JPH06505482A - 感染治療および叢制御の方法および組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 感染治療および叢制御の方法および組成物発明の分野 本願発明は感染を治療しそして叢［フローラ　（Ｉｌｏ＋ｉ）］組成を制御する 方法およびそのための組成物に関するものである。更に詳細には、本願発明はハ ロパーオキシダーゼ殺微生物活性を使用する防腐方法および組成物に関するもの である。

発明の背景 歴史的背景； 酸化防腐剤および消毒剤の使用は１８世紀後期にまで浦って興味ある発展をして きている。ハイポハライドおよび過酸化物防腐剤と本願発明の関連性のため、こ れらの歴史を簡略化して示す。１７８８年に、フランスの化学者ペルトレー（Ｂ ｅｒｔｈａ１１ｅ＋）は水性アルカリおよび塩素から製造された溶液の消毒およ び漂白特性を記載し、そして１７９２年にカリウムに基づく組成物製剤、オウ　 ド　ジャベル（ｃａｎｄｅ　Ｉｔマｅｌ）が消毒剤として市販された。１８２０ 年に、ラバラーク（Ｌｉｂｕ川ａｅ用は水性炭酸ナトリウムおよび塩素から溶液 を製造した。このリカー　ド　ラバラーク（ｌｉｑｏｅｕ＋　ｄｅ　Ｌ山ｒｎｑ ｕｅ　）は消毒剤および防臭剤特性のため良く知られていた。１８４６年に、セ ンメルバイス（Ｓｅｍｍｅ１ｗ山）は石灰の塩化物、次亜塩素酸カルシウム溶液 を使用して魔法敗血症の蔓延を首尾良く制御し、そして１８８１年にコツホ（Ｋ ｏｃｈ）は次亜塩素酸塩の殺菌作用に関する彼の結果を報告した。

１８１８年に、テナード（Ｔｈｅｎａｒｄ　）は、希釈酸を二酸化バリウムと反 応させて過酸化水素（ＨＯ）を合成し、比較的不安定なＲ２０□の３〜４％溶液 を得た。

Ｒ２０２の消毒剤特性は１９世紀半ばまでに認められた。「その適用は水および 牛乳を安全にするためや、下水の消毒用に提唱されてきた：これは医薬、外科、 歯科、調髪等で適用されてきた。Ｊ　（Ｈｅｉｎｅｍａｎｎ　％　１９１３年、 Ｊ、ん１ｌＬｋ、６０１６０３〜＋６０６）。しかし乍ら、この防腐能力は次亜 塩素酸塩と比較して比較約２しい。

染料の防腐作用も知られておりそして第一次世界大戦前および中に使用された。

１９００年に、ラーゾ（Ｒｏｂ）は染料アクリジンが光の存在下でのみ生存する 細胞（即ち、ゾウリムシ）を殺害したことを報告しくＸ、　Ｂｉｏｌ、３９：５ ２４以下、そして１９０５年にヨードルバウアーＱｏｄｌｂｘｕｅｔ　）と７オ ン　タッペイナー（マｏｆｉＴ！ｐｐｅｉｎｅｒ　）は細菌の染料感受性光殺害 には０２が必要であることを報告した（Ｄｅａｆ。

Ａｒｃｈ、　Ｋ１１ｎ、　Ｍｅｄ、　８２：　５２０〜５４６）。染料感受性の ０２依存性光酸化および光酸素付加活性は通常光力学活性と称される（Ｂｌｕｎ ｔ、　１９４１年、Ｐｈｏｊｏｄ７ｎｘｍｉｃ　Ａｃｔｉｏｎｘｎｄ　Ｄｉ＋ｅ ｘｓｅｓ　Ｃａｕｓｅｄ　ｂ７　Ｌｉｇｈｔ、　Ｒ５１ｎｈａｌｄ、　二Ｌ−ヨ ーク）。フラビンやブリリアントグリーンのような染料は、血清媒体中で比較的 高い希釈で使用したときでも、防腐剤として有効であった。残念なことに、それ らの抗微生物作用に加えて、これらの染料は宿主の損傷、即ち白血球破壊ももた らす（ＦｌｅＩｌｉｎｇ　５１９１９年、Ｂｒ口、Ｉ、Ｓｕｒｇ、Ｔ：　９９〜 １２９　）。

防腐作用分野における研究は第一次世界大戦で加速された。この期間中に、前記 した次亜塩素酸塩に基づく防腐剤の能力（Ａｎｄｒｃｖｅｓおよび０ｒｉｏｎ　 、１９０４年、２ｅｎｔｎｂ１．　ＢｘＨｅｔｉｏｌ、　（０＋ｉｇ、　Ａ、ｌ 　３５：　８１１〜８１６　）が確固として確立され、そしてニーゾル（Ｅｕｓ ｏｌ　）　（Ｓｍｉｔｈ等、１９１５年、Ｂｒ１Ｌ　Ｍｅｄ、１．２：　１２９ 〜１３６　）およびダーキンス（０１ｋｉｎ’　ｌ）溶液（Ｄｉｋｉｎ　、　１ ９１５年、Ｂｒ１（Ｍｅｄ、Ｊ、　２：　３１８〜３２０　）のような製剤が最 初に好まれた石炭酸およびヨウ素防腐剤に取って代わった。

アレキサングー　フレミングの１９１９年の「膿創における化学的および生理的 防腐剤の作用」と題したハンタリアン（Ｈｕｎｔｅ山ｎ）講義は今日まで関係の ある消毒法の主題の優れた解説を提供している。フレミングは創傷の治療に関し て２つの考え方の流儀を記載した：　（１）ｒ感染に対する身体の自然防護能力 を助ける努力」に向けた生理学的流儀、および（２）化学剤によって創傷微生物 を殺害する努力に向けた防腐的流儀。

生理学的流儀は、感染に対して最も大きい防護が生理学的能力　（１）血液およ び体液防護メカニズム並びに（２）食細胞白血球を助けることによって得られる と主張している。白血球は壁に集まりそして創傷の空洞に移り、最終的には膿の 細胞要素を形成することが知られていた。フレミングは「新鮮な膿」の食細胞白 血球は有効な抗微生物効果を発揮するが、「新鮮でない膿」　（即ち、非開放フ ルンケルのｌ並びに加熱処理または防腐剤処理した「新鮮な膿」は微生物殺害能 力を欠いていることに言及した。

ることである。「消毒は、反応剤が細菌に対してだけでなく細菌が見い出される 媒体に対しても作用する化学反応である。Ｊ　（Ｄｘｋｉｎ　、　１９１５年、 Ｂａ１ｔ、　Ｍｅｄ、Ｊ。

２・８０９〜８１Ｏ）。　防腐剤溶液は生物を水性媒体中に懸濁するときに最大 の微生物殺害をもたらすが、殺菌作用は血清液または血液中に存在する有機物と の競合反応によって非常に低下する。

防腐剤は、通常の免疫生理学的防禦メカニズムと非特異的に反応しそしてそれを 阻害する。殺菌濃度の防腐剤は食細胞白血球の抗微生物機能を阻害する。「白血 球は細菌よりも化学的防腐剤の作用に対して一層感受性が高く、そしてこれを考 慮すると、これら防腐剤のいずれも、先ず組織それ自体を破壊することなくして は、組織中に浸透して細菌を殺害する力を有していないように思われる。膿の自 然防腐能力は一掃されるが、微生物は完全には破壊されず、そして残っている微 生物は新たな膿細胞が移動してきて微生物を抑止できるときまで阻止されること なく増殖可能である。防腐剤の殺白血球能力を考えると、成る種の防腐剤は創傷 の洗浄に適当であるが他の防腐剤は適当でないことを我々に示している。それ故 、我々が創傷を洗浄するために防腐剤溶液を所望する場合、我々はその抗白血球 能力を急速に失いそしてその防腐作用を非常に迅速に発揮する防腐剤を選択すべ きである。そうすると、我々は創傷にあまり損傷を与えることなく該液体の洗浄 効果を有することになる。ニーゾルおよびダーキンス溶液の１つの大きな利点は それらが２．３分で活性の化学剤としては消滅しそして白血球に対して持続的な 悪い影響を何も有していないことである（Ｆｌｅｍｉｎｇ　ｓ　１９１９年）。

作用メカニズム： 初期の研究者の多くは次亜塩素酸塩の殺微生物作用は次亜塩素酸の自己プロドロ シス生成物として遊離する発生期酸素に依存しており、そして遊離した酸素は細 胞原形賀中の不飽和成分と結合して殺害を行うと考えていた。この見解は今世紀 の初めにダーキンによって正当性を疑われた。「次亜塩素酸の防腐作用が酸素の 遊離によるものであることは繰返し述べられてきた。私はこの陳述を支持する証 拠を何も見い出すことができなかった。」彼は続けて更に直接的な塩素化メカニ ズムを提案した。「次亜塩素酸および次亜塩素酸塩が細菌または他の起源の有機 物に作用するとき、タンパク質の（Ｎ　Ｈ）基の幾つかが（ＮＣＩ）基に変換さ れるように思われる。」このようにして形成されクロラミン−■の群に属する生 成物が元の次亜塩素酸塩と殆ど同じ防腐作用を有していると考えらね、そして次 亜塩素酸塩の防腐作用は、酸素の遊離を伴う分解によるよりはむしろこれらクロ ラミンの形成によって調節される可能性が多いように思われるＪ　（Ｄｘｋｉｎ 　、　１９１５年）。更に、「塩素以外の供給源からの酸素は、当量の発生期酸 素を生成するのに理論的に必要な量の塩素と同程度には容易に細菌を殺害しない 」ことが知られていた（ＭｅｒｃｅｒおよびＳｏｍｅ＋ｔ、　１．９５７年、Ａ ｄｖ、　Ｆｏｏｄ、Ｒｅｓ、　７：　１２９〜１６０　）。

現在まで持続している、塩素の直接的殺微生物作用に関するダーキンの見解も問 題が多い。「塩素の殺菌作用を説明するために提唱された他の仮説に対しても実 験的根拠がない。これら仮説は、細菌のタンパク質が塩素によって沈殿し、細胞 膜が塩素によって変化して細胞内容物の拡散を可能にし、そして細胞膜が塩素に よって機械的に崩壊するとの示唆を含んでいるＪ　（Ｍｅ＋ｃｅ＋およびＳｏｍ ｅｔｔ、　１９５７年）。細菌と塩素の結合はｐＨ５，５では顕著に低く、そし てｐＨを８．２まで上げることによって２倍になる（Ｆｒｉｂｅ＋ｇ　ｓ　１９ ５６年、Ａｃｊａ　ｌ’ａ＋ｈｏ１．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　５ｃａｎｄ、３ ８：　１３５〜１４４）。他方、次亜塩素酸塩の殺菌および殺ウイルス能力は酸 性、即ちｐＨの低下によって上昇する（ＢｕＨｅｒｌｉｅｌｄ等、１９４３年、 Ｐｎｂｌ、　Ｈｅａｌｔｈ　Ｒｅｐｏ＋ｔｓ　５８：　１８３７〜１８６６：　 Ｆｒ１ｂｅ＋ｇおよびＩｌａｍｍａｒｓ＋＋ｏｍ　ｓ　１９５６年、Ａｃｊａ　 Ｐａｊｈｏｌ、　Ｍ奄■ ｒｏｂｉｏｌ、５ｃａｎｄ、３８：　１２７〜１３４１゜このため、塩素の結合 は塩素依存性の殺害と反比例する。

有機クロラミン製剤、例えばクロラミン−Ｔも防腐剤として役立つが、逆説的に 言えば、これらクロラミンの殺微生物作用（ｍｉｃ＋ｏｂｉｃｉｄａｌ　ａｃｔ ｉｏｎ　）は全てまたは大部分、クロラミンの加水分解で形成される次亜塩素酸 に起因すると結論される（Ｌｅｅｃｈ　ｓ　１９２３年、Ｊ、　Ａｍ　Ｐｈｕｌ ＬＡｓｓｏｃ、１２：　５９２〜６０２１゜　クロラミンの殺菌作用（ｂｉｃ＋ ｅ＋１ｃｉｄｘｌ　ａｃｔｉｏｎ　）は［全てまたは部分的に、加水分解および イオン化平衡に従って形成される次亜塩素酸によるものと思われるＪ　（Ｍａ山 等、１９４５年、Ｊ、１ａｃｔｅｒｉｏ１．　４９：　２９９〜３０５）。　ク ロラミンのより緩慢な加水分解によってもたらされるより大きい安定性が殺菌作 用を緩慢にする。

次亜塩素酸塩は０．２から２．０ｐｐｍの濃度（即ち、１ｍｌ当たり４から４０ ｎｍｏｌ　）で殺菌作用を発揮する。このような「痕跡量」の濃度による高い能 力は、殺微生物作用が１つまたは複数の必須酵素の阻害に起因することを強く示 唆している（Ｇｒｅｅｎ　、　１９４１年、＾ｄｖ、Ｅ＋＋！ｙｍｏ１．　Ｉ： 　１７７〜１９８）。次亜塩素酸は種々のスルフヒドリル酵素を阻害しそしてグ ルコース代謝の阻害は細菌の殺害と比例するという証拠が提示されている（Ｋｎ ｏｘ等、１９４８年、１．Ｂａｃ＋ｅｒｉｏ１．　５５：　４５１〜４５８）。

Ｈ２Ｏ２の作用メカニズムに関する文献は幾らか不完全である。しかし乍ら、全 体的に一致していることは「■（２ｏ２はその高い酸化−還元能にも拘わらず分 子酸素と同様に緩慢な酸化剤であり、そして事実、この物質に起因する多数の酸 化は、注意深く検討すると、触媒量のＦｅ＋＋またはＣｕ　の付加によって生じ る遊離基の形成によるものであることが見い出されている」ということである（ Ｃ＋＋ｓｍａｎ−Ｂｔｒｒｏｎ等、１９５２年、＾ｒｃｈ、　ＢｉｏｃｈｅＩＬ Ｂｉｏｐｂｙｔ、４１：　１８８〜２０２）。この見解は幾つかの研究の一致す る結論を表わしている（Ｙｏｓｈｐｅ−ＰｕｒｅｒおよびＥ７１ａｎ、　１９６ ８年、Ｈｅｔｌｊｈ　Ｌａｂ、　Ｓｃｉ、５：　２３３〜２３８；　Ｍｉｌｌｅ ｒ、　１９６９年、Ｉ、　Ｂａｃｊｅ＋ｉｏ戟B ９８：　９４９〜９５５）。

種々の染料も防腐剤として使用されてきた。光力学作用は、染料（’Ｄｙｅｌ、 即ち、−重積（＋ｉｎｇｌｅ＋　）増感剤分子が光子を吸収しそしてその一重項 励起状態（’Ｄｙｅ’　）になるように促進されるときに生じる。ＩＤＹ−力恍 子を放出して’　Ｄ７ｅの基底状態に戻る場合、蛍光現象力呪力学作用なしに観 察される。光力学的増感剤として使用するためには、１ＤＹ−は項間交差（ＩＳ Ｃ）を行って、即ちスピン多重度が変化して染料の準安定的な三重積励起状態（ ３ＤＹ？）を比較的高い量子収量で生じさせなければならない（Ｇｏｌｌｎｉｃ ｋ、　１９６８年、Ａｄｖｍｎ、　Ｐｈｏｔ。

ｃｈｅａ　６：　Ｉ〜１２２）。

１　＊ ’Ｄ７ｅ　−−−ｈシー＞　Ｄ７ｅ−ＩＳＣ−＞　３Ｄ７ｅ”　（１）増感剤は 近紫外部から、近赤外部を含めて可視部全体までの範囲の光を吸収する。

この吸収が「染料」の色特性の原因である。染料の励起に必要な光の波長（即ち 、光子のエネルギー）は染料の吸収スペクトルによって特定される。

３ＤＹ−状態は比較的寿命が長いので、その状態で他の分子と反応することがで きる。光力半反応は３Ｄ７ｅ’の活性に依存し、て２つの主要なりラスに分ける ことができる（ＳｃｈｅｎｃｋおよびＫｏｃｈ、　１９６０年、２．　Ｅｌｅｃ ｊｔｏｅｈｅｌ　６４：　１７０〜１７７）。

タイプ１の反応では、励起された三重積（ｔｒｉｐｌｅ＋　）増感剤はもう１つ の分子による直接的な酸化還元転移を受ける。タイプ１の反応の増感剤は典型的 には容易に酸化されるかまたは還元される。

３Ｄ１ｅ’　＋　’５ｕｂＨ−＞　Ｄ７ｅ　＋　２Ｓｕｂ・（２）式（２）にお いて、三重積増感剤は１価の酸化剤として作用し、そしてその二重項状態（Ｉ） ｒｅ）に還元さへそして一重項基質（’５ｕｂＨ）は二重類（ｄｏｕｂｌｅｔ） の遊離基２Ｓｏｂ・状態に酸化される。同様な様式で、還元性の３Ｄ！−をラジ カル還元剤として作用させることができる。反応（２）の生成物２Ｄ７ｅは基底 状態の０２、二重類ジラジカル分子（３０２）と反応させて二重類のヒドロジ第 キシル酸ラジカル（・０２Ｈ）またはその抱合体塩基である過酸化アニオン（・ ０□　）を生成させ、そして−重積基底状態の染料を発生させることができる ２　３　ｌ　２ Ｄ７ｅ＋　０２−−−＞　Ｄ７ｅ＋　・０２　Ｈ（または２・０２−）　（３） 中性から酸性条件下では、酸素還元によるこれら生成物は二重項−二重積（即ち 、ラジカル−ラジカル）が消滅してＨ２Ｏ２が生成される：２−０２Ｈ＋−０２ ＋Ｈ−）　’Ｈ２Ｏ２＋　’０２（４）２　−　＋ 該反応が直接的な消滅によるものである場合、スピン恒存は維持されるので、こ のことにより一重項分子酸素（１０２）を生成させることもできる（にｈａｎ、 １９７０年、５ｃｉｅｎｃｅ　１６８：　４７６〜４７７）。

移動を伴い、生成物として基底状態の’Ｄ７ｅおよび一重項分子酸素（１ｏ　） を生成する（Ｋａｕｊ中、１９３９年、Ｔ「ａｎｓ、Ｆａ＋ａｄＢ　Ｓａｃ、３ ５：　２１６〜２１９　）　：３Ｄ７ｅ”　＋　３０２−’Ｄ７ｅＯ２−＞　’ Ｄ７ｅ＋　’０２　（５）反応（５）は非常に迅速でありそして最も普通のタイ プＩＩの経路である。しかし乍、３本 り、　Ｄ７ｅ　が十分に還元性である場合、０２への直接的な１価電子の移動が 生起することがある： ３Ｄ１ｅ”　＋　３０２−’Ｄ７ｅＯ２−＞　２Ｄ７ｅ”　＋　２・０２−　（ ５）ラジカルの消滅によって反応（４）で記載したようにＨ２０２を生成するよ うに進むことができる。これらの反応経路を考慮して、反応（５）の方が反応（ ６）より２桁以上好ましいと考えられる（ＫｌｓｃｈｅおよびＬｉｎｄｑｗｉｓ ｔ　、１９６５年、ＰｈｏｔｏＣｈｅｔＰｈｏｌｏｂｉｏｌ、Ｌ　９２３〜９３ ３）。

染料による微生物の殺害は３Ｄ！を自体またはそのタイプＩおよびタイプＩＩの 反応生成物、即ち　・０２　、Ｈ２Ｏ２、そして特にｌＯ２ど微生物のタンパク 質、核酸、不飽和脂肪等との反応に起因するものであろう（Ｓｐｉｋｅｓおよび Ｌｉｖｉｉ（ｔｔｏｎ、１９６９４ｊ、Ａｄｗ、Ｒｘｄ、Ｂｉｏｌ、３：　２９ 　〜１２１）。

範囲の広い電子酸化剤、１０　は触媒活性に必須のアミノ酸を破壊することによ って酵素を阻害することができる。　０２とトリプトファン、ヒスチジンおよび メチオニンとの反応の速度定数（ｋ、Ｍ−１秒−１）は２’　＋０７から９’　 １０７「 までの範囲である（Ｍ＊ｔｈｅｓｏｏおよびＬｅｅ　％　１９７９年、Ｐｈｏｊ ｏｃｈｅｉ　Ｐｈｏｊｏｂｉｏｌ、　２９：８７９〜８８１；　Ｋ＋５ｌｉｉｃ および５ｈｕｐｘｊＴｉ　％　１９７８年、ＰｈｏｊｏｃｈｅＩＬＰｈｏｊｏｂ ｉｏｌ、　２８；５８３〜５８６）。標的微生物に極めて近接して発生する場合 、「痕跡」量の　０２で微生物の代謝に必要な酵素を有効に阻害することができ よう。不飽和脂肪、核酸および他の電子稠密な生物学的分子も１０２と反応性で ある。このような必須の細胞成分の二原子酸素付加も殺微生物作用で役割を果た すことがあろう。

