Ｍリ ン酸カリウム緩衝液、ｐＨ６中６６ＰＤＨの１ｍｇ溶液に添加された。混合物は 室温で３０分間撹拌され、脱塩されてＣ３Ｉ５スパイラル流体濃縮装置（Ａｍｉ ｃｏｎ）を通されることで０．２ｍｌまで濃縮された。

Ｉｎモルのチオール化されたオリゴヌクレオチド（３ｕ１）か添加されその次に ２ｕｌの１ｍＭジチオトレイトールが添加された。混合物は室温で６０分間置か れかつオリゴヌクレオチド−０６ＰＤＨ結合体か例１のＩと同様ゾルパックスＧ Ｆ２５０カラム上で精製された。

Ｉｌ、ハイブリッド形成 ブロッカ−オリゴヌクレオチド、標的ＤＮＡおよびハイブリット形成条件は、ペ プチド／オリゴヌクレオチド結合体の代わりに１０ｐモルのオリゴヌクレオチド −０６ＰＤＨか使用される点を除いては例１と同様であった。

０６ＰＤＨ活性は以下のように測定された。ハイブリッド形成／抗ＢＵＤＲ混合 物か３０°Ｃにされかつこれに４４０ｕｌの、３．３ｍＭグルコース−６−リン 酸、２　ｍＭＮＡＤ、０１１％ウサギの血清アルブミンおよび０．０５Ｍトリス ＨＣｌｐＨ７，９か添加された。３５０ｎＭでの光学吸収か１分後に記録された 。

結果は、ブロッカ−オリゴヌクレオチドのない状態でＣＦＴＲ（Ａ）アクチヘー タを用いたものに対するグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ活性のパーセ ンテージで示しかつ以下のとおりであった。

アクチベータ／ブロブカ　ヒ　トＤＮＡ　％Ｇ６ＰＤＨ活性ＣＦＴＲ（Ａ）／無 　無　１００（Ａ３５０＝０．１１３／分）ＣＦＡ５０８（Ａ）／無　無　９５ ＣＦＴＩ？（Ａ）／ＣＦＴｌ？（Ｂ）　無　３５ＣＦＡ５０８（Ａ）／ＣＦＡ５ ０８（Ｂ）　無　３４ＣＦＴＲ（Ａ）／ＣＦＴＲ（Ｂ）　正常　５７ＣＦＴＲ（ Ａ）／ＣＦＴＲ（Ｂ）　のう飽性繊維症　２６ＣＦＡ５０８（Ａ）／ＣＦＡ５０ ８（Ｂ）　正常　３６ＣＦＡ５０８（Ａ）／ＣＦＡ５０８（Ｂ）　のう飽性繊維 症　６４これらの結果は、簡単なホモジニアス０６ＰＤＨ酵素阻害検定により正 常のＤＮＡとのう飽性繊維症のＤＮＡとが区別されていることを示す 当業者においては、上述より、本願の範囲内で他の多くの異なる検定方式が考え られる点は明らかであろう。

これらは興味の配列があるプローブと競合して他のプローブと結合する検定およ び興味の配列が双方のプローブに結合する能力がある検定を含む。

本願の検定方法は酵素の挙動における検出可能な変化を必要とする。そのような 変化とは酵素活性、酵素活性における増大または減少を含み得る。

このようにしてプローブは酵素、酵素フラグメント、酵素阻害因子、酵素アクチ ベータまたは酵素補助因子に結合され得る。

興味の配列は合成核酸、原核もしくは真核細胞から得られるまたはポリメラーゼ 連鎖反応に由来する核酸でよい。

典型的にはその大きさの範囲はｌＯから１００００ヌクレオチドの長さである。

同様に、プローブは、合成オリゴヌクレオチドまたは実質的に天然由来のもので もよい。これらは結合するパートナ−（たとえは抗ブロモデオキシウリジン抗体 ）のためのリガンドとして作用するブロモデオキシウリジン等の合成塩基類似体 を含んでいてもよい。

Ｆｉｇ　７゜ Ｆｉｇｌｏ。

Ｆ工ｇｕｒｅ　１２ Ｆｉｇｕｒｅ１４ Ｆｉｇｕｒｅ　１６ Ｃｙｓ　ｎ＊　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ　Ｌａｕ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｌ ａｕ　Ｇｉｎ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ａｓｐ　Ｔｒｐ　Ｇｌｕ　■奄■氏@Ｐｒｏ　 Ｇｌｙ ＶＪＬＩ　Ｔｈｒ　Ｇｌｎ　Ｉｚｕ　Ｊｓｎ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ａｌａ 　Ｈｉｓ　Ｐｒｏ　Ｅ’ｒｏ　Ｐｈｅ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　’■吹@Ａｒｇ　ｆｉ ｓｎ　Ｓｅｒ Ｆｉｇｕｒｅ　１７ ｕｇ　ＦＣＲｆｒａｇｍａｎｃ Ｕ８　ＰＣＦＬ　フ５＞ンント Ｆｉｇｕｒｅ　１８ ｕｇ　ＰＯｆｒａｇｍｅｎ仁 ＬＩＪ　ｔｃＲｙう２ンント 国際調査報告　。、７２、。。？／Ｉ’Ｎウウ。

フロントページの続き （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＳＥ）、０Ａ（ＢＦ 、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、ＣＩ、ＣＭ、ＧＡ、ＧＮ、ＭＬ、ＭＲ，ＳＮ、ＴＤ、ＴＧ ）、ＡＴ、　ＡＵ、　ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＣＡ、　ＣＨ，Ｃ３，ＤＥ。

