DE69233698T2 - Haloperoxidase zur Behandlung von Infektionen und Kontrolle der Flora - Google Patents

Haloperoxidase zur Behandlung von Infektionen und Kontrolle der Flora Download PDF

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Description

  • Bereich der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Verfahren und Zusammensetzungen zur Behandlung von Infektionen und Steuerung von Florazusammensetzungen. Mehr spezifischer bezieht sich die vorliegende Erfindung auf antiseptische Verfahren und Zusammensetzungen unter Verwendung von mikrobizider Aktivität der Haloperoxidase.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Historischer Hintergrund:
  • Die Verwendung von oxidierenden Antiseptika und Desinfektionsmitteln hat eine interessante Entwicklung genommen, die bis ins späte 18. Jahrhundert zurückgeht. Aufgrund der Relevanz von Hypohalit- und Peroxidantiseptika für die vorliegende Erfindung wird deren Geschichte gekürzt dargelegt. 1788 beschrieb der französische Chemiker Berthollet die desinfizierenden und bleichenden Eigenschaften einer Lösung, die aus wässrigem Alkali und Chlor hergestellt wurde, und 1792 wurde ein auf Kalium basierendes Präparat mit einer ähnlichen Zusammensetzung, eau de Javel, im Handel als Desinfektionsmittel verkauft. 1820 stellte Labarraque eine Lösung aus einem wässrigen Natriumcarbonat und Chlor her. Dieser liqueur de Labarraque war für seine desinfizierenden und desodorierenden Eigenschaften wohlbekannt. 1846 verwendete Semmelweiß Chlorkalk, eine Calcium-Hypochlorit-Lösung, erfolgreich bei der Steuerung der Verbreitung von puerperaler Sepsis, und 1881 präsentierte Koch seine Resultate über die bakterizide Wirkung von Hypochlorit.
  • 1818 synthetisierte Thenard Wasserstoffperoxid (H2O2) durch die Reaktion von verdünnter Säure mit Bariumdioxid, um eine 3 bis 4% Lösung von H2O2 hervorzubringen, die relativ instabil war. Die desinfizierenden Eigenschaften von H2O2 wurden Mitte des 19. Jahrhunderts erkannt. Seine Verwendung wurde empfohlen, um Wasser und Milch unbedenklich zu machen, Abwasser zu desinfizieren; es wurde in der Medizin, Chirurgie, Zahnheilkunde, beim Friseur etc., angewandt (Heinemann, 1913, J.A.M.A., 60: 1603-1606). Seine antiseptische Kapazität ist im Vergleich zu Hypochloriten allerdings relativ schlecht.
  • Die antiseptische Wirkung von Farbstoffen war ebenfalls bekannt und wurde vor und während des Ersten Weltkrieges eingesetzt. 1900 berichtete Raab, dass der Farbstoff Acridin lebende Zellen (d.h. Pantoffeltierchen) nur in Anwesenheit von Licht abtötet (Z. Biol. 39: 524 ff), und 1905 zeigten Jodlbauer und von Tappeiner, dass O2 für die farbstoffsensibilisierte Abtötung mit Licht („photokilling") von Bakterien (Deut.Arch.Klin.Med. 82: 520-546) benötigt wird. Farbstoffsensibilisierte, O2-abhängige Photooxidations- und Photooxigenierungsreaktivität wird üblicherweise als photodynamische Aktivität bezeichnet (Slum, 1941, Photodynamic Action and Diseases caused by Licht, Reinhold, New York). Farbstoffe, wie Flavin und Brilliantgrün waren als antiseptische Wirkstoffe wirksam, sogar wenn sie bei relativ hohen Streckungen in einem serumhaltigen Medium verwendet wurden. Unglücklicherweise hatten diese Farbstoffe zusätzlich zu ihrer starken antimikrobiellen Wirkung auch eine schädliche Wirkung auf den Wirten, d.h. sie töteten Leukozyten ab (Fleming, 1919, Brit. J. Surg. 7: 99-129).
  • Die Forschung im Bereich der antiseptischen Wirkung wurde durch den Ersten Weltkrieg beschleunigt. Während dieser Zeit wurde die zuvor beschriebene Wirksamkeit von auf Hypochlorit basierenden Antiseptika (Antrewes und Orton, 1904, Zentrabl.Bakteriol. (Orig. A) 35: 811-816) zu einer festen Größe und Präparate, wie Eusol (Smith et al., 1915, Brit.Med.J. 2:129-136) und die Dakinsche Lösung (Dakin, 1915, Brit.Med.J. 2:318-320) verdrängten die anfangs bevorzugten Carbolsäure- und Jodantiseptika.
  • Alexander Flemings „Hunterin lecture" von 1919 (supra) mit dem Titel „The Action of the Chemical and Physiological Antiseptics in a Septic Wound” gibt eine exzellente Darstellung des Themas Antisepsis, die bis heute relevant ist. Fleming beschrieb zwei Denkschulen bezüglich Wundbehandlung: (1) die physiologische Schule, welche ihre Anstrengungen auf die Unterstützung der natürlichen Schutzinstrumente des Körpers gegen Infektionen richtet, und (2) die antiseptische Schule, die ihre Anstrengungen auf das Abtöten der Wundmikroben mit chemischen Wirkstoffen richtet.
  • Die physiologische Schule behauptete, dass der größte Schutz gegen Infektionen durch Unterstützung der physiologischen Instrumente erhalten wird: (1) Blut- und humorale Abwehrmechanismen und (2) phagozytische Leukozyten. Es war bekannt, dass sich Leukozyten in den Wänden ansammeln und in die Wundhöhle wandern und schließlich die Eiterzellelemente bilden. Fleming bemerkte, dass die phagozytischen Leukozyten von „frischem Eiter" eine starke antimikrobielle Wirkung ausüben, aber das dem "abgestandenen Eiter" (d.h. Eiter von einem nicht geöffneten Furunkel) sowie dem hitze- oder antiseptisch behandelten „frischen Eiter" die mikrobentötende Kapazität fehlt.
  • Die nicht spezifische Natur der antiseptischen Behandlung:
  • Das Grundproblem beim chemischen Zugang zur Antisepsis ist, dass chemische Antiseptika nicht spezifisch reagieren. „Desinfektion ist eine chemische Reaktion, bei der das Reaktionsmittel nicht nur auf die Bakterien, sondern auch auf das Medium wirken, in dem sie gefunden werden" (Dakin, 1915, Brit.Med.J. 2: 809-810). Antiseptische Lösungen produzieren eine maximale Mikrobenabtötung, wenn die Organismen in einem wässrigen Medium suspendiert sind, allerdings wird die keimtötende Wirkung durch kompetitive Reaktion mit der organischen Materie, die in serumhaltigem Fluid oder Blut vorhanden ist, stark reduziert.
  • Antiseptika können mit normalen immunophysiologischen Abwehrmechanismen nicht spezifisch reagieren und diese inhibieren. Keimtötende Konzentrationen von Antiseptika inhibieren die antimikrobielle Funktion von phagozytischen Leukozyten. „Die Leukozyten reagieren auf die Wirkung von chemischen Antiseptika empfindlicher als die Bakterien, und angesichts dessen ist es unwahrscheinlich, dass eines dieser Antiseptika die Kraft besitzt, in diese Gewebe einzudringen und die Bakterien zu zerstören, ohne dass diese zuerst das Gewebe selbst abtöten. Die natürlichen antiseptischen Kräfte des Eiters werden beseitigt, aber die Mikroben nicht vollständig zerstört und jene, die zurückgelassen werden, dürfen ungehindert wachsen bis frische Eiterzellen emigrieren können, um diese unter Kontrolle zu halten. Eine Betrachtung der leukoziden Eigenschaft von Antiseptika wird uns zeigen, dass gewisse Antiseptika für das Waschen einer Wunde geeignet sind, wogegen andere schlecht sind. Wenn wir also eine antiseptische Lösung anstreben, mit der eine Wunde ausgewaschen werden soll, sollten wir eine wählen, die ihre antileukozytische Kraft schnell verliert und ihre antiseptische Wirkung sehr schnell ausübt. Dann haben wir den Wascheffekt des Fluids, ohne der Wunde großen Schaden zuzufügen. Ein großer Vorteil von Eusol und der Dakinschen Lösung ist, dass sie als aktive chemische Wirkstoffe in ein paar Minuten verschwinden und keine anhaltende schädliche Wirkung auf die Leukozyten haben" (Fleming, 1919).
  • Wirkungsmechanismus:
  • Viele der frühen Arbeiter glaubten, dass die mikrobizide Wirkung von Hypochlorit vom naszierenden Sauerstoff abhängt, der als ein Produkt der Autoprotolyse von Hypochloritsäure freigesetzt wird, und dass der freigesetzte Sauerstoff in Kombination mit den ungesättigten Komponenten im Zellprotoplasma die Abtötung bewirkt. Diese Ansicht wurde früh in diesem Jahrhundert von Dakin angefochten. „Es wurde wiederholt ausgeführt, dass die antiseptische Wirkung von Hypochloridsäure auf die Freisetzung des Sauerstoffes zurückzuführen ist. Es war mir nicht möglich, irgendeinen Beweis zu finden, der diese Aussage stützt." Er setzte fort, um einen direkteren Chlorierungsmechanismus vorzuschlagen. „Es scheint, dass, wenn Hypochloridsäure und Hypochlorite auf organische Materie bakteriellen oder anderen Ursprungs wirken, manche der (NH)Gruppen der Proteine in (Ncl)Gruppen umgesetzt werden. Ich habe herausgefunden, dass die auf diese Weise gebildeten Produkte – die zur Gruppe von Chloraminen gehören – ungefähr die gleiche antiseptische Wirkung wie die originalen Hypochlorite aufweisen, und es erscheint wahrscheinlicher, dass die antiseptische Wirkung der Hypochlorite eher durch die Bildung dieser Chloramine bedingt ist als durch irgendeinen Zerfall mit der Freisetzung von Sauerstoff" (Dakin, 1915). Weiters war bekannt, dass „Sauerstoff, der nicht aus Chlor stammt, Bakterien nicht so schnell abtötet wie die Menge an Chlor es tut, die theoretisch notwendig ist, um eine äquivalente Menge an naszierendem Sauerstoff hervorzubringen" (Mercer and Somers, 1957, Adv.Food.Res. 7: 129-160).
  • Dakins Position bezüglich der direkten mikrobiziden Wirkung von Chlor, an der bis heute festgehalten wird, ist ebenfalls problematisch. „Es fehlt auch für andere Hypothesen, die weiterentwickelt wurden, um die bakterizide Wirkung von Chlor zu erklären, der experimentelle Beweis. Diese umfassen Vorschläge, dass bakterielle Proteine durch Chlor gefällt werden; dass Zellmembranen durch Chlor verändert werden, um die Diffusion von Zellinhalten zu ermöglichen; und dass Zellmembrane durch Chlor mechanisch unterbrochen werden" (Mercer and Somers, 1957). Chlorbindung an Bakterien ist beachtenswert niedrig bei einem pH-Wert von 6,5 und wird durch das Anheben des pH-Werts auf 8,2 verdoppelt (Friberg, 1956, Acta Pathol.Microbiol.Scand. 38: 135-144). Andererseits wird die bakterizide und viruzide Kapazität von Hypochlorit durch Azidität erhöht, d.h. durch Herabsetzen des pH-Werts (Butterfield et al., 1943, Publ.Health Reports 58: 1837-1866; Friberg und Hammarstrom, 1956, Acta Pathol.Microbiol.Scand. 38: 127-134). An sich ist die Chlorbindung umgekehrt proportional zur chlorabhängigen Abtötung.
  • Organische Chloraminpräparate, z.B. Chloramin-T, dienen auch als antiseptische Wirkstoffe, aber paradoxerweise wird der Schluss gezogen, dass die mikrobizide Wirkung dieser Chloramine vollständing oder zu einem großen Teil aus der Hypochloridsäure, die aus der Chloraminhydrolyse gebildet wurde, resultiert (Leech, 1923, J.Am.Pharm. Assoc. 12: 592-602). Die bakterizide Wirkung von Chloramin „kann vollständig oder teilweise auf die Hypochloridsäure, die gemäß der Hydrolyse- und Ionisationsgleichgewichte gebildet wurde, zurückzuführen sein" (Marks et al., 1945, J. Bacteriol. 49: 299-305). Die durch die langsamere Hydrolyse von Chloraminen geleistete größere Stabilität verlangsamt die keimtötende Wirkung.
  • Hypochlorit übt eine bakterizide Wirkung bei Konzentrationen von 0,2 bis 2,0 ppm (d.h. 4 bis 40 nmol pro ml) aus. Die hohe Wirksamkeit einer solchen „Spuren"konzentration deutet stark darauf hin, dass die mikrobizide Wirkung aus der Inhibition eines essentiellen Enzyms oder essentieller Enzyme resultiert (Green, 1941, Adv.Enzymol. 1: 177-198). Es wurden Beweise vorgelegt, dass Hypochloridsäure verschiedene Sulfhydrylenzyme inhibiert und dass die Inhibition des Glucosemetabolismus zur Bakterienabtötung proportional ist (Knox et al., 1948, J.Bacteriol. 55: 451-458).
  • Die Literatur bezüglich des Mechanismus der H2O2-Wirkung ist ein wenig unvollständig. Allerdings ist der allgemeine Konsens, dass „H2O2 trotz seines hohen Redoxpotentials ein genauso träges Oxidationsmittel wie molekularer Sauerstoff ist und tatsächlich wurde durch sorgfältige Untersuchung herausgefunden, dass eine große Anzahl der Oxidationen, die dieser Substanz zugeschrieben wird, auf die Bildung von freien Radikalen zurückzuführen ist, die bei der Zugabe von katalytischen Mengen von Fe++ oder Cu++ stattfindet" (Guzman-Barron et al., 1952, Arch.Biochem.Biophys. 41: 188-202). Diese Ansicht drückt die übereinstimmende Schlussfolgerung mehrerer Studien aus (Yoshpe-Purer und Eylan, 1986, Health Lab.Sci. 5: 233-238; Miller, 1969; J.Bacteriol. 98: 949-955).
  • Verschiedene Farbstoffe wurden auch als Antiseptika verwendet. Photodynamische Wirkung resultiert, wenn ein Farbstoff (1Farbstoff), d.h. ein Singulett-Multiplizitäts-Sensibilisatormolekül („singlet multiplicity sensitizer molecule"), absorbiert ein Photon und wird in seinen Singulett-Anregungszustand (1Farbstoff*) befördert. Wenn 1Farbstoff* in seinen 1Farbstoff-Grundzustand durch Photonenemission zurückverfällt, wird das Phänomen der Fluoreszenz ohne photodynamischer Wirkung beobachtet. Um als photodynamischer Sensibilisator zu dienen, muss sich der 1Farbstoff* einem Zwischensystemübergang („ISC – intersystem crossing"), d.h. einem Wechsel der Spinmultiplizität, unterziehen, um den metastabilen Triplett-Anregungszustand des Farbstoffes (3Farbstoff*) bei einer relativ hohen Quantumausbeute zu erzielen (Gollnick, 1968, Advan.Photochem. 6 :1-122). 1Farbstoff --hv-→ 1Farbstoff* --ISC-→ 3Farbstoff* (1)
  • Sensibilisatoren absorbieren Licht vom nahen Ultraviolettbereich bis hin zum sichtbaren Bereich, um den nahen Infrarotbereich miteinzuschließen. Diese Absorption ist für die Farbeigenschaften des „Farbstoffes” verantwortlich. Die für die Farbstoffanregung notwendige Wellenlänge des Lichts (d.h. die Energie des Photons) wird durch das Absorptionsspektrum des Farbstoffes definiert.
  • Der 3Farbstoff*-Zustand ist relativ langlebig und an sich kann er mit anderen Molekülen reagieren. Photodynamische Reaktionen können abhängig von der Reaktivität vom 3Farbstoff* in zwei Hauptklassen unterteilt werden (Schenck und Koch, 1960, Z.Electrochem. 64: 170-177). Bei Typ-I-Reaktionen unterzieht sich der angeregte Triplett-Sensibilisator einem direkten Redoxtransfer mit einem anderen Molekül. Sensibilisatoren für Typ-I-Reaktionen werden typischerweise schnell oxidiert oder reduziert. 3Farbstoff* + 1SubH --→ 2Farbstoff + 2Sub· (2)
  • Bei der Gleichung (2) dient der Triplett-Sensibilisator als univalentes Oxidationsmittel und wird zu seinem Dublett-Zustand (2Farbstoff) reduziert, und das Singulett-Multiplizitäts-Substrat (1SubH) wird zu einem Dublett-Multiplizität-, Freies-Radikal-2Sub·-Zustand oxidiert. In einer analogen Art kann ein reduzierender 3Farbstoff* als radikales Reduktionsmittel dienen. Das 2Farbstoff-Produkt der Reaktion (2) kann mit dem Grundzustand O2, einem Triplett-Multiplizitäts-Diradikal-Molekül (302). reagieren, um das Dublett-Multiplizitäts-Hydrodioxylsäure-Radikal (2·O2H) oder seine konjugierte Base, das Superoxid-Anion (2·O2), hervorzubringen, und den Singulett-Grundzustand des Farbstoffes zu regenerieren: 2 · O2H + 2·Q- + H+ --→ 1H2O2 + 1O2 (4)
  • Erfolgt die Reaktion durch direkte Annihilation, bleibt die Spinerhaltung aufrecht und an sich kann auch der molekulare Singulett-Sauerstoff (1O2) produziert werden (Khan, 1970, Science 168: 476-477). 2Farbstoff + 3O2 --→ 1Farbstoff + 2·O2H (oder 2·O2 -) (3)
  • Unter neutralen bis sauren Bedingungen unterziehen sich die Produkte der Sauerstoffreduktion einer Dublett-Dublett-(d.h.Radikal-Radikal)-Annihilation, um H2O2 hervorzubringen:
  • Bei Typ-II-Reaktionen interagiert der angeregte Triplett-Sensibilisator direkt mit Triplett (Grundzustand) 3O2. Die Reaktion umfasst den spinbalancierten („spin-balanced") Transfer von Anregegungsenergie aus 3Farbstoff* zu 3O2, was den Grundzustand 1Farbstoff* den molekularen Singulett-Sauerstoff (1O2) als Produkte hervorbringt (Kautsky, 1939, Trans.Faraday Soc. 35: 216-219). 3Farbstoff* 3O2 - + 1FarbstoffO2 -→ 1Farbstoff + 1O2 (5)
  • Die Reaktion (5) ist sehr schnell und ist der üblichste Typ-II-Weg. Wenn sich allerdings der 3Farbstoff* ausreichend reduziert, kann direkter univalenter Elektronentransfer zu O2 auftreten: 3Farbstoff* 3O2 - – 1FarbstoffO2 -→ 2Farbstoff+ + 2·O2 - (6)
  • Radikale Annihilation kann stattfinden, um H2O2, wie von Reaktion (4) beschrieben, hervorzubringen. Bei Betrachtung dieser Reaktionswege sollte verstanden werden, dass die Reaktion (5) gegenüber der Reaktion (6) um mehr als zwei Größenordnungen bevorzugt wird (Kasche und Lindquist, 1965, Photochem. Photobiol. 4: 923-933).
  • Mikrobielle Abtötung durch Farbstoffe könnte aus der Reaktion des 3Farbstoff* selbst oder seiner Typ-I- und Typ-II-Reaktionsprodukte, d.h. 2·O2 -, H2O2 und insbesondere 1O2, mit mikrobiellen Proteinen, Nukleinsäuren, ungesättigten Fetten, etc. resultieren (Spikes und Livingston, 1969, Adv.Rad.Biol. 3: 29-121).
  • 1O2, ein elektrophiles oxigenierendes Breitbandmittel, kann Enzyme durch Zerstörung der für die katalytische Aktivität es sentiellen Aminosäuren inhibieren. Die Geschwindigkeitskonstanten (kr, in M-1sec-1) für die Reaktion von 1O2 mit Tryptophan, Histidin, und Methionin reichen von 2·107 bis 9·107 (Matheson und Lee, 1979, Photochem.Photobiol. 29:879-881; Kraljic und Sharpatyi, 1978, Photochem.Photobiol 28: 583-586). Wenn in enger Annäherung an eine Targetmikrobe generiert, könnte eine „Spuren-"-Menge von 1O2 die für den Metabolismus der Mikrobe notwendigen Enzyme effektiv inhibieren. Ungesättigte Fette, Nukleinsäuren und andere elektronendichte biologische Moleküle sind ebenfalls mit 1O2 reaktiv. Die Dioxigenierung von solch essentiellen zellulären Komponenten könnte auch eine Rolle bei der mikrobiziden Wirkung spielen.
  • Das anhaltende Problem:
  • Die folgenden essentiellen Punkte können aus dem vorangegangenen Material destilliert werden. Erstens sind hochwirksame chemische Antiseptika typischerweise Oxidationsmittel, z.B. HOCl. Diese oxidierenden und oxigenierenden Mittel sind zur mikrobiziden Wirkung in „Spuren-"Mengen fähig und üben ihre Effekte wahrscheinlich über Inhibition von für den Metabolismus essentiellen Enzymen aus (Green, 1941).
  • Zweitens ist die antimikrobielle Wirksamkeit solcher Antiseptika durch ihre nicht spezifische Reaktivität gefährdet. Der Schaden ist nicht auf die Targetmikrobe beschränkt. Wie von Fleming aufgezeigt, sind Wirtszellen allgemein empfindlicher gegenüber der toxischen Wirkung von Antiseptika als Mikroben.
  • Ein idealer antiseptischer Wirkstoff würde eine wirksame Reaktivität gegen ein breites Spektrum an pathogenen Mikroben, einschließlich Pilzen mit einer Minimumtoxizität gegenüber Wirtszellen, ausüben. Im Einklang mit den Prinzipien der physiologischen Schule der Wundversorgung sollte ein Antiseptikum die natürlichen Schutzinstrumente des Körpers gegen Infektionen unterstützen oder erhöhen.
  • Bis zu einem begrenzten Maß erfüllen gewisse Antibiotika diese Anforderungen. Die selektive bakterizide Wirkung von Antibiotika basiert auf Unterschieden zwischen prokaryotischen und eukaryotischen Zellen hinsichtlich der Proteinsynthese, Nukleinsäurereplikation, und der Anwesenheit oder Zusammensetzung der Zellwand. Antibiotika können tatsächlich gewisse Bakterien, d.h. prokaryotische Organismen, selektiv vergiften, ohne die eukaryotischen Wirtszellen zu vergiften. Allerdings kann die Breitband wirkung von Antibiotika schädliche Effekte auf die Bakterien haben, die die normale Flora des Wirts darstellen. Die Bakterien der normalen Flora dienen als Barriere für das Wachstum von pathogenen Organismen, und an sich bietet die antibiotische Zerstörung der normalen Flora eine Gelegenheit für das Wachstum von mehr pathogenen Bakterien. Antibiotikaassoziierte pseudomembranöse Kolitis resultiert aus Überwachsung von Pathogenen, d.h. Clostridium difficile und in seltenen Fällen Staphylococcus aureus, die nach einer antibiotischen Zerstörung der normalen Flora folgt.