継続している問題点： 以下の本質的な問題点を上記材料から引き出すことができる。第１に、能力の高 い化学的防腐剤は典型的には酸化剤、例えばＨＯＣＩである。これらの酸化剤や 酸素付加剤は「痕跡」量で殺微生物作用を有し、そして多分代謝に必須の酵素を 阻害することによってそれらの効果を発揮する（Ｇｒｅｅｎ　、　１９４１年） 。

第２に、このような防腐剤の抗微生物能力はそれらの非特異的な反応性により損 なわれる。損傷は標的微生物に限定されない。フレミングが指摘したように、一 般的に宿主細胞は防腐剤の毒性作用に対して微生物より感受性が高い。

理想的な防腐剤は、宿主細胞には最小の毒性しか有さないで、真菌を含む広範囲 の病原性微生物に対して有効な反応性を発揮するであろう。創傷の治療に関する 生理学的流儀の原則を維持すると、防腐剤は感染に対する身体の自然防禦能力を 助けるかまたは増大させるであろう。

範囲は限定されるが、これらの要件は成る種の抗生物質によって充足される。

抗生物質の選択的殺菌作用は、タンパク質合成、核酸複製および細胞壁の存在ま たはその組成に関して原核生物細胞と真核生物細胞間の差異に基づいている。抗 生物質は、事実上、宿主の真核細胞には毒性でなく、成る種の細菌、即ち原核生 物に選択的に毒性である。しかし乍ら、抗生物質の広範囲な作用は宿主の正常叢 証常フローラ（ｎｏｒｍａｌ　＋ｌｏ＋ｘ）］を形成する細菌に対して有害な影 響を有することがある。正常叢の細菌は病原性生物の増殖に対して障壁として作 用し、そしてこのため、抗生物質による正常叢の破壊はより多くの病原性細菌が 増殖する機会を提供する。抗生物質に関連した偽膜性大腸炎は、抗生物質による 正常叢を破壊した後の、病原体、即ち、クロストリジウム　ジフィシレおよびま れには黄色ブドウ球菌の増殖過剰によってもたらされる。

更に、酵母および真菌は真核微生物であり、そしてこのため、本質的に抗生物質 によって影響を受けない。従って、酵母の増殖過剰および感染は細菌感染の抗生 物質治療によることがある。

抗生物質はまた直接的な毒性の影響を示すことがある。これらの有害な影響は宿 主細胞および組織に対する医薬品の直接的作用、例えば抗生物質の腎毒性から生 じることがある。

前述のことから容易に明らかであるように、広範囲の病原性微生物に対して反応 性を有するが宿主細胞および正常叢には最小の活性しか示さない新規で改良され た防腐剤が長い間待望されている。

発明の要約 ハロパーオキシダーゼを使用して、標的微生物の環境下で、標的微生物と選択的 に結合させ、そして過酸化物およびハライドの存在下で、望ましい微生物を消失 させないでまたは宿主細胞のような他の媒体成分を顕著には損傷させないで、標 的微生物の増殖を阻害できることが今発見された。ハロパーオキシダーゼの新た に発見された選択的結合特性により、病原性微生物のような標的微生物が正常叢 のメンバーのような望ましい微生物よりハロパーオキシダーゼに対して大きい結 合能力を有するとき、標的微生物はハロパーオキシダーゼと選択的に結合するが 望ましい微生物はハロパーオキシダーゼと殆どまたは全く結合しない。過酸化物 およびハライドの存在下で、ハロパーオキシダーゼと結合した標的はハライドの 酸化を触媒しそして標的微生物の表面で一重項分子酸素への過酸化物の不均化を 促進して、標的細胞の選択的な殺害を生じさせるが、望ましい微生物または生理 学的媒体に対する付随的な損傷は最小である。

ハロパーオキシダーゼ結合の選択的な性賀は、本発明の方法や組成物を使用して 細菌または真菌感染と闘う際に正常叢または宿主細胞をあまり傷つけることなく 非常に有効であるように設計できるので、ヒトまたは動物対象の治療的または予 防的防腐剤治療において本発明の方法および組成物を非常に有用にしている。

本発明の方法および組成物で使用するのに適切なハロパーオキシダーゼにはミニ ロバ−オキシダーゼ（ＭＰＯ）、　好酸性パーオキシダーゼ（ＥＰＯ）、　ラク トパーオキシダーゼ（Ｌ　Ｐ　Ｏ）およびクロロパーオキシダーゼ（ＣＰ　Ｏ） が合図１は、本発明の一重項分子酸素（ＩＯ２）経路およびハロゲン化−過酸化 償質上の一重項分子酸素）経路による微生物殺害を示す概略図である。

図２は、ミニロバ−オキシダーゼ（ＭＰＯ）によるジチオナイト還元マイナス酸 化（Ｒ−０）差異スペクトルである。

図３は、好酸性パーオキシダーゼ（ＥＰＯ）によるジチオナイト還元マイナス酸 化（Ｒ−０）差異スペクトルである。

図４は、ミニロバ−オキシダーゼ（ＭＰＯ）に暴露する前（スペクトルＡ）およ び後（スペクトルＢ）の黄色ブドウ球菌によるジチオナイト還元マイナス酸化（ Ｒ−０）差異スペクトルを示す。

図５は、細菌に暴露しそして遠心して細菌を除去した後の溶液（遊離ＭＰＯ）中 に残っているＭＰＯによるジチオナイトＲ−０差異スペクトルを示す。

図６Ａは、ＭＰＯ依存依存性ルミノール酸化用使用ＭＰＯ濃度から得られる、２ ０秒当たりメガ光子で表わした化学発光（ＣＬ）のプロットである。図６Ｂは、 図６Ａに示したデータの範囲を限定した再プロットであり、その際Ｘとｙ軸は図 ６Ａと逆になっている。

図７は、実施例６に詳細に記載されているＭＰＯの結合データのプロットを示す 。図７Ａは、微生物黄色ブドウ球菌（図７の“＊”で示される）および連鎖法菌 種（ビリダンス、図７の“０”で示される）の別個のインキュベーションに関す る反応容量（１＋ｌ）当たりピコモルで表わした結合対遊離ＭＰＯのプロットで ある。図７Ｂは、図７Ａのデータを微生物当たりキロ分子（１０３個の分子）で 表わしたＭＰＯ濃度のプロットである。図７０は、図７Ｂのデータのスキャッチ ャードプロットであり、その際結合対遊離ＭＰＯの比は黄色ブドウ球菌懸濁液（ “＊”で示される）または連鎖法菌種（ビリダンス）懸濁液（０”で示される） の１ｍ１反応容量中の微生物当たりのキロ分子として表わした結合ＭＰＯに対し てプロットしている。

図８は、実施例７に詳細に記載されているＣＰｏの結合データのプロットを示す 。図８Ａは、微生物当たりのキロ分子（１０”個の分子）で表わした結合対遊離 ＣＰＯのプロットである。図８Ｂは、図８Ａのデータのスキャッチャードプロッ トであり、その際結合対遊離ＣＰＯの比は黄色ブドウ球菌懸濁液（“＊”で示さ れる）または連鎖法菌種（ビリダンス）懸濁液（“０″で示される）の１ｍ１反 応容量中の微生物当たりのキロ分子として表わした結合ＣＰＯに対してプロット している。

図９は、実施例８に詳細に記載されているＥＰＯの結合データのプロットを示す 。図９Ａは、微生物当たりのキロ分子（１０３個の分子）で表わした結合対遊離 ＣＰＯのプロットである。図９Ｂは、図９Ａのデータのスキャッチャードプロッ トであり、その際結合対遊離ＥＰＯの比は黄色ブドウ球菌懸濁液（“＊”で示さ れる）または連鎖法菌種（ビリダンス）懸濁液（“０”で示される）の１ｍ１反 応容量中の微生物当たりのキロ分子として表わした結合ＥＰＯに対してプロット している。

図１０は、実施例８に詳細に記載されているＬＰＯの結合データのプロットを示 す。図１ＯＡは、微生物当たりのキロ分子（１０３個の分子）で表わした結合対 遊離ＬＰＯのプロットである。図１０Ｂは、図１０Ａのデータのスキャッチャー ドプロットであり、その際結合対遊離ＬＰＯの比は黄色ブドウ球菌懸濁液（“＊ ”で示される）または連鎖法菌種（ビリダンス）懸濁液（“０”で示される）の １ｍ１反応容量中の微生物当たりのキロ分子として表わした結合ＬＰＯに対して プロ本願発明は、標的微生物に選択的に結合して殺害するためにハロパーオキシ ダーゼを使用する方法および組成物に広範に向けられているものであり、その際 標的微生物環境下で望ましい微生物は消失させないかまたは宿主細胞のような媒 体成分は殆ど損傷させない。

１つ、の特に好ましい実施態様では、本願方法および組成物は防腐剤として使用 される。真菌を含む広範囲の病原性微生物に対する有効な反応性および宿主細胞 に対する最小の毒性に加えて、理想的な防腐剤は宿主生物の正常叢も選択的に保 持しなければならない。１つの特徴において、本願発明は、病原性微生物に選択 的な親和性を有する二原子酸素付加酵素系の使用に基づく防腐剤系を提供する。

本発明の防腐剤系は化学的防腐剤能を有しているが、関連した宿主組織を破壊ま たは正常叢を崩壊させない；即ち、防腐作用は選択的でありそして標的微生物に 限定される。本発明は理想的な防腐剤系に関して上記した基準を充足するもので ある。

酸化剤および酸素付加剤の発生： ミニロバ−オキシダーゼ（ＭＰＯ）や好酸性パーオキシダーゼ（Ｅ　Ｐ　Ｏ）の ようなハロパーオキシダーゼ（ＸＰＯｓ）は、適当なハライド補因子（Ｘ−）お よびＨ２Ｏ２が基質として与えられるとき、天然系で殺微生物活性を示すことが 知られている（Ｋｌｅｂｘｎｏｆｆ、１９６８年、１．　Ｂａｃｊｅ＋ｉｏ１． 　９５＋　２１３１〜２１３８）　ｏ　しかし乍ら、ハロパーオキシダーゼ結合 の選択的性質並びに治療、研究および産業的適用におけるこれらの系の有用性は これまで認識されていなかった。

第じ３丈： ＸＰＯが触媒する反応の第１次段階はＨ２０２によるＸ−の酸化に係わるもので ある： ＨＯ＋Ｘ　＋Ｈ−（ＸＰＯＩ−−−＞　ＨＯＸ＋Ｈ２０（７）この反応はネルン スチアン（Ｎｅ＋ｎｒｔｉａｎ　）の関係式として最も良く理解されている： 式中、Ｅは観測された電位（ボルト）であり、Ｅｏは標準電位（ボルト）であり 、Ｒは気体定数であり、Ｔは絶対温度であり、ｎは移動したダラム当量当たりの 電子数であり、Ｆはファラデーであり、１ｎは還元反応剤対酸化反応剤（［（ｌ ｊ　／［還え）の濃度比の自然対数であり、そしてＩｎ［Ｉｌ］はプロトン（水 素イオン）濃度の自然対数である。式（７）で記載される反応は２つの別個の半 分ずつの反応　Ｈ２Ｏ２からＨ２Ｏへの還元、 およびＸ−からＨＯＸへの酸化、 と考えることができる。

ＨＯでＸ−を酸化するために組合わされた反応は正味の電位△Ｅ１即ちによって 行われる。熱力学的には、電位の正味の変化は反応の自由エネルギーの変化（△ Ｇ）として記載することができる：自由エネルギーの変化は下記式による電位の 変化に関係がある：ΔＧ＝　−ｎＦ　△Ｅ　（１３１ 酵素は特定の化学反応の速度を大いに高めることができるが、反応のΔＧには影 響を与えない。酵素は熱力学的に可能な反応の機械論的経路を提供する。本願発 明において、ハロパーオキシダーゼは、Ｈ２Ｏ２を使用してより一層反応性の酸 化剤、即ちハイポハライド（ＨＯＸ）および酸素付加剤、即ち一重項分子酸素（ ’０２）を発生させるメカニズムを提供する。表１のデータは、ノ＼イポノ１ラ イトを生成するハライドのＨ２Ｏ２酸化が熱力学的に好ましい、即ちエネルギー 発生性であることを示している。エネルギー発生性はハロゲンの電気陰性度に反 比例することに注意されたい。

第ａ仮丈 Ｈ２Ｏ２＋　Ｘ７　＋　Ｈ”　−（ＸＰＯヒ＞　Ｈ２Ｏ２＋　ＨＯＸ＋　ａＧ１ ボルト　ボルト　ボルト　ｋａａｌ　ｍｏｌ−１値はＰｏｕｂｔｉｘ、１９６６ 年、水溶液中の電気化学的平衡図表集、Ｐｅ＋ｇｉｍｏｎ　Ｐｒｅｓｓ。

６４４頁のデータから計算した。

第２次反応： よびＫｈ＞ｎ、　１９７０年、Ａｎｎ、　Ｎ、Ｙ、　＾ｃｘｄ、Ｓｃｉ、１７１ ：　５〜２３）；　即ち、この反応の正味の電位は次の関係式で示される：表２ は、Ｈ２Ｏ２によるＨＯＣＩまたはＨＯＢｒの酸化が　０２の発生に十分以上の エネルギー発生性を有することを示している。ＨＯＸがＨｏｔであるとき、反応 は中性付近からアルカリ性ｐＨの範囲においてだけ十分エネルギー発生性である 。

表２ 第２次反応 ＨＯＸ　＋　Ｈ２Ｏ２−＞　Ｈ２Ｏ＋　Ｈ”　＋　Ｘ−＋　１０２＋　ａＧ。

ボルト　ボルト　ボルト　ｋｃａｌ　ｍｏｌ−”この第２次反応における１０２ の発生は２２．６　ｋｃｘｌ　ｍｏｌ−１のエネルギー吸収性である。ΔＧ１の 値は調整したエネルギー発生性を表わす、即ち、ΔＧ２　＋　２２．５６＝　△ Ｇｌである。値はＰｏｕ山ｉ１　（１９６６年）のデータから計算した。

全体の正味の反応、即ち、反応（７）と（１４）の合計：２Ｈ２０，、−（ＸＰ ＯＩ−＞　２Ｈ２０＋　’０２（１６）表３ 正味の反応 ２Ｈ２０２’　２Ｈ２０＋”０２＋ΔＧｎａボルト　ボルト　ボルト　ｋｃａｌ 　ｍｏｌ−１この第２次反応における　０２の発生は２２．６　ｋｃｒｌ　ｍｏ ｌ　のエネルギー吸収性である。ΔＧ　の値は調整したエネルギー発生性を表わ す、即ち、ΔＧ＋２２．５６ｎｌ　１１ ＝　ΔＧ　である。値はＰｅａ山ｉｆ　（１９６６年）のデータから計算した。

ｎ！ ＸＰＯは反応調整に有利な酸化還元非対称を導入することによってＨ２Ｏ２の不 均化を触媒する。Ｘ−のＨ２Ｏ２酸化は温和なエネルギー発生性であり、ＨＯＸ を生成する。Ｈ２Ｏ２によるＨＯＸ酸化は非常にエネルギー発生性であり、１０ 　を生成する。換言すれば、ＣビとＨＯＣＩのＨ２Ｏ２酸化は共に熱力学的に好 ましい。ＸＰＯがミニロバ−オキシダーゼ（ＭＰＯ）であるとき、Ｘ−はＣ１ミ Ｂｒ−であり、そして程度は限定されるが■−であることができる。ＸＰＯが好 酸性パーオキシダーゼ（Ｅ　Ｐ　Ｏ）またはラクトパーオキシダーゼであるとき 、Ｘ−はＢｒ−であり、そして一定の程度でＩ−であることができる。

本発明の１つの特徴は、過酸化物およびハライドの存在下、第１の微生物に選択 的に結合して該微生物の増殖を阻止するのに有効であるが媒体から第２の微生物 を消失させるには有効でない量のハロパーオキシダーゼを媒体中に導入すること によって、媒体から第２の望ましい微生物を消失させることなく媒体中の第１の 標的微生物の増殖を選択的に阻止する方法を提供する。媒体中の標的微生物の増 殖を選択的に阻止する能力は、制御された濃度値の本発明のパーオキシダーゼが 微生物に種々の程度にそして種々の親和性で選択的に結合するという発見に起因 する。標的微生物が、上記で詳細に記載したように、望ましい微生物より大きい ハロパーオキシダーゼ結合能を有するとき、媒体に対してハロパーオキシダーゼ を飽和に満たない量で準備すると、標的微生物の表面へのハロパーオキシダーゼ の選択的結合が生じ、望ましい微生物の表面へのハロパーオキシダーゼの結合は 最小であるかまたは全く生じない。過酸化物とハライドの存在下で、標的と結合 したハロパーオキシダーゼはハライドの酸化を触媒し、そして標的微生物の表面 で過酸化物から一重項分子酸素への不均化を促進する。−重積分子酸素の寿命は 比較的短くそしてその拡散能は比例して限定されるので、これも上記で詳細に記 載したように、標的微生物表面での一重項分子酸素の生成は標的微生物の選択的 殺害を生じさせ、望ましい微生物または媒体の他の生理学的成分の付随的損傷は 最小である。

本発明のもう１つの特徴に従って、本発明のハロパーオキシダーゼは、宿主細胞 に対する付随的損傷が最小で病原性微生物に選択的に結合しそしてそれらを殺害 するために、ヒトまたは動物対象の治療的または予防的処置で防腐剤として使用 することができる。それ故、本発明は更に、過酸化物およびハライドの存在下で 防腐剤的に有効であるが宿主の正常な細胞を顕著に損傷するには無効な量のハロ パーオキシダーゼを宿主に投与することによってヒトまたは動物宿主を治療する 方法を提供する。好ましくは、使用されるハロパーオキシダーゼの性質および量 は宿主の正常叢を消失させるには無効であるように調節される。

本願発明に有用なハロパーオキシダーゼはハライド：過酸化水素の酸化還元酵素 として定義され（例えばｔｈｅ　Ｉｎ＋ｅ＋ｎｘｔｉｏｎａｌ　Ｕｎｉｏｎ　ｏ ｆ　Ｂｉｏｅｈｍｉ＋ｔ＋ｙに基づくＥＣＮｏ、１．１１．１．７およびＥＣＮ ｏ、　１．　Ｉｆ、　１．　ＩＱ）　、その際ハライドは電子供与体または還元 剤でありそして過酸化物は電子受容体または酸化剤である。過酸化水素から一重 項分子酸素のハライド依存性発生を触媒する任意のハロパーオキシダーゼを本願 発明で使用することができる。本願明細書で示されるように、適当なハロパーオ キシダーゼにはミニロバ−オキシダーゼ（ＭＰＯ）、好酸性パーオキシダーゼ（ ＥＰＯ）、　ラクトパーオキシダーゼ（ＬＰＯ）、　クロロパーオキシダーゼ（ ＣＰ　Ｏ）およびそれらの誘導体が含まね、現在好ましいハロパーオキシダーゼ はミニロバ−オキシダーゼおよび好酸性パーオキシダーゼである。本願明細書で 使用される「それらの誘導体」は一般的に、化学的にまたは機能的に修正したＭ ＰＯｌＥＰＯｌＣＰＯおよびＬＰＯを意味し、これらは本願明細書で記載するよ うに、標的微生物または特定の真核細胞タイプに特異的に結合できそして過酸化 物の不均化を高めるハロパーオキシダーゼ活性を保持して適当なハライドの存在 下で一重項分子酸素を形成する。有用な誘導体の例には、標的微生物または癌細 胞のような標的細胞の表面で抗原、受容体部位または他の顕著な特徴を特異的に 認識しそしてそれらに選択的に結合できる抗体、抗体フラグメント、レクチンま たは他の標的部分と抱合しているハロパーオキシダーゼが含まれる。誘導体化さ れていないＣＰＯおよびＬＰＯの微生物結合が比較的非特異的であるため、これ らのハロパーオキシダーゼは好ましくは、標的微生物との結合特異性および／ま たは親和性を高めるように誘導した後に本発明の実施に使用する。

本発明のハロパーオキシダーゼ組成物の防腐剤活性は、上記したように、ハイポ ハライドを形成させる過酸化物とハライドの反応および一重項分子酸素を形成さ せる過酸化物とハイポハライドの反応に係わっているので、本発明の組成物の活 性は感染部位での適当な過酸化物とハライドの存在に依存している。成る状況下 では、過酸化物（例えば、過酸化水素）は、例えば、天然に生起する叢の活性に より感染部位に存在することがあり、そして十分な量の塩化物が生理学的環境中 に存在することがあり変換反応の補因子として作用する。これらの状況下では、 治療される対象に過酸化物またはハライドを追加して投与する必要はない。他の 状況下では、過酸化水素および／またはハライドを感染部位に追加的に提供する 必要があると思われる。従って、本発明の組成物は更に、所望の場合、過酸化物 またはインビボ（ｉｎ　ｖｉマ０）で過酸化物を生成できる物質およびハライド からなることができる。