ＤＫ、　ＥＳ、ＦＩ、　ＧＢ、　ＨＵ、ＪＰ、　ＫＰ、　ＫＲ，ＬＫ、　ＬＵ、 　ＭＧ、　ＭＮ、　ＭＷ、　ＮＬ、　ＮＯ，ＰＬ、ＲＯ、ＲＵ、　ＳＤ、ＳＥ、 　ＵＳ （７２）発明者　デルナツト、サビーネ・ヨーランド・ジョセフ イギリス、オー・エックス・９５・ティー・ニス　オックスフォードシャー、ル ーフノール、ヒル・ロード、ホーム・ファーム（番地なし）

Claims (26)

【特許請求の範囲】
1. １．サンプル中の興味の核酸配列の存在を決定するためのホモジニアス検定法で あって、溶液中に、サンプルと、興味の配列の少なくとも１つに実質的に相補的 または相同でかつ酵素もしくは酵素の活性に影響を与える能力がある物質と結合 または結合する能力がある第１の核酸プローブと、第１のプローブに結合する能 力があるかまたは興味の配列の少なくとも１部に結合する能力があってかつリガ ンド部位を含む第２のプローブと、前記リガンド部位に結合する能力のある結合 パートナーとを混合するステップを含み、その配合は、第１および第２のプロー ブが近接して結合される場合に酵素の挙動に対する結合パートナーの効果が変更 されるものであり、かつ前記酵素の動きをモニタするステップを含む、方法。
2. ２．第２のプローブが核酸である、請求項１に記載の方法。
3. ３．第１のプローブが興味の配列に実質的に相同でありかつ第２のプローブが興 味の配列に実質的に棺桶的である、請求項２に記載の方法。
4. ４．第１および第２のプローブが双方ともに興味の配列に対し実質的に相補的で ありかつ双方ともに興味の配列に近接して結合する能力がある、請求項２に記載 の方法。
5. ５．第２のプローブが検定における結合パートナーの機能を果たす、請求項１に 記載の方法。
6. ６．第１のプローブが興味の配列に実質的に相補的でありかつ第２のプローブが 第１のプローブに対抗する抗体である、請求項５に記載の方法。
7. ７．第１のプローブが合成塩基類似体を含み、かつ第２のプローブが前記合成塩 基類似体に対抗する抗体である、請求項６に記載の方法。
8. ８．前記合成塩基類似体がブロモデオキシウリジンを含む、請求項７に記載の方 法。
9. ９．第１および第２のプローブは、第１および第２のプローブが近接する場合に 形成される結合部位の２つのそれぞれの部分を含む、請求項２に記載の方法。
10. １０．第１のプローブが抗体ＶＨまたはＶＬ領域を含みかつ第２のプローブが相 補の抗体ＶＬまたはＶＨ領域を含む、請求項９に記載の方法。
11. １１．第１のプローブが酵素、酵素フラグメント、酵素阻害因子、酵素アクチベ ータまたは酵素補助因子と結合する、請求項１から９のいずれかに記載の方法。
12. １２．第１のプローブがベーターガラクトシダーゼまたはＲＮアーゼＳと結合す る、請求項１１に記載の方法。
13. １３．第１のプローブがベータガラクトシダーゼのＭ１５変異体フラグメントと 結合する、請求項１２に記載の方法。
14. １４．第１のプローブが図１６に示されるアミノ酸配列を含むベータガラクトシ ダーゼのフラグメントまたはその機能的等価物と結合する、請求項１２に記載の 方法。
15. １５．第１のプローブがビオチン依存酵素と結合する能力がある、請求項１に記 載の方法。
16. １６．第１のプローブがアビジンと結合する請求項１に記載の方法。
17. １７．第１のプローブがビルビン酸デカルボキシラーゼと結合する能力がある、 請求項１５または１６に記載の方法。
18. １８．第１のプローブがグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼと結合する、 請求項１１に記載の方法。
19. １９．興味の配列が１０ヌクレオチド長より長い核酸を含む先行する請求項のい ずれかに記載の方法。
20. ２０．興味の配列が１００００ヌクレオチド長より短い核酸を含む請求項１９に 記載の方法。
21. ２１．酵素の挙動が定量的にモニタされる、先行の請求項のいずれかに記載の方 法。
22. ２２．サンプル中の興味の核酸配列の存在を決定するためのホモジニアス検定法 であって、溶液中に、サンプルと、興味の配列の少なくとも一部に実質的に相補 的または相同な第１の核酸プローブと、酵素またはその一部とを混合するステッ プを含み、その配合は、酵素の挙動が興味の配列の有無によって検出可能な形で 影響されるようなものであり、かつ前記酵素の挙動をモニタするステップを含む 、方法。
23. ２３．酵素、酵素フラグメント、酵素阻害因子、酵素アクチベータまたは酵素補 助因子に結合する核酸を含む組成物。
24. ２４．結合対の一部に結合する核酸を含み、それにより結合対の他の部分が結合 部位の形成を生じさせる、組成物。
25. ２５．結合対の２つの部分が抗体ＶＨ領域と抗体ＶＬ領域とを含む、請求項２４ に記載の組成物。
26. ２６．第１の核酸プローブと、第２のプローブと、酵素基質および結合パートナ ーとを含む、請求項１に記載の方法を行うためのキット。