  • Zusätzlich sind Hefe und Pilze eukaryotische Mikroben und an sich werden sie im Wesentlichen von Antibiotika nicht beeinflusst. Folglich können Hefeüberwachsung und -infektionen nach der antibiotischen Behandlung von bakteriellen Infektionen auftreten.
  • Antibiotika können auch direkte toxische Effekte ausüben. Diese schädlichen Effekte können aus der direkten Wirkung des Medikaments auf die Wirtszellen und das Gewebe resultieren, z.B. der Nephrotoxizität von Antibiotika.
  • Wie aus dem Vorangegangenen schnell ersichtlich, gibt es seit langem einen Bedarf an neuen und verbesserten Antiseptika, die eine Reaktivität gegen ein breites Spektrum an pathogenen Mikroben aufweisen, jedoch eine minimale Aktivität gegenüber den Wirtszellen und der normalen Flora zeigen.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Es wurde nun gefunden, dass Haloperoxidasen verwendet werden können, um selektiv an Targetmikroben zu binden und um in Anwesenheit von Peroxid und Halid das Wachstum von Targetmikroben ohne Eliminierung von wünschenswerten Mikroben oder signifikantem Schaden anderer Komponenten des Mediums, wie Wirtzellen in der Umgebung der Targetmikrobe, zu inhibieren. Dank der neu entdeckten selektiven Bindungseigenschaften von Haloperoxidasen bindet die Targetmikrobe die Haloperoxidase selektiv mit wenig oder gar keiner Bindung der Haloperoxidase durch die erwünschte Mikrobe, wenn eine Targetmikrobe, wie eine pathogenen Mikrobe, eine Bindungsfähigkeit für Haloperoxidase aufweist, die größer ist als jene der erwünschten Mikrobe, wie Elemente der normalen Flora. In Anwesenheit von Peroxid und Halid katalysiert die targetgebundene Haloperoxidase die Halidoxidation und erleichtert die Disproportionierung von Peroxid zu molekularem Singulett-Sauerstoff an der Oberfläche der Targetmikrobe, was in der selektiven Abtötung der Targetmikrobe mit einem minimalen Kollateralschaden der erwünschten Mikrobe oder des physiologischen Mediums resultiert.
  • Das selektive Wesen der Haloperoxidasenbindung macht die Verfahren und Zusammensetzungen der Erfindung in der therapeutischen oder prophylaktischen antiseptischen Behandlung von menschlichen oder tierischen Subjekten äußerst nützlich, da ihre Verwendung so gestaltet werden kann, dass sie höchst effektiv bei der Bekämpfung von bakteriellen Infektionen oder Pilzinfektionen ist, ohne die normale Flora oder Wirtszellen signifikant zu schädigen.
  • Geeignete Haloperoxidasen zur Verwendung in den Verfahren und Zusammensetzungen der Erfindung umfassen Myeloperoxidase (MPO) und eosinophile Peroxidase (EPO).
  • Kurze Figurenbeschreibung
  • 1 ist eine schematische Darstellung einer mikrobiellen Abtötung über den molekularen Singulett-Sauerstoff-(1O2)-Weg und den Halogenierung-Peroxidation-(virtueller molekularer Singulett-Sauerstoff)-Weg der Erfindung.
  • 2 ist ein Differenzspektrum von Myeloperoxidase (MPO), das Dithionit reduziert minus oxidiert (R-O) zeigt.
  • 3 ist ein Differenzspektrum von eosinophiler Peroxidase (EPO), das Dithionit reduziert minus oxidiert (R-O) zeigt.
  • 4 zeigt die Differenzspektren einer Staphylococcus-aureus-Suspension, in welchen Dithionit reduziert minus oxidiert (R-O) vor (Spektrum A) und nach (Spektrum B) einer Myeloperoxidase(MPO)-Aussetzung dargestellt ist.
  • 5 zeigt das Dithionit-R-O-Differenzspektrum von MPO, das in der Lösung bleibt (freie MPO) nach Bakterien-Aussetzung und Entfernung der Bakterien durch Zentrifugieren.
  • 6A ist ein Diagramm einer Chemilumineszenz (CL), ausgedrückt in Megaphotonen pro 20 Sekunden, resultierend aus MPO-abhängiger Luminoloxidation versus der angewandten MPG-Konzentration. 6B ist ein abermaliges Diagramm eines begrenzten Bereiches der in 6 gezeigten Daten, worin die x- und y-Achsen gegenüber 6A umgekehrt sind.
  • 7 zeigt Diagramme von Bindungsdaten für MPG, wie in Beispiel 6 näher beschrieben. 7A ist ein Diagramm von gebundener gegenüber freier MPO, ausgedrückt in Pikomol pro Reaktionsvolumen (1 ml) bei separater Inkubation mit den Mikroben Staph. aureus (gezeigt als „*" in 7) und Streptococcus sp. (viridans, gezeigt als „o" in 7). 7B ist ein Diagramm der Daten aus 7A mit einer MPO-Konzentration ausgedrückt in Kilomolekülen (103 Moleküle) pro Mikrobe. 7C ist ein Scatchard-Diagramm der Daten aus 7B, worin das Verhältnis gebundener zu freier MPO gegen die gebundene MPO, ausgedrückt in Kilomolekülen pro Mikrobe in 1 ml Reaktionsvolumen eines Staph.aureus-Suspension (gezeigt als „*" oder einer Streptococcus sp. (viridans)-Suspension (gezeigt als „o"), aufgetragen ist.
  • 8 zeigt Diagramme von Bindungsdaten für CPO, wie im Beispiel 7 näher beschrieben. 8A ist ein Diagramm von gebundener gegenüber freier CPO, ausgedrückt in Kilomolekülen (103 Moleküle) pro Mikrobe. 8B ist ein Scatchard-Diagramm der Daten von 8A, in dem das Verhältnis von gebundener zu freier CPO gegen die gebundene CPO aufgetragen, ausgedrückt in Kilomolekülen pro Mikrobe in 1 ml Reaktionsvolumen einer Staph.aureus-Suspension (gezeigt als „*") oder einer Streptococcussp.-(viridans)-Suspension (gezeigt als „o"), ist.
  • 9 zeigt Diagramme von Bindungsdaten für EPO, wie in Beispiel 8 näher beschrieben. 9A ist ein Diagramm von gebundener gegenüber freier EPO, ausgedrückt in Kilomolekülen (103 Moleküle) pro Mikrobe. 9B ist ein Scatchard-Diagramm der Daten von 9A, in dem das Verhältnis von gebundener zu freier EPO gegen die gebundene EPO aufgetragen ist, ausgedrückt in Kilomolekülen pro Mikrobe in 1 ml Reaktionsvolumen einer Staph.-aureus-Suspension (gezeigt als „*") oder einer Streptococcus-sp.-(viridans)-Suspension (gezeigt als „o").
  • 10 zeigt Diagramme von Bindungsdaten für LPO, wie in Beispiel 8 näher beschrieben. 10A ist ein Diagramm von gebundener gegenüber freier LPO, ausgedrückt in Kilomolekülen (103 Moleküle) pro Mikrobe. 10B ist ein Scatchard-Diagramm der Daten von 10A, in dem das Verhältnis von gebundener zu freier LPO gegen die gebundene LPO aufgetragen ist, ausgedrückt in Kilomolekülen pro Mikrobe in 1 ml Reaktionsvolumen einer Staph.-aureus-Suspension (gezeigt als „*") oder einer Streptococcus-sp.-(viridans)-Suspension (gezeigt als „o").
  • Detaillierte Beschreibung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung ist allgemein auf die Verwendung von Haloperoxidasen bei der Herstellung von flüssigen topischen Medikamenten zur Verwendung als antimikrobielle Wirkstoffe gerichtet, um Targetmikroben selektiv zu binden und abzutöten, ohne Eliminierung von erwünschten Mikroben oder ohne andere Komponenten des Mediums, wie Wirtzellen in der Umgebung der Targetmikrobe, signifikant zu schädigen.
  • Zusätzlich zur wirksamen Reaktivität gegenüber einem breiten minimalen Toxizität gegenüber Wirtszellen, sollte ein idealer antiseptischer Wirkstoff auch die normale Flora des Wirtsorganismus selektiv bewahren. In einem Aspekt stellt die vorliegende Erfindung antiseptische Systeme auf Basis der Verwendung von dioxigenierenden Enzymsystemen mit selektiver Affinität gegenüber pathogenen Mikroben bereit. Die antiseptischen Systeme der Erfindung haben die Wirksamkeit von chemischen Antiseptika, ohne der assoziierten Zerstörung des Wirtsgewebes oder Unterbrechung der normalen Flora; d.h. die antiseptische Wirkung ist selektiv und auf die Targetmikrobe beschränkt. Die Erfindung erfüllt die oben genannten Kriterien für ein ideales antiseptisches System.
  • Generierung von oxidierenden und oxigenierenden Mitteln:
  • Es ist bekannt, dass Haloperoxidasen (XPOs), wie Myeloperoxidase (MPO) und eosinophile Peroxidase (EPO), in natürlichen Systemen Mikrobenabtötungsaktivität aufweisen, wenn sie mit einem geeigneten Halid-Cofaktor (X-) und H2O2 als Substrat präsentiert werden (Klebanoff, 1968, J.Bacteriol. 95: 2131-2138). Das selektive Wesen der Haloperoxidasebindung und die Verwendbarkeit dieser Systeme für Anwendungen in der Therapie, Forschung und Industrie wurde bislang jedoch nicht erkannt.
  • Startreaktion:
  • Der erste Schritt der XPO-katalysierten Reaktion umfasst die Oxidation von X- durch H2O2: H2O2 + X- + H+ -- (XPO) -→ HOX + H2O (7)
  • Diese Reaktion ist am meisten verständlich in Bezug auf das Nernstian-Verhältnis:
    Figure 00120001
    wobei E das beobachtete Potential in Volt ist, Eo das Normalpotential in Volt, R die Gaskonstante, T die absolute Temperatur, n die Anzahl der Elektronen pro transferriertem Grammäquivalent, F ein Faraday, in der natürliche Logarithmus des Verhältnisses der Konzentrationen von reduzierten zu oxidierten Reaktanten ([oxidiert]/[reduziert]) und [H+] der natürliche Logarithmus der Protonen(Wasserstoffion)-Konzentration. Die in Gleichung (7) beschriebene Reaktion kann als zwei separate Halbreaktionen betrachtet werden: die Reduktion von H2O2 zu H2O,
    Figure 00130001
    und die Oxidation von X- zu HOX,
    Figure 00130002
  • Die kombinierte Reaktion für die Oxidation von X- durch H2O2 wird durch das Nettopotential ΔE, d.h.
    Figure 00130003
    gesteuert.
  • Thermodynamisch gesehen kann die Nettopotentialveränderung als Veränderung der freien Energie (ΔG) für die Reaktion:
    Figure 00130004
    beschrieben werden.
  • Veränderung in der freien Energie steht mit der Potentialveränderung durch die Gleichung ΔG = –nF ΔE (3)im Verhältnis.
  • Ein Enzym kann die Geschwindigkeit von spezifischen chemischen Reaktionen stark erhöhen, aber es beeinträchtigt das ΔG der Reaktion nicht. Enzyme stellen einen mechanistischen Weg für thermodynamisch erlaubte Reaktionen bereit. Bei der vorliegenden Erfindung sehen Haloperoxidasen den Mechanismus zur Verwendung von H2O2 vor, um mehr reaktive Oxidanten, d.h. Hypohalite (HOX), und oxigenierende Mittel, d.h. molekularen Singulett-Sauerstoff (1O2), zu generieren. Die Daten in Tabelle 1 zeigen, dass H2O2-Oxidation von Haliden, die Hypohalite hervorbringen, thermodynamisch bevorzugt ist, d.h. exergon. Man beachte, dass Exergonie umgekehrt proportional zur Elektronegativität von Halogen ist.
  • TABELLE 1 Primärreaktion H2O2 + X- + H+ -- (XPO) -→ H2O2 + HOX + ΔG1
    Figure 00150001
  • Werte wurden aus den Daten von Pourbaix, 1966, Atlas of Electrochemical Equilibria in Aqueous Solutions, Pergamon Press, S. 644, errechnet.
  • Sekundärreaktion:
  • Reaktion von HOX mit H2O2, beides Singulett-Multiplizitäts-Reaktanten, wird über eine Singulett-Multiplizitäts-Fläche zum Hervorbringen von 1O2, X- und H2O, allen Singulett-Multiplizitätsprodukten (Kasha und Khan, 1970 Ann.N.Y.Acad.Sci. 171: 5-23) stattfinden; d.h. HOX + H2O2 → X- + H+ + 1O2 + H2O (14)
  • Das Nettopotential dieser Reaktion ist durch das Verhältnis gegeben.
  • Figure 00160001
  • Tabelle 2 zeigt, dass die HOC- oder HOBr-Oxidation von H2O2 mehr als ausreichende Exergonie für die Generierung von 1O2 aufweist. Wenn das HOX Hol ist, ist die Reaktion nur im fast neutralen bis alkalinen pH-Bereich ausreichend exergon. TABELLE 2 Sekondärreaktion HOX + H2O2 --→ H2O + H+ + X- + 1O2 + ΔGa
    Figure 00170001
  • Die Generierung von 1O2 ist durch 22,6 kcal mol-1 in dieser Sekondärreaktion endergon. Der Wert von ΔGa spiegelt die eingestellte Ergonie wieder; d.h. ΔG2 + 22,56 = ΔGa. Die Werte wurden aus den Daten von Pourbaix (1966) errechnet.
  • Die gesamte Nettoreaktion, d.h die Summe der Reaktionen (7) und (14) 2H2O2 -(XPO)→ 2H2O + 1O2 (16)ist eine H2O2-Disproportionierung, die 1O2 plus ein ΔG von –27,8 kcal mol-1 hervorbringt, wie in den Daten der Tabelle 3 dargestellt. TABELLE 3 Nettoreaktion 2H2O2 --→ 2H2O + 1O2 + ΔGna
    Figure 00190001
  • Die Generierung von 1O2 ist durch 22,6 kcal mol-1 in dieser Sekondärreaktion endergon. Der Wert von ΔGna spiegelt die eingestellte Ergonie wieder; d.h. ΔGn + 22,56 = ΔGna. Die Werte wurden aus den Daten von Pourbaix (1966) errechnet.
  • XPOs katalysieren H2O2-Disproportionierung durch das Einbringen von Redoxasymetrie, die eine reaktive Einstellung bevorzugt. H2O2-Oxidation von X- ist ein bisschen exergon und bringt HOX hervor. HOX-Oxidation von H2O2 ist stark exergon und bringt 1O2 hervor. Anders dargelegt ist sowohl die H2O2-Oxidation von Cl-, als auch die HOCl-Oxidation von H2O2 thermodynamisch bevorzugt. Ist die XPO Myeloperoxidase (MPO), kann X- Cl-, Br- und bis zu einem begrenzten Ausmaß l- sein. Ist die XPO eosinophile Peroxidase (EPO) oder Lactoperoxidase, kann X- Br- und zu einem begrenzten Ausmaß l- sein.
  • Die Fähigkeit, das Wachstum einer Targetmikrobe selektiv zu inhibieren, resultiert aus der Entdeckung, dass Haloperoxidasen bei kontrollierten Konzentrationshöhen selektiv an Mikroben zu verschiedenen Graden und mit unterschiedlichen Affinitäten binden. Hat die Targetmikrobe eine Bindungsfähigkeit für eine Haloperoxidase, die größer ist als jene einer erwünschten Mikrobe, wie infra näher beschrieben, resultiert das Vorsehen der Haloperoxidase unter Sättigungsmengen in der selektiven Bindung der Haloperoxidase an die Oberfläche der Targetmikroben, mit einer minimalen oder mit keiner Bindung der Haloperoxidase an die Oberfläche der erwünschten Mikrobe. In Anwesenheit von Peroxid und einem Halid katalysiert die targetgebundene Haloperoxidase Halidoxidation und erleichtert die Disproportionierung von Per oxid in molekularen Singulett-Sauerstoff an der Oberfläche der Targetmikrobe. Da die Lebensspanne von molekularem Singulett-Sauerstoff relativ kurz und sein Diffusionspotential entsprechend begrenzt ist, wie auch infra näher beschrieben, resultiert die Produktion von molekularem Singulett-Sauerstoff an der Oberfläche der Targetmikrobe in der selektiven Abtötung der Targetmikrobe mit einem minimalen Kollateralschaden der erwünschten Mikrobe.
  • Es wurde entdeckt, dass Myeloperoxidase und eosinophile Peroxidase als Antiseptika in der therapeutischen oder prophylaktischen Behandlung von menschlichen oder tierischen Subjekten zur selektiven Bindung an und Abtötung von pathogenen Mikroben mit einem minimalen Kollateralschaden der Wirtszellen verwendet werden kann.
  • Die in der vorliegenden Erfindung verwendbaren Haloperoxidasen sind als Halid:Wasserstoff-Peroxid-Oxidoreduktasen (z.B. EC Nr. 1.11.1.7 und EC Nr. 1.11.1.10 bei der International Union of Biochemistry) definiert, für welche Halid der Elektronenspender oder das Reduktionsmittel ist und Peroxid der Elektronenempfänger oder der Oxidant. Geeignete Haloperoxidasen, wie hierin gezeigt, umfassen Myeloperoxidase (MPO) und eosinophile Peroxidase (EPO) und Derivate davon. "Derivate davon", wie hier verwendet, bedeutet im Allgemeinen chemisch oder funktional modifizierte MPO und EPO, die spezifisch an eine Targetmikrobe oder an spezifische eukaryotische Zelltypen binden können und die Haloperoxidaseaktivität bei Steigerung der Disproportionierung von Peroxid zur Bildung von molekularem Singulett-Sauerstoff in Anwesenheit eines geeigneten Halids, wie hierin beschrieben, erhalten. Erläuternde Beispiele für verwendbare Derivate umfassen Haloperoxidasen, die zu Antikörpern, Fragmenten von Antikörpern, Lektinen und anderen Targetingresten konjugiert worden sind, die Antigene, Rezeptorenstellen oder andere unterscheidende Merkmale auf der Oberfläche von Targetmikroben oder Targetzellen, wie Krebszellen, spezifisch erkennen und selektiv daran binden können.
  • Da die antiseptische Aktivität der Haloperoxidasezusammensetzungen die Reaktion von Peroxid und Halid zur Bildung von Hypohalit und die Reaktion von Peroxid und Hypohalit zur Bildung von molekularem Singulett-Sauerstoff, wie oben beschrieben, miteinschließt, hängt die Aktivität der Zusammensetzungen von der Anwesenheit eines geeigneten Peroxids und Halids an der Infektionsstelle ab. In manchen Situationen kann Peroxid (z.B. Wasserstoffperoxid) an der Infektionsstelle aufgrund, z.B. der Aktivität von natürlich vorkommender Flora, vorhanden sein. In diesen Situationen muss kein zusätzliches Peroxid dem zu behandelnden Subjekt verabreicht werden. In anderen Situationen kann es notwendig sein, zusätzlich Wasserstoffperoxid an der Infektionsstelle vorzusehen. Demgemäß können die Zusammensetzungen zusätzlich, wenn erwünscht, ein Peroxid oder ein Mittel umfassen, das Peroxid in vivo produzieren kann.
  • Die in den Zusammensetzungen verwendbaren Peroxide schließen Wasserstoffperoxid und Alkylhydroperoxide der Formel: R-OOH mit ein, wobei R ein Wasserstoff oder eine kurzkettige Alkylgruppe mit von 1 bis 3 Kohlenstoffatomen ist. Die Oxidantenaktivität nimmt generell mit ansteigender Länge der R-Kette wie folgt ab: R=H >> CH3 > CH3CH2 > CH3 (CH2)2
  • Das derzeit bevorzugte Peroxid zur Verwendung in den Zusammensetzungen der Erfindung ist Wasserstoffperoxid. Wasserstoffperoxid kann auch an den Infektionsstellen verfügbar gemacht werden, indem in der antiseptischen Zusammensetzung ein Mittel beinhaltet ist, das Wasserstoffperoxid in vivo produzieren kann. Insbesonders nützliche Mittel für diesen Zweck umfassen, z.B., Oxidasen, wie Glucoseoxidase und Galactoseoxidase.
  • Ist ein Wasserstoffperoxid direkt in den Zusammensetzungen der Erfindung beinhaltet, werden die angewandten Mengen vorzugsweise gestaltet, um die maximale antiseptische Aktivität bereitzustellen, während der den Zellen und dem Gewebe des menschlichen oder tierischen Subjekts zugefügte Schaden minimiert wird. Demgemäß, wenn in flüssigen Zusammensetzungen zur topischen oder bukkalen Verabreichung enthalten, können die Zusammensetzungen der Erfindung von ca. 1 nmol bis ca. 10 μmol Wasserstoffperoxid pro ml flüssige Zusammensetzung, mehr bevorzugt von ca. 5 nmol bis ca. 5 μmol Wasserstoffperoxoid pro ml flüssige Zusammensetzung, und am meisten bevorzugt von ca. 10 nmol bis ca 1 μmol Wasserstoffperoxid pro ml flüssige Zusammensetzung, umfassen. Mittel, die Wasserstoffperoxid in vivo produzieren können, z.B. Oxidasen, sind für die dynamische Steuerung der an der Infektionsstelle vorhandenen Wasserstoffmengen beson ders nützlich. Solche Mittel maximieren die antiseptische Aktivität der Zusammensetzung, während sie den dem Gewebe des zu behandelnden Subjekts zugefügten Schaden minimieren. Demgemäß hängt die Menge solcher anzuwendender Mittel stark vom Wesen des Mittels und vom erwünschten therapeutischen Effekt ab, aber sie ist vorzugsweise fähig, einen konstanten Zustandslevel von ca 1 pmol bis ca. 100 nmol Wasserstoffperoxid pro ml Flüssigkeit pro Minute zu produzieren, abhängig von der Art und Konzentration des an der Stelle der Mikrobeninfektion verfügbaren Halids.
  • Die zur Verwendung in den Zusammensetzungen geeignete Halide können Bromid oder Chlorid sein. Die Verwendung, Auswahl und die in einer speziellen Anwendung eingesetzte Menge an Halid hängt von verschiedenen Faktoren, wie der in der antiseptischen Zusammensetzung verwendeten Haloperoxidase, dem erwünschten therapeutischen Effekt, der Verfügbarkeit von Peroxid und anderen Faktoren, ab. Ist die Haloperoxidase MPO, kann das Halid Bromid oder Chlorid sein. Die Menge an verwendetem Chlorid fällt vorzugsweise in den Bereich von 10 μmol Chlorid bis 150 μmol Chlorid pro ml Lösung, um sich physiologischen Bedingungen anzunähern. Ist die Haloperoxidase EPO, ist das Chlord als Cofaktor relativ ineffektiv und demzufolge ist das bevorzugte Halid Bromid. Wenn in flüssigen Zusammensetzungen zur topischen oder bukkalen Verabreichung enthalten, können die Zusammensetzungen von ca. 1 nmol Bromid bis ca. 20 μmol Bromid pro ml flüssige Zusammensetzung, mehr bevorzugt von ca 10 nmol Bromid bis ca. 100 μmol Bromid pro ml flüssige Zusammensetzung und am meisten bevorzugt von ca. 10 nmol Bromid bis ca. 1 μmol Bromid pro ml flüssige Zusammensetzung, umfassen.