本発明の方法および組成物に有用な過酸化物には式：（式中、Ｒは水素または１ から３個の炭素原子を有する短鎖アルキル基である）の過酸化水素およびアルキ ルヒドロパーオキサイドが含まれる。酸化剤活性は一般的に、Ｒ鎖の長さが増す につれて低下し、それは次のとおりである：Ｒ＝Ｈ＞＞　ＣＨａ　）　ＣＨ３Ｃ Ｈ２＞　ＣＨ３（ＣＨ２）　２本発明の組成物で使用するのに現在好ましい過酸 化物は過酸化水素である。過酸化水素はまた、インビボで過酸化水素を生成でき る物質を防腐剤組成物に含めることによって感染部位で利用可能にすることもて きる。この目的で特に有用な物質には、例えばグルコースオキシダーゼやガラク トースオキシダーゼのようなオキシダーゼが含まれる。

過酸化水素を本発明組成物に直接食めるとき、使用される量は好ましくは、最大 の防腐剤活性を提供するがヒトまたは動物対象の細胞および組織の損傷は最小と するように設計される。従って、局所的または口内投与用の液体組成物に含める とき、本発明組成物は１ｍｌの液体組成物当たり約１　ｎｌｌ１ｏｌから約１０ μｍａｔまでの過酸化水素、更に好ましくは１ｍｌの液体組成物当たり約５ｎｍ ｏｌから約５μｍＯ１までの過酸化水素、そして最も好ましくは１ｍｌの液体組 成物当たり約１０ｎｍｏｌから約１μｍｏｌまでの過酸化水素からなることがで きる。インビボで過酸化水素を生成できる物質、例えばオキシダーゼは感染部位 に存在する過酸化水素の量を力学的に制御するのに特に有用である。このような 物質は組成物の防腐剤活性を最大にし、一方治療すべき対象の組織の損傷は最小 にする。従って、使用すべきこのような物質の量は該物質の性質および望まれる 治療効果に非常に依存するが、微生物感染の部位で利用可能なハライドのタイプ および濃度に依存して、好ましくは１分当たり液体１ｍｌ当たり約１ｐｍｏｌか ら約ＩＱＱ　ｎｍｏｌまでの一定状態値をもたらし得る量である。

本発明の方法および組成物に使用するのに好適なハライドは臭化物または塩化物 であることができる。特定の適用で使用されるハライドの使用、選択および量は 種々の因子、例えば防腐剤組成物に使用されるハロパーオキシダーゼ、所望の治 療効果、過酸化物の利用可能性および他の因子に依存する。ハロパーオキシダー ゼがＭＰＯまたはＣＰＯであるとき、ハライドは臭化物または塩化物であること ができる。塩化物は殆どの生理学的媒体中にハライド補因子として制限がないほ ど十分な値で存在しているので、塩化物の外部供給源は一般的には必要でなく、 その結果使用するのに現在量も好ましいハライドは塩化物である。塩化物の外部 供給源を所望する場合、使用される塩化物の量は、生理学的条件に近づけるため 、好ましくは溶液１ｍｌ当たり約１０μｍｏｌの塩化物から約１５０μｍｏｆの 塩化物までの範囲内である。ハロパーオキシダーゼがＥＰＯまたはＬＰＯである とき、塩化物は補因子として比較的無効であり、従って好ましくいライドは臭化 物である。局所または口内投与用の液体組成物中に含めるとき、本発明の組成物 は液体組成物］、ｍｌ当たり約１ｎｍｏｌから約２０μｍｏｌまでの臭化物、更 に好ましくは液体組成物１ｍｌ当たり約１０ｎｍｏｌから約１０μｍｏｌまでの 臭化物、最も好ましくは液体組成物１ａ＋ｌ当たり約１００　ｎｍｏｌから約１ μｍｏｌまでの臭化物からなることができる。本発明の全身送達用の液体組成物 および他の投与形態の組成物は好ましくは実質的に当量のハライドを治療すべぎ 微生物感染部位に提供する。

下記の実施例１０に詳細に記載するように、ハライド対過酸化物の比は前動な殺 微生物環境の形成における重要な考慮事項である。従って、上記したように微生 物攻撃位置でのハライドと過酸化物の有効値を確保することに加えて、最適な殺 微生物活性をもたらすハライド：過酸化物比で本発明の方法を実施することが好 ましい。例えば、ハロパーオキシダーゼがＭＰＯでありそしてハライドが０１− であるとき、ＣＩ一対過酸化物の比は殺微生物活性の環境下で好ましくは約１か ら約４０．０００まで、更に好ましくは約５０から約４０．０００まで、そして 最も好ましくは約２００から約４０．０００までの範囲内に維持する。ハライド がＢｒ−であるとき、Ｂｒ一対過酸化物の比は殺微生物活性の環境下で好ましく は約０１から約４゜０００まで、更に好ましくは約０．５から約２，０００まで 、そして最も好ましくは約１から約１．０００までの範囲内に維持する。

防腐剤適用で使用するとき、本発明の方法および組成物は、好ましくは正常叢へ の損傷が最小で、病原性微生物による広範囲の感染を治療するために使用するこ とができる。本願明細書て使用するとき、「病原性微生物」は宿主中に通常存在 していないかまたは宿主中に病原的程度にまで過剰に集まった病原性細菌または 真菌を含むように意図されている。宿主の病原体感染を生じさせる微生物は良く 知られている（Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　Ｐｒａｃｔｉｃｅ　ｏｆ　Ｉｎ １ｅｃｔｉｏａ＋　Ｄｉｓｅａｓｅｓ、第３版１１９９０年、Ｇ、　Ｍａｎｄｅ ｌ１等編、Ｃｈｕ＋ｃｈｉｌｌ　Ｌｉｖｉｎｇｓｌｏｎｅ　Ｉｎｃ、、　ニュー ヨー・り参照）。

かくして、本発明の方法および組成物は、感染部位に本発明の組成物を送達でき るようにする任意の条件と関連させて病原性微生物による感染治療または予防に 使用することができ、これらには表面若しくは外科的創傷、火傷または他の顕著 な表皮障害、例えば中毒性表皮壊死、膀胱炎および尿道炎のような尿路感染、外 陰部膣炎および子宮頸管炎のような膣炎、歯肉炎、外耳炎、アクネ、外部真菌感 染、上気道感染、胃腸管感染、亜急性細菌性心内膜炎並びに他の細菌若しくは真 菌感染の治療が含まれるがこれらに限定されず、これら感染に対して本発明の組 成物を効果的に送達することができる。本発明を実施して選択的に殺すことがで きる代表的な病原性微生物には化膿性連鎖球菌、ストレプトコッカス　アガラク チェ、黄色ブドー球菌、緑膿菌、大腸菌および他の大腸菌型細菌、カンジダ　ア ルビカンス、並びに他の感染性細菌および真菌が含まれるがこれらに限定されな い。微生物感染の治療に使用される特定のハロパーオキシダーゼは好ましくは治 療すべき病原性微生物の結合特性に基づいて選択される。一般的に、病原性微生 物が細菌であるとき、好ましいハロパーオキシダーゼはしばしばミニロバ−オキ シダーゼである。以下で更に説明されるように、カンジダ　アルビカンスおよび 他の真菌に対しては好酸性パーオキシダーゼの親和性がより大きいため、通常は ＥＰＯがこれら微生物による感染の治療に好ましいハロパーオキシダーゼであろ う。

本願明細書て使用するとき、用語［正常叢証常フローラ（ｎｏｒｍａｌ　ｆｌｏ ｒａ）］　Ｊは健康な宿主の体表面中または上に共生値で通常存在する細菌を意 味する。正常叢には、例えばヒト対象の口、腸または膣内細菌の乳酸系統群、例 えば口内の連鎖球菌（ビリダンス）並びに母乳栄養乳児の腸、外生殖器、前尿道 および膣内の乳酸桿菌種（例えば、チシアー桿菌およびデーデルライン桿菌）が 含まれる。宿主の正常叢を構成する微生物は良く知られている（例えば、上述の Ｐ＋ｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　Ｐｒａｃｔｉｃｅ　ｏｆ　Ｉｎ［＋ｃｔｉｏｕ＋ 　Ｄｌｓｅａｓｅｓ　、ニューヨーク、３４〜３６および１６１頁参照）。本発 明のハロパーオキシダーゼは正常叢に優先して多くの病原性細菌および真菌と選 択的に結合することが見い出されている。宿主は好ましくは、宿主の正常叢を消 失させるには無効な量のハロパーオキシダーゼで治療される。正常な叢集団が病 原性微生物の過剰集団のためかまたは他の理由により抑圧されているような成る 種の状況下では、正常叢の増殖を更に刺激することが望ましいことがある。

従って、本発明の実施に関連して宿主の正常叢の再転移増殖を促進するのに有効 な量の正常叢を用いて宿主を更に治療することができる。

本発明の防腐剤組成物は一般的には、過酸化物およびハライドの存在下で病原性 微生物の増殖を阻止するのに有効な量のハロパーオキシダーゼと共に製薬的に受 容可能な担体とからなる。担体がハロパーオキシダーゼの選択的結合能力または 酵素活性を顕著に妨げない限り、一般的には任意の製薬的に受容可能な担体を本 目的のために使用することができる。

該防腐剤組成物は任意の効果的な製薬的に受容可能な形態でヒトおよび動物対象 を含む温血動物に、例えば、局所、洗浄法、経口、坐剤、非経口または注入可能 な投与形態で、例えば局所、口内若しくは鼻スプレーとしてまたは活性のハロパ ーオキシダーゼを微生物感染部位に送達するのに有効な他の任意の方法で投与す ることができる。投与経路は好ましくは防腐剤組成物と感染微生物が直接接触す るように設計される。

局所投与用には、製薬的に受容可能な担体は液体、クリーム、ローションまたは ゲルの形態をとることができ、そして更に有機溶媒、乳化剤、ゲル化剤、加湿ら なることができる。本発明の組成物は吸収性材料、例えば縫合糸、包帯およびガ ーゼ中に含浸させるかまたは固体相材料、例えば繊維、ジッパ−およびカテーテ ルの表面上に被覆させて該組成物を微生物感染部位に送達させることができる。

このタイプの他の送達系は当該技術分野の熟練者に容易に明白であろう。

注射用に設計される組成物は製薬的に受容可能な無菌の水性若しくは非水性溶液 、懸濁液またはエマルジョンからなることができる。適当な非水性担体、希釈剤 、溶媒または媒体の例にはプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植 物油、例えばオリーブ油、および注射可能な有機エステル、例えばオレイン酸エ チルが含まれる。このような組成物は保存剤、湿潤化剤、乳化剤および分散剤の ようなアジュバントからなることもできる。それらは、例えば、細菌保持フィル ターによるろ過によって、または組成物中に滅菌剤を導入することによって滅菌 することができる。それらはまた、投与する前に無菌の水、生理食塩水または他 の注射可能な媒体中に溶解させるかまたは懸濁させることができる無菌の固体組 成物の形態で製造することもできる。

経口または局所投与用の固形の投与形態にはカプセル、錠剤、ピル、坐剤、粉末 および顆粒が含まれる。固形の投与形態では、該組成物はスクロース、ラクトー スまたは殿粉のような少なくとも１つの不活性希釈剤と混合することができ、そ して滑沢剤、緩衝化剤、腸溶剤外皮および当該技術分野の熟練者に周知の他の成 分から更になることができる。

本発明組成物中のハロパーオキシダーゼの実際の投与値は、特定のハロパーオキ シダーゼおよび投与方法で所望の治療または予防的応答を得るのに有効な量のハ ロパーオキシダーゼを感染部位で得られるように変化させることができる。従っ て、選択される投与値は感染の性質および部位、所望の治療応答、投与経路、所 望の治療期間および他の因子に依存する。一般的には、ハロパーオキシダーゼが ミニロバ−オキシダーゼであるとき、局所または口内投与用の液体の投与形態は 、液体組成物ｉｎ＋ｌ当たり約００１ピコモル（ｐｍｏｌ　）から約５００　ｐ ｍｏｌまでのミニロバ−オキシダーゼ、更に好ましくは液体組成物１ｍｌ当たり 約Ｑ、ｌｐｍｏｌから約５０ｐｍｏｌ　までのミニロバ−オキシダーゼ、そして 最も好ましくは液体組成物１ｍｌ当たり約０．５ｐｍｏｌから約５ｐｍｏｌまで のミニロバ−オキシダーゼからなる。

同様な投与量の他のハロパーオキシダーゼを使用することができる。

前述のことは、下記の代表的な実施例に関連して更によく理解することができる 。これらの実施例は説明のために示したものであって限定するためのものではな い。

実施例 材料　以下で更に詳細に記載する細菌はトリブチカーゼ（１＋７ｐ＋１ｃｉｓｅ ）大豆ブイヨン（ＴＢＳ）中３５℃で１５〜１６時間増殖させた。以下で更に詳 細に記載する酵母はサボラウド（Ｓａｂｏｕ＋ａａｄ　）のデキストロース寒天 （ＳＤＡ）中３５℃で１６時間増殖させた。培養物を３．０００　＋ｐｍで１５ 分間遠心し、そして上清液を取り除いた。

ペレットを集めそして０．８５％の無菌の標準生理食塩液（ＮＳ）で２回洗浄し た。

洗浄した微生物を再懸濁し、そして５４０ｎｍの波長で０．１の吸収、すなわち 、１ｍｌ当たり約１０７個の細菌コロニー形成単位（ＣＦ　Ｕ）および１ｍｌ当 たり約１０６個の酵母ＣＦＵになるようにＮＳで希釈した。

３％のＨ２Ｏ２ストック溶液（０，８８Ｍ）を使用して必要なＨ２０２希釈物を 調製した。ＨＯの濃度は４３．６Ｍ−’ｃｍ−’の２４０ｎｍ吸光係数または１ ．　ＯＭ−’ｃｍ−’の３００ｎｍ吸光係数を使用して紫外線吸収で確認した。

５．２５％のＨＯＣＩストック溶液（０，７Ｍ）を使用して必要なＨＯＣＩ希釈 物を調製した。

血液は健康なヒトのボランティアから静脈穿刺によって集めた。リチウムヘパリ ンを抗凝血剤として使用した。全血液を１，５００＋ｐｍで１５分間遠心し、そ してバフィコートを血漿と一緒に吸引して赤血球（ＲＢＣ）を回収した。赤血球 をＮＳに再懸濁し、モして遠＜ｓ吸引および再懸濁を繰り返した。次いで、残っ ている白血球を除くために赤血球懸濁液は無菌の木綿ガーゼを通過させた。遠心 および吸引を再度繰返し、そしてペラレットを５０ｍ１のＮＳに再度懸濁させた 。血球計で細胞を計数し、そして懸濁液は１ｍｌ当たり１０８個のＲＢＣに調整 した。ヘモグロビン濃度はドラブキンス（Ｄ＋ａｂｋｉｎ＋）技術て測定した（ ＋、Ｂ、Ｈｅｎ＋７　、１９８４年、Ｃ１、ｎ１ｃａｌ　Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ　 ａｎｄ　Ｍａｎａｇｅｍ＋＋＋＋　Ｂｙ　Ｌａｂｏ＋ａｔｏ＋７　Ｍｅｔｈｏｄ ｓ　、第１７版、５８O　′５８ ５頁、Ｗ、Ｂ、５ａｏｎｄｅ＋＋　Ｃｏ、）。

方法論　無菌技術を使用して、１００μｍの微生物懸濁液と１００μｍのＮＳま たは１００μｍのＲＢＣ懸濁液を１２Ｘ７５ｍｍのポリスチレン管に加えた。Ｈ ２Ｏ２またはＨＯＣＩの種々の希釈物を加えて反応を開始させた；ＮＳを加えて 最終容量を１ｍｌに調整した。反応は２３℃で３０分間行わさせた。混合して細 胞成分を再び懸濁させた後、１００μｍの反応懸濁液を９００μｍのＮＳに加え 、そして１Ｇ−３まで連続的に（１０°）希釈した。次いで、「ガラス　ホラキ ー　スティック（ｇｌａｓｓ　ｈａｃｋｅ７　＋４ｉｃｋ）　Ｊ技術を使用して 、１００μｌの各希釈物を予め標識した寒天プレート上に均一に広げて乾燥させ た。細菌にはトリブチカーゼ大豆寒天（ＴＳＡ）を使用し、そして酵母にはサポ ラウド　デキストロース寒天（ＳＤＡ）を使用した。

次いで、プレートは読み取るまで３５℃で約２４から約４８時間インキュベート した。

コロニーを計数し、そしてＣＦＵ／試験は計数されたコロニー数を１０（最初の 希釈ファクター）倍して得て、そしてこの値にプレート希釈ファクターを掛けた 。

表４および５は、３種の細菌および１種の酵母、カンジダ　アルビカンスに対す るＨ２０２　（表４）とＨＯＣＩ　（、表５）の殺害研究の結果を示す。２つの 細菌、緑膿菌ど大腸菌はグラム陰性細菌であり；黄色ブドウ球菌はグラム陽性球 菌である。これらの微生物はタイプが多様であるため、そしてそれらが全て共通 して感染性病理学に関係があるので選択した。これらの実験はまた、Ｈ２Ｏ２お よびＨＯＣｌの防腐作用に対する赤血球（ＲＢＣ）の阻害影響を定量するために 構築した。ＲＢＣは、Ｈ２Ｏ２を不均化して３０２とＨ２Ｏを生成する酵素、カ タラーゼを含有している。ＲＢＣはまた、ｌＯ２およびＨＯＣＩと反応し得る多 数の基質も含有しているので、防腐作用を競合的に阻害する。

表４ 過酸化水素の殺微生物作用　赤血球（ＲＢＣ）の阻害影響および関連した溶血作 用およびヘモグロビン破壊： 表４の集めたデータは、ＲＢＣの存在下または不存在下で微生物殺害に必要なＨ Ｏの量を示す。例えば、ＲＢＣの不存在下では２°１Ｇ６個の緑膿菌の１００％ 殺害には７９μｍｏｆのＨ２Ｏ２が必要てあり、そして？、９μｍｏｌの■（２ ０２は２°１０６個の緑膿菌を９ｇ、８％殺害した。これは、殺害される各緑膿 菌１山１当たり約４ｐｍｏｌまたは２°１０１２個の分子のＨ２Ｏ２に等しい。

１０７個のＲＢＣ／ｍｌの存在下ては、２°１０６個の緑膿菌を殺害するには７ ９０μｍｏｌのＨ２Ｏ２、即ち、２°１０１４個のＨ２Ｏ２分子／殺害緑膿菌が 必要てあった。殺害の１００倍阻止は細菌力たり約５個のＲＢＣの存在によって 行われることに注意されたい。上清液およびペレット　フラクションの両方にヘ モグロビンが共に存在していないことに基づいて、ＲＢＣは７９０４ｍｏｌのＨ ２０２／ｍｌて完全に破壊されそして７９μｍｏｌ／ｍｌで８０％破壊された。

ＲＢＣの存在下では、８０％のＲＢＣ破壊が行われたＨ２Ｏ２濃度でさえ緑膿菌 は全く殺害されないことに注意されたい。同様な結果か標的微生物として大腸菌 を用いて得られた。

ＲＢＣの阻害効果は標的微生物として黄色ブドウ球菌を用いると更に一層劇的で ある。ＲＢＣの不存在下ではＨ２０２に対して僅かにより感受性である、即ち、 約９°１０　個のＨ２Ｏ２分子／殺害黄色ブドウ球菌であるが、ＲＢＣは殺害に 対して非常に大きい阻止効果を発揮する。ＲＢＣを含有する懸濁液中では殺害さ れる黄色ブドウ球菌当たり約４°１０４個のＨＯ分子／ｍｌが必要である。１０ ７個のＲ，ＢＣ／ｍｌの存在は黄色ブドウ球菌殺害を４００倍阻害した。グラム 陰性微生物て見られるように、ＲＢＣの存在下では、存在するＲＢＣの６０％を 破壊した濃度、７９μｍｏｉ／１ｍｌのＨ２Ｏ２の濃度では黄色ブドウ球菌を全 く殺害しない。

カンジダ　アルビカンスはＨ２０２の作用に対して例外的に抵抗する。ＲＢＣの 不存在下または存在下で殺害されるカンジダ　アルビカンス当たり１０１５個よ り次亜塩素酸塩の殺微生物作用・赤血球（ＲＢＣ）の阻害影響および関連した溶 血作用およびヘモグロビン破壊： 表５の集めたデータは、ＲＢＣの存在下または不存在下で微生物殺害に必要なＨ ＯＣｌの量を示す。ＨＯＣｌは非常に有効な防腐剤である。ＲＢＣの不存在下で 殺害される緑膿菌当た引０６個のＨＯＣＩ分子が必要である。ＲＢＣの不存在下 ではＨＯＣＩは緑膿菌の殺害にＨ２Ｏ２より１００万倍有効であることに注意さ れたい。しかし乍ら、その能力はＲＢＣの存在下では極度に損なわれる。ＲＢＣ の存在下では、殺害される緑膿菌当たり１０１２個のＨＯＣＩ分子が必要である 。細菌当たり約５個のＲＢＣの比率で、赤血球は緑膿菌の殺害に必要なＨＯＣｌ の量に関して１００万倍の阻止を発揮する。６３０　ｎｍｏｌのＨＯＣＩｌｏｆ でＲＢＣを完全に溶解するが、殺微生物作用には影響が無いことに注意されたい 。

大腸菌と黄色ブドウ球菌は共にＨＯＣＩに対する感受性に関して同様な感受性パ ターンを示す、即ち、ＲＢＣの不存在下では約１０９個の分子／殺害細菌であり ＲＢＣの存在下では１０１２個の分子／殺害細菌である。かくして、ＲＢＣはＨ ＯＣｌの作用に対して１０００倍の阻止を発揮し、そして６３ｍｍｏｌ　／ｍｌ では総計１０７個のＲＢＣを溶解するにも拘わらず有効な殺微生物作用はない。

カンジダ　アルビカンスはＨＯＣＩに感受性である。殺害される微生物当たり１ ０　個のＨＯＣ１分子／ｍｌが必要である。かくして、Ｈ２Ｏ２と比較して、Ｈ ＯＣｌはカンジダ　アルビカンスの殺害に１万倍有効である。ＨＯＣＩの殺微生 物作用はＲＢＣの存在によって１００倍阻害さね、そして細菌で観察するとき６ ３ｍｍ。

ｌのＨＯＣＩ／ｍｌでは、存在する総計１０７個のＲＢＣを溶解するにも拘わら ず、カンジダ　アルビカンスの殺害には全く有効でなかった。

これらのデータはＨ２０２とＨＯＣＩの防腐作用の量を測定するものであり、そ れ故、本発明のハロパーオキシダーゼの防腐活性を比較するための参照データと １゜て役立つ。これらの結果は上記したダーキン、フレミングおよびノックス（ Ｋｎｏｔ）の観察および結論と一致している。第１に、ＨＯＣＩは有効な防腐剤 である。ノックス等（１９４８年）はＨＯＣｌが０．２から２．０ｐｐｍまでの 範囲の濃度、即ち４〜４０ｎｍｏｌ　／ω１のＨＯＣＩで効果的に微生物を殺害 すると報告した。表５のデータはこの範囲の活性と定量的に一致している。第２ に、微生物はＨ２Ｏ２およびＨＯＣｌの作用に対して宿主細胞、例えばＲＢＣよ り感受性が低い。宿主組織を損傷する可能性は、防腐剤の治療的有効性を評価す るときに考慮しなければならない。

実施例２ ミニロバ−オキシダーゼおよび好酸性パーオキシダーゼの殺微生物作用 細胞不含ミニロバ−オキシダーゼは酸化性ハライド、即ち、ｌ−１Ｂｒ−および Ｃビ並びにＨ２０２と組み合わせると殺微生物作用を発揮することが知られてい る（Ｋｌｅｂｘｎｏ＋＋　、　１９６８年）。ハライドがＩ−であるとき、ヨー ド化が観察される。ハライドとしてＢｒ−またはＣＩ−を用いると、ＨＯＢｒお よびＨＯＣＩが生成し、そしてこれらの有効な酸化剤は微生物基質と直接反応す るかまたは反応（１４）に記載したようにして追加的なＨ２０２と反応させて１ ０２を生成させることができる（Ａｌｌｅｎ　、　１９７５年、Ｂｉｏｃｈ、　 Ｂｉｏｐｈ７ｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃａｍ、　６３：　６７５〜６８３および６８４ 〜６９１）。行われる反応経路は大部分、Ｈ２０２の利用可能性によって決定さ れる。反応（７）に従うと、ＨＯＣＩの発生速度・ｄＨＯｃｌ／ｄｔ　＝　ｋ　 ［Ｈ２Ｏ２コ　（１７）はＨ２Ｏ２の濃度と一次関数的に正比例するが、反応（ １６）に従うと、１ｏ２の生成速度： ｄ　Ｏ２／ｄｔ　＝ｋ［Ｈ２Ｏ２］（１８）はＨ２Ｏ２濃度の二乗に依存する１ 即ち、反応はＨ２０２の濃度に関して二次関数的である。このため、Ｈ２Ｏ２が １０分の１に減少するとＨＯＣＩの利用可能性は１０分の１に減少するが、Ｈ２ ０２が同じ＜１０分の１に減少しすると１０２の生成は１００分の１に減少する 。Ｈ２０２を制限するとき、微生物基質の直接的ハロクロラミン形成は微生物基 質の最終的な二原子酸素付加（ｄｉｏＸＹｇｅｎａｔｉｏｎ　）に介在すること がある。酸性ｐＨはＨＯＣＩを生成するクロラミン解離に好都合であり、そして 酸性ｐＨはまた微生物の殺害にも好都合である。かくしてＨＯＣｌ。

タロラミンまたは塩素化された微生物基質の他の幾つかの可能な形態がＨ２Ｏ２ と反応して事実上または実際上二原子酸素付加剤として役立つｌＯで二原子酸素 付加された微生物を生成させることができる。塩素化および臭素化した有機化合 物とＨＯとの反応は二原子酸素付加された生成物、即ち１０　反応により得られ るものと同一のジオキセタン（ｄｉｏｘｅ＋ａｎｅ　）を生成する（Ｋｏｐｅｃ ｋｙ　５１９８２Ｌ　ｉｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　ａｎｄ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ 　Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｅｘｃｉｔｅｄ　５ｔａｔｅｓ　、　Ａｄｘ高 ■■ びＣ１１ｅｎｔｏ編集、８５〜１１４頁、＾ｅ＠ｄｅｍｉｃ　Ｐ「ｅｓｓ）。

る。生じた電子性の二原子酸素付加は非常にエネルギー発生性であり、スピンか 認められる、即ち機械論的に好ましい（Ａ１１ｅｎ等、１９７２年、Ｂｉｏｃｈ ｎｈ　Ｂｉｏｐｈ７ｓ。

Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍｕｎ、　４７：　６７９：　Ａ１１ｅｎ、　１９８６Ｌ　Ｍ ｅｔｈ、　Ｅｎｒ７ｍｏ１．１３３：　４４９〜４９３）。

n ロパーオキシダーゼの１０　発生メカニズムの図式的描写は図１に示す。１０に よる微生物の殺害は土中へ、九、膜の完全性の酸化的破壊、代謝機能に必要な酵 素の酸化的阻害および／または再生に必要な核酸の酸化的分解に関係している。

過酸化物の存在下または不存在下におけるミニロバ−オキシダーゼおよび好酸性 パーオキシダーゼの殺微生物活性は次のようにして測定した。グルコースおよび グルコースオキシダーゼが存在するとき、それらを過酸化水素の供給源として使 用した。

材料　細菌および酵母は実施例１に記載したようにして調製した。グルコースオ キシダーゼ（Ｇ　ＯＸ）はシグマ　ケミカル　カンパニー（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅ ｍｉｃａｌ　Ｃｏ、）から購入し、そしてＤ−グルコースの無菌ストック溶液（ １ｍｇ／ｍｌ）はＮＳ中で調製した。ＧＯＸは４５０ｎｍでＩｆ、　３ｍ　Ｍ− ’ｃｍ−’のＦＡＤ（’７ラビンアデニン　ジヌクレオチド、ｗｈｉｉｂ７．１ ９５３年、Ｂｉｏｃｈｅａ　１．　５４：　４３７〜４４２　）吸光係数を使用 して吸収分光法で定量した。各ＧＯＸは２つのＦＡＤを含有しているので、Ｇ。

Ｘの定量には４５０ｎｍで２２．８ｍ　Ｍ−’ｃｍ−’の吸光係数を使用した。

ＧＯＸはまた、供給者（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、）が記載したよ うにして、過剰の西洋ワサビパーオキシダーゼの存在下でオルト−ジアニシジン のミリモル酸化単位としても定量した。

１単位は、試験で使用したものと同じ条件下で１分当たり１μｍｏｌのグルコー スを過酸化物に酸化するＧＯＸの量である。

ミニロバ−オキシダーゼ（ＭＰＯ）および好酸性パーオキシダーゼ（ＥＰＯ）は ブタの白血球から抽出しそしてクロマトグラフィーで精製した。ハロパーオキシ ダーゼの量は、還元剤としてジチオナイトを使用して還元マイナス酸化（Ｒ−０ ）差異分光法で評価した。ＭＰＯのラインハイツツァール（ｒｅｉｎｈｅｉｔｓ ｏｈｌ　）（ＲＺ、純度改、即ち４３０ｎｍ対２８０ｎｍの吸収比（Ａ　）は０ ７であり、概ね９０％の純度を示していた。ＭＰＯのＲ−０差異スペクトルは図 ２に示す、４７５ｎｍでの５０ｍ　Ｍ−’ｃｍ−’のＲ−０差異吸収係数をＭＰ Ｏの定量に使用した。ＥＰＯのＲ−０差異スペクトルは図３に示す。ＥＰＯ定量 用のＲ−０差異吸光係数は、＝１−１ ４５Ｇ＋＋＋ｎでの５６ｍＭｃｍ　であった。ＥＰＯのＲＺ、即ちＡ　は０７で あり、４１２／２８ｆｌ 概ね７０％の純度を示していた。分光光度計測定はＤＷ２０００　ＵＶ−可視分 光光度計（ＳＬＭ　ｌｎ＋ｔ＋ｕｍｅｎ＋ｓ　Ｃｏ、）で実施した。

方法論　ハロパーオキシダーゼおよび過酸化水素または次亜塩素酸塩を添加する 代わりに過酸化物の供給源としてグルコースとＧＯＸを加えた以外は実施例１の 方法に従った。この実施例においては、１００μｍの微生物懸濁液、１００μｌ のノ田パーオキシダーゼ、１００μｍのグルコースおよび６００μｍのＮＳを１ ２Ｘ７５ｍｍ管に加えた。１００μｌのＧＯＸを加えて反応を開始させた。２３ ℃で３０分間反応させた。希釈、ブレーティングおよびコロニー計数は実施例１ に記載したようにし表６および７は実施例１て既に試験した３種の細菌と１種の 酵母のＭＰＯおよびＥＰＯ殺害の結果を示す。この実施例では、微生物は更に１ ０倍に希釈した。

Ｈ２Ｏ２発生用に１００　ｐｍｏｌのグルコースオキシダーゼ（Ｇ　ＯＸ）を使 用し、そして管当たりのグルコースの最終濃度はＯ，Ｉｍｇ　／ｍｌ、即ち、０ ，５６μｍｏｌ　／ｍｌであった。Ｈ２Ｏ２発生は一次関数的にグルコース利用 可能性に比例し、この系で発生するＨ２Ｏ２の総量は０．５６μｍｏｌに制限さ れる。表４のデータで示されるように、この濃度のＨ２Ｏ２だけでは微生物を直 接殺害するには不十分である。ＭＰＯおよびＥＰＯの殺微生物活性は表６および ７に示すように、ＧＯＸ供給系の存在下および不存在下で試験した。

表６ Ｈ２Ｏ２発生体としてグルコースオキシダーゼ（Ｇ　ＯＸ）の存在下および不存 在下でのミニロバ−オキシダーゼ（ＭＰＯ）の殺害能力微生物（１００ｔｔ　ｌ ）　、ＭＰＯ（１００μｌ　）およびグルコース（１００μｌ　、１ｍｇ／ｍｌ ）プラスまたはマイナスＧＯＸ　（１００ｐｍｏｌ　、即ちｌＱＯμｌ中約１ｍ Ｍ一単位）をＮＳに加えて最終容量を１．　Ｏｍｌ　とした。

Ｈ２Ｏ２発生体としてグルコースオキシダーゼ（ＧＯＸ）の存在下および不存在 下での好酸性パーオキシダーゼ（ＥＰＯ）の殺害能力０．８　２Ｂ０，０００　 １００，０００／１１）プラスまたはマイナスＧＯＸ　（１００ｐｍｏｌ　、即 ちｔｏｏ１１１中約１ｍＭ一単位）をＮＳに加えて最終容量を１．　Ｏｍｌ　と した。

ＭＰＯおよび特にＥＰＯは塩基性であり、即ち陽イオン性（プラスに荷電した） タンパク質であり、そして成る種の陽イオン性タンパク質は明白に証明される酸 化還元酵素作用の不存在下て殺微生物作用を発揮する。しかし乍ら、本願の試験 条件下では、０７から５００　ｐｍｏｌ　／＋ｎｌの濃度範囲ではＭＰＯまたは ＥＰＯのいずれも直接的な過酸化物依存性の殺微生物作用は本質的に全（示さな かった。同様に、１００　ｐｍｏｌ　／ｍｌの濃度のＧＯＸ、即ち、試験条件下 で約１ｍＭの。−ジアニシジン酸化単位活性はＸＰＯの不存在下では検出可能な 殺微生物作用を発揮しなかった。これはＧＯＸによる０、　１ｍｇ　（［１，５ ６μｍｏｌ　）のグルコースの０．５６μｍｏｌＨ２０２への総変換では殺微生 物作用には不十分てあったろうから、予期されることである。１ミリリツトル当 たりピコモルの濃度のＭＰＯかまたはＥＰＯのいずれかに対して同じ量のＧＯＸ を添加すると、試験される全ての微生物に対して有力な殺微生物作用をもたらす 。ＭＰＯおよびＥＰＯのデータも、以下で更に詳細に記載する殺害特異性を示す ように思われる。

材料　細菌および酵母は実施例１に記載したようにして調製した。ＭＰＯは実施 例２に記載したようにして調製した。

方法論　実施例１の方法に一般的的に従ったが、その際１００μｍの微生物懸濁 液、１００μｌのＭＰＯ（ＩＯｐｍｏｌ）、および８００　、ｃｚｌの酢酸緩衝 液（Ａｃ　Ｂ）、ｐＨ６中、指示された濃度のＨ２Ｏ２を＋２Ｘ７ｓｍｍ管に加 えた。Ｈ２Ｏ２を加えて反応を開始させた。反応は１００μｍｏｌのＣＩ−の存 在下（表８Ａ）またはハライドの不存在下若しくはＩＯｐｍｏｌのＢｒ−の存在 下（表８Ｂ）で実施した。２３℃で３０分間反応させた。希釈、ブレーティング およびコロニー計数は実施例１に記載したようにした。

表８Ａ ミニロバ−オキシダーゼ（ＩＯｐｍｏｌのＭＰＯ）の存在下および不存在下並び に塩表８Ｂ 臭化物（ＩＯｐｍｏｌのＢｒ−）の存在下および不存在下でミニ口、＜−オキシ ダーゼ（１０ｐｍｏｌのＭＰＯ）によるＨ２Ｏ２の殺害能力１　実施しなかった 。

表８Ａおよび８Ｂのデータは、ハライド補因子としてそれぞれ１００μｍｏｌの Ｃ１−とＩＯｐｍｏｌのＢｒ−を使用してＨ２０２の殺微生物作用に与えるＭＰ Ｏの潜在的影響を示すものである。ｌＯｐｍｏｌ　／ｍｌの濃度では、ＭＰＯは １０６個の標的微生物のＭＰＯ＋ＣＩ−（またはＢｒ−）　・Ｈ２Ｏ２依存性殺 害に関して速度制限的でない。このＭＰＯ量では、殺微生物動力学におけるＸＰ Ｏに関して本質的にゼロ桁の条件を提供し、このため、ハライドが制限的でなく そしてハライド：過酸化物比が阻害的でない（以下で十分に記載する）場合、殺 害はＨ２０□の利用可能性に比例する。Ｈ２Ｏ２の殺微生物作用に与えるＭＰＯ の触媒的影響は上記したのと同じ細菌および酵母を使用して試験した。

ＭＰＯとハライドの濃度は一定に保ち、そしてＨ２Ｏ２の濃度は広範囲に変化さ せた。表８Ａのデータにおいて、ＭＰＯの不存在下でのＨ２０２の殺害活性はＲ ＢＣの不存在下での直接的なＨ２Ｏ２の殺害活性と比肩できるものであることに 注意されたい。表４の集めたデータを参照のこと。両試験では殺害される細菌当 たり約１０１２個のＨＯ分子が必要であり、そしてＨ２０２は７００　、ｃｚｍ ｏｌ　／ｍ１の濃度、即ち２４％のＨ２０２であってもカンジダ　アルビカンス の殺害においては無効であった。表８Ｂのデータは更に、臭化物がＭＰＯの殺微 生物作用のハライドとして作用し得ることを確立している。本質的に、ハライド の不存在下ではＭＰＯＨ２０２系を使用しても殺害は観察されなかった。

Ｈ２０２の不存在下では、ＭＰＯは試験した微生物を殺害しなかったが、ＭＰＯ はＨ２０２の殺微生物能力を数倍増加させた。例えばμｍｏｌ　／ｍｌ　の範囲 の比較的高い濃度では、ハライド濃度が比例的に増加しない限り、Ｈ２Ｏ２はＸ ＰＯの触媒活性を阻害することができる。高濃度のＨ２Ｏ２でのＭＰＯ−依存性 のカンジダ　アルビカンス殺害阻害はＣ１−・Ｈ２Ｏ２比の非常な低下から生じ る。

細菌で観察可能な影響がないことはこれらの細菌に関するＨ２Ｏ２のＭＰＯ非依 存性殺害活性の方かはるかにより大きいことの結果であると思われる１即ち、殺 害はＭＰＯ阻害にも拘わらず生じる。黄色ブドウ球菌殺害阻害が２．８および１ ４μｍａｔの過酸化物で観察されることに注意のこと。ＭＰＯはハライドの濃度 を上昇させるかまたはｐＨを低下させることによってＨ２Ｏ２の作用から保護す ることができる。しかし乍ら、添加するＨ２Ｏ２濃度を低下させるかまたは、比 較的低いがＨ２０２の利用可能性を動力学的に維持するＨ２Ｏ２発生体系を導入 することの方が多分一層適切であろう。塩化物／過酸化物の比はハロパーオキシ ダーゼの安定性および機能的な触媒活性に関して重要な因子である。塩化物／過 酸化物比が好ましくは約５０以上に維持される限り、広範囲の過酸化物濃度を使 用することができる。例えば、塩化物濃度が１００μｍｏｌ　／ｍｌ、即ち、生 理学的血漿濃度に概ね等しい場合には、過酸化物濃度は２μｍｏｌ　／ｍ１未満 、好ましくは１μｍａｔ／ｍ１未満に維持されよう。

ピコモル量のＭＰＯはＨ２Ｏ２の殺微生物作用を１万倍以上上昇させる。１゜ｐ ｌｏｏｌのＭＰＯでは、試験細菌に関係なく殺害細菌当たり約１０８個のＨ２Ｏ ２分子が必要である。これは０旧ｐｐｍのＨ２Ｏ２濃度に相当する。このより低 い範囲の過酸化物濃度は塩化物／過酸化物または臭化物／過酸化物の比を最適に 調整することによってなお更に低くすることができよう。このことにより、ＭＰ ｏが触媒するＨ２Ｏ２の殺害作用はＨＯＣＩで報告されたもの、即ち、０．２か ら２．０ｐｐｍ（Ｋｎｏｘ等、１９４８年）より優れている。表５においてＨＯ ＣＩを使用する際の分子／殺害微生物の比が大腸菌および黄色ブドウ球菌では約 １０９であったが、緑膿菌では約１０６であったことを思い出されたい。例外は あるが、濃度または分子／微生物基準が等しいとき、ＭＰＯが触媒するＨ２Ｏ２ の殺微生物作用はＨＯＣＩより大きい。

表４．８Ａおよび８Ｂのデータで示されるように、カンジダ　アルビカンスはＨ ２Ｏ２の直接的作用に対しては非常に耐性であるが、ＣＩ−またはＢｒ−の存在 下でＩＯｐｍｏｌのＭＰＯを導入すると、この酵母に関するＨ２Ｏ２の殺害活性 が１０万倍以上増加する。カンジダ　アルビカンスに関するＭＰＯ−依存性Ｈ２ ０２殺害は約５”　１０９の分子Ｊ量比で行われる。ＭＰｏ系の酵母殺害能力は 細菌で観察される能力より小さいが、該殺害系は慣用の防腐剤または抗生物質と 比較して法外に有力である。表５と８のデータの比較に基づいて、ＭＰＯが触媒 するＨ２Ｏ２−依存性のカンジダ　アルビカンス殺害はＨＯＣＩを使用して観察 されたものより大きい。

材料　細菌および酵母は実施例１に記載したようにして調製した。ＭＰＯｌＧＯ ＸおよびＲＢＣ懸濁液は、グルコースを１０倍高い濃度、即ち１０ｍｇ／ｍｌの ストックグルコースを使用した以外は実施例２に記載したようにして調製した。