  • Wie infra in Beispiel 10 näher beschrieben, ist das Verhältnis von Halid zu Peroxid eine wichtige Erwägung bei der Formulierung einer effektiven mikrobiziden Umgebung. Demgemäß ist es zusätzlich zur Gewährleistung von effektiven Leveln an Halid und Peroxid beim Situs des mikrobiellen Angriffs, wie oben beschrieben, vorzuziehen, die Verfahren der Erfindung bei Halid:Peroxid-Verhältnissen durchzuführen, die eine optimale mikrobizide Aktivität liefern. Ist die Haloperoxidase z.B. MPO und ist das Halid Cl-, wird das Verhältnis von Cl- zu Peroxid vorzugsweise im Bereich von ca. 1 bis ca. 4.000 in der Umgebung der mikrobiziden Aktivität, mehr bevorzugt von ca. 50 bis ca. 40.000 und am meisten bevorzugt von ca. 200 bis ca. 40.000, gehalten. Ist das Ha lid Br-, wird das Verhältnis von Br- zu Peroxid vorzugsweise im Bereich von ca. 0,1 bis ca. 40.000 in der Umgebung der mikrobiziden Aktivität, mehr bevorzugt von ca. 0,5 bis ca. 2.000 und am meisten bevorzugt von ca. 1 bis ca. 1.000, gehalten.
  • Wenn in antiseptischen Anwendungen verwendet, können die Zusammensetzungen zur Behandlung eines breiten Spektrums an Infektionen durch pathogene Mikroben, vorzugsweise mit einem minimalen Schaden der normalen Flora, eingesetzt werden. Wie hierin gebraucht, ist der Ausdruck „pathogene Mikroben" dazu bestimmt, pathogene Bakterien oder Pilze miteinzuschließen, die im Wirten normalerweise nicht anwesend sind, oder die im Wirten zu einem pathogenen Grad übergewachsen sind. Mikroben, die in einer pathogenen Infektion eines Wirten resultieren, sind wohlbekannt (siehe Principles and Practice of Infectious Diseases, 3. Ausgabe, 1990, G. Mandell et al., Hsg., Churchill Livingstone Inc. New York). Somit können die Zusammensetzungen bei der Behandlung oder Prophylaxe von Infektionen durch pathogene Mikroben verwendet werden, die mit jedem Zustand assoziiert sind, der die Lieferung der Zusammensetzungen der Erfindung zur Infektionsstelle erlaubt, einschließlich, ohne Einschränkungen, die Behandlung von oberflächlichen oder chirurgischen Wunden, Verbrennungen oder anderen signifikanten epidermalen Schaden, wie toxische epidermale Nekrolyse, Harnweginfektionen, wie Cystitis und Urethritis, Vaginitis, wie Vulvovaginitis und Cervicitis, Gingivitis, Otitis externa, Akne, äußere Pilzinfektionen, Infektionen der oberen Atemwege, Magen-Darm-Traktinfektionen, subakute bakterielle Endocarditis und andere bakterielle Infektionen oder Pilzinfektionen, zu welchen die Zusammensetzungen der Erfindung effektiv geliefert werden können. Repräsentative pathogene Mikroben, die bei Ausführung der Erfindung selektiv abgetötet werden können, umfassen, ohne Einschränkung, Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli und andere coliforme Bakterien, Candida albicans und andere infektiöse Bakterien und Pilze. Die Auswahl einer speziellen Haloperoxidase zur Verwendung bei Behandlung von mikrobiziden Infektionen wird vorzugsweise auf Basis der Bindungseigenschaften der zu behandelnden pathogenen Mikrobe getroffen. Im Allgemeinen, wenn die pathogene Mikrobe eine Bakterie ist, ist die bevorzugte Haloperoxidase häufig Myeloperoxidase. Aufgrund der größeren Affinität von eo sinophiler Peroxidase für Candida albicans und andere Pilze, wie unten weiter beschrieben, ist EPO üblicherweise die bevorzugte Haloperoxidase für die Behandlung von Infektionen durch diese Mikroben.
  • Wie hierin verwendet, bedeutet der Ausdruck „normale Flora" Bakterien, die normalerweise in oder an Körperoberflächen eines gesunden Wirts zu symbiotischen Leveln anwesend sind. Die normale Flora umfasst z.B. die Milchsäurefamilie von Bakterien im Mund, Darm oder in der Vagina von menschlichen Subjekten, Z.B. Streptococcus (viridans) im Mund und Lactobacillus sp. (z.B. Tissier-Bazillus und Döderlein-Bazillus) im Darm von gestillten Kindern, externen Genitalien, in der vorderen Harnröhre und Vagina. Mikroben, die eine normale Flora eines Wirten darstellen, sind wohlbekannt (siehe z.B. Principles and Practice of Infectious Diseases, supra, New York, S. 34-36 und 161). Es wurde herausgefunden, dass die Haloperoxidasen der Erfindung bevorzugt gegenüber normaler Flora selektiv an viele pathogene Bakterien und Pilze binden. Der Wirt wird vorzugsweise mit einer Menge an Haloperoxidase behandelt, die ineffektiv ist, normale Flora vom Wirten zu eliminieren. In manchen Situationen, wenn z.B. Bevölkerungen der normalen Flora aufgrund von Überwachsung der pathogenen Mikrobe oder aus anderen Gründen gesenkt wurden, kann es erstrebenswert sein, das Wachstum der normalen Flora weiter zu stimulieren. Demzufolge kann der Wirt zusätzlich mit einer Menge an normaler Flora behandelt werden, die effektiv ist, um die Rekolonisation der normalen Flora im Wirten in Verbindung mit Durchführung der Erfindung zu erleichtern.
  • Die antiseptischen Zusammensetzungen umfassen im Allgemeinen eine Menge an Haloperoxidase, die in Anwesenheit eines Peroxids und eines Halids effektiv ist, das Wachstum von pathogenen Mikroben gemeinsam mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger zu inhibieren. Im Allgemeinen kann jeder pharmazeutisch akzeptable Träger zu diesem Zweck verwendet werden, vorausgesetzt, dass der Träger die selektiven Bindungsfähigkeiten des Haloperoxids oder die Enzymaktivität nicht signifikant stört.
  • Für topische Anwendungen kann der pharmazeutisch akzeptable Träger die Form von Flüssigkeiten, Cremen, Lotionen oder Gelen haben und kann zusätzlich organische Lösungsmittel, Emulgatoren, Geliermittel, Feuchthaltemittel, Stabilisatoren, oberflächenaktive Substanzen, Benetzungsmittel, Konservierungsstoffe, Depot mittel und geringfügige Mengen an Befeuchtungsmitteln, Sequestrierungsmitteln, Farbstoffen, Duftstoffen und anderen Komponenten, die üblicherweise in pharmazeutischen Zusammensetzungen zur topischen Verabreichung verwendet werden, umfassen. Die Zusammensetzungen der Erfindung können in Absorptionsmaterialien, wie Nähte, Bandagen und Gaze imprägniert sein oder auf die Oberfläche von Festphasenmaterialen, wie Heftklammern, Reißverschlüssen und Kathetern, beschichtet sein, um die Zusammensetzungen zu einer Stelle einer Mikrobeninfektion zu liefern. Andere Liefersysteme dieser Art werden für Fachmänner sofort ersichtlich sein.
  • Die tatsächlichen Dosierungshöhen von Haloperoxidase in den Zusammensetzungen der Erfindung können variiert werden, um die Mengen an Haloperoxidase an der Infektionsstelle zu erhalten, die effektiv ist, um die erwünschte therapeutische oder prophylaktische Antwort für eine spezielle Haloperoxidase und Verabreichungsmethode zu bekommen. Demgemäß hängt die ausgewählte Dosierungshöhe von der Natur und Stelle der Infektion, der erwünschten therapeutischen Antwort, dem Verabreichungsweg, der erwünschten Behandlungsdauer und anderen Faktoren ab. Im Allgemeinen, wenn die Haloperoxidase Myeloperoxidase ist, umfassen flüssige Verabreichungsformen für topische oder bukkale Verabreichung von ca. 0,01 Pikomol (pmol) bis ca. 500 pmol Myeloperoxidase pro ml flüssige Zusammensetzung, mehr bevorzugt von ca. 0,1 pmol bis ca. 50 pmol Myeloperoxidase pro ml flüssige Zusammensetzung, und am meisten bevorzugt von ca. 0,5 pmol bis ca 5 pmol Myeloperoxidase pro ml flüssige Zusammensetzung. Ähnliche Dosierungen von eosinophiler Peroxidase können eingesetzt werden.
  • Das Vorangegangene kann in Verbindung mit den folgenden repräsentativen Beispielen besser verstanden werden, die zum Zwecke der Veranschaulichung und nicht als Einschränkung präsentiert werden.
  • Beispiele
  • Beispiel 1
  • H2O2 versus mikrobizider Aktivität von HOC, der Effekt von Erythrozyten
  • Materialien: Bakterien, die unten genauer beschrieben sind, wurden für 15 bis 16 Stunden bei 35°C in Trypticase-Soja-Brei (TSB – „Trypticase soya broth") gezüchtet. Hefe, die unten genauer beschrieben wird, wurde für 16 Stunden in Sabourauds-Dextrose-Agar (SDA) bei 35°C gezüchtet. Die Kulturen wurden bei 3.000 Umdrehungen/min für 15 min zentrifugiert und die Überstände entfernt. Das Pellet wurde gesammelt und zweimal mit steriler 0,85 % normaler Salzlösung (NS – „normal saline") gewaschen. Die gewaschenen Mikroben wurden resuspendiert und mit NS zu einer Absorption von 0,1 bei einer Wellenlänge von 540 nm, d.h. ungefähr 10 Bakterien-CFU (CFU – "colony forming units" – koloniebildende Einheiten) pro ml und ungefähr 106 Hefe-CFU pro ml, verdünnt.
  • Eine 3% H2O2-Vorratslösung (0,88 M) wurde zur Herstellung der erforderlichen verdünnten Lösungen von H2O2 verwendet. Die H2O2-Konzentration wurde durch ultraviolette Absorption unter Verwendung eines 240 nm Extinktionskoeffizienten von 43,6 M-1 cm-1 oder eines 300 nm Extinktionskoeffizienten von 1,0 M-1 cm-1 verifiziert. Eine 5,25% HOCl-Vorratslösung (0,7 M) wurde zur Herstellung der erforderlichen verdünnten HOCl-Lösungen verwendet.
  • Blut wurde einer gesunden freiwilligen Person durch Venenpunktion abgenommen. Lithiumheparin wurde als Antikoagulierungsmittel eingesetzt. Das Vollblut wurde bei 1.500 Umdrehungen/min für 15 min zentrifugiert und der Buffy-Coat wurde gemeinsam mit dem Plasma aspiriert, um die Erythrozyten, d.h. rote Blutkörperchen (RBC – „red blond cells") zu gewinnen. Die Erythrozyten wurden in NS resuspendiert und die Zentrifugierung, Aspiration und Resuspension wurde wiederholt. Die Erythrozytensuspension wurde dann durch eine sterile Baumwollgaze passiert, um sämtliche verbleibende Leukozyten zu entfernen. Die Zentrifugierung und Aspiration wurde abermals wiederholt und das Pellet wurde in 50 ml NS resuspendiert. Die Zellen wurden durch einen Haemocytometer gezählt und die Suspension auf 108 RBC pro ml eingestellt. Die Hämoglobinkonzentration wurde durch die Technik Drabkins gemessen (J.B. Henry, 1984, Clinical Diagnosis and Management by Laboratory Methods, 17. Ausgabe, Seiten 580-585, W.B. Saunders Co.).
  • Methodologie: Unter Verwendung einer sterilen Technik wurden 100 μl Mikrobensuspension und 100 μl NS oder 100 μl RBC-Suspension Polystyrolröhrchen von 12×75 mm zugegeben. Die Reaktion wurde durch die Zugabe von verschiedenen verdünnten Lösungen des H2O2 oder HOCl initiiert; das Endvolumen wurde durch die Zugabe von NS auf 1 ml eingestellt. Der Reaktion wurde ein Durchlauf für 30 min bei 23°C erlaubt. Nach dem Mischen, um die zellulären Komponenten zu resuspendieren, wurden 100 μl der Reaktionsuspension 900 μl NS zugegeben und auf 10-3 seriell (10π) ausverdünnt. 100 ml jeder verdünnten Lösung wurden dann gleichmäßig auf vormarkierten Agar-Platten unter Verwendung der „glass hockey stick"-Technik zur Trockne ausgebreitet. Trypticase-Soja-Agar (TSA – „trypticase soy agar") wurde für die Bakterien und Sabourauds-Dextrose-Agar (SDA – „Sabouraud's dextrose agar") für die Hefe verwendet. Die Platten wurde dann bei 36°C für ca. 24 bis ca. 48 Stunden bis zum Auslesen inkubiert. Die Kolonien wurden gezählt und die CFU/Test wurden durch Multiplikation der gezählten Kolonieanzahl mit 10 (der anfängliche Faktor der verdünnten Lösung) hergeleitet und dieser Wert wurde mit dem Faktor der verdünnten Lösung der Platte multipliziert.
  • Die Tabellen 4 und 5 zeigen die Resultate der Abtötungsstudien von H2O2 (Tabelle 4) und HOCl (Tabelle 5), die gegen drei Bakterien und eine Hefe, Candida albicans, gerichtet sind. Zwei der Bakterien, Pseudomonos aeruginosa und Escherichia coli sind gramnegative Bazillen; Staphylococcus aureus ist eine grampositive Kokke. Diese Mikroben wurden aufgrund der Artenvielfalt gewählt und weil sie alle üblicherweise mit der Infektionspathologie assoziiert werden. Diese Experimente wurden auch angelegt, um den Inhibitionseffekt von roten Blutkörperchen (RBCs) auf die antiseptische Wirkung von H2O2 und HOCl quantitativ zu bestimmen. RBCs enthalten Katalase, ein Enyzm, dass H2O2 disproportioniert, wodurch 3O2 und H2O hervorgebracht wird. RBCs enthalten auch eine Vielzahl an Substraten, die mit 1O2 und HOCl reagieren können und inhibieren somit die antiseptische Wirkung konkurrierend. TABELLE 4 Mikrobizide Wirkung von Wasserstoffperoxid: Inhibitionseffekt von Erythrozyten (Rote Blutkörperchen, RBC) und assoziierte Haemolyse und Hamoglobinzerstörung:
    Keine RBC RBC (107) Hämoglobin:
    Organismus H2O2, μmol CFU: CFU: Pellet Überst.
    P. aeruginosa Keines 2,000.000 2,000.000 0,9 0,0
    790 0 0 0,0 0,0
    79 0 2,200.000 0,2 0,1
    7,9 4.500 1,700.000 0,9 0,1
    0,79 2,000.000 1,800.000 0,9 0,1
    0,079 1,600.000 1,700.000 0,9 0,1
    0,0079 1,200.000 2,000.000 0,9 0,1
    0,0008 1,400.000 1,700.000 0,9 0,1
    E.coli Keines 1,600.000 1,300.000 0,9 0,0
    790 0 10.000 0,0 0,0
    79 0 1,100.000 0,4 0,0
    7,9 670.000 1,300.000 0,9 0,1
    0,79 1,600.000 1,200.000 0,9 0,1
    0,079 1,300.000 1,700.000 0,9 0,1
    0,0079 1,600.000 1,200.000 0,9 0,1
    0,0008 1,200.000 1,300.000 1,0 0,0
    Staph.aureus Keines 1,200.000 1,300.000 0,9 0,0
    790 0 280.000 0,0 0,0
    79 0 1,600.000 0,4 0,0
    7,9 0 1,600.000 0,9 0,1
    0,79 880.000 1,500.000 0,9 0,1
    0,079 1,400.000 1,400.000 0,9 0,1
    0,0079 1,400.000 1,200.000 0,9 0,1
    0,0008 1,400.000 1,200.000 1,0 0,0
    Cand.albicans Keines 190.000 350.000 1,0 0,0
    790 78.000 150.000 0,0 0,0
    79 230.000 300.000 0,3 0,0
    7,9 150.000 380.000 1,0 0,0
    0,79 180.000 330.000 1,0 0,0
    0,079 170.000 280.000 0,9 0,0
    0,0079 160.000 290.000 0,9 0,0
    0,0008 270.000 320.000 1,0 0,0
  • Die erhobenen Daten der Tabelle 4 zeigen die Mengen an H2O2 an, die zur Mikrobenabtötung in Anwesenheit oder Abwesenheit von RBCs benötigt werden. Z.B. sind in Abwesenheit von RBCs 79 μmol H2O2 für die 100%ige Abtötung von 2·106 P.aeruginosa notwendig und 7,9 μmol H2O2 töteten 99,8 % des 2·106 P.aeruginosa ab. Dies gleicht ungefähr 4 pmol oder 2·1012 Molekülen H2O2/ml für jeden abgetöteten P.aeruginosa. In Anwesenheit von 10 RBCs/ml, waren 790 μmol H2O2 zur Abtötung des 2·106 P.aeruginosa notwendig, d.h. 2·1014 Moleküle H2O2/abgetötetem P.aeruginosa. Man beachte, dass die hundertfache Inhibition der Abtötung durch die Anwesenheit von ca. 5 RBCs pro Bakterie bewirkt wird. Aufgrund der Abwesenheit von Hämoglobin sowohl in den Überstand-, als auch Pelletfraktionen wurden die RBCs bei 790 μmol H2O2/ml vollständig zerstört und bei 79 μmol H2O2/ml wurden 80% zerstört. Man beachte, dass in Anwesenheit von RBCs sogar bei einer Konzentration von H2O2, die eine 80%ige Zerstörung der RBCs bewirkte, kein P.aeruginosa abgetötet wird. Ähnliche Resultate wurden bei E.coli als Targetmikrobe erhalten.
  • Der Inhibitionseffekt von RBCs ist sogar noch dramatischer bei Staph.aureus als Targetmikrobe. Obwohl in Abwesenheit von RBCs ein wenig empfindlicher gegenüber H2O2, d.h. ungefähr 9·1011 Moleküle H2O2/abgetötetem Staph.aureus, üben RBCs einen sehr großen Inhibitionseffekt auf die Abtötung aus. Ungefähr 4·1014 Moleküle/ml sind pro abgetötetem Staph.aureus in den Suspensionen, die RBC enthalten, notwendig. Die Anwesenheit von 107 RBCs/ml bewirkte eine vierhundertfache Inhibition der Abtötung von Staph.aureus. Wie bei den gramnegativen Mikroben gibt es in Anwesenheit von RBCs keine Abtötung von Staph.aureus bei einer Konzentration von 79 μmol/ml H2O2, eine Konzentration, die 60 % der anwesenden RBCs zerstörte.
  • Candida albicans ist gegen die Wirkung von H2O2 außergewöhnlich resistent. Mehr als 1015 Moleküle H2O2 wurden pro abgetöteter Candida albicans in Abwesenheit oder Anwesenheit von RBCs benötigt. TABELLE 5 Mikrobizide Wirkung von Hypochlorit: Inhibitionseffekt von Erythrozyten (RBC) und assoziierte Haemolyse und Hämoglobinzerstörung:
    Keine RBC BBC (107) Hämoglobin:
    Organismus HOC nmol CFU: CFU: Pellet Überst.
    P. aeruginosa Keines 1,800,000 2,700.000 0,9 0,1
    6300 0 0 0,0 0,0
    630 0 2,000.000 0,0 1,0
    63 0 2,300.000 1,0 0,0
    6,3 400 2,100.000 1,0 0,0
    0,63 5.000 2,300.000 0,9 0,1
    0,063 2.100 2,300.000 1,0 0,0
    0,0063 1.200 2,900.000 0,9 0,1
    0,0006 2,100.000 2,500.000 0,9 0,0
    E.coli Keines 1,700.000 1,500.000 0,9 0,0
    6300 0 0 0,0 0,0
    630 0 1,400.000 0,1 0,3
    63 0 1,400.000 0,0 0,7
    6,33 0 1,700.000 1,0 0,0
    0,63 1,600.000 1,500.000 0,9 0,0
    0,063 1,500.000 1,500.000 1,0 0,0
    0,0063 1,500.000 1,600.000 1,0 0,0
    0,0006 1,400.000 1,600.000 1,0 0,0
    Staph.aureus Keines 1,500.000 1,400.000 1,0 0,0
    6300 0 0 0,0 0,0
    630 0 710.000 0,1 0,3
    63 0 1,200.000 0,0 1,0
    6,33 0 1,500.000 1,0 0,0
    0,63 1,300.000 1,400.000 0,9 0,0
    0,063 1,400.000 1,500.000 1,0 0,0
    0,0063 1,300.000 1,200.000 1,0 0,0
    0,0006 1,500.000 1,300.000 1,0 0,0
    Cand.albicans Keines 360.000 340.000 1,0 0,1
    6300 0 0 0,0 0,0
    630 0 350.000 0,0 0,2
    63 0 350.000 0,0 0,9
    6,33 240.000 250.000 0,9 0,1
    0,63 250.000 310.000 0,7 0,1
    Rein RBC BBC (107) Hämoglobin:
    Organismus H2O2 μmol CFU: CFU: Pellet Überst.
    Cand.albicans 0,063 280.000 360.000 0,8 0,1
    0,0063 240.000 340.000 0,9 0,1
    0,0006 290.000 290.000 0,9 0,1
  • Die erhobenen Daten von Tabelle 5 zeigen die Mengen an HOCl an, die für die Mikrobenabtötung in Anwesenheit oder Abwesenheit von RBCs notwendig sind. HOC ist ein hochwirksamer antiseptischer Wirkstoff. In Abwesenheit von RBCs sind 106 Moleküle HOCl pro abgetötetem P.aeruginosa notwendig. Man beachte, dass in Abwesenheit von RBCs HOCl einmillionenfach effektiver als H2O2 bei der Abtötung von P.aeruginosa ist. Allerdings ist seine Wirksamkeit durch die Anwesenheit von RBCs ernsthaft gefährdet. In Anwesenheit von RBCs sind 1012 Moleküle HOC pro abgetötetem P.aeruginosa notwendig. Bei einem Verhältnis von ungefähr 5 RBCs pro Bakterie üben die Erythrozyten eine millionenfache Inhibition in Bezug auf die für die Abtötung von P.aeruginosa nötige Menge an HOCl aus. Man beachte, dass es bei 630 nmol HOCl/ml eine vollständige Lysis von RBCs, aber keine effektive mikrobizide Wirkung gibt.
  • Sowohl E.coli, als auch Staph.aureus zeigen ähnliche Sensibilitätsmuster gegenüber der HOCl-Wirkung, d.h. ungefähr 109 Moleküle pro in Abwesenheit von RBCs abgetöteter Bakterie und 1012 Moleküle pro in Anwesenheit von RBCs abgetöteter Bakterie. Somit üben RBCs eine eintausendfache Inhibition auf die HOCl-Wirkung aus und bei 63 nmol HOCl/ml gibt es keine effetive mikrobizide Wirkung trotz einer vollständigen Lysis der 10 RBCs.
  • Candida albicans ist gegenüber HOCl sensibel; 1011 Moleküle HOCl/ml sind pro abgetöteter Candida albicans nötig. Somit ist HOC im Verhältnis zu H2O2 zehntausendfach wirksamer für die Abtötung von Candida albicans. Die mikrobizide Wirkung von HOCl wurde einhundertfach durch Anwesenheit von RBCs inhibiert und, wie für die Bakterien beobachtet, zeigten 63 nmol HOCl/ml keine effektive Abtötung von Candida albicans trotz der vollständigen Lysis der anwesenden 107 RBCs.
  • Diese Daten bestimmen die antiseptische Wirkung von H2O2 und HOCl quantitativ und dienen somit als Bezugsdaten beim Vergleich der antiseptischen Aktivitäten von Haloperoxidasen der Erfindung. Die Resultate stimmen mit den Beobachtungen und Schlussfolgerungen von Dakin, Fleming und Knox, die oben beschrieben wurden, überein. Erstens ist HOCl ein wirksamer antiseptischer Wirkstoff. Knox et al. (1948) berichteten, dass HOCl bei Konzentrationen im Bereich von 0,2 bis 2,0 ppm, d.h. 4 bis 40 nmol/ml HOCl, effektiv mikrobizid ist. Die Daten der Tabelle 5 sind mengenmäßig im Einklang mit diesem Aktivitätsbereich. Zweitens sind Mikroben gegenüber der Wirkungen von H2O2 und HOCl weniger empfindlich als Wirtszellen, z.B. RBCs. Die Möglichkeit eines Schadens des Wirtsgewebes muss erwogen werden, wenn die therapeutische Wirkungskraft eines antiseptischen Wirkstoffes bewertet wird.
  • Beispiel 2
  • Mikrobizide Wirkung von Myeloperoxidase und eosinophiler Peroxidase
  • Es ist bekannt, dass zellfreie Myeloperoxidase in Kombination mit einem oxidierbaren Halid, d.h. l-, Br- und Cl- und H2O2, eine mikrobizide Wirkung ausübt (Klebanoff, 1968). Ist l- das Halid, wird ein Iodieren beobachtet. Bei Br- oder Cl- als Halid werden HOBr und HOCl produziert und diese wirksamen Oxidationsmittel können entweder direkt mit mikrobiellen Substraten reagieren oder mit einem zusätzlichen H2O2 reagieren, um 1O2, wie in Reaktion (14) beschrieben, hervorzubringen (Allen, 1975, Bioch.-Biophys.Res.Com. 63: 675-683 und 684-691). Der genommene Reaktionsweg wird zu großen Teilen durch H2O2-Verfügbarkeit bestimmt. Gemäß Reaktion (7) ist die Geschwindigkeit der HOCl-Generierung: dHOCl/dt = k[H2O2]1 (17)direkt proportional zur H2O2-Konzentration auf eine Weise der ersten Ordnung, aber gemäß Reaktion (16) ist die Geschwindigkeit der 1O2-Generierung: d1O2/dt = k[H2O2]2 (18)vom Quadrat der H2O2-Konzentration abhängig; d.h. die Reaktion ist eine der zweiten Ordnung in Bezug auf die H2O2-Konzentration. An sich resultiert eine zehnfache Abnahme von H2O2 in einer zehnfache Abnahme der HOCl-Verfügbarkeit, die gleiche zehnfache Abnahme von H2O2 resultiert allerdings in einer hundertfachen Abnahme der 1O2-Generierung. Ist H2O2 begrenzend, wird direkte Halogenierung von mikrobiellen Substraten, z.B. die Bildung von Chloramin, bevorzugt. Ist jedoch ein adequates H2O2 verfügbar, wird die Generierung von 1O2 bevorzugt.
  • Die Bildung von Chloramin kann ein Intermediat zur schließlichen Dioxigenierung von mikrobiellen Substraten sein. Ein saurer pH-Wert bevorzugt die Chloramindissoziation, was HOCl hervorbringt, und ein saurer pH-Wert begünstigt auch die mikrobielle Abtötung. Somit könnte entweder HOCl, Chloramin oder möglicherweise irgendeine andere Form von chloriertem mikrobiellen Substrat mit H2O2 reagieren, um eine dioxigenierte Mikrobe mit 102 hervorzubringen, die als das virtuelle oder tatsächliche dioxigenierende Mittel dient. Die Reaktion von chlorierten oder bromierten organischen Verbindungen mit H2O2 bringt dioxigenierte Produkte hervor, d.h. Dioxetane, die mit jenen identisch sind, die über die 1O2-Reaktion erhalten wurden (Kopecky, 1982, in Chemical and Biological Generation of Excited States, Adan and Cilento, Hrsg., S. 85-114, Academic Press).
  • Die Mikrobenabtötungswirkung von 1O2 wurde oben mit Bezug auf die Reaktionen der farbstoffsensibilisierten Abtötung mit Licht („photokilling") betrachtet. 1O2 ist ein wirksames Elektrophil, das mit den pi(π)-Bindungselektronen von Singulett-Multiplizitäts-Substraten reagieren kann. Die resultierenden elektrophilen Dioxigenierungen sind stark exergon und spinerlaubt, d.h. mechanistisch bevorzugt (Allen et al., 1972, Bioch.-Biophys.Res.Commun. 47: 679; Allen, 1986, Meth. Enzymol. 133: 449-493). Eine schematische Darstellung des Haloperoxidasemechanismus für 1O2-Generierung ist in 1 präsentiert. Mikrobenabtötung durch 1O2 hängt am Wahrscheinlichsten mit der oxidativen Zerstörung der Membranintegrität, der oxidativen Inhibition von für die metabolische Funktion notwendigen Enzymen und/oder oxidativen Disintegration der für die Reproduktion notwendigen Nukleinsäuren zusammen.
  • Die mikrobizide Aktivität von Myeloperoxidase und eosinophiler Peroxidase in Anwesenheit oder Abwesenheit von Peroxid wurde wie folgt bestimmt. Wenn anwesend, wurden Glucose und Glucoseoxidase als Quelle für Wasserstoffperoxid verwendet.
  • Materialien: Bakterien und Hefe wurden wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt. Die Glucoseoxidase (GOX) wurde von Sigma Chemical Co. erworben und eine sterile Vorratslösung von D-Glu cose (1 mg/ml) wurde in NS zubereitet. GOX wurde durch Absorptionsspektroskopie unter Verwendung des FAD-Extinktionskoeffizienten (FAD – „flavine adenine dinucleotide” – Flavin-Adenin-Dinukleotid, Whitby, 1953, Biochem.J. 54: 437-442) von 11,3 mM-1 cm-1 bei 450 nm quantifiziert. Jede GOX enthält zwei FADs und somit wurde ein Extinktionskoeffizient von 22,6 mM-1 cm1 bei 450 nm verwendet, um GOX zu quantifizieren. GOX wurde auch als millimolare Orthodianisidin-Oxidationseinheiten in Anwesenheit von überschüssiger Meerrettichperoxidase, wie durch den Anbieter (Sigma Chemical Co.) beschrieben, quantifiziert. Eine Einheit ist die Menge an GOX, die pro Minute unter den gleichen Bedingungen wie während des Testens 1 μmol Glucose zu Peroxidase oxidiert.
  • Myeloperoxidase (MPO) und eosinophile Peroxidase (EPO) wurden extrahiert und von porzinen Leukozyten durch Chromatographie gereinigt. Die Menge an Haloperoxidase wurde durch die Differenzspektroskopie, die reduziert minus oxidiert (R-O) anzeigt, unter Verwendung von Dithionit als Reduktionsmittel bewertet. Die Reinheitszahl (RZ), d.h. das Verhältnis von 430 nm zu 280 nm Absorption (A430/280) für MPO war 0,7 und zeigte ungefähr 90 Reinheit an. Das R-O-Differenzspektrum von MPO ist in 2 gezeigt; ein R-O-Differenz-Extinktionskoeffizient von 50 mM-1 cm-1 bei 475 nm wurde zur MPO-Quantifizierung verwendet. Das EPO-R-O-Differenzspektrum ist in 3 gezeigt. Der R-O-Differenz-Extinktionskoeffizient für die EPO-Quantifizierung war 56 mM-1 cm-1 bei 450 nm. Die RZ für EPO, d.h. A412/280, war 0,7 und zeigte ungefähr 70 Reinheit an. Die spektrophotometrischen Messungen wurden auf einem DW2000 UV-sichtbaren Spektrophotometer (SLM Instruments Co.) durchgeführt.
  • Methodologie: Die Prozedur von Beispiel 1 wurde im Allgemeinen befolgt, nur nicht die Einschließung von Haloperoxidase und Glucose und GOX als eine Peroxidquelle anstatt des zugegebenen Wasserstoffperoxids oder Hypochlorits. In diesem Beispiel wurden 100 μl Mikrobensuspension, 100 μl Haloperoxidase, 100 μl Glucose und 600 μl NS Röhrchen von 12×75 mm zugegeben. Die Reaktion wurde durch die Zugaben von 100 μl GOX initiiert. Der Reaktion wurde ein Durchlauf von 30 min bei 23°C erlaubt. Verdünnung, Plattieren und Koloniebildung erfolgte wie in Beispiel 1.
  • Die Tabellen 6 und 7 zeigen die Resultate der MPO- und EPO-Abtötung der drei Bakterien und der einen Hefe, die zuvor in Beispiel 1 getestet wurden. In diesem Beispiel wurden die Mikroben um ein zusätzliches Zehnfaches verdünnt. 100 pmol Glucoseoxidase (GOX) wurden für die H2O2-Generierung eingesetzt, und die Glucoseendkonzentration pro Röhrchen betrug 0,1 mg/ml, d.h. 0,56 μmol/ml. Da die H2O2-Generierung zur Glucoseverfügbarkeit auf eine Weise der ersten Ordnung proportional ist, ist die Gesamtmenge an dem durch dieses System generierten H2O2 auf 0,56 μmol beschränkt. Wie von den Daten in Tabelle 4 demonstriert, ist die H2O2-Konzentration allein für die direkte Mikrobenabtötung nicht ausreichend. Die mikrobiziden Aktivitäten von MPO und EPO wurden in Anwesenheit und Abwesenheit des GOX-Speisungssystems getestet, wie in den Tabellen 6 und 7 dargestellt. TABELLE 6 Abtötungskapazität von Myeloperoxidase (MPO) in Anwesenheit und Abwesenheit von Glucoseoxidase (GOX) als H2O2-Generator:
    GOX, keine GOX, 100 pmol
    Organismus MPO, pmol CFU: CFU:
    P. aeruginosa Keine 130,000 100.000
    450 100,000 0
    90 78.000 0
    18 50.000 0
    3,6 110.000 1.000
    0,7 100.000 4.000
    E.coli Keine 243.000 287.000
    450 149.000 0
    90 217.000 0
    18 113.000 0
    3,6 208.000 430.000
    0,7 178.000 790.000
    Staph.aureus Keine 384.000 298.000
    450 222.000 0
    90 379.000 0
    18 584.000 43.000
    3,6 263.000 78.000
    0,7 217.000 114.000
    Cand.albicans Keine 240.000 520.000
    450 180.000 0
    90 420.000 0
    18 300.000 0
    3,6 740.000 26.000
    0,7 400.000 340.000
  • Die Mikroben (100 μl), MPO (100 μl) und Glucose (100 μl, 1 mg/ml) plus oder minus GOX (100 pmol, d.h. ungefähr 1 mM-Einheit, in 100 μl) wurden NS für ein Endvolumen von 1,0 ml zugegeben. TABELLE 7 Abtötungskapazität von eosinophiler Peroxidase (EPO) in Anwesenheit und Abwesenheit von Glucoseoxidase (GOX) als H2O2-Generator:
    GOX, keine GOX, 100 pmol
    Organismus EPO, pmol CFU: CFU:
    P. aeruginosa Keine 160,000 220.000
    500 110,000 0
    100 500.000 0
    20 110.000 1.000
    4 180.000 11.000
    0,8 140.000 190.000
    E.coli Keine 180.000 140.000
    500 100.000 0
    100 91.000 0
    20 150.000 0
    4 170.000 27.000
    0,8 280.000 100.000
    Staph.aureus Keine 180.000 100.000
    500 110.000 0
    100 140.000 0
    20 130.000 0
    4 100.000 0
    0,8 180.000 3.500
    Cand.albicans Keine 100.000 100.000
    500 170.000 0
    100 110.000 0
    20 110.000 0
    4 110.000 0
    0,8 100.000 0
  • Die Mikroben (100 μl), EPO (100 μl) und Glucose (100 μl, 1 mg/ml) plus oder minus GOX (100 pmol, d.h. ungefähr 1 mM-Einheit, in 100 μl) wurden NS für ein Endvolumen von 1,0 ml zugegeben.
  • MPO und insbesondere EPO sind basische, d.h kationische (positiv geladene) Proteine und manche kationische Proteine üben eine mikrobizide Wirkung in Abwesenheit von jeglicher demons trierbarer enzymatischer Redoxwirkung aus. Allerdings wurde unter den vorliegenden Testbedingungen im Wesentlichen keine direkte, von Peroxid unabhängige mikrobizide Wirkung entweder bei MPO, oder EPO über dem Konzentrationsbereich von über 0,7 bis 500 pmol/ml bemerkt. Gleichermaßen übte eine GOX-Konzentration von 100 pmol/ml, d.h. ungefähr 1 mM O-Dianisidin-Oxidationseinheiten-Aktivität unter den Testbedingungen, keine detektierbare mikrobizide Wirkung in Abwesenheit von XPO aus. Dies wird erwartet, da die Gesamtumwandlung von 0,1 mg (0,56 μmol) Glucose in 0,56 μmol H2O2 durch GOX für mikrobizide Wirkung nicht ausreichend wäre. Die Zugabe der gleichen Menge an GOX zu entweder MPO- oder EPO-Konzentrationen in Pikomol pro Milliliter produzierte eine starke mikrobizide Wirkung gegen alle getesteten Mikroben. Die MPO- und EPO-Daten scheinen auch eine Abtötungsspezifität zu zeigen, die infra näher ausgeführt wird.
  • Beispiel 3
  • Der Effekt von Myeloperoxidase auf die mikrobizide Wirkung von Peroxid
  • Materialien: Die Bakterien und Hefe wurden wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt. MPO wurde wie in Beispiel 2 beschrieben hergestellt.
  • Methodologie: Die Prozedur von Beispiel 1 wurde im Allgemeinen befolgt, bei welcher 100 μl Mikrobensuspension, 100 μl MPO (10 pmol) und 800 μl der angegebenen H2O2-Konzentration in Acetatpuffer (AcB), pH 6, Röhrchen von 12×75 mm zugegeben wurden. Die Reaktion wurde durch die H2O2-Zugabe initiiert. Die Reaktionen wurden in Anwesenheit von 100 μmol Cl- (Tabelle 8A) oder in Abwesenheit von Halid oder in Anwesenheit von 10 μmol Br- Tabelle 83) durchgeführt. Der Reaktion wurde ein Durchlauf von 30 min bei 23°C erlaubt. Verdünnen, Plattieren und Koloniebildung erfolgte wie in Beispiel 1 beschrieben. TABELLE 8A Abtötungskapazität von H2O2 in Anwesenheit und Abwesenheit von Myeloperoxidase (10 pmol MPO) und Chlorid (100 μmol Cl-):
    MPO, keine MPO, 10 pmol
    Organismus H2O2, μmol CFU: CFU:
    P. aeruginosa Keines 2,100.000 2,500.000
    700 0 0
    70 0 0
    14 23.000 0
    2,8 950.000 0
    0,56 1,800.000 0
    0,112 2,700.000 0
    0,0224 2,500.000 13.000
    0,00448 1,800.000 220.000
    0,000896 2,600.000 2,500.000
    E.coli Keines 3,200.000 2,500.000
    700 0 0
    70 0 0
    14 40.000 0
    2,8 1,700.000 0
    0,56 2,800.000 0
    0,112 3,200.000 0
    0,0224 3,600.000 37.000
    0,00448 2,100.000 0
    0,000896 3,000.000 19.000
    Staph.aureus Keines 2,400.000 1,700.000
    700 0 0
    70 0 0
    14 6.600 1,300.000
    2,8 1,500.000 1,900.000
    0,56 1,600.000 0
    0,112 2,000.000 0
    0,0224 2,500.000 0
    0,00448 2,700.000 30.000
    0,000896 2,300.000 2,300.000
    MPO, keine MPO, 10 pmol
    Organismus H2O2, μmol CFU: CFU:
    Cand.albicans Keines 620.000 760.000
    700 360.000 320.000
    70 320.000 380.000
    14 480.000 460.000
    2,8 440.000 0
    0,56 460.000 0
    0,112 420.000 0
    0,0224 540.000 0
    0,00448 440.000 180.000
    0,000896 420.000 520.000
  • Die Mikroben (100 μl), MPO (100 μl) und die angegebene Menge an H2O2 wurden NS für ein Endvolumen von 1,0 ml zugegeben. TABELLE 8B H2O2-Abtötungskapazität von Myeloperoxidase (10 pmol MPO) in Anwesenheit und Abwesenheit von Bromid (10 μmol Br-):
    Kein Halid 10 μmol Br
    Organismus H2O, μmol CFU: CFU:
    P. aeruginosa Keines 2,600,000 1,500.000
    0,56 2,800,000 0
    0,112 2,000.000 0
    0,0224 2,200.000 2.000
    0,00448 2,200.000 23.000
    0,000896 2,600.000 2,300.000
    0,0001792 ND1 3,100.000
    E.coli Keines 520.000 1,700.000
    0,56 1,400,000 0
    0,112 970.000 0
    0,0224 1,900.000 0
    0,00448 1,200.000 600
    0,000896 780.000 910.000
    0,0001792 ND1 1,600.000
    0,0000358 ND 1,300.000
    Staph.aureus Keines 3,700.000 3,800.000
    0,56 3,500,000 0
    0,112 3,300.000 0
    0,0224 3,000.000 0
    0,00448 3,300.000 0
    0,000896 3,800.000 54.000
    0,0001792 ND 500
    0,0000358 ND 200.000
    0,0000072 ND 3,200.000
    Cand.albicans Keines 820.000 450.000
    0,56 920.000 0
    0,112 940.000 0
    0,0224 660.000 500
    0,00448 880.000 5.600
    0,000896 880.000 580.000
    0,0001792 ND 23.000
    0,0000358 ND 63
    0,0000072 ND 540.000
    • 1 Nicht durchgeführt
  • Die Daten der Tabellen 8A und 8B zeigen den potenzierenden Effekt von MPO auf die mikrobizide Wirkung von H2O2 unter Verwendung von 100 μmol Cl1- bzw. 10 μmol Br- als Halidkofaktor. Bei einer Konzentration von 10 pmol/ml begrenzt MPO die Geschwindigkeit in Bezug auf die MPO:Cl-(oder Br-):H2O2-abhängige Abtötung der 106 Targetmikroben nicht. Diese Menge an MPO liefert einen Zustand der im Wesentlichen nullten Ordnung bezüglich der XPO in der mikrobiziden Kinetik und an sich, wenn Halid nicht begrenzend ist und wenn das Halid:Peroxid-Verhältnis nicht inhibierend ist (infra vollständig beschrieben), erfolgt die Abtötung proportional zur H2O2-Verfügbarkeit. Der katalytische Effekt von MPO auf die mikrobizide Wirkung von H2O2 wurde unter Verwendung der gleichen Bakterien und der gleichen Hefe, wie zuvor beschrieben, getestet.
  • Die MPO- und Halidkonzentrationen wurden konstant gehalten und H2O2wurde über einen breiten Konzentrationsbereich variiert. Man beachte in den Daten der Tabelle 8A, dass die H2O2-Abtötungsaktivitäten in Abwesenheit von MPO mit den direkten H2O2-Abtötungsaktivitäten in Abwesenheit von RBC vergleichbar sind. Siehe die in Tabelle 4 erhobenen Daten. In beiden Studien werden ungefähr 1012 Moleküle H2O2 pro abgetöteter Bakterie benötigt und H2O2 war bei der Abtötung von Candida albicans sogar bei einer Konzentration von 700 μmol/ml, d.h. 2,4 % H2O2, ineffektiv. Die Daten in Tabelle 8B eröffnen weiters, dass Bromid als das Halid für die mikrobizide Wirkung von MPO dienen kann. Im Wesentlichen wurde keine Abtötung unter Verwendung des MPO-H2O2-Systems in Abwesenheit von Halid beobachtet.
  • In Abwesenheit von H2O2 tötete MPO keine der getesteten Mikroben ab, allerdings erhöhte MPO die mikrobizide Kapazität von H2O2 um mehrere Größenordnungen. Bei relativ hohen Konzentrationen, z.B. im μmol/ml-Bereich, kann H2O2 die katalytische Aktivität von XPO inhibieren, außer es gibt eine proportionale Erhöhung der Halidkonzentration. Die Inhibition der MPG-abhängigen Abtötung von Candida albicans bei hohen H2O2-Konzentrationen resultiert aus dem stark gesenkten Cl-:H2O2-Verhältnis. Der Mangel eines beobachtbaren Effekts bei den Bakterien kann das Resultat einer viel größeren MPG-unabhängigen Abtötungsaktivität von H2O2 in Bezug auf diese Bakterien sein; d.h. die Abtötung erfolgt trotz MPG-Inhibition. Man beachte, dass die Inhibition der Abtötung von Staph.aureus bei 2,8 und 14 μmol Peroxid beobachtet wird. MPO kann vor der Wirkung von H2O2 durch Erhöhen der Halidkonzentration oder durch Absenken des pH-Wertes geschützt werden. Es ist jedoch wahrscheinlich passender die zugegebene H2O2-Konzentration zu senken oder ein H2O2-Generatorsystem einzubringen, das eine relativ geringe, aber dynamisch nachhaltige H2O2-Verfügbarkeit sichert. Das Verhältnis von Chlorid/Peroxid ist ein wichtiger Faktor im Hinblick auf die Stabilität und funktionale katalytische Aktivität von Haloperoxidase. Ein breiter Bereich an Peroxidkonzentrationen kann angewandt werden, solange das Chlorid/Peroxid-Verhältnis vorzugsweise über ungefähr 50 gehalten wird. Ist die Chloridkonzentration z.B. 100 pmol/ml, d.h. ungefähr gleich der physiologischen Plasmakonzentration, dann sollte die Peroxidkonzentration unter 2 μmol/ml und vorzugsweise unter 1 μmol/ml gehalten werden.