方法論　実施例２の方法に従ったが、その際１００μｍの微生物懸濁液、１００ μｍのＭＰｏ、１００μＩのグルコース（１ｍｇ／１ｏｌ１μｍ）、プラスまた はマイナス１００μｍのＲＢＣ懸濁液および０．９ｍｌの容量にするのに十分な ＮＳを１２Ｘ７Ｓｍｍ管に加えた。１００　μｌのＧＯＸ　（１００ｐｍｏｌ　 ／ｍｏｌ；　約１ｍＭの０−ジアニシジン酸化単位）を添加して反応を開始させ た。２３℃で３０分間反応を行わせた。希釈、ブレーティングおよびコロニー計 数は実施例１に記載したようにした。

表９のデータで更にもう１度、Ｈ２０２発生系としてグルコース：　ＧＯＸを組 み合わせたＭＰＯの潜在的殺微生物活性を示す。実施例４の方法の最初の部分は 、グルコース濃度を１０倍高くした点でのみ実施例２（表６のデータ）に記載し た方法と異なっていた。Ｈ２Ｏ２発生用に１００　ｐｍｏｌのＧＯＸを使用し、 背当たりのグルコースの最終濃度は１．　Ｏｍｇ　／ｍｌ、即ち、５．６μｍｏ ｌ　／ｍｌであった。それ故、この系によって発生するＨ２０２の総量は５．６ μｍｏｌに制限される。表４のデータに基ついて、ＲＢＣの不存在下での直接的 殺微生物作用にはこの量のＨ２Ｏ２で十分であるが、ＲＢＣが存在すると十分で はない。

この実施例はＭＰＯの殺微生物作用に与えるＲＢＣの影響を評価するために設計 した。ＲＢＣ：細菌比は約２であり、そしてＲＢＣ：酵母比は約４０であった。

これらの比は表４および５に集めた実験と同じ大きさの範囲内である。細胞の大 きさの差異に従って、赤面球塊は微生物塊より数倍大きい。

ミニロバ−オキシダーゼ：グルコースオキシダーゼ（Ｍ　Ｐ　Ｏ−Ｇ　ＯＸ）の 殺微生物作用の赤血球（ＲＢＣ）による阻害・関連した溶血作用およびヘモグロ ビン破壊 微生物（１００ｕ　ｌ）　、ＭＰＯ（１００μｌｌ、グルコース（１００ｔｔｌ 　、、ｌＱｍｇ／ｍｌ）、ＧＯＸ　（１００ｐｍｏｌ　、即ちｌｏＯμｌ中約１ ａ＋Ｍ一単位）プラスまたはマイナス１０７個のＲＢＣ（１００μｌ　）をＮＳ に加えて最終容量を１０ｍ１とした。

表９に示されるように、ＭＰＯ−ＧＯＸ系の殺微生物能力はＲＢＣの存在によっ て阻害されるが、その阻害影響は比較的小さい。約６μｍｏｌの量のＨ２Ｏ２は 検出可能な殺微生物作用を示すはずであるが、ＲＢＣの不存在下では殺真菌作用 を示さずそしてＲＢＣの存在下では検出可能な殺菌または殺真菌作用を示さなか った。表９のデータは、ＭＰＯ−ＧＯＸ系がＲＢＣの存在下であっても潜在的殺 微生物作用を行うことを示している。ＭＰＯを約１　ｐｍｏｌ　７ｍはり大きい 濃度で使用したとき、上記ＭＰＯ−ＧＯＸ系は溶血を生じさせた。しかし乍ら、 ｐｍｏｌ／ｍ１未満の範囲のＭＰＯ濃度では、溶血活性を伴わないで殺菌作用が 観察される。

この後者の観察は、それがＭＰＯの破壊活性に関する選択性を示唆している点で きわめて重要である；即ち、最適の条件下で、細菌を選択的に殺害することかで き、宿主細胞に対する付随的な損傷は最小である。

飽和脂肪および核酸と反応し得る広範囲で、しかも比較的選択的な電子性酸素の 反応速度定数（ｋ＋、　Ｍ−’秒−１）はそれぞれ３°１０７０１１ｘ＋ｈｕｏ ｎおよびＬｅｅ、１９７９年、Ｐｈｏｔｏｃｈｅａ　Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ、　２ ９：　８７９〜８８１　）、８．８°１０７および２”１０７（Ｋ＋ａｌｊｉｃ およびＳｂａ＋ｐａｌｙｉ　、１９７８年１、ＰｈＯｔｏｃｈｅｍ、　Ｐｈｏｔ ｏｂｉｏｌ、　２８：　５８３〜５８６）であるうこれら必須アミノ酸は必要な タンパク質構造成分でありそして典型的には酵素触媒メカニズムに関与している 。このため、「痕跡」濃度の　０２は代謝機能に必要な多数の酵素を反応的に阻 害することがあろう（Ｇｒｅｅｎ　、　１９４１年）。

スピン多重度の変化、即ち項間交差が　０２から　０２への緩和に必要である。

ライブナ−（Ｗｉｇｎｅ＋）のスピン恒存規則に従って、準安定性はスピン状態 における何らかの変化に関連した低い蓋然性に起因する。このため、酸素の１０ ２励起状態は準安定状態であり、μ秒領域の水性反応性寿命を有する（　Ｍｅ＋ ｋｅｌおよび電子特性による機械論的制限に加えて、１０　の反応性もその寿命 で支配される一時的な領域に制限される。「水性溶液中での１０　の寿命はμ秒 領域であることが分かっており、その期間中に少なくとも１，０００オングスト ロームの平均放射距離に拡散することができる。かくして、発生部位から離れた 位置で反応することができる。Ｊ　（ＬｉｎｄｉｇおよびＲｏｄｇｅ「ｉ　５１ ９８１年、Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ、Ｐｈｏ＋ｏｂｉｏ１．　３３６２７〜６３４） 。

この反応性に関する時間関門制限は、損傷量を発生器酵素、ＸＰｏの接近に関連 させることによって、　０２の酸化的損傷の範囲および程度に対して生物学的に 必要な限定を負わせている。換言すれば、三次元的空間における反応は反応剤の 第４次元的のもの、即ち　０２の寿命によって制限される。ＸＰＯが微生物の表 面に結合する場合、ＸＰＯ位置から約１０００オングストローム（０，１μｍま たは１１００ｎ　）の半径での酸化的損傷量は微生物の何らかの成分を本質的に 破壊するのに十分であろう。細菌の直径は約０．５から１．０μｍまでの範囲で あり、そして膜およびペプチドグリカン領域は典型的には５０ｍｍ未満の厚さで ある。かくして、微生物膿の重要な成分並びに細胞質の必須酵素および核酸は表 面に結合したＸＰＯによって発生される　０２に感受性である。

ＸＰＯが標的微生物に密接に接近する場合、この反応量の制限は微生物に対する 酸素付加損傷を制限するように作用する。更に、ＸＰＯど微生物の結合が真核細 胞に比べて選択的である場合には、殺微生物作用は居合わせる宿主細胞の損傷、 例えば溶血が最も少ないように行うことができよう。

ミニロバ−オキシダーゼ（ＭＰＯ）および特に好酸性パーオキシダーゼ（ＥＰＯ ）は陽イオン性のグリコプロティンである。ＸＰｏは共に多数のレシチン、例え ばコンカナバリンＡとも結合する。このため、これらのＸＰｏは静電的負荷、レ シチン結合を介して、または成る種の他のメカニズムによって微生物と結合する ことができよう。本願明細書で示されるように、標的微生物に対する結合が十分 選択的である場合、ＸＰＯ系の容量限定酸素付加活性の防腐能力は十分に具現化 されよう。

材料　細菌はトリブチカーゼ大豆ブイヨン（Ｔ　Ｓ　Ｂ）中３５℃で約１６時間 増殖させた。次いで、培養物を遠心（３，（１００＋ｐｍで１５分間）し、そし て上溝液を除去した。

ペレットを集め、そして無菌の０．８５％の通常生理食塩液（ＮＳ）で２回洗浄 した。

洗浄した微生物は約１０９個の細菌／ｍｌの密度に再懸濁した。最終の量測定は 血球計計数によった。ＭＰＯは実施例２に記載したようにして調製した。

方法論　ＭＰＯの種々の希釈物を２，１°１０９個の黄色ブドウ球菌の懸濁液に 加えた。最終容量は１ｍｌであった。懸濁液は静かに３０分間混合し、次いで２ ．０００＋ｐｍで１０分間遠心した。上清液を取り出して、遊離ＭＰＯの定量用 に保管した。ペレットを５等容量のＮＳ中で再懸濁して洗浄した。傾斜テーブル 上で約１０分間完全に混合した後、細菌を再び遠心した。上清液は廃棄し、そし てペレットをＮＳを用いて再懸濁して元の容量とした。

Ｒ−０差異分光学的測定は実施例２に記載したものを次のように修正した。比較 的稠密な黄色ブドウ球菌懸濁液は、４７５ｎｍで５０ｍ　Ｍ’ｃｍ−’のＲ−０ 差異吸光係数に基づ（ＭＰＯの定量に関して、シグナル対ノイズの問題をもたら した。この問題は４４９および５００ｎｍでのＲ−０差異吸収を平均化すること によって解決された。次いて、この平均を４７５ｎ＋ｎでのＲ−０差異吸収から 差し引いた。４７５ｎｍでの調整したＲ−０差異吸収は、５０ｍ　Ｍ−’ｃｍ− ’の吸光係数を使用して、ＭＰＯ濃度を計算するために使用した。

図４はＭＰＯへの暴露前後の黄色ブドウ球菌、即ち結合ＭＰＯのジチオナイト還 元マイナス酸化（Ｒ−０）差異スペクトルを表わす。図５は細菌を遠心除去した 後に溶液中に残っているＭＰＯ１即ち遊離ＭＰＯのＲ−０スペクトルを表わす。

約２０ｐｍｏｌのＭＰＯが２ビ１０９個の黄色ブドウ球菌と結合し、一方１．５ ６０ｐｍｏｌのＭＰＯが１ｍｌ容量の溶液中に残っていた。このため、ＭＰＯの 結合：遊離比は０．０１３であり、細菌当たり約５．７００分子のＭＰＯが結合 していた。この最初のＭＰＯ濃度の連続２ｎ希釈によって、ｎがそれぞれ１およ び２であるとき、０．０２０および０．０１８のＭＰＯ結合・遊離比が得られた 。同様に、細菌当たりの結合ＭＰＯ分子の数は、ｎがそれぞれ１および２である とき、４．１００および１．７００であった。

残念なことに、シグナル　ノイズ比はより大きいＭＰＯ希釈では非常に小さかっ た。かくして、結合ＭＰＯの直接的な分光学的測定は比較的親和性の低い範囲の 結合に限られる。感度がこのように限定されるにも拘わらず、これらの分光学的 測定はＭＰＯと細菌の結合の直接的証明を提供する。事実、十分な数の細菌と適 当なＭＰＯが組合わされる場合、細菌に対するＭＰＯの結合は肉眼で視覚的に観 察することができる。

スキャンチャード法は結合親和性を分析するための図表的方法として頻繁に使用 される（Ｒｏｂａ＋ｄ、　１９８１年、Ｌｉｇ＋ｎｄ　ＡｕａｙＳＬａｎｇａｎ およびＣｌａｐｐ編集、４５〜１０１頁、＠ａ！ｌｏｎ　Ｐｕｂｌ、、ニューヨ ーク参照）。微生物に対するＸＰＯ結合の動力学遊離ＸＰＯ十微生物部位　＜＝ ＝＝＞　微生物−ＸＰＯ（１９＋は集団作用関係に従って表わすことができ・Ｋ ａｆｔ　＝　［微生物−ＸＰＯ］−（２０）［遊離ＸＰＯ］　［微生物部位］ そしてそれ故： かくして、結合対遊離ＭＰＯ比は微生物当たりの部位数に親和性定数に！（］を 掛けた一次関数である。

材料　緑膿菌、大腸菌、ネズミチフス菌および黄色ブ幼球菌は実施例１に記載し たようにして調製した。連鎖法菌種および乳酸桿菌種は、各群の増殖を支持する ためにそれぞれトッド−へビット（Ｔｏｄｄ−Ｈｅｗｉ＋ｌ）およびＭＲ８培地 を使用した以外は、実施例１に記載したようにして調製した。カンジダ　アルビ カンスおよびクリプトコツカス　ネオホルマンスは、サボラウド　デキストロー ス　寒天培地を使用した以外は同様な方法で調製した。ＲＢＣは上記実施例１に 記載したようにして調製した。細菌および酵母は血球計計数によって定量した。

ＭＰＯは実施例２に記載したようにして調製しそして定量した。

方法論　ＭＰＯの連続１．５°または２　希釈物を調製しそして微生物と組み合 わせた。ＭＰＯ濃度を変化させ、そして微生物数は一定に保った。約１０５から １０６個の細菌または酵母細胞を１試験当たりて使用した。微生物調製物の１容 量をＭＰＯ希釈物またはＮＳの１容量に加えた。懸濁液を混合しそして２３℃で ３０分間インキュベートした。次いて、懸濁液はエッペンドルフ　モデル（Ｅｐ ｐｅｎｄｏ＋ＩＭｏｄｅｌ　）　５４１４　高速遠心機で１５．　ＧＯＯ＋ｐｍ で５分間遠心した。上清液を傾瀉し、そして試験用に貯蔵した。ペレットを再懸 濁しそして当量のＮＳで洗浄した。再懸濁したペレットを再度遠心しそして洗浄 上清液は棄てた。ペレットを再懸濁！７て１容量、即ち元の容量の微生物調製物 、！ニジた。

各ＭＰＯ希釈物のＭＰＯ活性はハライドとしてＢＴ″、酸化剤としてＨ２０２、 そして化学発光源基質としてルミノールを使用し、１９８９年１０月５Ｂｌこ提 出された係属中の米国特許出願番号第４１７．２７６号に記載されでいるように して、ＭＰＯの生成物発光として測定した。各ＭＰＯ希釈物の１００μｍ分別物 を試験した。各試料を１２Ｘ７５闘の試験管に加えた。発光はＬＢ９５０ルミノ メータ−（Ｂｅ＋ｊｈｏｌｄＩｎｓ＋＋ｕｍｅｎ＋＋　、ビルトバード、ドイツ ）で測定した。２つの注入器を使用した。最初の注入器は３００　μｌの１５０ 　ｔｔＭ　（４５ｍｍｏｌ）のルミノールを、５μｍｏｌのＢｒ−を含有する５ ０ｍ　Ｍの酢酸塩緩衝液（Ａｃ　Ｂ）　、ｐＨ５中に注入した。３００μｍの１ ６．７ｍ　Ｍ　（５μｍｏｌ）のＨ２Ｏ２を第２の注入器から注入した後に２０ 秒の測定を行った。

遊離および微生物と結合したＭＰＯの活性は、背当たり１００μｍの試験上清液 、即ぢ遊離ＭＰＯまたは１００μｌのＭＰＯ−微生物懸濁液、即ち結合ＭＰＯを 加えた以外は同し方法論を使用して測定した。この方法論によって、遊離ＭＰＯ は結合ＭＰＯに関して２の因数で希釈する。これは、遊離ＭＰＯ測定の有効範囲 を広げるためになされた。それ故、遊離ＭＰＯ測定の活性値は、スキャッチャー ド分析に使用する前に２の因数を掛けた。

ＸＰＯ活性を定量する蛍光の感度の大きいので、この感度は、結合親和性のスキ ャッチャード分析に必要なｐｍｏｌおよびｐｍｏ１未満の量の遊離および微生物 結合ＭＰＯを測定するのに理想的に適するものとなる。このような分析の第１段 階は、測定されたＣＬ活性をＭＰＯ分子の量に等しくする標準曲線を構築するこ とである。

図６はメガ光子／２０秒、即ち１０６光子／２０秒対試験したＭＰＯのｐｍｏｌ 量として表わした化学蛍光（ＣＬ）のプロットである。ＭＰＯ対ＣＬの関係は０ から１０ｐｍｏｌの範囲のＭＰＯ濃度では、Ｘおよびｙ軸を図６Ａと逆にした図 ６Ｂのこの範囲のプロットで示されるとおり、本質的に直線的である。回帰分析 によって次式が得られる。

０Ｌ光子／２０秒　＝ｋ”［ＭＰＯコｐ　（２２）ｍｏ　１ 式中、ｋは定数でありそして上つき文字ｐはＭＰＯに関する反応次数である。式 の実際の値は・ またはその逆の表現。

ＭＰＯｐｍ。、　＝０．７０２°　［ＣＬ、カ光子／２ｏ秒］Ｏ°８１１（２４ ）は１０個の別個の標準範囲の測定を平均して決定した。決定係数、即ちｒ２は ０．９８７である。ＭＰＯのｐｍｏｌ値はＲ−０差異分光学による最初の定量に 基づいており、そして評価は連続２ｎ希釈に基づいている。ポリスチレン管中で の希釈は管結合による幾らかの損失に関連しており、これは比較的高い希釈物で 特に明白である。このことにより、反応次数の評価は僅かに不均斉である。かく して、１．１５のｐ値は最初の次数より僅かに大きい。

図７Ａは、試験当たりそれぞれ７．５°１０８個の黄色ブドウ球菌および２．４ ゛１０８個のビリダンス連鎖球菌を使用して、黄色ブドウ球菌およびビリダンス 連鎖球菌に結合したＭＰＯ対遊離ＭＰＯをプロットしたものである。微生物結合 対遊離ＭＰＯの関係は次のように記載される：遊離ＭＰＯ，□。、＝に’［結合 ＭＰＯ，。。、］　ｐ（２５）約１０ｐｍｏｌのＭＰＯ／ｍｌ　の遊離濃度で、 ７．５”１０８個の黄色ブドウ球菌に結合したＭＰＯ量は約２ｐｍｏｌに限定さ 枳そして２．４°１０８個のビリダンス連鎖球菌当たりの結合ＭＰＯ量は約１ｐ ｍｏｌである。

微生物の近飽和のＭＰＯ結合能力は、ＭＰＯ結合量を微生物当たりの分子で表わ すことによって評価することができる。例えば、結合ＭＰＯのモル量、即ち黄色 ブドウ球菌では２１０ｍｏｌにアボガドロ数、即ち６°耐３を掛け、そして、− １２ この積、即ち結合ＭＰＯ分子を微生物数、７．５”１０８で割って商、即ち黄色 ブドウ球菌当たり２．４００個の結合ＭＰＯ分子を得る。

図７Ｂは微生物当たりの分子として表わした結合対遊離ＭＰＯをプロットしたも のである。

これらのデータのスキャッチャードプロットは図７Ｃに示し、その際黄色ブドウ 球菌のデータのポイントは“＊”で記し、そしてビリダンス連鎖球菌は“０”で 記す。等式（１９）から（２１）までを考慮して上記で展開したように、結合／ 遊離ＭＰＯ比と結合ＭＰＯ濃度間には直線関係がある。この直線の傾斜の絶対値 は親和性定数、Ｋａｌｆの値である。図７Ｃでは、結合ＭＰＯは反応容量光たり 微生物当たり総結合部位、即ち結合ＭＰＯ／微生物／ｍｌで表わされる。かくし て、Ｘ−インターセプトは微生物当たりのＭＰＯ結合部位数に近く、そしてｙ− インターセプトは外挿した最大結合／遊離比、即ちＫａｌｌに微生物当たりの結 合ＭＰＯ部位数を掛けた積である。

２つの比較的明確な直線的関係が黄色ブドウ球菌データのプロットによって示さ れる。微生物当たり結合ＭＰＯ分子が０から１．０００の範囲で、その関係は比 較的直線的、即ちｒ２＝０．８３であり、次の関数で記載することができるＭＰ Ｏ−黄色ブドウ球菌−一０．０１２１２８“　［部位］　＋１４．６４７　（２ ８）それ故、Ｋ　は概ね１．２１３°１０−２であり、Ｋａｌｌｏ［微生物部位 ］は旧４７でｌｌ あり、そして総結合能力は微生物当たり１．２０８ＭＰＯである。黄色ブドウ球 菌のプロットはまた、比較的親和性の低い第２のクラスの結合部位の存在も示し ている。微生物当たり結合ＭＰＯ分子が１，０００から３．０００の範囲で、こ の低い親和性結合は次の関数で定義さねへその際ｒ２＝ｏ、６５である：ＭＰＯ −黄色ブド黄色１御９ この第２のクラスの結合物のＫ　、４．９０７”１Ｏ−４は親和性の高い結合部 位で計ｌｌ 算されたものより２５倍小さいが、微生物当たりのＭＰＯ結合部位数はより多く 、概ね２．　９００　／微生物であることに注意されたい。