  • Pikomol-Mengen an MPO produzieren einen mehr als zehntausendfachen Anstieg der bakteriziden Wirkung von H2O2. Bei 10 pmol MPO werden ungefähr 108 Moleküle H2O2 pro abgetöteter Bakterie benötigt, ungeachtet der getesteten Bakterien. Dies entspricht einer H2O2-Konzentration von 0,01 ppm. Dieser untere Bereich der Peroxidkonzentration könnte durch die optimale Einstellung des Chlorid/Peroxid- oder Bromid/Peroxid-Verhältnisses noch weiter nach unten erweitert werden. An sich übertrifft die bakterizide Wirkung von MPO-katalysiertem H2O2 jene, die für HOCl berichtet wurde, d.h. 0,2 bis 2,0 ppm (Knox et al., 1948). Man rufe in Erinnerung, dass das in Tabelle 5 gezeigte Verhältnis Moleküle/abgetöteter Mikrobe unter Verwendung von HOCl für E.coli und Staph.aureus ungefähr 109 betrug, für P.aeruginosa allerdings bei ungefähr 106 lag. Mit Ausnahme ist die mikrobizide Wirkung von MPO-katalysiertem H2O2 größer als jene von HOC wenn auf einer Konzentrations- oder Molekül/Mikroben-Basis gleichgesetzt.
  • Wie von den Daten der Tabellen 4, 8A und 8B gezeigt, ist Candida albicans gegenüber der direkten Wirkung von H2O2 stark resistent, die Einbringung von 10 pmol MPO in Anwesenheit von Cl oder Br- produziert aber einen mehr als hunderttausendfachen Anstieg der H2O2-Abtötungsaktivität bezüglich dieser Hefe. Die MPO-abhängige H2O2-Abtötung von Candida albicans wird bei einem Molekül/Hefe-Verhältnis von ungefähr 5·109 bewirkt. Obwohl die Hefeabtötungskapazität des MPO-Systems weniger stark ist als jene, die für die Bakterien beobachtet wurde, ist das Abtötungssystem in Vergleich mit konventionellen Antiseptika und Antibiotika außergewöhnlich stark. Basierend auf dem Vergleich der Daten aus den Tabellen 5 und 8 ist die MPO-katalysierte H2O2-abhängige Abtötung von Candida albicans höher als jene, die unter Verwendung von HOCl beobachtet wurde.
  • Beispiel 4
  • Der Effekt von Erythrozyten auf die mikrobizide Wirkung von MPO-GOX
  • Materialien: Bakterien und Hefe wurden wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt. MPO-, GOX- und RBC-Suspensionen wurden wie in Beispiel 2 beschrieben hergestellt, nur wurde die Glucose zu einer zehnfach höheren Konzentration, d.h. 10 mg/ml Vorratsglucose, verwendet.
  • Methodologie: Die Prozedur von Beispiel 2 wurde befolgt, bei welcher 100 μl Mikrobensuspension, 100 μl MPO, 100 μl Glucose (1 mg/100 μl), plus oder minus 100 μl RBC-Suspension und ausreichend NS, um ein Volumen von 0,9 ml hervorzubringen, Röhrchen von 12×75 mm zugegeben wurden. Die Reaktion wurde durch die Zugabe von 100 μl GOX (100 pmol/ml; ungefähr 1 mM O-Dianisidin-Oxidationseinheiten) initiiert. Der Reaktion wurde ein Durchlauf von 30 min bei 23°C erlaubt. Verdünnung, Plattieren und Koloniebildung erfolgte wie in Beispiel 1 beschrieben.
  • Die Daten in Tabelle 9 zeigen noch einmal die starke mikrobizide Aktivität von MPO in Kombination mit Glucose:GOX als das H2O2-Generierungssystem. Der erste Teil der Prozedur dieses Beispiels 4 unterschied sich von der in Beispiel 2 (Daten der Tabelle 6) beschriebenen nur darin, dass die Glucosekonzentration verzehnfacht wurde. 100 pmol GOX wurden für die H2O2-Generierung eingestetzt und die Endkonzentration von Glucose pro Röhrchen betrug 1,0 mg/ml, d.h. 5,6 μmol/ml. Deshalb ist die Gesamtmenge an durch dieses System generiertem H2O2 auf 5,6 μmol beschränkt. Basierend auf den Daten der Tabelle 4 ist diese Menge an H2O2 für eine direkte mikrobizide Wirkung in Abwesenheit von RBCs ausreichend, aber nicht in deren Anwesenheit.
  • Dieses Beispiel wurde angelegt, um den Effekt von RBCs auf die mikrobizide Wirkung von MPO zu bewerten. Die RBC:Bakterie-Verhältnisse waren ungefähr 2 und das RBC:Hefe-Verhältnis lag bei ungefähr 40. Diese Verhältnisse liegen innerhalb des gleichen Größenordnungsbereichs wie die in den Tabellen 4 und 5 zusammengestellten Experimente. Gemäß der Zellgrößenunterschiede ist die Erythrozytenmasse um einige Größenordnungen größer als jene der Mikroben. TABELLE 9 Erythrozyten(Red Blood Cell, RBC)-Inhibition der mikrobiziden Wirkung von Myeloperoxidase:Glucoseoxidase (MPO:GOX): Assoziierte Haemolyse und Hamoglobinzerstörung:
    Keine RBC RBC (107) Hämoglobin:
    Organismus MPO, pmol CFU: CFU: Pellet Überst.
    P. aeruginosa Keine 4,500,000 4,500.000 0,6 0,0
    100,0 0 4.600 0,0 0,8
    33,3 0 5.200 0,0 0,9
    11,1 0 1.600 0,0 0,9
    3,7 0 3.700 0,0 1,0
    1,2 0 1.200 0,2 0,9
    0,4 0 4.400 0,8 0,4
    0,13 0 22.000 0,7 0,0
    E.coli Keine 4,800.000 4,200.000 0,9 0,0
    100,0 0 0 0,0 0,5
    33,3 0 0 0,0 0,6
    11,1 0 300 0,0 0,6
    3,7 0 0 0,1 0,6
    1,2 0 2.000 1,0 0,0
    0,4 0 1.400 0,9 0,0
    Staph.aureus Keine 4,900.000 5,400.000 0,7 0,0
    100,0 0 0 0,0 0,7
    33,3 0 0 0,0 0,7
    11,1 0 0 0,0 0,6
    3,7 0 0 0,0 0,5
    1,2 0 5.000 1,0 0,1
    0,4 0 3.000 1,0 0,0
    Cand.albicans Keine 200.000 260.000 0,8 0,0
    100,0 0 90.000 0,0 0,9
    33,3 0 120.000 0,0 1,0
    11,1 0 110.000 0,0 0,9
    3,7 0 180.000 0,0 1,3
    1,2 100 90.000 0,4 0,9
    0,4 310.000 190.000 0,9 0,5
    0,13 130.000 190.000 0,8 0,0
  • Die Mikroben (100 μl), MPO (100 μl), Glucose (100 μl, 10 mg/ml), GOX (100 pmol, d.h. ungefähr 1 mM-Einheit, in 100 μl) plus oder minus 10 RBC (100 μl) wurden NS für ein Endvolumen von 1,0 ml zugegeben.
  • Wie in Tabelle 9 gezeigt, ist die bakterizide Kapazität des MPO-GOX-Systems durch die Anwesenheit von RBCs inhibiert, allerdings ist der Inhibitionseffekt relativ gering. Die H2O2-Menge von ungefähr 6 μmol sollte eine detektierbare bakterizide Wirkung, aber keine fungizide Wirkung in Abwesenheit von RBCs und keine detektierbare bakterizide oder fungizide Wirkung in Anwesenheit von RBCs ausüben. Die Daten in Tabelle 9 zeigen, dass das MPO-GOX-System sogar in Anwesenheit von RBCs eine starke mikrobizide Wirkung bewirkt. Dieses MPO-GOX-System verursachte Haemolyse, wenn MPO zu einer Konzentration von mehr als ca. 1 pmol/ml verwendet wurde. Die bakterizide Wirkung ohne die assoziierte haemolytische Aktivität wird jedoch im sub-pmol/ml-Bereich der MPO-Konzentration beobachtet. Diese letztere Beobachtung ist dadurch von grundlegender Wichtigkeit, dass sie eine Selektivität in Bezug auf die zerstörende Aktivität von MPO nahe legt; d.h. unter optimalen Bedingungen können Bakterien selektiv mit einem minimalen Kollateralschaden der Wirtszellen abgetötet werden.
  • Beispiel 5
  • Spektralanalyse der MPO-Bindung an Mikroben
  • 1O2 bietet als antiseptischer Wirkstoff mehrere Vorteile. Es ist ein Breitbandmittel, jedoch ein relativ selektives elektrophiles oxygenierendes Mittel, das mit den Schlüsselaminosäuren, ungesättigten Fetten und Nukleinsäuren reagieren kann. Die reaktiven Geschwindigkeitskonstanten (kr, in M-1 sec-1) für eine 1O2-Reaktion mit Trytophan, Histidin and Methionin sind 3·107 (Matheson and Lee, 1979, Photochem.Photobiol. 29: 879-881), 8,8·107 bzw. 2·107 (Kraljic and Sharpatyi, 1978, Photochem.Photobiol. 28: 583-586). Diese essentiellen Aminosäuren sind notwendige Komponenten der Proteinstruktur und nehmen typischerweise an katalytischen Enzymmechanismen teil. An sich könnte eine „Spuren"-Konzentration an 1O2 eine große Anzahl der für die metabolische Funktion notwendigen Enzyme reaktiv inhibieren (Green, 1941).
  • Ein Spin-Multiplizitäts-Wechsel, d.h. ein Zwischensystemübergang, ist für die Relaxation von 1O2 zu 3O2 notwendig. Im Einklang mit Wigners Spinerhaltungsregeln resultiert die Metastabilität aus der geringen Wahrscheinlichkeit, die mit jegli chem Wechsel des Spinzustands assoziiert wird. An sich ist der 1O2-Anregungszustand Sauerstoff mit einer wässrigen reaktiven Lebensdauer im μs-Bereich metastabil (Merkel and Kearns, 1972, J.Am.Chem.Soc. 94: 1029-1030). Zusätzlich zu den durch ihren elektrophilen Charakter auferlegten mechanistischen Einschränkungen ist die 1O2-Reaktivität somit auch auf eine temporale Domgin beschränkt, die durch ihre Lebensdauer geregelt wird. „Es wurde herausgefunden, dass die Lebensdauer von 1O2 in einer wässrigen Lösung im μs-Bereich liegt, während welchem Intervall es durchschnittliche radiale Distanzen von zumindest 1,000 Angstrom diffusieren kann. Somit kann es an von der Stelle der Generierung entfernten Orten reagieren„ (Lindig and Rogers, 1981, Photochem.Photobiol. 33: 627-634).
  • Diese zeitgesteuerte Einschränkung der Reaktivität erlegt eine biologisch notwendige Beschränkung auf den Bereich und auf das Ausmaß des oxidativen Schadens von 1O2 durch Binden des Schadenvolumens an die Proximität des Generatorenzyms, XPO, auf. Anders ausgedrückt ist die Reaktion im dreidimensionalen Raum durch die vierdimensionale Eigenschaft des Reaktionsmittels, d.h. der Lebensdauer von 1O2, beschränkt. Wenn die XPO an die Oberfläche der Mikrobe bindet, wäre ein oxidatives Schadenvolumen mit einem Radius von ungefähr 1000 Angstrom (0,1 μm oder 100 nm) von der XPO-Stelle ausreichend, μm im Wesentlichen alle Komponenten der Mikrobe zu zerstören. Die Durchmesser der Bakterien reichen von ungefähr 0,5 bis 1,0 um und der Membran- und Peptidoglycanbereich ist typischerweise unter 50 nm dick. Somit sind die Schlüsselkomponenten der Mikrobenmembran sowie die essentiellen zytoplasmatischen Enzyme und Nukleinsäuren empfindlich gegenüber durch oberflächengebundener XPO generiertem 1O2.
  • Wenn die XPO in naher Proximität zu der Targetmikrobe ist, dient diese reaktive Volumensbeschränkung dazu, den Oxygenierungsschaden auf die Mikrobe zu begrenzen. Weiters, wenn die Bindung von XPO an Mikroben gegenüber den eukaryiotischen Zellen selektiv ist, dann könnte die mikrobizide Wirkung mit einem minimalen Schaden der „Bystander"-Wirtszelle, z.B. Haemolyse, erfolgen.
  • Myeloperoxidase (MPO) und insbesondere eosinophile Peroxidase (EPO) sind kationische Glycoproteine. Beide XPOs binden auch an eine Reihe von Lektinen, z.B. Concanavalin A. An sich könnten diese XPOs an Mikroben über elektrostatische Ladungen, Lektin bindung oder durch manch andere bMechanisms binden. Ist die Bindung an Targetmikroben ausreichend selektiv, wie hierin demonstriert, kann das antiseptische Potential der volumenbegrenzten Oxygenierungsaktivität des XPO-Systems vollständig realisiert werden.
  • Materialien: Die Bakterien wurden für ungefähr 16 Stunden in Trypticase-Soya-Brei (TSB) bei 35°C gezüchtet. Die Kulturen wurden dann zentrifugiert (3.000 Umdrehungen/min für 15 min) und der Überstand wurde entfernt. Das Pellet wurde gesammelt und zweimal mit steriler 0,85 normaler Salzlösung (NS) gewaschen. Die gewaschenen Mikroben wurden zu einer Dichte von ungefähr 109 Bakterien/ml resuspendiert. Die Endquantifizierung erfolgte durch Haemocytometerzählung. MPO wurde wie in Beispiel 2 beschrieben hergestellt.
  • Methodologie: Verschiedene verdünnte Lösungen von MPO wurden einer Suspension von 2,1·109 Staph.aureus zugegeben; das Endvolumen war 1 ml. Die Suspension wurde für 30 min sanft vermischt und danach bei 2.000 Umdrehungen/min für 10 min zentrifugiert. Der Überstand wurde entfernt und für die Quantifizierung von freier MPO aufbewahrt. Das Pellet wurde durch Resuspendierung in 5 äquivalenten NS-Volumen gewaschen. Nach gründlichem, ca. zehnminütigem Vermischen auf einem Rütteltisch, wurden die Bakterien abermals zentrifugiert. Der Überstand wurde entsorgt und das Pellet wurde mit NS zum ursprünglichen Volumen resuspendiert.
  • Spektroskopische Messungen der R-O-Differenz wurden gegenüber den in Beispiel 2 beschriebenen wie folgt modifiziert. Die relativ dichte Staph.aureus-Suspension führte ein Signal/Rauschproblem hinsichtlich der Quantifizierung von MPO basierend auf dem R-O-Differenz-Extinktionskoeffizienten von 50 mW-1 cm-1 bei 475 nm herbei. Dieses Problem wurde durch Mittelwertsbildung der R-O-Differenzabsorptionen bei 449 und 500 nm gelöst. Dieser Mittelwert wurde dann von der R-O-Differenzabsorption bei 475 nm subtrahiert. Die eingestellte R-O-Differenzabsorption bei 475 nm wurde zur Berechnung der MPO-Konzentration unter Verwendung des Extinktionskoeffizienten von 50 mM-1 cm-1 genutzt.
  • 4 zeigt das Differenzspektrum der Staph.-aureus-Suspension, in welchem Dithionit reduziert minus oxidiert (R-O) vor und nach einer MPO-Aussetzung, d.h. gebundene MPO, dargestellt ist. 5 zeigt das R-O-Spektrum der MPO, die nach zentrifugaler Entfernung der Bakterien in der Lösung bleibt, d.h. freie MPO. Ungefähr 20 pmol MPO bindeten an 2,1·109 Staph.aureus, während 1.560 pmol MPO in der 1-ml-Volumslösung blieben. An sich ist das Gebunden:Frei-Verhältnis von MPO 0,013 mit ungefähr 5.700 Molekülen MPO gebunden pro Bakterie. Serielle 2n verdünnte Lösung aus dieser MPO-Anfangskonzentration brachten Gebunden-Frei-Verhältnisse von MPO von 0,020 und 0,018 hervor, wobei n 1 bzw. 2 war. Ähnlich betrug die Anzahl der pro Bakterie gebundenen MPO-Moleküle 4.100 und 1.700, wenn n 1 bzw. 2 war.
  • Unglücklicherweise waren die Signal/Rausch-Verhältnisse bei höheren verdünnten MPO-Lösungen sehr schlecht. Somit ist die direkte spektroskopische Messung von gebundener MPO auf den relativ niedrigen Bindungsaffinitätsbereich beschränkt. Trotz dieser Sensibilitätsbeschränkung liefern diese spektroskopischen Messungen einen direkten Beweis für MPO-Bindung an Bakterien. Tatsächlich wird eine ausreichende Anzahl an Bakterien und adequater MPO kombiniert, kann die Bindung von MPO an Bakterien visuell mit nacktem Auge beobachtet werden.
  • Beispiel 6
  • Scatchard-Analyse der MPO-Bindung an Mikroben
  • Das Scatchard-Verfahren wird als graphisches Verfahren zur Analyse der Bindungsaffinität häufig verwendet (s. Rodbard, 1981, in: Ligang Assay, Langan and Clapp, Hrsg., S, 45-101, Masson Publ. New York). Die Dynamik der XPO-Bindung an eine Mikrobe: Freie XPO + Mikrobenstellen <====> Mikrobe-XPO (19)kann gemäß dem Massenwirkungsverhältnis:
    Figure 00500001
    ausgedrückt werden und deshalb:
    Figure 00500002
  • Somit ist das Verhältnis von gebundener zu freier MPO eine lineare Funktion der Anzahl der Stellen pro Mikrobe multipliziert mit der Affinitätskonstanten Kaff.
  • Materialien: P.aeruginosa, E.coli, Salmonella typhimurium und Staph.aureus wurden wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt. Streptococcus sps. und Lactobacillus sps. wurden wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt, nur wurden Todd-Hewitt- bzw. MRS-Medien zur Unterstützung des Wachstums jeder Gruppe verwendet. Candida albicans und Cryptococcus neoformans wurden auf die gleiche Weise hergestellt, nur wurde Sabourauds Dextrose-Agar-Medien verwendet. RBCs wurden wie zuvor in Beispiel 1 beschrieben hergestellt. Die Bakterien und Hefe wurden durch Haemocytometerzählung quantifiziert. MPO wurde wie in Beispiel 2 beschrieben hergestellt und quantifiziert.
  • Methodologie: Serielle 1,5n oder 2n verdünnte MPO-Lösungen wurden hergestellt und mit den Mikroben kombiniert. Die MPG-Konzentration wurde variiert und die Anzahl der Mikroben wurde konstant gehalten. Ungefähr 105 bis 106 Bakterien- oder Hefezellen wurden pro Test verwendet. Ein Volumen des Mikrobenpräparats wurde einem Volumen der verdünnten MPG-Lösung oder NS zugegeben. Die Suspension wurde vermischt und durfte für 30 Minuten bei 23°C inkubieren. Die Suspension wurde dann bei 15.000 Umdrehungen/min für 5 min auf einer Eppendorf Modell 5414 Hochgeschwindigkeitszentrifuge zentrifugiert. Der Überstand wurde dekantiert und für Tests aufbewahrt. Das Pellet wurde resuspendiert und mit einem äquivalenten Volumen an NS gewaschen. Das resuspendierte Pellet wurde rezentrifugiert und der gewaschene Überstand entsorgt. Das Pellet wurde zu 1 Volumen, d.h. dem ursprünglichen Volumen des Mikrobenpräparats, resuspendiert.
  • Die MPG-Aktivität jeder verdünnten MPG-Lösung wurde als ihre Produktlumineszenz unter Verwendung von Br- als Halid, H2O2 als Oxidationsmittel und Luminol als das chemoluminogene Substrat, wie in der parallen US-Patentanmeldung Serielle Nr. 417,276 , eigereicht am 5 Oktober 1989, beschrieben, gemessen. Ein 100 μl Aliquot jeder verdünnten MPG-Lösung wurde getestet. Jede Probe wurde einem Teströhrchen von 12×75 mm zugegeben. Die Lumineszenz wurde mit einem LB950 Luminometer (Berthold Instruments, Wildbad, Deutschland) gemessen. Zwei Injektoren wurden benutzt. Der erste injizierte 300 μl von 100 μM (45 nmol) Luminol in 50 mM Acetatpuffer (AcB), pH 5, enthaltend 5 μmol Br-. Eine 20-sekündige Messung wurde nach der Injektion von 300 μl von 16,7 mM (5 μmol) H2O2 aus dem zweiten Injektor durchgeführt.
  • Die freien und mikrobengebundenen MPG-Aktivitäten wurden unter Anwendung der gleichen Methodologie gemessen, nur wurden 100 μl Testüberstand, d.h. freie MPO, oder 100 μl MPO-Mikrobenlösung, d.h. gebundene MPO, pro Röhrchen zugegeben. Durch diese Methodologie wird die freie MPO mit einem Faktor von zwei hinsichtlich der gebundenen MPO verdünnt. Dies wurde erlaubt, um den effektiven Bereich der Messung von freier MPO zu erweitern. Die Aktivitätswerte für die Messungen von freier MPO wurden deshalb mit einem Faktor von zwei vor Verwendung in der Scatchard-Analyse multipliziert.
  • Durch die große Lumineszenzsensibilität zur Quantifizierung der XPO-Aktivität ist es ideal zur Messung von pmol- und sub-mol-Mengen von freier und mikrobengebundener MPO geeignet, wie für die Scatchard-Analyse von Bindungsaffinität notwendig. Der erste Schritt bei einer solchen Analyse ist die Erstellung einer Standardkurve, die die gemessene CL-Aktivität gegenüber einer molekularen MPO-Menge gleichsetzt.
  • 6 ist ein Diagramm der Chemolumineszenz (CL), ausgedrückt in Megaphotonen/20s, d.h. 106 Photonen/20 Sekunden, versus der pmol-Menge von getesteter MPO. Das Verhältnis von MPO zu CL ist im Bereich der MPO-Konzentration von 0 bis 10 pmol im Wesentlichen linear, wie durch das Diagramm dieses Bereichs in 6B gezeigt, in welchem die x- und y-Axen gegenüber 6A umgekehrt wurden. Die Regressionsanalyse bringt die Gleichung: CLPhotonen/20x = k·[MPOpmol]p (22)hervor, worin k die Konstante und die Hochstellung p die Reaktionsordnung in Bezug auf die MPO-Konzentration ist. Die tatsächlichen Werte für die Gleichung: CLMegaphalonen/20s = 3,35·[MPOpmol]1 , 15 (23)oder ihren Kehrwert-Ausdruck: MPOpmol = 0,702·[CLMegaphalonen/20s]0,811 (24)wurden durch Mittelwertsbildung von zehn separaten Standardbereichsbestimmungen ermittelt. Der Bestimmungskoeffizient, d.h, r2, ist 0,987. Die pmol-Werte für MPO basieren auf der Initialquantifizierung durch R-O-Differenzspektroskopie und Schätzungen basierend auf serieller verdünnter 2n Lösung. Die verdünnte Lö sung in Polystyrolröhrchen wird mit einem gewissen Verlust aufgrund der Röhrchenbindung assoziiert; dies ist bei relativ hohen verdünnten Lösungen besonders ersichtlich. An sich ist die Einschätzung der Reaktionsordnung leicht verzerrt. Der p-Wert 1,15 ist somit ein wenig größer als erste Ordnung.
  • 7A stellt die an Staph.aureus und Viridans streptococci gebundene MPO versus freier MPO unter Verwendung von 7,5·108 Staph.aureus bzw. 2,1·108 Viridans streptococci pro Test graphisch dar. Das Verhältnis von mikrobengebundener zu freier MPO ist als: Freie MPOpmo l = k·{gebundene MPOpmol]p (25)beschrieben.
  • Bei einer freien Konzentration von ungefähr 10 pmol MPO/ml ist die an 7,5·108 Staph.aureus gebundene MPO-Menge auf ungefähr 2 pmol beschränkt und die Menge an MPO, die pro 2,4·108 Viridans streptococci gebunden ist, beträgt ungefähr 1 pmol.
  • Die Nah-Sättigungs-MPO-Bindungskapazität („near-saturation MPO binding capacity") der Mikrobe kann durch Ausdrücken der Menge an MPO geschätzt werden, die in Bezug auf Moleküle pro Mikrobe gebunden ist. Zum Beispiel wird die molare Menge an gebundener MPO, d.h. 2·10-12 mol für Staph.aureus, mit Avogadros Zahl, d.h. 6·1023, multipliziert und das Produkt in Molekülen von gebundener MPO wird durch die Anzahl der Mikroben, 7,5·108, dividiert, was den Quotienten, 2.400 Moleküle MPO gebunden pro Staph.aureus, ergibt.
  • 7B stellt die gebundene versus freie MPO graphisch dar, ausgedrückt in Molekülen pro Mikrobe.
  • Die Scatchard-Diagramme dieser Daten sind in 7C präsentiert, wobei die Staph.aureus-Datenpunkte als „*" und die Daten von Viridans streptococcus mit „o” gekennzeichnet sind. Wie zuvor unter Betrachtung der Gleichungen (19) bis (21) erschlossen, gibt es ein lineares Verhältnis zwischen dem Verhältnis gebundene/freie MPO und der Konzentration von gebundener MPO. Der absolute Wert der Neigung dieser Linie ist der Wert der Affinitätskonstanten Kaff. In 7C ist die gebundene MPO als die gesamten Bindungsstellen pro Mikrobe pro Reaktionsvolumen, d.h. MPO gebunden/Mikrobe/ml, ausgedrückt. Somit nähert sich der x- Achsenabschnitt der Anzahl von MPO-Bindungsstellen pro Mikrobe an und der y-Achsenabschnitt ist das maximale extrapolierte Gebunden/Frei-Verhältnis, d.h. das Produkt von Kaff multipliziert mit der Anzahl der MPO-Bindungsstellen pro Mikrobe.
  • Zwei relativ ausgeprägte lineare Verhältnisse sind durch das Diagramm der Staph.aureus-Daten gezeigt. Im Bereich von 0 bis 1.000 MPO Molekülen gebunden pro Mikrobe ist das Verhältnis relativ linear, d.h. r2 = 0,83, und kann durch die Funktion: MPO-Staph.aureus = –0,012128·[Stellen] + 14,647 (28)beschrieben werden.
  • Deshalb beträgt Kaff 1,213·10-2, Kaff·[Mikrobenstellen] 14,647 und die gesamte Bindungskapazität 1,208 MPO Moleküle pro Mikrobe. Das Staph.aureus-Diagramm indiziert auch die Anwesenheit einer zweiten Klasse von Bindungsstellen mit relativ niedriger Affinität. Im Bereich von 1.000 bis 3.000 MPO Molekülen gebunden pro Mikrobe ist diese niedrige Affinitätsbindung durch die Funktion: MPO-Staph.aureus = –0,000491·[Stellen] + 1,433 (29)definiert, mit r2 = 0,65. Man beachte, dass Kaff, 4,907·10-Q, für diese zweite Klasse an Bindungsmitteln 25mal niedriger als jene für die Bindungsstellen mit hoher Affinität berechnete ist, aber dass die Anzahl an MPO-Bindungsstellen pro Mikrobe höher ist, ungefähr 2.900/Mikrobe.
  • Obwohl aus dem Diagramm weniger ersichtlich, indizieren die Daten von Viridans streptococcus auch die Anwesenheit von zumindest zwei unterschiedlichen Bindungsarten. Im Bereich von 0 bis 1.500 MPO Molekülen gebunden pro Mikrobe ist das Verhältnis annähernd linear, d.h. r2 = 0,66, wie durch die Gleichung: MPO-Strep.(viridans) = -0,000255·[Stellen] + 0,406 (30)definiert.
  • Man beachte, dass diese Kaff, 2,551·10-4, in Bezug auf Größenordnung niedriger als die Staph.aureus-Bindungsstellen mit "hoher Affinität" ist. Ungefähr 1.600 dieser MPO-Bindungsstellen mit niedriger Affinität sind pro Viridans streptococcus vorhan den. Wie zuvor vom Rohdiagramm der Daten abgeleitet sind die MPO-Bindungskapazitäten für die zwei Mikroben hinsichtlich der Gesamtzahl an Bindungsstellen pro Mikrobe vergleichbar. Man beachte, dass die Diagramme bei ca. 2.000 Molekülen pro Mikrobe ziemlich ähnlich sind. Die Werte für B/F, Kaff, und Stellen/Mikrobe, die durch Scatchard-Analyse errechnet wurden, sind in der folgenden Tabelle 10 angeführt. Auf ähnliche Weise wurden mehrere gramnegative und grampositive Bakterien, Pilzhefen und menschliche Erythrozyten auf MPO-Bindungskapazität getestet. Die Resultate dieser Scatchard-Analysen sind ebenfalls in Tabelle 10 präsentiert. TABELLE 10 Myeloperoxidase:Mikrobe-Bindungsstatistik, abgeleitet durch das Scatchard-Verfahren: B/F = Kaff·[Mikrobenstelle]
    Kaff Stellen/
    Zelltyp Bereich B/F (*106) Mikrobe r2
    Gramnegative Bakt.:
    P.aeruginosa 0 100 1.141 16.568 69 0,73
    8.000..18.000 49.458 2.703 8.469 0,92
    S.typhimurium 1.000...8.800 4.161 510 8.156 0,98
    E.coli 0 250 0,383 1.511 253 0,73
    10.000..23.000 2,756 83 33.305 0,68
    Grampositive Bakt.:
    Staph.aureus 400...1.200 14,646 12.124 1.208 0,83
    Milchsäurebakterien (LAB):
    Lact. (Döderlein) 400...2.500 1,805 329 5.488 0,68
    Strep. viridans 200...1.200 0,406 255 1.591 0,66
    St.pyogenes (A) 700...1.200 1,775 1.370 1.295 0,77
    St.agalactiae (B) 500...2.000 0,732 325 2.253 0,93
    St.faecalis (D) 1.000...6.000 6,373 1.053 6.055 0,95
    Hefe (Eukaryot, Fungus)
    Cand.albicans 2.400...7.000 0,657 57 11.480 0,91
    Cryp.neoformans 700..14.000 0,256 15 17.141 0,86
    Erythrozyten (Eukaryot,Mensch)
    Rote Blutkörperchen 0..30.000 <0,2 <0,1
    (menschl. RBC)
  • Der MPO-Inhalt des Überstands und Pellets wurde durch Luminometrie unter Verwendung gleichzeitig durchgeführter MPG-Standards ermittelt. Der Bereich ist als das Verhältnis von MPO Molekülen pro Zelle ausgedrückt. Ungefähr 108 bis 109 Zellen wurden pro MPG-Konzentration getestet. B/F ist das Verhältnis von gebundener zu freier MPG; d.h. B ist die Anzahl der MPO Moleküle gebunden pro Zelle und F ist die Anzahl der freien MPO Moleküle.
  • K ist die Affinitäts- oder Assoziationskonstante und Stellen/Mi krobe ist die Anzahl der MPO-Bindungsstellen pro Zelle.
  • Aus den in Tabelle 10 gezeigten Resultaten ist ersichtlich:
    • (1) MPO bindet an alle getesteten pathogenen Bakterien.
    • (2) Jene Milchsäurebakterien, die die Hauptkomponenten der normalen Flora sind, d.h. Streptococcus sp. (viridans) im Mund und Mundrachenraum, und Lactobacillus sp. (Döderlein's Bazillus) der Vagina, haben die niedrigsten Kaff-Werte der getesteten Bakterien.
    • (3) Hefe hat hinsichtlich Bakterien niedrigere Kaff-Werte, aber im Einklang mit deren größeren Größe, weist Hefe mehr Bindungsstellen pro Mikrobe auf.
    • (4) Es wurde im Wesentlichen keine Bindung von MPO an menschliche Erythrozyten festgestellt, d.h. B/F ist weniger als 0,2 mit r2 von unter 0,1.
  • An sich wird die Proximitätsanforderung zur XPO-katalysierten Mikrobenabtötung für MPO erfüllt. MPO zeigt eine hohe Affinität gegenüber gramnegativen und grampositiven pathogenen Mikroben und eine relativ geringe Affinität gegenüber H2O2-produzierenden Elementen der normalen Flora, d.h. Viridans streptococci und Döderlein's Lactobazillus. In einer Umgebung, die Pathogene und normale Flora enthält, schränkt eine Begrenzung der MPO-Verfügbarkeit die MPO-Bindung an Pathogene effektiv ein. Somit kann die mikrobizide Wirkung selektiv auf die anwesenden pathogenen Mikroben begrenzt sein und die Lebensfähigkeit der normalen Flora bewahrt werden. In Anwesenheit von konkurrierenden Pathogenen würde MPO mit der LAB-Flora durch selektive Bindung an und Abtötung von pathogenen Mikroben synergetisch agieren.
  • Bezugsbeispiel I
  • Scatchard-Analyse von Chloroperoxidase-Bindung an Mikroben Materialien: Die Bakterien, Hefen und Erythrozyten wurden wie in Beispiel 6 beschrieben hergestellt. Pilzchloroperoxidase (CPO) wurde von Sigma Chemical Company erworben. Chloroperoxidase wurde anfangs durch Reduziert-Minus-Oxidert-(R-O)-Differenzspektroskopie unter Verwendung von Dithionit als Reduktionsmittel quantifiziert. Das Absorptions(A400/280)-Verhältnis von 400 nm bis 280 nm für CPO betrug 0,8. Ein R-O-Differenzextinktionskoeffizient von 56 mM-1 cm-1 bei 450 nm wurde zur CPO-Quantifizierung verwendet. Luminolabhängige Lumineszenzassays von CPO-Oxygenierungsaktivität wurden auch bei jedem Mikrobenbindungsassay vollzogen.
  • Methodologie: Das Protokoll war das gleiche wie das für Beispiel 6 beschriebene, nur wurde CPO als XPO verwendet.
  • Standardmessungen von CPO versus CL wurden bei jeder Bindungsstudie getätigt und diese Daten wurden zur Konvertierung der Chemolumineszenzdaten in Moleküle CPO verwendet. Die Methodologie war wie die für die MPO-Standardisierungsmessungen in 6 beschriebene.
  • 8A zeigt die Moleküle von CPO gebunden pro Staph.aureus und Streptococcus sp. (viridans), aufgetragen gegen die ungebundenen Moleküle von CPO pro Mikrobe pro Reaktionsvolumen. Im Gegensatz zu den MPO-Bindungsdaten von Figur zB bindet Streptococcus sp. (viridans) CPO stärker als Staph.aureus. Allerdings bindet keine Mikrobe CPO so effektiv wie MPO.
  • Das Scatchard-Diagramm dieser Daten ist in 8B gezeigt. Für einen ähnlichen Bindungsbereich ist die Größenordnung der Ordinate, d.h. B/F = Kaff·[Stellen/Mikrobe], hundertfach niedriger als jene, die für das MPO-Scatchard-Diagramm von 7C beschriebene. Die CPO-Bindungskapazität von Streptococcus sp. (viridans) ist relativ größer als jene von Staph.aureus, allerdings sind die CPO-Bindungskapazitäten beider Mikroben in Bezug auf die MPO-Bindungskapazität relativ gering.
  • Auf eine gegenüber jeder für MPO beschriebenen analogen Weise wurde der gleiche Bereich von Bakterien, Hefe sowie Erythrozyten auf CPO-Bindungskapazität mit dem Scatchard-Verfahren analysiert. Die tabellarisierten Resultate sind in Tabelle 11 gezeigt: TABELLE 11 Chloroperoxidase:Mikrobe-Bindungsstatistik, abgeleitet durch das Scatchard-Verfahren: B/F = Raff·[Mikrobenstellen]
    Kaff Stellen/
    Zelltyp Bereich B/F (*106) Mikrobe r2
    Gramnegative Bakt.:
    P.aeruginosa 20 500 0,030 34 882 0,52
    S.typhimurium 0 200 0,130 683 191 0,65
    E.coli 0 150 0,310 381 162 0,72
    Grampositive Bakt.:
    Staph.aureus 0 175 0,087 501 173 0,72
    Milchsäurebakterien (LAB):
    Lact. (Döderlein) 40 350 0,146 428 340 0,64
    Strep. viridans 200 700 0,163 182 898 0,78
    St.pyogenes (A) 300...1.500 0,321 344 932 0,70
    St.agalactiae (B) 120 600 0,085 139 614 0,68
    St.faecalis (D) 150...1.500 0,051 19 2.610 0,52
    Hefe (Eukaryot, Fungus)
    Cand.albicans 1.600...7.000 0,178 29 6.133 0,64
    Cryp.neoformans 400...6.500 0,039 4 9.010 0,10
    Erythrozyten (Eukaryot,Mensch)
    Rote Blutkörperchen 0..60.000 <0,2 <0,1
    (menschl. RBC)
  • Der CPO-Inhalt des Überstands und Pellets wurde durch Luminometrie unter Verwendung von gleichzeitig durchgeführten CPO-Standards ermittelt. Die Bedingungen waren wie in der Legende von Tabelle 10 beschrieben.
  • Beispiel 7
  • Scatchard-Analyse der Bindung von eosinophiler Peroxidase und Lactoperoxidase an Mikroben
  • Materialien: Die Bakterien, Hefen und Erythrozyten wurden wie in Beispiel 6 beschrieben hergestellt. Eosinophile Peroxida se (EPO) wurde extrahiert und von porzinen Leukozyten wie in Beispiel 2 beschrieben gereinigt. Lactoperoxidase (LPO) wurde von Sigma Chemical Co. erworben. EPO und LPO wurden durch Reduziert-Minus-Oxidert-(R-O)-Differenzspektroskopie unter Verwendung von Dithionit als Reduktionsmittel quantifiziert. Das Absorptions (A412/280)-Verhältnis von 412 nm bis 280 nm für EPO betrug 0,7 und das Absorptions (A412/280)-Verhältnis von 412 nm bis 280 nm für LPO war 0,7. Ein R-O-Differenzextinktionskoeffizient von 56 mM-1 cm-1 bei 450 nm wurde zur EPO-Quantifizierung und ein R-O-Differenzextinktionskoeffizient von 56 mM-1 cm-1 bei 438 nm wurde zur LPO-Quantifizierung verwendet. Luminolabhängige Lumineszenzassays von EPO- und LPO-Oxygenierungsaktivitäten wurden auch bei jedem Mikrobenbindungsassay vollzogen.
  • Methodologie: Das Protokoll war das gleiche wie das für Beispiel 6 beschriebene, nur wurden EPO und LPO als die XPOx verwendet.
  • Die Durchsicht der MPO- und EPO-Bindungsdaten unterstreicht die Unterschiede, die Haloperoxidasen hinsichtlich ihren Mikrobenbindungskapazitäten kennzeichnen können. Zur Folgerichtigkeit der Vergleiche der Bindungsdaten untereinander zeigt 9A die Moleküle von EPO gebunden pro Staphylococcus aureus und Streptococcus sp. (viridans), gegen die ungebundenen Moleküle von EPO pro Mikrobe pro Reaktionsvolumen gezeichnet. Die EPO-Bindung an Streptococcus sp. (viridans) und Staph.aureus ist im unteren Bereich der EPO-Konzentration ähnlich, aber es scheint, als würden weniger Bindungsstellen pro Staph.aureus vorhanden sein. Man beachte, dass innerhalb des getesteten Konzentrationsbereiches EPO effektiver an jede Mikrobe, die zuvor bei MPO beobachtet wurde, gebunden ist.
  • Das Scatchard-Diagramm dieser Daten ist in 98 dargestellt. Für einen ähnlichen Bindungsbereich ist die Größenordnung der Ordinate, d.h. B/F = Kaff·[Stellen/Mikrobe] die gleiche wie jene, die für das MPO-Scatchard-Diagramm von 7C beschrieben wurde. Die EPO-Bindungskapazität für Streptococcus sp. (viridans) ist relativ größer als die MPO-Bindungskapazität. Allerdings ist die Bindungskapazität für Staph.aureus ähnlich MPO. Insgesamt ähnelt die EPO-Bindungskapazität MPO mehr als CPO.
  • Wie zuvor für MPO und CPO beschrieben, wurde der gleiche Bereich an Bakterien, Hefe und Erythrozyten auf EPO-Bindungskapazität durch das Scatchard-Verfahren analysiert. Die tabellarisierten Resultate sind in Tabelle 12 präsentiert. TABELLE 12 Eosinophile-Peroxidase:Mikrobe-Bindungsstatistik, abgeleitet durch das Scatchard-Verfahren: B/F = Kaff·[Mikrobenstellen]
    Kaff Stellen/
    Zelltyp Bereich B/F (*106) Mikrobe r2
    Gramnegative Bakt.:
    P.aeruginosa 50...300 0,964 2.771 348 0,72
    8.500..10.000 9,151 830 11.030 0,59
    S.typhimurium 1.000..17.000 11,982 651 18.394 0,94
    E.coli 0...160 3,444 22.280 155 0,72
    100...300 0,735 2.108 349 0,65
    Grampositive Bakt.:
    Staph.aureus 130...4.000 13,910 3.829 3.633 0,92
    Milchsäurebakterien (LAB):
    Lact. (Döderlein) 0 50 1,368 92.089 15 0,69
    Strep. viridans 1.000...7.500 12,349 1.641 7.526 0,84
    St.pyogenes (A) 200...2.000 32,750 12.713 2.576 0,82
    St.agalactiae (B) 3.000...6.000 8,658 1.417 6.109 0,93
    St.faecalis (D) 0 34 0,329 13.986 24 0,59
    Hefe (Eukaryot, Fungus)
    Cand.albicans 5.000..13.000 7,066 512 13.806 0,83
    Cryp.neoformans 20.000..60.000 19,123 329 58.059 0,95
    Erythrozyten (Eukaryot,Mensch)
    Rote Blutkörperchen 0..60.000 <0,2 <0,1
    (menschl. RBC)
  • Der EPO-Inhalt des Überstands und Pellets wurde durch Luminometrie unter Verwendung von gleichzeitig durchgeführten EPO-Standards ermittelt. Die Bedingungen waren wie in der Legende von Tabelle 10 beschrieben.
  • Ein Vergleich der Daten aus Tabelle 10 und 12 zeigt, dass sich die EPO-Bindungskapazitäten von den MPO-Bindungskapazitäten hinsichtlich individueller Mikroben, z.B. Streptococcus sp. (viridans) unterscheiden, aber dass beide Haloperoxidasen in Bezug auf Größenordnung ähnliche Bindungskapazitäten hinsichtlich der im Allgemeinen getesteten Bakterien besitzen. Die in Bezug auf Größenordnung größere Bindungskapazität von EPO gegenüber den getesteten Pilzen, d.h. Candida albicans und Cryptococcus neoformans, ist von potentieller Signifikanz.
  • 10A präsentiert die Moleküle von LPO gebunden pro Staph.aureus und Streptococcus sp. (viridans), gegen die ungebundenen Moleküle von LPO pro Mikrobe pro Reaktionsvolumen gezeichnet. Die Bindungskapazitäten von LPO gegenüber Streptococcus sp. (viridans) und Staph.aureus sind geringer als die für EPO und MPO beobachteten, sind aber viel höher als die für CPO beobachteten.
  • Das Scatchard-Diagramm dieser Daten ist in 10B dargestellt. Die EPO-Bindungskapazitäten gegenüber Viridans streptococcus und Staph.aureus sind ähnlich und im Vergleich mit MPO und EPO relativ gering. Eine Untersuchung der LPO-Mikrobenbindungskapazitäten wurde unter Verwendung des gleichen Bereichs von Bakterien, Hefe und Erythrozyten durchgeführt, der zuvor für die Analyse der Haloperoxidasebindung angewandt wurde. Die tabellarisierten Resultate sind in Tabelle 13 präsentiert. TABELLE 13 Lactoperoxidase:Mikrobe-Bindungsstatistik, abgeleitet durch das Scatchard-Verfahren: B/F = Kaff·[Mikrobenstellen]
    Kaff Stellen/
    Zelltyp Bereich B/F (*106) Mikrobe r2
    Gramnegative Bakt.:
    P.aeruginosa 1.100...2.300 0,748 309 2.423 0,82
    S.typhimurium 900...4.000 0,610 176 3.462 0,92
    E.coli 2.000...5.100 1,053 201 5.232 0,75
    Grampositive Bakt.:
    Staph.aureus 800...2.300 0,392 162 2.417 0,82
    Milchsäurebakterien (LAB):
    Lact. (Döderlein) 600...3.000 0,415 110 3.784 0,79
    St. viridans 1.500...3.200 0,599 155 3.877 0,26
    St.pyogenes (A) 4.000..24.000 0,511 22 22.793 0,84
    St.agalactiae (B) 1.000...8.000 0,173 104 6.884 0,69
    St.faecalis (D) 1.250...6.000 0,219 25 8.762 0,63
    Hefe (Eukaryot, Fungus)
    Cand.albicans 7.000..16.000 1,213 76 16.002 0,79
    Cryp.neoformans 110.000..300.500 0,684 2 302.664 0,86
    Erythrozyten (Eukaryot,Mensch)
    Rote Blutkörperchen 0..500.000 <0,2 <0,1
    (menschl. RBC)
  • Der LPO-Inhalt des Überstands und Pellets wurde durch Luminometrie unter Verwendung von gleichzeitig durchgeführten LPO-Standards ermittelt. Die Bedingungen waren wie in der Legende von Tabelle 10 beschrieben.
  • Ein Vergleich der Daten aus den Tabellen 10, 11, 12 und 13 untereinander zeigt, dass die Bindungskapazitäten von LPO im Allgemeinen geringer sind als jene von MPO und EPO, aber größer als jene von CPO. Wie zuvor für MPO und EPO angemerkt, tendiert LPO dazu, eine relativ größere Bindungskapazität gegenüber gramnegativen Bakterien und Hefen zu zeigen.