プロットからはあまり明白でないが、ビリダンス連鎖球菌のデータはまた少なく とも２つの異なるタイプの結合の存在も示している。微生物当たり結合ＭＰＯ分 子が０から１，５００の範囲で、その関係は概ね直線状、即ちｒ２＝０．６６で あり、次の等式で定義される： ＭＰＯ一連鎖球菌（ビリダンス）　＝　−０．０００２５５”　［部面＋０．　 ４０６　（３０）このＫ　、２．５５１”ｌ［ｌ’は黄色ブドウ球菌の「親和性 の高い」結合部位より非常に小さいことに注意されたい。これらの親和性の低い ＭＰＯ結合部位はビリダンス連鎖球菌当たり概ね１．６００存在する。データの 生プロットから上記で推論したように、２種の微生物に対するＭＰＯの結合能力 は微生物当たりの縁結合部位数に関して比肩し得るものである。プロットは全く 同様な微生物当たり約２，　０００分子であることに注意されたい。スキャッチ ャード分析で計算したＢ／Ｆ。

Ｋａｌｆおよび部位／微生物の値は次表１０に記載する。同様にして、数種のグ ラム陰性およびグラム陽性細菌、真菌性酵母およびヒト赤血球をＭＰＯ結合能力 に関して試験した。これらのスキャッチャード分析の結果も表１０に示す。

表１０ スキャッチャード法で得られたミニロバ−オキシダーゼ：微生物結合の統計学。

Ｂ／　Ｆ　＝Ｋ　、　＋−［微生物部位］上清液およびペレットのＭＰＯ含量は 、同時に実施したＭＰＯ標準を使用して蛍光測定法によって測定した。範囲は細 胞当たりＭＰＯ分子の比で表わす。ＭＰＯ濃度当たり約１０８から１０９個の細 胞を試験した。Ｂ／Ｆは結合対遊離ＭＰＯの比である。即ち、Ｂは細胞当たり結 合したＭＰＯ分子の数であり、そしてＦは遊離のＭＰＯ分子の数である。Ｋａｌ ｌは親和性または会合定数であり、そして部位／微生物は細胞当たりのＭＰＯ結 合部位の数である。

表１０に示した結果から分かるように：（１）ＭＰＯは試験した病原性細菌の全 てに結合する。

（２）口内および中咽頭の正常叢の主要成分、即ち連鎖球菌種（ビリダンス）並 びに膣の乳酸桿菌種（デーデルライン桿菌）である乳酸産生細菌は試験した細菌 のうちで最も低いＫａｆｔ値を有している。

（３）細菌と比較して、酵母はより小さいに、１．値を有しているが、酵母の大 きさがより大きいことに一致して、酵母は微生物当たりの結合部位がより多い。

（４）ヒト赤血球に対するＭＰＯの結合は本質的に検出されながった。即ち、Ｂ ／Ｆは０．２未満であり、ｒ２は０．１未満であった。

このため、ＸＰＯか触媒する微生物殺害の接近要件はＭＰＯでは充足される。

ＭＰＯはグラム陰性およびグラム陽性の病原性微生物に対しては高い親和性を、 そして正常叢、即ちピリデンス連鎖球菌およびデーデルライン乳酸桿菌の０２Ｈ ２産生菌には比較的低い親和性を示す。病原体および正常叢を含有する環境下で は、ＭＰＯの利用可能性を制限するとＭＰＯの結合は病原体に効果的に限定され る。かくして、殺微生物作用は存在する病原性微生物に選択的に限定することが でき、そして正常叢の生存性を保持することができる。競合する病原体の存在下 では、ＭＰＯは病原性微生物への選択的結合およびそれらの殺害によってＬＡＢ 叢と相乗的に作用するであろう。

材料　細菌、酵母および赤血球は実施例６に記載したようにして調製した。真菌 性クロロパーオキシダーゼ（ＣＰ　Ｏ）はシグマ　ケミカル　カンパニーから購 入した。クロロパーオキシダーゼは最初に、還元剤としてジチオナイトを使用し て還元マイナス酸化（Ｒ−０）差異分光学で定量した。ＣＰＯの４００＋＋ｍ対 ２８０ｎｍの吸光度（Ａ４００／２８Ｇ　）比は０８であった。ｃｐｏの定量に は４５０＋＋ｍでの５６ｍＭ−１ｃｍ−’のＲ−０差異吸光係数を使用した。Ｃ ＰＯ酸素付加活性に関するルミノール依存性の蛍光アッセイも各微生物結合アッ セイで行った。

方法論　プロトコールは、ＣＰＯをＸＰＯとして使用した以外は実施例６に記載 したものと同じであった。

ＣＰＯ対ＣＬの標準測定は各結合研究で行い、そしてこれらのデータは化学蛍光 データを０２０分子に変換するために使用した。方法論は図６のＭＰＯ標準化測 定に記載したようにした。

図８Ａは、反応容量当たり微生物当たりの非結合０２０分子に対してプロットし た黄色ブドウ球菌および連鎖球菌種（ビリダンス）当たりの結合ＣＰＯ分子を示 す。図７８のＭＰＯ結合データと対照的に、連鎖球菌種（ビリダンス）は黄色ブ ドウ球菌より強＜ｃｐｏに結合する。しかし乍ら、どちらの微生物もＭＰＯと同 じ位効果的にはＣＰＯと結合しない。

これらのデータのスキャッチャードプロットは図８Ｂに示す。同様な結合範囲で 、縦座標の大きさ、即ち、Ｂ／Ｆ＝に、、、　本　［部位／微生物］は図７０の ＭＰＯスキャッチャードプロットで記載したものより１００倍小さい。連鎖球菌 種（ビリダンス）に対するＣＰＯの結合能力は黄色ブドウ球菌に対するより比較 的大きいが、両数生物に対するＣＰＯの結合能力はＭＰＯの結合能力に比較して 小さい。

ＭＰＯて記載したものと同様な方法で、同し範囲の細菌、酵母並びに赤血球はそ のＣＰＯ結合能力をスキャッチャード法て分析した。結果をまとめて表１１に示 す。

表１１ クロロパーオキシダーゼニスキャッチ忙ド法で得られた微生物結合の統計学；Ｂ ／Ｆ＝に、、−［微生物部位］ 上清液およびペレットのＣＰＯ含量は同時に実施したｃＰｏ標準を使用して蛍光 測定法で測定した。条件は表１０の凡例に記載したものと同しであった。

実施例８ 材料・細菌、酵母および赤血球は実施例６に記載したようにして調製した。好細 菌パーオキシダーゼ（ＥＰＯ）は実施例２に記載したようにしてブタ白血球から 抽出しそして精製した。ラクトパーオキシダーゼ（ＬＰＯ）はシグマ　ケミカル 　カンパニーから購入した。ＥＰＯおよびＬＰＯは、還元剤としてジチオナイト を使用して還元マイナス酸化（Ｒ−０）差異分光学で定量した。ＥＰＯの４１２ ｎｍ対２８０ｎｍの吸光度（Ａ　’）比は０．７であり、そしてＬＰＯの４１２ ｎｍ対２８０ｎｍの吸光度（Ａ　）比は０．７であった。ＥＰＯの定量には４５ Ｇｎｍでの５６＋＋ｍＭ−’ｃｍ−’のＲ−０差異吸光係数を、そしてＬＰＯの 定量には４３８ｎｍでの５６ｍＭ’ｃｍ−’のＲ−０差異吸光係数を使用した。

ＥＰＯおよびＬＰＯ酸素付加活性に関するルミノール依存性化学蛍光アッセイも 各微生物結合アッセイで実施した。

方法論　プロトコールは、ＥＰＯおよびＬＰＯをｘｐｏｓとして使用した以外は 実施例６に記載したものと同じであった。

ＭＰＯおよびＥＰＯの結合データを熟読すると、それらの微生物結合能力に関し てハロパーオキシダーゼを区別できる差異が強調される。結合データの相互比較 を整合させるため、図９Ａは反応容量当たり微生物当たりの非結合ＥＰＯ分子に 対してプロットした黄色ブドウ球菌および連鎖法菌種（ビリダンス）当たりの結 合ＥＰＯ分子を示す。連鎖法菌種（ビリダンス）と黄色ブドウ球菌に対するＥＰ Ｏの結合は低い範囲のＥＰＯ濃度では類似しているが、黄色ブドウ球菌当たりの 結合部位はより少ないように思われる。試験した濃度範囲内で、ＥＰＯはＭＰＯ に関して上記で観察されたどの微生物に対してよりも効果的に結合する。

これらのデータのスキャッチャードプロットは図９Ｂに示す。同様な結合範囲で 、縦座標の大きさ、即ち、Ｂ／Ｆ＝に、、、＊［部位／微生物］は図７０のＭＰ ０スキャッチャードプロットで記載したものと同一である。連鎖法菌種（ビリダ ンス）に対するＣＰＯの結合能力はＭＰＯの結合能力より相対的に大きい。しか し乍ら、黄色ブドウ球菌に対する結合能力はＭＰＯと同様である。全体的に、Ｅ ＰＯの結合能力はＣＰＯよりＭＰＯに一層良く類似している。

ＭＰＯおよびＣＰＯに関して上記したようにして、同じ範囲の細菌、酵母並びに 赤血球のＥＰＯ結合能力をスキャツチャード法で分析した。結果をまとめて表１ ２に示す。

表１２ 好酸性パーオキシダーゼ（ＥＰＯ）　・スキャッチャード法で得られた微生物結 合の統計学部Ｂ／Ｆ＝に、、、零　［微生物部位］ 乳酸菌（１，八〇）： トリプトフ祷ス　ネオホルマノス　２０，０００．．６０．０Ｏ０１９，１２３ ３２９５８，０５９０，９５上清液およびペレットのＥＰＯ含量は同時に実施し たＥＰＯ標準を使用して蛍光測定法で測定した。条件は表１０の凡例に記載した ものと同じてあった。

表１０と表１２のデータを比較すると、個々の微生物、例えば連鎖法菌種（ビリ ダンス）に関してＥＰＯ−結合能力はＭＰＯ−結合能力と異なっているが、両ハ ロパーオキシダーゼは共に一般的に試験した細菌に関しては大きな同様な結合能 力を有していることが示される。潜在的に重要なことは、試験した真菌、即ち、 カンジダ　アルビカンスおよびクリプトコツカス　ネオホルマンスに対してＥＰ Ｏが一層大きい結合能力を有することである。

図１０Ａは、反応容量当たり微生物当たりの非結合ＬＰＯ分子に対してプロット した黄色ブドウ球菌および連鎖法菌種（ビリダンス）当たりの結合ＬＰＯ分子を 示す。連鎖法菌種（ビリダンス）と黄色ブドウ球菌に対するＬＰＯの結合能力は ＥＰＯおよびＭＰＯで観察されたものより小さいが、ＣＰＯで観察されたものよ りはるかに大きい。

これらのデータのスキャッチャードプロットは図１０Ｂに示す。ビリダンス連鎖 球菌と黄色ブドウ球菌に対するＥＰＯの結合能力は類似しており、そしてＭＰＯ およびＥＰＯと比較すると相対的に小さい。ＬＰＯ−結合能力の調査は、ハロパ ーオキシダーゼの結合分析で上記で使用した同じ範囲の細菌、酵母および赤血球 を使用して実施した。結果をまとめて表１３に示す。

表１３ ラクトパーオキシダーゼニスキャッチヤード法で得られた微生物結合の統計学Ｂ ／Ｆ＝に、、、＊　［微生物部ｍｌ ネズミチフス菌　９０Ｇ、、、、４．００Ｇ　０．６１０　１７６　３．４６２ 　０．９２大腸菌　２．０ＧＯ，、、，５，１ＧＯ１，０５３２０１５，２３２ ０，？５乳酸菌（ＬＡＢＩ　： 乳酸桿菌（デーデルライノ）　６Ｈ，、、，３，０Ｏ００，４１５１１０３，７ ８４０，７９連鎖球菌（ビリダンス）　１．５ＧＯ，、、Ｊ、２００　Ｇ、５９ ９　１５５　３．８７７　０．２６化膿連鎖球菌（Ａ）　４．０００．、．２４ ，０００　Ｇ、５１１　２２　２２．７９３　０．８４ストレプトコブカス７ガ ラクチエ（Ｂ）１．ｏｏｏ、、、、８．０００１１．７＋３１０４６．８８４０ ．６９糞便連鎖球菌ｆｉｌ　１．２５０．、、．６．０ｏＯ０，２＋９　２５　 ８．７６２　０．６３クリプトコテｈＸ　ネオ本ルマノス　ｌｌ［１，０００， ，３００，５０００，６８４２３０２，６６４０，８６上清液およびペレットの ＬＰＯ含量は同時に実施したＬＰＯ標準を使用して蛍光測定法で測定した。条件 は表１０の凡例に記載したものと同じであった。

表１０．１１．１２および１３のデータの相互比較によって、ＬＰＯの結合能力 は一般的にＭＰＯおよびＥＰＯの結合能力より小さいが、ＣＰＯより大きいこと が示される。ＭＰＯとＥＰＯに関して上記で認められたように、ＬＰＯはグラム 陰性細菌および酵母に対して相対的により大きい結合能力を示す傾向がある。

ヒトの正常叢には乳酸産生細菌属の幾つかのメンバーが含まれている。同様に、 この属の幾つかの他のメンバーが発酵産業、例えばチーズ生産に使用される。こ れらのグラム陽性細菌は、プロトポルフィンを合成できないことが特徴である。

ダラム陽性菌に呼吸性のシトクロムが無い結果、酸化還元代謝はフラビン酵素で これらの乳酸産生細菌（ＬＡＢ）の多くは必須的にヒトおよび関連動物に固有で ある。連鎖球菌のビリダンス群のメンバー、即ち、連鎖球菌ミチス、サリバリウ ス等は口、中咽頭、および程度はより少ないが、上気道の鼻咽頭部に固有のもの である。ビリダンス連鎖球菌も膣や糞便中に一般的に見られる。ＬＡＢの乳酸桿 菌のメンバーも口中で一般的に見られる。この群の他のメンバー、即ちチシアー 桿菌（ビフィズス菌）およびデーデルライン乳酸桿菌は母乳栄養乳児および妊娠 期間中の膣に固有のものである。

「天然の２つまたはそれ以上の微生物種（または、ついでに言えば、巨大生物） が親密な関係で増殖する場合にはいつも、各々お互いに作用し、そして微生物が 宿主生物上で増殖する場合には、宿主は相互作用によって何らかの方法で影響を 受ける　「許容だけでは生物学的にそして統計的に不可能であるＪ　（Ｌｏｃｏ 　。

１９４９年）　Ｊ　（Ｒｏ＋ｅｂｕ＋ｙ、　１９６２年、Ｍｉｃ＋ｏｏ＋ｇａｎ ｉ＋ｍ＋　Ｉｎｄｉｇｅｎｏｏ＋　Ｔｏ　Ｍａｎ、ＳＭｃＧuａｖ　− Ｈｉ　ｌ　ｌ、ニューヨーク）。ＬＡＢのメンバーか病原性微生物と競合して宿 主を保護するように作用することは期待されない。「ヒトの固有の微生物叢と外 因性病原体の相互作用は５０年以上もの間散在的な研究および継続的な調査の対 象であった。

しかし乍ら、拮抗的相互作用が感染に抵抗するヒトの能力を高めることができる ことは最近証明されただけであるＪ　（Ｓａｎｄｅｎ　、　１９６９年、１．　 Ｉｎｆｅｃｔ、Ｄｉｓ、１２９：６９８〜７０７）。この見解の有効性は、抗生 物質の投与後の重複感染の現象によって示される（Ｗｅｉｎｓｔ＋ｉｎ　、　１ ９４７年、Ａ（Ｂ「、１ＭａｄＳ（ｉ、２１４：　５６〜６３；　ＭｃＣｕ＋ｄ ｙおよびＮｅｔｅ＋　、１９５２年、Ｐｅｄｉａ＋＋ｉｃｓ　９：　５７２〜５ ７６　）。

インビトロで肺炎球菌とビリダンス連鎖桿菌か髄膜炎菌や他のグラム陰性細菌を 殺害する能力は１９１５年にコールプルツク（Ｃｏｌｅｂ＋ｏｏｋ　）によって 最初に報告された（Ｌａｎｃｅｔ、　１９１５年１１月２０日、１１３６〜１１ ３８）、彼の技術は、１滴の連鎖球菌（肺炎球菌）培養物を置き、そしてそれを 寒天プレートを横切って細く流すことである。この流れの跡を乾燥させた跡、彼 は元の連鎖球菌と垂直方向に１滴のグラム陰性培養物を流すことによって上記方 法を繰り返］７た。彼は、２つの流れが交差した場所でのグラム陰性培養物の阻 止を観察した。更に、彼は、殺害の程度か２つの培養物のブレーティングを隔て る時間間隔に比例することに注目した。

「髄膜炎菌流をブレーティングする前に肺炎球菌の増殖を良好に開始させること によって、髄膜炎菌の増殖を２つの流れが出会う場所だけでなく、その点のどち らかの側のほぼ１センチメーター離れた場所でも総合的に点検した。」コールプ ルツクは、グラム陰性細菌懸濁液の濃度が非常に増加すると微生物の激しい増殖 か生しることも見い出した。［明らかに、その後、肺炎球菌は培地から髄膜炎菌 の増殖に必須のものを奪わなかったし、また他のどんな方法でも肺炎球菌は培地 をそのような生物に不適当なものとはしなかったＪ　（Ｃｏｌｅｂ＋ｏｏｋ　、 １９１５年）。ビリダンス連鎖球菌による酸およびＨ２Ｏ２の発生はミロード（ Ｍ’１ｅｏｄ）およびゴートン（Ｇｏ＋ｄｏｎ）によって１９２２年に証明され た（ＢｉｏｃｈｅＩＩＬ＋、１６：　４９９　）　ｏ連鎖球菌による髄膜炎菌阻 止に必要な時間間隔は多分連鎖球菌が発生するＨ２０２の蓄積に関係がある。

潜在的な病原体の増殖抑制における連鎖球菌のインビボでの重要性も抗生物質治 療後の重複感染の現象によって暗示される。［連鎖球菌のビリダンス群のメンバ ー、即ち殆どの人間の中咽頭叢の有力な株は小腸のグラム陰性細菌、即ちペニシ リンの大量投与で治療した後にこの部位で通常過剰に増殖する生物の増殖を阻止 することができる。抗生物質の大量投与によるこれら連鎖球菌の抑制（または消 失）がそれらの阻止作用を抑制（または消失）し、そしてそれまで阻止されてい た（または新たに導入された）細菌の増殖を可能にすることが提言された」（Ｓ ｐ＋ｏｎ＋等、１９７１年、１．　Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｄｉｓ、１２３：　ｌ〜１ ０）。

表１０のデータで示されるように、ＸＰＯ結合は微生物特異性である。更に、結 合親和性は細菌の乳酸属の正常叢のメンバーでは比較的に貧弱である。結合の選 択性は、１０２反応性の寿命制限と一緒になって、低濃度のＭＰＯの存在で生き 延びるメカニズムを有するＨ２Ｏ２産生ＬＡＢをもたらす。更に、このような状 態は実際に、拮抗的な微生物の競合において固有のＬＡＢが優位となるのに好ま しい。混合細菌環境、例えば、黄色ブドウ球菌と連鎖法菌種（ビリダンス）中に ＭＰＯを導入するとＭＰＯの黄色ブドウ球菌への選択的結合が生じる。従って、 連鎖法菌種（ビリダンス）の代謝産生物であるＨ２Ｏ２は黄色ブドウ球菌結合Ｍ ＰＯの基質として作用し、有効な活性を有するが反応寿命か限られている微生物 反応斉ｊ、例えば、ＨＯＣＩおよび特に　０２を産生ずる。実施例６に記載した ように、このようなＭＰＯが触媒する殺微生物作用は黄色ブドウ球菌に対して比 較的に選択的であろう。

赤血球の不存在下および存在下での黄色ブドウ球菌、大腸菌、緑膿菌およびカン ジダ　アルビカンスのＭＰＯ依存性殺害に与えるビリダンス連鎖球菌の相乗的影 響を次のとおり示す。

材料　細菌、酵母およびＲＢＣは実施例１に記載したようにして調製しそして定 量した。ＭＰＯは実施例２に記載したようにして調製しそして定量した。

方法　１００μｌの標的微生物懸濁液（約１０６個の微生物）、１００μｍの連 鎖法菌種（ビリダンス）懸濁液（約５°１０７個の連鎖球菌）、１００μｍのＭ ＰＯ（濃度を変化させた）、１００μｌのグルコース（１ｍｇ）　、５００　、 ｃｚｌのＮＳおよび、指示された場合、１００μｍの赤血球懸濁液（１０７個の ＲＢＣ）かまたはＮＳのいずれかを容管に加えて１ｍｌの最終容量とした。内容 物を静かに混合し、そして管を２３℃で３０分間インキュベートした。微生物殺 害は、連鎖球菌のより小さいコロニーを十分に顕在化させるためにコロニーを２ 〜３日間増殖させた以外は上記実施例１に記載したようにして、寒天プレート希 釈によって測定した。