  • Beispiel 8
  • Synergetische Wirkung Milchsäurebakterien:Haloperoxidase
  • Die normale Flora eines Menschen umfasst mehrere Mitglieder der Milchsäurebakterienfamilie. Gleichfalls werden einige andere Mitglieder dieser Familie in der Gärungsindustrie, z.B. Käseproduktion, eingesetzt. Diese grampositiven Bakterien sind durch die Unfähigkeit, Protoporphin zu synthetisieren, gekennzeichnet. Als Folge ihres Mangels an respiratorischen Cytochromen, wird der Redoxmetabolismus durch Flavoenzyme katalysiert, was Milchsäure und in vielen Fällen H2O2 als metabolische Produkte hervorbringt.
  • Viele dieser Milchsäurebakterien (LAB) sind beim Menschen und verwandten Tieren verpflichtend indigen. Mitglieder der Viridans-Gruppe von streptococci, d.h. Streptococcus mitis, salivarious, etc., sind im Mund, Mundrachenraum und zu einem geringeren Ausmaß in Nasen-Rachenraum-Teilen in den oberen Atemwegen indigen. Die Viridans streptococci werden auch häufig in der Vagina und in Fäkalien gefunden. Die Lactobazillen-Mitglieder der LAB werden auch oft im Mund gefunden. Andere Mitglieder dieser Gruppe, d.h. Tissiers Bazillus (Lactobacillus bifidus) und Döderleins Lactobazillus, sind in den Fäkalien von gestillten Kindern und in der Vagina während der reproduktiven Jahre indigen.
  • „Wo auch immer in der Natur zwei oder mehrere Spezies von Mikroorganismen (oder eigentlich Makroorganismen) in intimer Verbindung wachsen, wird jede mit den anderen interagieren; und wenn die Mikroorganismen auf einer Wirtszelle wachsen, dann wird der Wirt auf irgendeine Weise durch die Interaktion beeinflusst; 'schiere Toleranz ist biologlisch und statistisch unwahrscheinlich' (Lucas, 1949)" (Rosebury, 1962, Microorganisms Indigenous to Man, McGraw-Rill, New York). Es ist nicht überraschend, dass-Mitglieder der LAB dazu dienen, den Wirt durch Konkurrenz mit pathogenen Mikroben zu schützen. „Die Interaktion der indigenen Mikroflora des Menschen und der exogen erlangten Pathogene war Gegenstand einer sporadischen Untersuchung und andauernden Spekulation für mehr als 5 Jahrzehnte. Allerdings wurde erst kürzlich schlüssig gezeigt, dass antagonistische Interaktionen die Fähigkeit des Menschen, Infektionen abzuwehren, verbessern kann" (Sanders, 1969, J.Infect.Dis. 129: 698-707). Die Stichhaltigkeit dieser Haltung wird durch das Phänomen der Superinfektion nach Verabreichung von Antibiotika veranschaulicht (Weinstein, 1947, Amer.J.Med.Sci. 214: 56-63; McCurdy and Neter, 1952, Pediatrics 9: 572-576).
  • Über die In-Vitro-Fähigkeit von Pneumococcus und Viridans streptococcus, Meningococcus und andere gramnegative Bakterien abzutöten, wurde das erste Mal 1915 von Colebrook berichtet (Lancet, 20. November 1915, 1136-1138). Seine Technik war es, einen Tropfen Streptococci(pneumokokkal)-Kultur zu platzieren und ihn über eine Agarplatte rinnen zu lassen; nachdem die Spur dieses Stroms getrocknet war, wiederholte er den Prozess, indem er einen Tropfen gramnegative Kultur in einer zur originalen Streptococci-Richtung perpendikularen Richtung laufen ließ. Er beobachtete Inhibition der gramnegativen Kultur, wo sich die beiden Ströme kreuzten. Weiters bemerkte er, dass das Ausmaß der Abtötung proportional zum Zeitintervall war, der das Plattieren der beiden Kulturen separierte. „Indem das Wachstum von Pneumococcus gut anlaufen durfte bevor der Meningococcus-Strom gepflanzt wurde, wurde das Wachstum des Letzeren vollständig geprüft, nicht nur dort, wo sich die beiden Ströme trafen, sondern auch in einer Distanz von fast einem Zentimeter auf jeder Seite dieses Punktes." Colebrook fand auch heraus, dass die stark ansteigende Konzentration der gramnegativen bakteriellen Suspension in einem heftigen Wachstum der Mikrobe resultierte. „Klar, dann hatten die Pneumococci das Medium nicht von etwas beraubt, das für das Wachstum von Meningococcus essentiell war, noch machten sie das Medium an sich in irgendeiner Art und Weise für diesen Organismus ungeeignet" (Colebrook, 1915). Die Generierung von Säure und H2O2 durch Viridans streptococcus wurde von M'Leod und Gordon 1922 demonstriert (Biochem.J. 16: 499). Es ist wahrscheinlich, dass der für die Streptococcus-Inhibition von Meningococcus notwendige Zeitintervall mit der Akkumulation von durch Streptococcus generiertem H2O2 in Verbindung steht.
  • Die In-Vivo-Wichtigkeit von Streptococci bei der Unterdrückung des Wachstums von potentiellen Pathogenen wird auch durch das Phänomen der Superinfektion nach Therapie mit Antibiotika impliziert. „Mitglieder der Viridans-Gruppe von Streptococci, die vorwiegenden Stränge der Flora des Mundrachenraums bei den meisten Individuen, können das Wachstum von enterischen gramnegativen Bazillen inhibieren, Organismen, die üblicherweise an dieser Stelle nach Therapie mit massiven Dosen Penicillin überwachsen. Es wurde vorgeschlagen, dass die Unterdrückung (oder Eliminierung) dieser Streptococci durch massive Dosen Antibiotika ihre inhibierende Wirkung unterdrückt (oder eliminiert) und die Multiplizierung der zuvor inhibierten (oder neu eingebrachten) Bazillen erlaubt" (Sprunt et al., 1971, J.Infect.Dis. 123: 1-10).
  • Wie durch die Daten in Tabelle 10 demonstriert, ist XPO-Bindung mikrobenspezifisch. Weiters ist die Bindungsaffinität gegenüber Mitgliedern der normalen Flora der Milchsäurebakterienfamilie relativ schlecht. Die Selektivität der Bindung, kombiniert mit den Lebensdauerbeschränkungen der 1O2-Reaktivität, liefert H2O2-produzierende LAB mit einem Mechanismus zum Überleben in Anwesenheit von niedrigen MPG-Konzentrationen. Darüber hinaus begünstigen solche Bedingungen tatsächlich die Vormachtstellung von indigenen LAB in antagonistischen mikrobiellen Konkurrenzen. Die Einbringung von MPO in eine gemischte bakterielle Umgebung, z.B. Staph.aureus und Streptococcus sp. (viridans) resultiert in einer selektiven Bindung von MPO an Staph.aureus. Folglich dient H2O2, das metabolische Produkt von Streptococcus sp. (viridans) als Substrat für die Staph.aureus-gebundene MPG, was mikrobielle Reaktionsmittel, z.B. HOCl und insbesondere 1O2, mit einer starken Reaktivität, aber beschränkten reaktiven Lebensdauer hervorbringt. Wie in Beispiel 6 beschrieben, sollte eine solche MPG-katalysierte mikrobizide Wirkung relativ selektiv gegenüber Staph.aureus sein.
  • Der synergetische Effekt von Viridans streptococci auf die MPG-abhängige Abtötung von Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa und Candida albicans in Abwesenheit und Anwesenheit von Erythrozyten ist im Folgenden gezeigt.
  • Materialien: Die Bakterien, Hefe und RBCs wurden wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt und quantifiziert. MPO wurde wie in Beispiel 2 beschrieben hergestellt und quantifiziert.
  • Methoden: 100 μl Targetmikrobensuspension (ungefähr 106 Mikroben), 100 μl Streptococcus sp.(viridans)-Suspension (ungefähr 5·107 Streptococci), 100 μl MPO (Konzentration variierte), 100 μl Glucose (1 mg), 500 μl NS und, wo angegeben, entweder 100 μl Erythrozytensuspension (10 RBCs) oder NS wurden jedem Röhrchen für ein Endvolumen von 1 ml zugegeben. Die Inhalte wurden sanft vermischt und die Röhrchen wurden für 30 min bei 23°C inkubiert. Mikrobielle Abtötung wurde durch verdünnte Agarplattenlösungen, wie zuvor in Beispiel 1 beschrieben, gemessen, nur dass die Kolonien 2-3 Tage zur vollen Entwicklung der kleineren Streptococci-Kolonien wachsen durften.
  • (1) Abtötung von Staph.aureus in Abwesenheit von Erythrozyten.
  • Die Daten in Tabelle 14 demonstrieren den Effekt von MPO auf die Streptococci-abhängige Abtötung von Staph.aureus. TABELLE 14 Myeloperoxidase-abhängige mikrobizide Wirkung von Viridans streptococci in Abwesenheit und Anwesenheit von Erythrozyten
    Keine RBC RBC (107) Hämoglobin:
    Organismus MPO, pmol CFU: CFU: Pellet Überst.
    P. aeruginosa Keine 3,500,000 3,400.000 1,0 0,0
    100,0 0 0 1,0 0,1
    33,3 0 10.000 0,9 0,0
    11,1 0 7.200 0,9 0,0
    3,7 0 6.200 1,0 0,0
    1,2 0 520.000 1,0 0,1
    0,4 10.000 4,500.000 1,0 0,0
    0,13 2,200.000 3,900.000 0,7 0,0
    E.coli Keine 2,000.000 2,600.000 1,0 0,0
    100,0 0 0 1,0 0,0
    33,3 0 0 1,0 0,0
    11,1 0 10.000 1,0 0,0
    3,7 10.000 930.000 1,1 0,0
    1,2 650.000 2,600.000 1,0 0,0
    0,4 1,900.000 2,500.000 1,0 0,0
    Staph.aureus Keine 1,600.000 1,800.000 1,0 0,0
    100,0 0 8.000 0,9 0,0
    33,3 0 740.000 1,0 0,0
    11,1 820.000 930.000 1,0 0,0
    3,7 430.000 1,900.000 1,0 0,0
    1,2 1,600.000 1,700.000 1,0 0,1
    0,4 1,700.000 1,900.000 1,0 0,0
    Cand.albicans Keine 200.000 240.000 1,0 0,0
    100,0 0 4.000 0,8 0,0
    33,3 0 250.000 0,9 0,0
    11,1 0 180.000 1,0 0,0
    3,7 0 240.000 1,0 0,0
    1,2 6.000 250.000 1,0 0,0
    0,4 160.000 210.000 1,0 0,0
    0,13 110.000 260.000 1,0 0,0
  • Streptococci inhibieren Staph.aureus in Abwesenheit von MPO nicht. Die Zugabe von 3,7 pmol MPO während des 30-minütigen Intervalls senkte die Staph.aureus-Zählung um 73 % ohne jeglichen Effekt auf die Streptococci und die Zugabe von 33 pmol MPO produzierte eine vollständige Abtötung von Staph.aureus ohne Abtötung von Streptococci. Die Zugabe von 100 pmol MPO produzierte eine vollständige Abtötung von Staph.aureus und senkte die Streptococci-Zählung um mehr als eine Größenordnung.
  • Die Daten aus Tabelle 10 indizieren, dass die MPO-Bindungskapazität von Staph.aureus mehr als das Dreißigfache jener von Streptococci ist. Die Daten aus Tabelle 14 zeigen, dass mehr als 50 % der 106 Staph.aureus bei 2·1012 Molekülen von MPO getötet werden und dass 2·1013 Moleküle MPO eine 100%ige Abtötung von 106 Staph.aureus bewirken, wobei Viridans streptococcus relativ verschont bleiben. Dieser Bereich von MPO gleicht einer Gesamtheit von ungefähr 106 bis 10 Molekülen MPO/Staph.aureus und 109 bis 105 Molekülen MPO/Streptococcus. Basierend auf der hohen MPO-Bindungskapazität, d.h. B/F = 14,6, von Staph.aureus, wird ein sehr großer Teil der verfügbaren MPO an Staph.aureus gebunden. Weiters gewährleistet die niedrige Bindungskapazität, d.h. B/R = 0,4, von Streptococcus sp. (viridans), dass nur ein kleiner Teil der vorhandenen MPO an die Streptococci bindet. Bei 100 pmol MPO ist eine Konzentration in Bezug auf Größenordnung höher als jene, die für die Staph.aureus-Abtötung notwendig ist, Streptococci-Abtötung war unvollständig.
  • MPO-Konzentrationen, die eine vollständige Abtötung von Staph.aureus bewirken, fügen Streptococci sp. (viridans) minimalen Schaden zu. An sich begünstigt eine Einbringung von MPO die Vormachtstellung von Streptococci sp. (viridans) gegenüber Staph.aureus und anderen MPO-bindenden Mikroben mit hoher Kapazität in antagonistschen mikrobiellen Konkurrenzen.
  • (2) Abtötung von Staph.aureus in Anwesenheit von Erythrozyten.
  • Die Tabelle 14 dokumentiert weiters den Efekt von 107 RBCs auf Streptococcus sps.(viridans)-abhängige Abtötung von Staph.aureus in Anwesenheit der verschiedenen getesteten MPO-Konzentrationen. Keine Abtötung wurde bei 3,7 pmol MPO beobachtet, allerdings senkten 33,3 pmol MPO die Staph.aureus-Zählung um mehr als 50 %. Die Einschließung von 100 pmol MPO senkte die Staph.aureus-Zählung um 95 %, d.h. auf 8·104 CFU. Diese MPG-Konzentration senkte Streptococci ebenfalls, aber eliminierte diese nicht.
  • Bystander- oder Kollateralschaden der RBCs wurden durch Messen des Ausmaßes der Haemolyse, d.h. des Überstand/Pellet-Hämoglobin-Verhältnisses, und der Hämoglobinzerstörung, d.h. End-/Anfangs-Hämoglobin-Verhältnis, bewertet. Die Einschließung von 10 RBCs in das Reaktionssystem produzierte eine kleine, ungefähr dreifache Inhibition der Staph.aureus-Abtötung. Die zugegebenen RBCs inhibieren auch die Streptococci-sp.(viridans)-Abtötung, die mit relativ hohen MPO-Konzentrationen assoziiert wird. Erythrozyten enthalten Katalase und die Inhibition der Abtötung sowohl von Staph.aureus, als auch Streptococci sp. (viridans) resultiert am Wahrscheinlichsten aus der konkurrierenden Konsumierung von H2O2 durch RBC-Katalase. Wie in Tabelle 10 präsentiert, weisen Erythrozyten im Wesentlichen KEINE Bindungskapazität für MPO auf. Dies stimmt mit der beobachteten Abwesenheit von Haemolyse in Kombination mit der starken Staph.aureus-Abtötung überein. Die mikrobizide Wirkung des Streptococcal-MPO-Systems bewirkt keinen Bystander-RBC-Schaden und an sich dienen RBCs nicht als konkurrierende Substrate. Diese Beobachtungen stehen gänzlich im Gegensatz zu den in Beispiel 1 präsentierten, worin Haemolyse bei H2O2- und HOCl-Konzentrationen weit unter jenen beobachtet wurde, die für mikrobizide Wirkung notwendig sind.
  • Erythrozyteninhibition des Streptococcal-MPO-Systems ist gegenüber jener sehr gering, die für die direkte (MPO-unabhängige) H2O2- und HOCl-Abtötung beobachtet wurde. Die Daten aus Tabelle 4 und 5 indizieren, dass die äquivalente Menge an RBCs eine ungefähr tausendfache Inhibition sowohl bei der H2O2-abhängigen, als auch bei der HOCl-abhängigen Abtötung von Staph.aureus verursachte.
  • Die selektive Staph.aureus-Abtötung in Anwesenheit von RBC ohne Haemolyse unterstützt die Auffassung der reaktiven Proximität hinsichtlich der selektiven antiseptischen Wirkung von MPO stark: d.h. die selektive Bindung von MPO an die Targetmikrobe maximiert den Targetschaden und minimiert den Schaden der H2O2-generierenden normalen Flora und Wirtszellen. Die selektive mikrobizide Wirkung von MPO liefert die Basis für einen physiologisch ausgereiften Zugang zur Antisepsis. Wie zuvor von Dakin, Fleming und anderen beschrieben, sind Wirtszellen gegenüber der schädlichen Wirkung von chemischen Antiseptika empfindlicher als Mikroben. Die vorliegende Erfindung ist ein relativ mikrobenselektives antiseptisches Haloperoxidasesystem, das (1) fähig ist, ein breites Spektrum an Pathogenen wirksam abzutöten, (2) die normale Flora verschont und dieser gegenüber sogar selektiv ist, und (3) für Wirtszellen nicht toxisch ist und die Immunantwort des Wirts nicht beeinträchtigt.
  • (3) Abtötung von E.coli in Abwesenheit von Erythrozyten. Die
  • Daten aus Tabelle 14 zeigen weiters den Effekt von MPO auf die streptococci-abhängige Abtötung von E.coli. Für jede Reaktion wurden ungefähr 2·106 E.coli und 5·107 Streptococci sp. (viridans) für 30 min bei 23°C mit der angegebenen Menge an MPO inkubiert. Streptococci töten E.coli in Abwesenheit von MPO nicht ab. Vielmehr inhibierte E.coli das Wachstum von Streptococci in Abwesenheit von MPO vollständig. Die Zugabe von 3,7 pmol MPO bewirkt eine mehr als 99%ige Abtötung von E.coli. Diese MPG-Konzentration bewirkte auch die Entstehung von Streptococci-Kolonien im Verhältnis zum Verschwinden von E.coli-Kolonien. 11,1 pmol MPO produzierten eine vollständige E.coli-Abtötung, wobei Streptococci relativ verschont blieben, allerdings bei 100 pmol MPO war die Streptococcal-Zählung um mehr als zwei Größenordnungen gesenkt.
  • E.coli hat eine geringe Anzahl an MPG-Bindungsstellen mit hoher Affinität und eine große Anzahl an MPG-Bindungsstellen mit relativ niedriger Affinität, wie in Tabelle 10 beschrieben. Die gesamten MPG-Bindungskapazitäten von E.coli sind größer als jene von Streptococci, aber niedriger als jene, die zuvor für Staph.aureus beschrieben wurden. Die Streptococcal-MPO-Kombination übt jedoch eine höhere Abtötungskapazität gegenüber E.coli als gegenüber Staph.aureus aus. Eine mehr als 99%ige Abtötung der 2·106 E.coli wurde mit 2·1012 Molekülen von MPG, d.h. ungefähr 106 Molekülen MPO/E.coli, bewirkt. Die gesteigerte relative Abtötungskapazität kann eine größere E.coli-Empfindlichkeit gegenüber MPG-generierten Reaktionsmitteln, wie HOCl und 1O2, Wiederspiegeln.
  • Die geringere MPG-Bindungskapazität von E.coli wandelt sich in eine größere anwesende MPO um, die für Streptococci-Bindung verfügbar ist. Folglich ist der Effekt von 100 pmol MPO auf die Streptococci-Abtötung in Anwesenheit von E.coli größer als die Streptococcus-Abtötung in Anwesenheit von Staph.aureus.
  • (4) Abtötung von E.coli in Anwesenheit von Erythrozyten. Der
  • Effekt von 10 RBCs auf viridans-streptococci-abhängige Abtötung von E.coli in Anwesenheit von MPO ist auch in Tabelle 14 gezeigt. Die Einschließung von 3,7 pmol MPO bewirkte eine 50%ige Senkung der E.coli-Kolonien und Entstehung von Streptococci-Kolonien. Bei 11,1 pmol MPO war die E.coli-Zählung um mehr als 99%, d.h. auf 1·104 CFU, reduziert, ohne jeglichen schädlichen Effekt auf Streptococci. Die vollständige Abtötung von E.coli und ein kleiner Abfall von Streptococci wurden mit 100 pmol MPO bewirkt.
  • Wie zuvor bei Staph.aureus beobachtet, produziert die Einschließung von 107 RBCs im Reaktionssystem eine geringe, dreifache Inhibition der E.coli-Abtötung. Die zugegebenen RBCs inhibierten auch die Streptococci-Abtötung, die mit relativ hohen MPO-Konzentrationen assoziiert wird. Wie in Tabelle 14 beschrieben, produzierten die Mengen an MPO, die eine vollständige E.coli-Abtötung bewirken, KEINE Haemolyse. Wie zuvor bei der Staph.aureus-Abtötung in Anwesenheit von RBCs beobachtet, produziert die Einbringung einer kleinen Menge an MPO zur gemischten mikrobiellen Suspension eine selektive und vollständige Zerstörung von E.coli, begünstigt die Dominanz von nicht pathogenen Streptococci selektiv und schädigt Bystander-Erythrozyten nicht.
  • (5) Abtötung von P.aeruginosa in Abwesenheit und Anwesenheit von Erythrozyten.
  • Von allen getesteten Mikroben ist P.aeruginosa gegenüber der mikrobiziden Wirkung von MPO am empfindlichsten. Die Daten in Tabelle 14 indizieren eine mehr als 99%ige Abtötung unter Verwendung von 0,4 pmol MPO in Abwesenheit von RBCs und eine 85%ige Abtötung unter Verwendung von 1,2 pmol MPO in Anwesenheit von RBCs. Haemolytischer Schaden wurde bei keiner der getesteten MPO-Konzentrationen beobachtet.
  • Die Resultate dieser Abtötungsstudie stimmen mit den Bindungsdaten von Tabelle 10 überein. P.aeruginosa hat einen kleine Anzahl an MPO-Bindungsstellen mit extrem hoher Affinität und eine große Anzahl an Bindungsstellen mit hoher Affinität. Die gesamte MPO-Bindungskapazität von P.aeruginosa ist größer als jene der anderen getesteten Mikroben.
  • (6) Abtötung von Candida albicans in Abwesenheit und Anwesenheit von Erythrozyten.
  • Candida albicans ist gegenüber MPO-abhängiger mikrobizider Wirkung empfindlich. Wie in Tabelle 14 gezeigt, produzieren 1,2 pmol MPO eine 97%ige Abtötung in Abwesenheit von RBCs. Die Abtötung ist jedoch durch die Anwesenheit von RBCs stark gefährdet. 100 pmol MPO werden für ungefähr die gleiche Abtötungsaktivität in Anwesenheit von RBCs ohne Beweis für Haemolyse benötigt.