（１）赤血球の不存在下での黄色ブドウ球菌の殺害。表１４のデータは黄色ブド ウ球菌の連鎖球菌依存性殺害に与えるＭＰＯの影響を示すものである。

表１４ 赤血球の不存在下および存在下ミニロバ−オキシダーゼ依存性のビリダンス連鎖 球菌殺微生物作用： 連鎖球菌はＭＰＯの不存在下では黄色ブドウ球菌を阻止しない。３０分の期間中 に３．７ｐｍｏｌのＭＰＯを添加すると連鎖球菌には何の影響も与えないで黄色 ブドウ球菌数を７３％減少させ、そして３３ｐｍｏｌのＭＰＯの添加は連鎖球菌 を殺さないで黄色ブドウ球菌を全滅させた。１００　ｐｍｏｌのＭＰＯ添加は黄 色ブドウ球菌の全滅をもたらしそして連鎖球菌数を１桁低下させた。

表１０のデータは黄色ブドウ球菌のＭＰＯ−結合能力が連鎖球菌より３０倍以上 であることを示している。表１４のデータは２°１０１２個のＭＰＯ分子で１０ ６個の黄色ブドウ球菌の５０％以上が殺さべそして２°１０１３個のＭＰＯ分子 では、ビリダンス連鎖球菌は比較的に生かしておいて、１０６個の黄色ブドウ球 菌を１００％殺害する。このＭＰＯの範囲は総計約１０６から１０７個のＭＰＯ 分子／黄色ブドウ球菌および１０４から１０５個のＭＰＯ分子／連鎖球菌と等し い。黄色ブドウ球菌に関するＭＰＯの高い結合能力、即ちＢ／Ｆ＝１４．６に基 づいて、利用可能なＭＰＯの極く大部分か黄色ブドウ球菌に結合する。更に、連 鎖法菌種（ビリダンス）に関する低い結合能力、即ちＢ／Ｆ＝０．４によって、 残っているＭＰＯの小部分しか連鎖球菌に結合しないことが確実である。黄色ブ ドウ球菌の殺害に必要な濃度より非常に高い濃度である１００　ｐｍｏｌのＭＰ Ｏでは、連鎖球菌には不十分であった。

黄色ブドウ球菌を完全に殺害するＭＰＯ濃度が、連鎖法菌種（ビリダンス）に対 しては最小の損傷しか与えない。これにより、ＭＰＯの導入は、拮抗的微生物競 合において黄色ブドウ球菌およびＭＰＯ結合能力の高い他の微生物より連鎖法菌 種（ビリダンス）を優位にするのに好ましい。

（２）赤血球の存在下での黄色ブドウ球菌の殺害。　表１４は、試験した種々の 濃度のｈｔｐｏの存在下連鎖法菌種（ビリダンス）依存性の黄色ブドウ球菌の殺 害に与える１０７個のＲＢＣの影響を更に記録するものである。３．７ｐｍｏｌ のＭＰＯでは殺害は全く観察されなかったが、３３．３ｐｍａｌのＭＰＯは黄色 ブドウ球菌数を５０％以上減少させた。！００　ｐｍｏｌのＭＰＯを加えると黄 色ブドウ球菌数は９５％減少し、即ち８°１０４のＣＦＵになった。この濃度の ＭＰＯは連鎖球菌も減少させたが消失させはしなかった。

ＲＢＣに対する同時的または付随的損傷は溶血の程度、即ち上清液／ペレットの ヘモグロビン比およびヘモグロビン破壊、即ち最終／初期ヘモグロビン比を測定 して評価した。反応系に１０７個のＲＢＣを加えると黄色ブドウ球菌殺害の少々 の、即ち約３倍の阻止をもたらす。ＲＢＣの添加はまた、比較的高いＭＰＯ濃度 と関連した連鎖法菌種（ビリダンス）殺害も阻止する。赤血球はカタラーゼを含 有するので、黄色ブドウ球菌と連鎖法菌種（ビリダンス）殺害の両方の阻害は大 部分、ＲＢＣカタラーゼによるＨ２Ｏ２の競合的消費に起因すると思われる。表 １０に示されるように、赤血球はＭＰＯに対して本質的に結合能力を有していな い。これは有効な黄色ブドウ球菌殺害と一緒に溶血作用の欠如が観察されたこと と一致する。連鎖球菌−ＭＰＯ系の殺微生物作用は随伴するＲＢＣの損傷は生じ させず、そしてこのため、ＲＢＣは競合的基質として作用しない。これらの観察 は、溶血作用が殺微生物作用に必要な濃度よりはるかに低いＨ２Ｏ２およびＨＯ Ｃ１濃度て観察された実施例１に示した観察とは全（対照的である。

連鎖球菌−ＭＰＯ系の赤血球阻害は直接的（ＭＰＯ−依存性）Ｈ２Ｏ２およびＨ ＯＣＩ殺害て観察されたものと比較して非常に小さい。表４および５のデータは 、同じ量のＲＢＣがＨ２Ｏ２−依存性およびＨＯＣＩ−依存性の黄色ブドウ球菌 殺害の両方で約１０００倍阻止したことを示している。

ＲＢＣの存在下で溶血作用を有さないで黄色ブドウ球菌を選択的に殺害すること はＭＰＯの選択的防腐作用に関して反応性接近の概念を強力に支持している。

即ち、標的微生物に対するＭＰＯの選択的結合は標的の損傷を最大にし、そして Ｈ２Ｏ２を発生する正常叢および宿主細胞に対する損傷を最小にする。ＭＰＯの 選択的殺微生物作用は防腐法に対する生理学的に健常な試みの根拠を提供する。

ダーキン、フレミングおよびその他の者によってこれまでに記載されたように、 宿主細胞は化学的防腐剤の損傷作用に対して微生物より感受性が高い。本願発明 は、（１）有力で広範囲の病原体を殺害でき、（２）正常叢は生存させそして正 常叢に対して選択的でさえあり、そして（３）宿主細胞には非毒性であって宿主 の免疫応答を妨げない比較的に微生物選択的なハロパーオキシダーゼ防腐剤系で ある。

（３）赤血球の不存在下での大腸菌の殺害。

表１４のデータは、連鎖球菌依存性の大腸菌殺害に与えるＭＰＯの影響を更に示 すものである。各反応で、概ね２°１０’個の大腸菌および５°１０７個の連鎖 球菌種（ビリダンス）を指示された量のＭＰＯと共に２３℃で３０分間インキュ ベートした。連鎖球菌はＭＰＯの不存在下では大腸菌を殺害しなかった。むしろ 、大腸菌は総合的にはＭＰＯの不存在下では連鎖球菌の増殖を阻止した。３．７ ｐｍｏｌのＭＰＯの添加は大腸菌を９９％以上殺害する。この濃度のＭＰＯはま た大腸菌コロニーの消失に比例して連鎖球菌コロニーの出現も生じさせる。１１ ．ｌｐｍｏｌのＭＰＯは連鎖球菌は比較的に生存させ乍ら総体的に大腸菌の殺害 をもたらすが、１００１００ｐのＭＰＯでは連鎖球菌数は１００分の１に減少し た。

大腸菌は、表１０に記載したように、少数の高親和性のＭＰＯ結合部位と多数の 比較的に低い親和性のＭＰＯ部位を有する。大腸菌の総ＭＰＯ結合能力は連鎖球 菌より大きいが、黄色ブドウ球菌について上記したものより小さい。しかし乍ら 、連鎖球菌−ＭＰＯの組合せは連鎖球菌より大腸菌に対して大きい殺害能力を発 揮する。２”ＩＯ’個の大腸菌の９９％以上の殺害が２°、０１２個のＭＰＯ分 子、即ち、約１０６個のＭＰＯ分子／大腸菌によって行われた。相対的な殺害能 力の上昇はＨＯＣＩおよび１０　のようなＭＰＯにより発生した反応剤に対して 大腸菌がより感受性が高いことを示していると思われる。

大腸菌のＭＰＯ結合能力がより小さいことは連鎖球菌の結合に利用可能な残存Ｍ ＰＯがより多くなると解釈される。従って、大腸菌の存在下での連鎖球菌殺害− 二与える１００　ｐｍｏｌのＭＰＯの影響は黄色ブドウ球菌の存在下で連鎖球菌 殺害に与える影響より大きい。

（４）赤血球の存在下での大腸菌殺害。ＭＰＯの存在下でのビリダンス連鎖球菌 依存性の大腸菌殺害に与える１０７個のＲＢＣの影響も表１４に示す。３．７ｐ ｉａｌのＭＰＯを加えると、大腸菌コロニーを５０％減少させそして連鎖球菌コ ロニーを出現させた。１１．１ｐｍｏｌのＭＰＯでは、連鎖球菌には何らの悪い 影響を与えることなく、大腸菌数は９９％以上消失させ、即ち１”　Ｉｏ’のＣ ＦＵになる。大腸菌の完全な殺害および連鎖球菌の僅かな減少が１００　ｐｍｏ ｌのＭＰＯで行われた。

黄色ブドウ球菌で上記で観察されたように、反応系に１０７個のＲＢＣを加える と小さい、約３倍の大腸菌殺害阻止がもたらされる。添加されたＲＢＣはまた、 比較的に高いＭＰＯ濃度に関連した連鎖球菌殺害も阻止する。表１４に記載され るように、全体的な大腸菌殺害をもたらすＭＰＯ量は溶血作用をもたらさなかっ た。ＲＢＣの存在下での黄色ブドウ球菌殺害に関して」己で観察されたように、 少量のＭＰＯを混合微生物懸濁液に導入すると大腸菌の選択的且つ総合的破壊を 生じさせ、非病原性連鎖球菌の優位性に選択的に助力し、そして随伴する赤血球 への障害は生じさせない。

（５）赤血球の不存在下および存在下での緑膿菌の殺害。

試験した全ての微生物のうちで、緑膿菌がＭＰＯの殺微生物作用に対して最も感 受性である。表１４のデータはＲＢＣの不存在下で０．４ｐｍｏｌのＭＰＯを使 用して９９％以上の殺害、およびＲＢＣの存在下で１．２ｐｍｏｌのＭＰＯを使 用して８５％の殺害を示すものである。溶血的損傷は試験したＭＰＯ濃度のいず れでも観察されなかった。

この殺害研究の結果は表１０の結合データと一致する。緑膿菌は少数の極端に高 い親和性のＭＰＯ結合部位および多数の高親和性の結合部位を有する。緑膿菌の 全体的なＭＰＯ結合能力は試験した他の微生物より大きい。

（６）赤血球の不存在下および存在下でのカンジダ　アルビカンスの殺害。

カンジダ　アルビカンスはＭＰＯ−依存性の殺微生物作用に対して感受性である 。表１４に示されるように、１．２ｐｍｏｌのＭＰＯはＲＢＣの不存在下で９７ ％の殺害をもたらす。しかし乍ら、殺害はＲＢＣの存在によって非常に損なわれ る。

ＲＢＣの存在下溶血作用の徴候なしに概ね同一の殺害活性を得るためには１００ １００ｐのＭＰＯが必要である。

ＭＰＯ−依存性のカンジダ　アルビカンス殺害結果は表１０に示されるＭＰＯ− カンジダ　アルビカンス結合の結果と一致する。カンジダ　アルビカンス、即ち 真核性酵母は試験した細菌と比べて相対的に大きい。各酵母は約１０’個のＭＰ Ｏ結合部位を有しているが、これらの部位は比較的に親和性が低い。カンジダア ルビカンスの全体的なＭＰＯ結合能力は連鎖球菌種（ビリダンス）やＲＢＣより 大きい。ＭＰＯにビリダンス連鎖球菌を加えると効果的にカンジダを殺害する。

赤血球のカンジダ殺害阻止は多分、ＲＢＣカタラーゼが比較的に小さいＭＰＯ結 合親和性と一緒になってビリダンス連鎖球菌性Ｈ２０２を破壊することを反映し ている。

カンジダ　アルビカンスは正常叢と病原体の間の灰色領域にある。これは典型的 に存在し、そして正常叢の小部分を占める。カンジダは、特に、実際上カンジダ の過剰増殖および重複感染を選択する原核細胞特異性抗生物質の使用に関係があ る免疫を損傷された宿主で問題となる。表１４のデータは、カンジダを殺害しモ して酵母の過剰増殖を抑制するためにＭＰＯと組み合わせたビリダンス連鎖球菌 の相乗作用を示すものである。

（７）　（ＩＪＩＩ連鎖球菌（Ａ群）およびストレプトコッカス　アガラクチェ （Ｂ群）の直接的なＭＰＯ殺害。

材料　全て連鎖法菌属のメンバーである細菌をトッド−へビット　ブイヨン（Ｔ ＨＢ）中で一夜増殖させた。ＲＢＣおよびＭＰＯは実施例］および２に記載した ようにして調製しそして定量した。

方法　１００μｍの標的微生物懸濁液（約１０６個の微生物）　、１００μｍの ＭＰＯ（濃度を変化させた’）　、１００μｌのグルコース（１ｍｇ）　、６０ ０μ！のＮＳおよび、指示される場合、赤血球懸濁液（１０７個のＲＢＣ）かま たはＮＳかのいずれか１００μｍを容管に加えて１ｍｌの最終容量とした。この 内容物を静かに混合し、そして管は２３℃で３０分間インキュベートした。微生 物殺害は、コロニーを血液寒天上にブレーティングしそして小コロニーを十分に 発育させモして溶血パターンを得るために２日間増殖させた以外は上記実施例１ に記載したようにして寒天プレート希釈によって測定した。

連鎖法菌属の全てではないが多数のメンバーは代謝産生物としてＨ２０２を発生 する。表１０に示された結果は、連鎖法菌属のメンバーもＭＰＯ結合能力に関し ては異なっていることを示している。これらの観察はＭＰＯ殺害に対する感受性 に差異がある可能性を示唆する。表１５に示される結果はこの可能性を実証して いる。

表１５ 種々の連鎖球菌に対するミニロバ−オキシダーゼの直接的殺微生物作用ＭＰＯは 連鎖球菌種（ビリダンス）、化膿連鎖球菌（Ａ群）およびストレプトコッカス　 アガラクチェ（Ｂ群）を直接殺害するが、糞便連鎖球菌（Ｄ群）の直接的殺害は もたらさない。ＲＢＣの存在はＭＰＯの殺微生物作用を減少させるが溶血作用は 最小であった。

ＭＰＯ殺害に関して、化膿連鎖球菌（Ａ群）はＲＢＣの不存在下でストレプトコ ッカス　アガラクチェ（Ｂ群）および連鎖球菌種（ビリダンス）より一層感受性 である。この順序は表１０に示したＭＰＯ結合親和性および能力と一致する。

この結合−殺害の関係はＲＢＣの存在によって歪められる。ＲＢＣはＭＰＯとは 結合しないが、Ｈ２Ｏ２を破壊できるカタラーゼを含有している。微生物殺害に 差異のある阻止は、種々の連鎖球菌によるＨ２Ｏ２発生の種々の速度に比例した 一定量のＲＢＣカタラーゼの作用を反映していると思われる。

糞便連鎖球菌（Ｄ群）は、アルファ型またはベータ型の溶血性ではなくそして代 謝産生物としてＨ２Ｏ２を放出しない試験群の唯一のメンバーである。かくして 、最も高いＭＰＯ結合親和性および能力を有しているにも拘わらず、糞便連鎖球 菌はＨ２０２の外部供給源の不存在下ではＭＰＯの作用から保護される。

これらの観察はＬＡＢ属の病原性メンバーの直接的ＭＰＯ殺害を実証しており、 そしてＡ群および／またはＢ群の連鎖球菌コロニー形成または感染を消失させる ＭＰＯの治療的な有用性を証明している。

（８）赤血球の不存在下および存在下でのビリダンス連鎖球菌−クロロパーオキ シダーゼの相乗的殺微生物作用。

材料・細菌、酵母およびＲＢＣは上記したようにして調製しそして定量した。

ＣＰＯはシグマ　ケミカル　カンパニーから購入しそして実施例７に記載したよ うにして調製した。

方法・方法論は、ＣＰＯが使用したハＯ／々−オキシダーゼであった以外は上記 したとおりであった。

ＣＰＯはハロパーオキシダーゼ作用の比較分析用のデータを提供するためにＭＰ Ｏの代わりに使用した。ビリダンス連鎖球菌と組み合わせたＣＰＯの殺微生物能 力は上記した３種の細菌と１種の酵母を使用して試験し、そしてその結果は表１ ６に示す。

表１６ 赤血球の不存在下および存在下クロロパーオキシダーゼ依存性のビリダンス連鎖 球菌殺微生物作用 大腸菌　無し　２，５００，０００　２，８００．Ｇｏｏ　１．０　０．０黄色 ブドウ球菌　無し　２，４００，０００　２，００Ｇ、０００　１．１　０．０ ＲＢＣの不存在下で、ビリダンス連鎖球菌はビリダンス連鎖球菌−ＭＰＯ系で上 記で得られた結果と比肩できるＣＰＯ−依存性殺菌活性を発揮するが、ＭＰＯ系 とは異なって、ＣＰＯ系はカンジダ　アルビカンスは効果的には殺害しなかった 。ＭＰＯとＣＰＯは共に、ハライド酸化および　０２生成に関して比肩し得る活 性を有しているが、表１０および１１のＭＰＯとＣＰＯの結合データを比較する とＭＰＯの微生物結合能力の方が非常に大きいことを示している。

ＭＰＯとＣＰＯのＨＯＣＩおよび１０　発生は共に殺微生物効果をもたらすが、 ＣＰＯ系は付随的な損傷が最小である選択的殺害に必要な高度の特異性を欠いて いる。カンジダは試験したどの濃度でもＣＰＯによって殺害されない。溶血作用 の形態の付随的な損傷は１０ｐｍｏｌの上記のＣＰＯ／ｍｌで観察される。

材料・カンジダ　アルビカンスは実施例１０に記載したようにして調製しそして 定量した。ＥＰＯおよびＭＰＯは実施例２に記載したようにして調製した。

方法、方法論は、ＥＰＯとＭＰＯを共に使用しそして両ハライド、即ちＣＩ−お よびＢｒ−並びにＨ２０２の濃度を変えた以外は実施例３で上記したとおりであ った。

実施例３で上記で考察したように、ハライド／　Ｈ２０２比はハロパーオキシダ ーゼの安定性および機能に関して重要な要素である。非常に低い比では、Ｈ２Ｏ ２はハロパーオキシダーゼの機能を阻害することができ、そして非常に高い比率 では、ハライドは触媒作用を競合的に阻害することができる。

表１７は、ＣＩ−／Ｈ２Ｏ２比をカンジダ　アルビカンスのＭＰＯおよびＣＰＯ 依存性殺害に関連づけているデータを表わす。カンジダはＨ２Ｏ２の直接的作用 に対して耐性であるので、標的微生物として選択した。データはカンジダ　アル ビカンス　ＣＦＵとして示す。Ｃｌ　−／　Ｈ２０２比を以下に示し、そして殺 害パーセントはこの比の下に示す。

表１７ ミニロバ−オキシダーゼおよび好酸性パーオキシダーゼ依存性のカンジダアルビ カンス殺害に与えるＣＩ−：Ｈ２Ｏ２比および量の影響好酸性パーオキシダーゼ ：１ｐｍｏｌ ］　カンジダ　アルビカンスのコロニー形成単位数。

ハロパーオキシダーゼとしてＭＰＯを用いると、殺カンジダ作用は１から４０， ０００のＣ１−／Ｈ２Ｏ２比で検出さね、そして本質的に完全な殺害は２００か ら４０，０００の範囲で観察された。ハライド／　Ｈ２０２比は効果的な殺微生 物環境の形成における重要な考慮事項である。低いＨ２Ｏ２濃度では、ＣＩ−が 体液の遍在成分であるので、相対的に高い比が本質的に保証される。正常な対象 （ヒト）では、血漿のＣｔ−値は９１１〜１（ＩＴ　μｌｌ１ｏｌ　／ｍｌの範 囲であり：脳を髄液の値は１１９〜１３１μｍｏｌ　／ｍｌの範囲であり；唾液 の値は７〜４３μｍｏｌ　／ｍｌの範囲であり、そして汗の値は４〜６０μｍｏ ｌ　／ｍｌの範囲である。刺激された胃の分泌は４６０〜１，０４０μＳＯ１／ ｍｌの範囲であり、そして尿排泄は８０．０００〜２７０．０００　μｍｏｌ　 ／日の範囲である（Ｇｅｉｇ７５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　ｔａｂｌｅ＋　、第８版 、１９８１年、Ｃｉｂｘ−Ｇｅｉｇ７　ｔｌｄ、、バーゼル、スイス）。５μｎ ｏｔ　７ｍ１未満のＨ２Ｏ２を含有する体液を得るのは困難であるので、酵素の 大部分の防腐的および選択的抗微生物適用では、利用可能なＨ２０２の濃度は５ μｎｏｔ　７ｍ１未満、好ましくは０，５μｎｏｔ　７ｍ１未満、そして最も好 ましくは０．θ５μａｏ＋ｌ　７ｍ１未満に維持すべきである。

ハロパーオキシダーゼとしてＥＰＯを用いると、殺カンジダ作用は試験した０か ら４０．０００の範囲内のＣ１−／Ｈ２Ｏ２比では有効でなかった。上記したよ うに、塩化物はＥＰＯ殺微生物作用のハライド補因子として相対的に無効である 。

表１８のデータは、Ｂｒ−／Ｈ２Ｏ２比をＭＰＯおよびＥＰＯ依存性のカンジダ 　アルビカンス殺害に関連づけるものである。データは表１７で上記したように して示す。

表１８ ミニロバ−オキシダーゼおよび好酸性パーオキシダーゼ依存性のカンジダ　アル ビカンス殺害に与えるＢｒ−・Ｈ２０２比および量の影響：臭化物、νｍｏｌ 好酸性パーオキシダーゼ：１ｐｍｏ１ １、カンジダ　アルビカンスのコロニー形成単位数。

ハロパーオキシダーゼとしてＭＰＯを用いると、殺カンジダ作用は２から４．０ ００のＢｒ−／Ｈ２Ｏ２比では検出されず、そして本質的に完全な殺害は２０か ら４００の範囲で観察された。ハロパーオキシダーゼとしてＥＰＯを使用すると 、殺害は０．２から４，０００の範囲のＢｒ−／Ｈ２Ｏ２比で観察さね、そして 本質的に完全な殺害は２から４００の範囲で得られた。ＭＰＯに比較してＥＰＯ の殺カンジダの有効性の上昇は、表１０および１３に示されるこれらハロパーオ キシダーゼのカンジダ　アルビカンスに対する相対的な結合親和性と一致する。

正常なヒト対象では、血漿のＢｒ−値は０．０４９〜０．９３μｍｏｌ　／ｍｌ の範囲であり：脳を髄液の値は０．０１８〜Ｇ、０４８μｍｏｌ　／ｍｌの範囲 であり：唾液の値は０．００３〜０、０１３　μｍｏｌ　／＋ｌの範囲であり、 そして汗の値は０．００２〜０．００６　μｍｏｌ　／ｍｌの範囲である。Ｂｒ −は胃壁細胞によってＣＩ−に優先して分泌さね、そして尿排泄は２０〜８４μ ｍｏｌ　／日の範囲である（Ｇｅｉｇｙ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｔｘｂｌｅｓ 　ｓ第８版、１９８１年、ＣＩ−Ｇｅｉ訂Ｌｔｄ、、バーゼル、スイス）。体液 中で利用可能なりｒ−の濃度は典型的には５　ｎｍｏｌ　／ｍｌから９０ｎａ＋ ｏｌ　／ｍｌの範囲である。それ故、Ｂｒ−の補給がなければ、ＥＰＯまたはＬ ＰＯのような臭素要求性のハロパーオキシダーゼの大部分の防腐的または選択的 抗微生物適用では、利用可能なＨ２Ｏ２の濃度は０．０１μｍｏｌ　／＋１未満 、好ましくは０．００１μｍｏｌ　７ｍ１未満に維持すべきである。

臭素は囮の治療に治療的に使用される。この治療的範囲は９〜１８μｍｏｌ／ｍ ｌであり、１６μｍａｔ　／ｍｌを超えると毒性があると報告されている（Ｃｅ ｅｉｌ’　ｓ　Ｔｅｘｊｂ。

ｏｋ　ｏｌ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、第１８版、１９８８年、Ｗ、Ｂ、５ａｕｎｄｅ ＋ｓ　Ｃｏ１、フィラデルフィア）。

それ故、毒性を有さないで体液のＢｒ−濃度を１０倍から１００倍高めることは 可能である。これにより、ＥＰＯまたはＬＰＯが選択されるハロパーオキシダー ゼである場合、Ｂｒ−を毒性範囲未満の濃度にまで処方に加えることができ、そ してＨ２Ｏ２濃度は最適範囲内のＢｒ−／Ｈ２Ｏ２比を維持するように比例して 高めることができる。

実施例１す る付随的損傷および微生物叢の選択的制御が最小で微生物を殺害するハロパーオ キシダーゼの使用を示唆している。これらの可能性を完全に具現化するためには 、ハロパーオキシダーゼは競合的基質で満たされた媒体中で微生物を効果的に殺 害しなければならない。次の実験はミニロバ−オキシダーゼの殺菌活性に与える 複雑な媒体の影響を試験するために行った。

材料および方法；材料および方法は、反応媒体が標準濃度の１７２希釈のシミラ ック（Ｓｉｍｉｌｌｃ　）　（登録商標）乳児処方（Ｒｏｓｓ　Ｌｘｂｏ＋ａｊ ｏｒｉｅｓ　、Ａｂｂｏｔ４　Ｌａｂｏｒｔｌｏ＋ｉｅｓの部門）を含有してい た以外は実施例３に記載したとおりであった。

表１９のデータは、１７２標準濃度のシミラック（登録商標）の存在下で大腸菌 および黄色ブドウ球菌に与える種々の濃度のＨ２Ｏ２のＭＰＯ−依存性殺菌作用 を示す。種々の濃度のＨ２Ｏ２によるＭＰＯ−依存性殺微生物作用は上記実施例 ３に記載されており、そして表８Ａのデータで示されている。

シミラック（登録商標）はタンパク質、脂肪、炭水化物およびビタミンの複合懸 濁液である。試験に使用した濃度では、媒体各１ｍｌはｌＯｐｍｏｌのＭＰＯお よび指示された量のＨ２Ｏ２に加えて７．５ｍｇのタンパク質、１８ｍｇの脂肪 （このうち、４．４ｍｇはリノール酸である）、３６ＩＩ１ｇの炭水化物および ３０μｇのアスコルビン酸（ビタミンＣ）を含有していた。比較的高濃度の競合 的基質、例えばリノール酸および還元剤、例えばアスコルビン酸はＭＰＯの殺微 生物作用の大きな阻止をもたらすが、この阻止にも拘わらず、残存するＭＰＯの 殺微生物能力は有効なままである。表１９のデータは、０．６μｍｏｌ　７ｍ１ 未満のＨ２Ｏ２でも殺菌作用が完全であることを示している。

表１９ ミニロバ−オキシダーゼ依存性のＨ２Ｏ２殺害能力に与えるシミラック（登録商 標）乳児処方の影響Ｈ２０□、　ＭＰｏ無し　ＭＰｏ、　１０　ｐｍｏｌ生−」 吻　１四ｌ　ＣＦＵ＋　ＣＦＵ＋大腸菌　無し　６，７００．０００　４，５０ ０，０００黄色ブドウ球菌　無し　４，０００，００Ｇ　５，３００，０００シ ミラツク（登録商標）は１／２標準濃度で使用した。試験懸濁液の各１ｍｌは７ 、５＋ｎｇのタンパク質、１８ｍｇの脂肪（このうち、４．４ｍｇはリール酸で ある）、３６ｍｇの炭水化物および３０μｇのアスコルビン酸を含有していた。

微生物に結合するハロパーオキシダーゼは複雑な媒体を滅菌するために比較的低 い濃度で使用することができる。同様に、実施例６から９に記載したように微生 物に特異的に結合しそして殺害するハロパーオキシダーゼの特性は、叢組成の選 択的制御におけるハロパーオキシダーゼの潜在的な役割を示唆している。これら のハロパーオキシダーゼは医薬療法のみならず発酵法の制御に適用することがで きる。

本発明の防腐剤方法および組成物の種々の修正および改変は、前述したことから 当該技術分野の熟練者に明白であろう。このような任意の修正および改変は、先 行技術によって排除されない限り、下記の請求の範囲内であるように意図するも のである。

波長、ナノメーター 波長、ナノメーター 波長、ナノメーター 図ｓＡＭＰＯ，ｐｍｏｌ Ｏフ Ｏ二　〜 図６　Ｂ　ＣＬ、メガカウント／２０秒図７Ａ 禦 遊　離Ｈρ０．キロ分子／微生物 図７Ｂ 結　合　ＭＰＯ，キロ分子／微生物 図７Ｃ 遊　離ｃｐｏ、キロ分子／微生物 図８Ａ 結　合ｃｐｏ、キロ分子／微生物 図８Ｂ 遊　離ＥＰＯ，キロ分子／微生物 結　合　ＥＰＯ，キロ分子／微生物 図９Ｂ 遊　離ＬＰＯ，キロ分子／微生物 図１ＯＡ 結　合ＬＰＯ，キロ分子／微生物 図１．ＯＢ 国際調査報告

Claims (58)

【特許請求の範囲】
1. １．治療を必要とするヒトまたは動物宿主の治療方法であって、該方法は過酸化 物およびハライドの存在下病原性徴生物の増殖を阻止するのに治療的に有効であ るが対象の正常な細胞を顕著に損傷するには無効である量のハロパーオキシダー ゼを上記宿主に投与することを含む方法。
2. ２．上記宿主に投与するハロパーオキシダーゼの量が該宿主の正常叢を消失させ るには無効である請求項１に記載の方法。
3. ３．上記宿主の正常叢の再コロニー形成を促進するのに有効な量の正常叢を該宿 主に投与することから更になる請求項１に記載の方法。
4. ４．ハロパーオキシダーゼがミエロパーオキシダーゼ（ＭＰＯ）、好酸性パーオ キシダーゼ（ＥＰＯ）、ラクトパーオキシダーゼ（ＬＰＯ）、クロロパーオキシ ダーゼ（ＣＰＯ）および病原性徴生物に選択的に結合し、ハライドを酸化しそし て過酸化物の不均化を高めて一重項分子酸素を形成し得る上記の誘導体からなる 群から選択される請求項１に記載の方法。
5. ５．ハロパーオキシダーゼがＭＰＯまたは病原性徴生物に選択的に結合し得るＣ ＰＯ誘導体でありそしてハライドが塩化物または臭化物である請求項４に記載の 方法。
6. ６．ハライドが塩化物でありそして病原性徴生物部位における塩化物対過酸化物 の比を約１から４０，０００の範囲に維持することから更になる請求項５に記載 の方法。
7. ７．塩化物対過酸化物の比が約２００から約４０，０００の範囲に維持される請 求項６に記載の方法。
8. ８．ハロパーオキシダーゼがＥＰＯ、ＬＰＯまたは病原性徴生物に選択的に結合 し得るＬＰＯ誘導体でありそしてハライドが臭化物である請求項４に記載の方法 。
9. ９．病原性徴生物部位における臭化物対過酸化物の比を約０．１から約４，００ ０の範囲に維持することから更になる請求項８に記載の方法。
10. １０．臭化物対過酸化物の比が約１から約１，０００の範囲に維持される請求項 ９に記載の方法。
11. １１．ハロパーオキシダーゼが上記対象に液体溶液の形態で投与されそして該溶 液１ｍｌ当たり約０．０１ｐｍｏｌから約５００ｐｍｏｌのハロパーオキシダー ゼが該対象に投与される請求項１に記載の方法。
12. １２．上記溶液１ｍｌ当たり約０．１ｐｍｏｌから約５０ｐｍｏｌのハロパーオ キシダーゼが上記対象に投与される請求項１１に記載の方法。
13. １３．上記溶液１ｍｌ当たり約０．５ｐｍｏｌから約５ｐｍｏｌのハロパーオキ シダーゼが上記対象に投与される請求項１２に記載の方法。
14. １４．過酸化物または上記対象に投与されるとき過酸化物を生成し得る物質を該 対象に投与することから更になる請求項１に記載の方法。
15. １５．病原性微生物の感染をわずらっているヒトまたは動物宿主を治療する方法 であって、該方法は過酸化物およびハライドの存在下防腐剤的に有効であるが該 宿主の正常な細胞を顕著に損傷するには無効である量のハロパーオキシダーゼを 該宿主に投与することを含む方法。
16. １６．上記宿主に投与されるハロパーオキシダーゼの量が該宿主の正常叢を消失 させるには無効である請求項１５に記載の方法。
17. １７．上記宿主の正常叢の再コロニー形成を促進するのに有効な量の正常叢を該 宿主に投与することから更になる請求項１５に記載の方法。
18. １８．ハロパーオキシダーゼがミエロパーオキシダーゼ（ＭＰＯ）、好酸性パー オキシダーゼ（ＥＰＯ）、ラクトパーオキシダーゼ（ＬＰＯ）、クロロパーオキ シダーゼ（ＣＰＯ）および病原性徴生物に選択的に結合し、ハライドを酸化しそ して過酸化物の不均化を高めて一重項分子酸素を形成し得る上記の誘導体からな る群から選択される請求項１５に記載の方法。
19. １９．ハロパーオキシダーゼがＭＰＯまたは病原性微生物に選択的に結合し得る ＣＰＯ誘導体でありそしてハライドが塩化物または臭化物である請求項１８に記 載の方法。
20. ２０．ハライドが塩化物でありそして感染部位における塩化物対過酸化物の比を 約１から４０，０００の範囲に維持することから更になる請求項１９に記載の方 法。
21. ２１．塩化物対過酸化物の比が約２００から約４０，０００の範囲に維持される 請求項２０に記載の方法。
22. ２２．ハロパーオキシダーゼがＥＰＯ、ＬＰＯまたは病原性微生物に選択的に結 合し得るＬＰＯ誘導体でありそしてハライドが臭化物である請求項１８に記載の 方法。
23. ２３．感染部位における臭化物対過酸化物の比を約０．１から約４，０００の範 囲に維持することから更になる請求項２２に記載の方法。
24. ２４．臭化物対過酸化物の比が約１から約１，０００の範囲に維持される請求項 ２３に記載の方法。
25. ２５．ハロパーオキシダーゼが上記宿主に液体溶液の形態で投与されそして該溶 液１ｍｌ当たり約０．０１ｐｍｏｌから約５００ｐｍｏｌのハロパーオキシダー ゼが該宿主に投与される請求項１５に記載の方法。
26. ２６．上記溶液１ｍｌ当たり約０．ｌｐｍｏｌから約５０ｐｍｏｌのハロパーオ キシダーゼが上記宿主に投与される請求項２５に記載の方法。
27. ２７．上記溶液１ｍｌ当たり約０．５ｐｍｏｌから約５ｐｍｏｌのハロパーオキ シダーゼが該宿主に投与される請求項２６に記載の方法。
28. ２８．過酸化物または過酸化物を生成し得る物質を上記宿主に投与することから 更になる請求項１５に記載の方法。
29. ２９．第１の徴生物が第２の徴生物より結合ハロパーオキシダーゼ対遊離ハロパ ーオキシダーゼ比が大きい第１の徴生物と第２の徴生物からなる媒体中で第１の 徴生物の増殖を選択的に阻止する方法であって、該方法は過酸化物およびハライ ドと接触するとき第１の徴生物に選択的に結合しそして該微生物の増殖を阻止す るのに有効であるが第２の徴生物を消失させるには無効である量のハロパーオキ シダーゼを上記媒体に導入するを含む方法。
30. ３０．ハロパーオキシダーゼがミエロパーオキシダーゼ（ＭＰＯ）、好酸性パー オキシダーゼ（ＥＰＯ）、ラクトパーオキシダーゼ（ＬＰＯ）、クロロパーオキ シダーゼ（ＣＰＯ）および第１の徴生物に選択的に結合し、ハライドを酸化しそ して過酸化物の不均化を高めて一重項分子酸素を形成し得る上記の誘導体からな る群から選択される請求項２９に記載の方法。
31. ３１．ハロパーオキシダーゼがＭＰＯまたは第１の徴生物に選択的に結合し得る ＣＰＯ誘導体でありそしてハライドが塩化物または臭化物である請求項３０に記 載の方法。
32. ３２．ハライドが塩化物でありそして治療部位における塩化物対過酸化物の比を 約１から４０，０００の範囲に維持することから更になる請求項３１に記載の方 法。
33. ３３．塩化物対過酸化物の比が約２００から約４０．０００の範囲に維持される 請求項３２に記載の方法。
34. ３４．ハロパーオキシダーゼがＥＰＯ、ＬＰＯまたは第１の徴生物に選択的に結 合し得るＬＰＯ誘導体でありそしてハライドが臭化物である請求項３０に記載の 方法。
35. ３５．治療部位における臭化物対過酸化物の比を約０．１から約４．０００の範 囲に維持することから更になる請求項３４に記載の方法。
36. ３６．臭化物対過酸化物の比が約１から約１．０００の範囲に維持される請求項 ３５に記載の方法。
37. ３７．上記宿主が、液体溶液１ｍｌ当たり約０．０１ｐｍｏｌから約５００ｐｍ ｏｌのハロパーオキシダーゼからなる液体溶液と接触させられる請求項２９に記 載の方法。
38. ３８．上記液体溶液が１ｍｌ当たり約０．１ｐｍｏｌから約５０ｐｍｏｌのハロ パーオキシダーゼを含む請求項３７に記載の方法。
39. ３９．上記液体溶液が１ｍｌ当たり約０．５ｐｍｏｌから約５ｐｍｏｌのハロパ ーオキシダーゼを含む請求項３８に記載の方法。
40. ４０．上記第１の徴生物に過酸化物または過酸化物を生成し得る物質を接触させ ることから更になる請求項２９に記載の方法。
41. ４１．過酸化物およびハライドの存在下ヒトまたは動物宿主に投与するとき、該 宿主中の病原性徴生物に選択的に結合しそして該徴生物の増殖を阻止するのに有 効な量のハロパーオキシダーゼ並びに製薬的に受容可能な担体を含む製薬組成物 。
42. ４２．ハロパーオキシダーゼがミエロパーオキシダーゼ（ＭＰＯ）、好酸性パー オキシダーゼ（ＥＰＯ）、ラクトパーオキシダーゼ（ＬＰＯ）、クロロパーオキ シダーゼ（ＣＰＯ）および病原性徴生物に選択的に結合し、ハライドを酸化しそ して過酸化物の不均化を高めて一重項分子酸素を形成し得る上記の誘導体からな る群から選択される請求項４１に記載の組成物。
43. ４３．ハロパーオキシダーゼがＭＰＯまたは病原性徴生物に選択的に結合し、塩 化物または臭化物を酸化しそして過酸化物の不均化を高めて一重項分子酸素を形 成し得るＣＰＯ誘導体である請求項４２に記載の組成物。
44. ４４．製薬的に受容可能な液体担体中１ｍｌ当たり約０．０１ｐｍｏｌから約５ ００ｐｍｏｌのミエロパーオキシダーゼを含む請求項４３に記載の組成物。
45. ４５．製薬的に受容可能な液体担体中１ｍｌ当たり約０．１ｐｍｏ１から約５０ ｐｍｏｌのミエロパーオキシダーゼからなる請求項４４に記載の組成物。
46. ４６．製薬的に受容可能な液体担体中１ｍｌ当たり約０．５ｐｍｏ１から約５ｐ ｍｏｌのミエロパーオキシダーゼからなる請求項４５に記載の組成物。
47. ４７．ハロパーオキシダーゼがＥＰＯ、ＬＰＯまたは病原性微生物に選択的に結 合し、臭化物を酸化しそして臭化物の存在下過酸化物の不均化を高めて一重項分 子酸素を形成し得るＬＰＯ誘導体である請求項４２に記載の組成物。
48. ４８．製薬的に受容可能な液体担体中１ｍｌ当たり約０．０１ｐｍｏｌから約５ ００ｐｍｏｌの好酸性パーオキシダーゼを含む請求項４７に記載の組成物。
49. ４９．製薬的に受容可能な液体坦体中１ｍｌ当たり約０．１ｐｍｏｌから約５０ ｐｍｏｌの好酸性パーオキシダーゼを含む請求項４８に記載の組成物。
50. ５０．製薬的に受容可能な液体担体中１ｍｌ当たり約０．５ｐｍｏｌから約５ｐ ｍｏｌの好酸性パーオキシダーゼを含む請求項４９に記載の組成物。
51. ５１．製薬的に受容可能な液体担体中約１０ｎｍｏｌから約１０μｍｏｌの臭化 物から更になる請求項４７に記載の組成物。
52. ５２．１ｍｌ当たり約１００ｎｍｏｌから約１μｍｏｌの臭化物を含む請求項５ １に記載の組成物。
53. ５３．過酸化水素から更になる請求項４１に記載の組成物。
54. ５４．製薬的に受容可能な液体担体中１ｍｌ当たり約１ｎｍｏｌから約１０μｍ ｏｌの過酸化水素を含む請求項５３に記載の組成物。
55. ５５．製薬的に受容可能な液体担体中１ｍｌ当たり約５ｎｍｏｌから約５μｍｏ ｌの過酸化水素を含む請求項５４に記載の組成物。
56. ５６．製薬的に受容可能な液体担体中１ｍｌ当たり約１０ｎｍｏｌから約１μｍ ｏｌの過酸化水素を含む請求項５５に記載の組成物。
57. ５７．ヒトまたは動物宿主に投与するとき、１分当たり１ｍｌ当たり約１ｐｍｏ ｌから約１００ｎｍｏｌの過酸化物を発生するのに有効な過酸化物生成オキシダ ーゼから更になる請求項４１に記載の組成物。
58. ５８．請求項４１の製薬組成物を含む創傷用包帯。