  • Die Resultate der MPO-abhängigen Abtötung von Candida albicans stimmen mit den Resultaten der MPO-Candida-albicans-Bindung, wie in Tabelle 10 präsentiert, überein. Candida albicans, eine eukaryotische Hefe, ist im Vergleich zu den getesteten Bakterien relativ groß. Jede Hefe enthält ungefähr 104 MPO-Bindungsstellen, aber diese Stellen sind von relativ niedriger Affinität. Die gesamte MPO-Bindungskapazität für Candida albicans ist höher als für Streptococcus sp. (viridans) und für RBCs. MPO plus Viridans streptococci töten Candida effektiv ab. Erythrozyteninhibition von Candida-Abtötung spiegelt wahrscheinlich die Zerstörung von Viridans-Streptococcal-H2O2 durch RBC-Katalase in Kombination mit relativ schlechter MPO-Bindungsaffinität wieder.
  • Candida albicans liegt im grauen Bereich zwischen normaler Flora und Pathogen. Sie ist typischerweise anwesend und macht einen kleinen Prozentsatz der normalen Flora aus. Candida wird zu einem Problem im immuno-gefährdeten Wirt insbesondere in Verbindung mit der Verwendung von prokaryotspezifischen Antibiotika, die in Wirklichkeit bezüglich Candida-Überwachsung und Superinfektion ausselektieren. Die Daten aus Tabelle 14 demonstrieren die synergetische Wirkung von Viridans streptococci in Kombination mit MPO zur Candida-Abtötung und Unterdrückung von Hefeüberwachsung.
  • (7) Direkte MPO-Abtötung von Streptococcus pyogenes (Gruppe A) und Streptococcus agalactiae (Gruppe B).
  • Materialien: Die Bakterien, alle Mitglieder der Gattung Streptococcus, wurden über Nacht in Todd-Hewitt-Brei („Todd-Hewitt Broth” – THB) gezüchtet. Die RBCs und MPO wurden wie in Beispielen 1 und 2 beschrieben hergestellt und quantifiziert.
  • Methoden: 100 μl Targetmikrobensuspension (ungefähr 106 Mikroben), 100 μl MPO (Konzentration variierte), 100 μl Glucose (1 mg), 600 μl NS und, wo angegeben, entweder 100 μl Erythrozytensuspension (10 RBCs) oder NS wurden jedem Röhrchen für ein Endvolumen von 1 ml zugegeben. Die Inhalte wurden sanft vermischt und die Röhrchen wurden für 30 min bei 23°C inkubiert. Mikrobielle Abtötung wurde durch verdünnte Agarplattenlösungen, wie zuvor in Beispiel 1 beschrieben, gemessen, nur dass die Kolonien auf Blutagar plattiert wurden und für 2 Tage zur vollständigen Entwicklung der kleinen Kolonien und haemolytischen Mustern wachsen durften.
  • Viele, aber nicht alle Mitglieder der Gattung Streptococcus generieren H2O2 als metabolisches Produkt. Die in Tabelle 10 präsentierten Resultate indizieren, dass sich die Mitglieder der Gattung Streptococcus auch hinsichtlich der MPO-Bindungskapazität unterscheiden.
  • Diese Beobachtungen legen mögliche Unterschiede in der Empfindlichkeit gegenüber MPO-Abtötung nahe. Die in Tabelle 15 präsentierten Resultate bekräftigen diese Möglichkeit. TABELLE 15 Direkte mikrobizide Wirkung von Myeloperoxidase gegen verschiedene Streptococci:
    Reine RBC RBC (107) Hämoglobin:
    Organismus MPO, pmol CFU: CFU: Pellet Überst.
    Strep. (virid.) Keine 800,000 260.000 0,7 0,3
    Alpha-Strep.
    100,0 0 22.000 0,1 0,8
    33,3 0 33.000 0,3 0,7
    11,1 0 30.000 0,7 0,4
    3,7 0 63.000 1,0 0,0
    1,2 600 200.000 0,7 0,2
    0,4 26.000 160.000 1,3 0,0
    0,13 37.000 130.000 -- ---
    St.pyogenes Keine 2,500.000 970.000 1,0 0,1
    Gruppe A
    100,0 0 290.000 0,8 0,1
    33,3 0 280.000 1,0 0,1
    11,1 0 260.000 0,7 0,0
    3,7 0 300.000 1,0 0,0
    1,2 0 130.000 0,8 0,0
    0,4 600 750.000 1,0 0,0
    0,13 1,300.000 970.000 1,4 0,0
    St.agalactiae Keine 740.000 930.000 1,0 0,0
    Gruppe B
    100,0 0 0 0,6 0,0
    33,3 0 0 0,7 1,0
    11,1 0 0 0,5 0,0
    3,7 750.000 6.200 0,8 0,0
    1,2 1,700.000 1,300.000 1,0 0,0
    0,4 1,100.000 1,200.000 1,0 0,0
    0,13 1,200.000 1,300.000 1,0 0,0
    Reine RBC RBC (107) Hämoglobin:
    Organismus MPO, pmol CFU: CFU: Pellet Überst.
    St.faecalis Keine 1,900.000 1,700.000 1,0 0,0
    Gruppe D
    100,0 1,600.000 1,500.000 0,5 0,0
    33,3 1,900.000 1,300.000 1,1 0,3
    11,1 1,700.000 1,500.000 0,7 0,0
    3,7 1,500.000 1,400.000 .0,6 0,1
    1,2 1,500.000 1,600.000 1,4 0,0
    0,4 1,700.000 1,700.000 1,0 0,0
    0,13 1,800.000 1,500.000 1,1 0,0
  • MPO bewirkt eine direkte Abtötung von Streptococcus sp. (viridans), Streptococcus pyogenes (Gruppe A) und Streptococcus agalactiae (Gruppe B), aber produziert keine direkte Abtötung von Streptococcus faecalis (Gruppe D). Die Anwesenheit von RBCs reduzierte die mikrobizide Wirkung von MPO, allerdings erfolgte eine minimale Haemolyse.
  • In Hinsicht auf die MPO-Abtötung ist Streptococcus pyogenes (Gruppe A) empfindlicher als Streptococcus agalactiae (Gruppe B) und Streptococcus sp. (viridans) in Abwesenheit von RBCs. Diese Ordnung stimmt mit den in Tabelle 10 angeführten MPO-Bindungsaffinitäten und -kapazitäten überein. Die Eindungs-Abtötungs-Korrelation wird durch die Anwesenheit von RBCs verzerrt. RBCs binden MPO nicht, aber sie enthalten Katalse, die H2O2 zerstören kann. Die differenzielle Inhibition der Mikrobenabtötung kann die Wirkung einer konstanten Menge an RBC-Katalse im Verhältnis zu den unterschiedlichen Geschwindigkeiten der H2O2-Generierung durch die verschiedenen Streptococci, reflektieren.
  • Streptococcus faecalis (Gruppe D) ist das einzige Mitglied der getesteten Gruppe, das nicht alpha- oder betahaemolytisch ist und kein H2O2 als metabolisches Produkt freisetzt. Somit wird St.faecalis trotz der höchsten MPO-Bindungsaffinität und -kapazität vor der MPO-Wirkung in Abwesenheit einer exogenen H2O2-Quelle geschützt.
  • Diese Beobachtungen dokumentieren die direkte MPO-Abtötung von pathogenen Mitgliedern der LAB-Familie und demonstrieren den therapeutischen Nutzwert von MPO bei der Eliminierung von Streptococcal-Kolonialisierung oder -infektion der Gruppe A und/oder B.
  • (8) Synergetische mikrobizide Wirkung von Viridans Streptococci-Chloroperoxidase in Abwesenheit und Anwesenheit von Erythrozyten.
  • Materialien: Die Bakterien, Hefe und RBCs wurden wie supra beschriebene hergestellt und quantifiziert. CPO wurde von Sigma Chemical Co. erworben und wie im Beispiel 7 beschrieben hergestellt.
  • Methoden: Die Methodologie erfolgte wie die supra beschrieben, nur dass CPO die eingesetzte Haloperoxidase war.
  • CPO wurde durch MPO substituiert, um Daten zur vergleichenden Analyse der Wirkung von Haloperoxidase zu liefern. Die mikrobizide Kapazität von CPO in Kombination mit Viridans streptococci wurde unter Verwendung der zuvor beschriebenen drei Bakterien und einen Hefe getestet und die Resultate sind in Tabelle 16 präsentiert. TABELLE 16 Chloroperoxidaseabhängige mikrobizide Wirkung von Viridans streptococci in Abwesenheit und Anwesenheit von Erythrozyten
    Keine RBC RBC (107) Hämoglobin:
    Organismus CPO, pmol CFU: CFU: Pellet Überst.
    P. aeruginosa Keine 2,400,000 2,000.000 0,9 0,0
    100,0 0 4.400 0,0 1,0
    33,3 200 5.300 0,0 1,1
    11,1 100 29.000 0,0 1,2
    3,7 1.100 10.000 0,7 0,2
    1,2 1.700 57.000 1,0 0,0
    0,4 23.000 390.000 1,2 0,0
    0,13 52.000 1,800.000 0,7 0,0
    E.coli Keine 2,500.000 2,800.000 1,0 0,0
    100,0 0 2.500 0,3 0,9
    33,3 0 6.000 1,1 0,0
    11,1 0 6.500 1,0 0,0
    3,7 0 81.000 0,9 0,0
    1,2 200 2,500.000 1,0 0,1
    0,4 2.600 2,400.000 1,0 0,0
    0,13 650.000 2,200.000 0,9 0,1
    Staph.aureus Keine 2,400.000 2,000.000 1,1 0,0
    100,0 30.000 6.200 0,1 0,9
    33,3 0 6.000 0,5 0,5
    11,1 500 1,500.000 1,0 0,0
    3,7 510.000 2,500.000 1,0 0,0
    1,2 1,600.000 2,500.000 0,8 0,0
    0,4 1,700.000 2,600.000 1,0 0,0
    0,13 2,000.000 2,700.000 1,0 0,1
    Cand.albicans Keine 550.000 840.000 1,2 0,1
    100,0 350.000 520.000 0,0 0,5
    33,3 310.000 450.000 0,0 1,3
    11,1 380.000 640.000 0,3 1,1
    3,7 430.000 560.000 1,0 0,0
    1,2 430.000 530.000 1,0 0,0
    0,4 440.000 520.000 1,0 0,1
    0,13 430.000 870.000 0,7 0,2
  • In Abwesenheit von RBCs übten Viridans streptococci eine CPO-abhängige bakterizide Wirkung aus, die mit jener vergleich bar ist, die zuvor mit dem Viridans-Streptococci-MPO-System erhalten wurde, aber ungleich dem MPO-System tötete das CPO-System die Candida albicans nicht effektiv ab. Sowohl MPO, als auch CPO haben vergleichbare Aktivitäten hinsichtlich der Halidoxidation und 1O2-Produktion, aber ein Vergleich der MPO- und CPO-Bindungsdaten aus den Tabellen 10 und 11 zeigt die in Bezug auf Größenordnung größere MPO-Mikrobenbindungskapazität.
  • Sowohl MPO-, als auch CPO-Generierung von HOCl und 1O2 produziert einen mikrobiziden Effekt, aber dem CPO-System mangelt es an dem für die selektive Abtötung mit minimalem Kollateralschaden notwendigen hohen Grad an Spezifität. Candida wird bei keiner der getesteten Konzentrationen von CPO abgetötet. Ein Kollateralschaden in Form von Haemolyse wird über 10 pmol CPO/ml beobachtet.
  • Beispiel 9
  • Optimale Bereiche der Verhältnisse von Chlorid/H2O2 und Bromid/H2O2 für die mikrobizide Haloperoxidasewirkung
  • Materialien: Candida albicans wurde wie in Beispiel 10 beschrieben hergestellt und quantifiziert. EPO und MPO wurden wie in Beispiel 2 beschrieben hergestellt.
  • Methoden: Die Methodologie war wie die zuvor für Beispiel 3 beschriebene, nur dass sowohl EPO, als auch MPO eingesetzt wurden, und dass sowohl die Konzentrationen von Halid, d.h. Cl- und Br-, als auch von H2O2 variiert wurden.
  • Wie zuvor in Beispiel 3 betrachtet, ist das Halid/H2O2-Verhältnis ein wichtiger Faktor hinsichtlich der Stabilität und Funktionalität von Haloperoxidase. Bei sehr niedrigen Verhältnissen kann H2O2 die Haloperoxidasefunktion inhibieren und bei extrem hohen Verhältnissen kann Halid die Katalyse konkurrierend blockieren.
  • Tabelle 17 präsentiert Daten, die das Cl-/H2O2-Verhältnis der MPO- und EPO-abhängigen Abtötung von Candida albicans gegenüberstellen. Candida wurde aufgrund ihrer Resistenz gegen die direkte Wirkung von H2O2 als Targetmikrobe ausgewählt. Die Daten sind als Candida albicans CFU präsentiert. Das Cl-/H2O2-Verhältnis wird unten präsentiert und die Abtötung in Prozent ist unter dem Verhältnis angegeben. TABELLE 17 Der Effekt des Cl- : H2O2-Verhältnisses und der Menge davon auf die von Myeloperoxidase und eosinophiler Peroxidase abhängige Abtötung von Candida albicans:
    Chlorid, μmol
    Kein 0,10 1,00 10,00 100,00
    H2O2,
    μmol
    Myeloperoxidase: 1 pmol
    Kein 900.0001 500.000 820.000 720.000 840.000
    (0,00)2 (Inf.) (Inf.) (Inf.) (Inf.)
    0,00 %3 44,4 % 8,9 % 20,0 % 6,7 %
    0,0025 900.000 640.000 620.000 40.000 0
    (0,00) (40,00) (400,00) (4000,00) (40.000,00)
    0,0 % 28,9 % 31,1 % 95,6 % 100,0 %
    0,0500 580.000 780.000 720.000 10.000 0
    (0,00) (2,00) (20,00) (200,00) (2000,00)
    35,6 % 13,3 % 20,0 % 98,9 % 100,0 %
    1,000 560.000 700.000 480.000 280.000 480.000
    (0,00) (0,10) (1,00) (10,00) (100,00)
    37,8 % 22,2 % 46,7 % 68,9 % 46,7 %
    Eosinophile Peroxidase: 1 pmol
    Kein 960.000 860.000 960.000 980.000 1,200.000
    (0,00) (Inf.) (Inf.) (Inf.) (Inf.)
    0,00 % 10,4 % 0,00 % –2,1 % –25,0 %
    0,0025 820.000 960.000 1,000.000 780.000 660.000
    (0,00) (40,00) (400,00) (4000,00) (40.000,00)
    14,6 % 0,00 % –4,2 % 18,8 % 31,4 %
    0,0500 960.000 900.000 760.000 740.000 540.000
    (0,00) (2,00) (20,00) (200,00) (2000,00)
    0,00 % 6,3 % 20,8 % 22,9 % 43,8
    1,000 780.000 700.000 840.000 900.000 800.000
    (0,00) (0,10) (1,00) (10,00) (100,00)
    18 8 27,1 % 12,5 % 6,3 % 16,7 %
    • 1 Anzahl der koloniebildenden Einheiten von Candida albicans
    • 2 Verhältnis von Cl-/H2O2
    • 3 Prozentsatz der abgetöteten Candida albicans
  • Mit MPO als Haloperoxidase wurde die Wirkung von Candida bei Cl-/H2O2-Verhältnissen von 1 bis 40.000 detektiert und eine im Wesentlichen vollständige Abtötung wurde im Bereich von 200 bis 40.000 beobachtet. Das Halid/H2O2-Verhältnis ist eine wichtige Erwägung bei der Formulierung einer effektiven mikrobiziden Umgebung. Bei niedrigen H2O2-Konzentrationen ist ein relativ hohes Verhältnis im Wesentlichen garantiert, da Cl- eine ubiquitäre Komponente der Körperflüssigkeiten ist. Im Plasma von normalen (menschlichen) Subjekten reichen die Cl--Level von 98 bis 107 μmol/ml; die Level von Zerebrospinalflüssigkeiten reichen von 119 bis 131 μmol/ml; Speichellevel reichen von 7 bis 43 μmol/ml und die Schweißlevel von 4 bis 60 μmol/ml. Stimulierte Magensekretion reicht von 460-1.040 μmol/min, und Harnausscheidung reicht von 80.000–270.000 μmol/Tag (Geigy Scientific Tables, 8. Ausgabe, 1981, Ciba-Geigy Ltd. Basel, Schweiz). Es ist schwer, eine Körperflüssigkeit zu erhalten, die weniger als 5 μmol/ml enthält, und deshalb sollten die Konzentrationen an verfügbarem H2O2 für die meisten antiseptischen und selektiven antimikrobiellen Anwendungen des Enzyms unter 5 μmol/ml, vorzugsweise unter 0,5 μmol/ml und am meisten bevorzugt unter 0,05 μmol/ml, gehalten werden.
  • Mit EPO als Haloperoxidase war die Wirkung der Candida innerhalb des Bereichs von 0 bis 40.000 der getesteten Cl-/H2O2-Verhältnisse NICHT effektiv. Wie supra beschrieben, ist Chlorid als Halidkofaktor für mikrobizide Wirkung von EPO relativ ineffektiv.
  • Die Daten in Tabelle 18 stellen das Br-/H2O2-Verhältnis der MPO- und EPO-abhängigen Abtötung von Candida albicans gegenüber. Die Daten werden wie zuvor für Tabelle 17 beschrieben präsentiert. TABELLE 18 Der Effekt des Br-: H2O2-Verhältnisses und der Menge davon auf die von Myeloperoxidase und eosinophiler Peroxidase abhängige Abtötung von Candida albicans:
    Bromid, μmol
    Kein 0,001 0,01 0,10 1,00 10,00
    H2O2,
    μmol
    Myeloperoxidase: 1 pmol
    Kein 900.0001 580.000 720.000 720.000 640.000 720.000
    (0,00)2 (Inf.) (Inf.) (Inf.) (Inf.) (Inf.)
    0,00 %3 35,6 % 20,0 % 20,0 % 28,9 % 20,0 %
    0,0025 900.000 500.000 700.000 9.000 80.000 620.000
    (0,00) (0,40) (4,00) (40.00) (400,00) (4.000,00)
    0,0 % 44,4 % 22,2 % 99,0 % 91,1 % 31,1 %
    0,0500 580.000 640.000 660.000 520.000 40.000 420.000
    (0,00) (0,02) (0,20) (2,00) (20,00) (200,00)
    35,6 % 28,9 % 26,7 42,2 % 95,6 % 53,3 %
    1,000 560.000 1,000.000 500.000 540.000 620.000 540.00
    (0,00) (0,001) (0,01) (0,10) (1,00) (10,00)
    37,8 % –11,1 % 44,4 % (40,0 % 31,1 % 40,0 %
    Eosinophile Peroxidase: 1 pmol
    Kein 960.000 900.000 900.000 960.000 760.000 1,200.000
    (0,00) (Inf.) (Inf.) (Inf.) (Inf.) (Inf.)
    0,00 % 6,3 % 0,00 % 0,0 % 20,8 % –25,0 %
    0,0025 820.000 700.000 24.000 26.000 120.000 540.000
    (0,00) (0,40) (6,30) (40,00) (400,00) (4.000,00)
    14,6 % 27,1 % 97,5 % 97,3 % 87,5 % 43,8 %
    0,0500 960.000 640.000 460.000 0 0 0
    (0,00) (0,02) (0,20) (2,0) (20,00) (200,00)
    0,00 % 33,3 % 52,1 % 100,00 % 100,0 % 100,0 %
    1,000 780.000 560.000 780.000 660.000 600.000 0
    (0,00) (0,001) (0,01) (0,10) (1,00) (10,00)
    18,8 % 41,7 % 18,8 % 31,3 % 37,5 % 100,0 %
    • 1 Anzahl der koloniebildenden Einheiten von Candida albicans
    • 2 Verhältnis von Br-/H2O2
    • 3 Prozentsatz der abgetöteten Candida albicans
  • Mit MPO als Haloperoxidase wurde die Wirkung von Candida bei Br-/H2O2-Verhältnissen von 2 bis 4.000 detektiert und eine im Wesentlichen vollständige Abtötung wurde im Bereich von 20 bis 400 beobachtet. Mit EPO als Haloperoxidase wurde eine Abtötung mit Br-/H2O2-Verhältnissen im Bereich von 0,2 bis 4.000 detektiert und eine im Wesentlichen vollständige Abtötung wurde im Bereich von 2 bis 400 erhalten. Die gesteigerte Candida-Effektivität von EPO im Verhältnis zu MPO stimmt mit den relativen Bindungsaffinitäten von diesen Haloperoxidasen gegenüber Candida albicans überein, wie in den Tabellen 10 und 13 präsentiert.
  • Bei normalen Subjekten reichen die Br--Plasmalevel von 0,049 bis 0,93 μmol/ml; Zerebrospinalflüssigkeitslevel von 0,018 bis 0,048 μmol/ml; Speichellevel von 0,003 bis 0,013 μmol/ml und Schweißlevel von 0,002 bis 0,006 μmol/ml. Br- wird vorzugsweise über Cl- durch die Parietalzellen des Magens sekretiert und die Harnausscheidung reicht von 20 bis 84 μmol/Tag (Geigy Scientific Tables, B. Ausgabe, 1981, Ciba-Geigy Ltd. Basel, Schweiz). Die in Körperflüssigkeiten verfügbare Konzentration an Br- liegt typischerweise im Bereich von 5 nmol bis 90 nmol/ml. Deswegen sollte die Konzentration von verfügbarem H2O2 in Abwesenheit von Br--Ergänzung für die meisten antiseptischen oder antimikrobiellen Anwendungen von Haloperoxidasen, die Bromid benötigen, wie EPO oder LPO, unter 0,01 μmol/ml, vorzugsweise unter 0,001 μmol/ml, gehalten werden.
  • Bromid wird therapeutisch in der Behandlung von Epilepsie angewandt. Es wird berichtet, dass der therapeutische Bereich von 9 bis 18 μmol/ml mit einer Toxizität von über 16 μmol/ml liegt (Cecil's Textbook of Medicine, 18. Ausgabe, 1988, W.B. Saunders Co., Philadelphia). Es ist deshalb möglich, die Br--Konzentration der Körperflüssigkeiten zehn- bis hundertfach ohne Toxizität zu erhöhen. An sich, wenn EPO oder LPO die gewählte Haloperoxidase ist, kann das Br- in der Formulierung zu einer Konzentration unter dem toxischen Bereich enthalten sein und die H2O2-Konzentration kann proportional erhöht werden, um das Br /H2O2-Verhältnis innerhalb des optimalen Bereichs zu halten.
  • Beispiel 10
  • Der Effekt von hohen Konzentrationen an konkurrierenden Substraten auf die bakterielle Wirkung von MPO
  • Mikrobenselektive Bindungseigenschaften in Kombination mit starker mikrobizider Wirkung legen die Verwendung von Haloperoxidase zur Mikrobenabtötung mit einem minimalen Kollateralschaden der Medienkomponenten und selektiven Steuerung der mikrobiellen Flora nahe. Um diese Möglichkeiten vollständig zu realisieren, müssen Haloperoxidasen Mikroben in mit konkurrierenden Substraten gesättigten Medien effektiv abtöten. Das folgende Experiment wurde zur Testung des Effekts eines komplexen Mediums auf die bakterizide Aktivität von Myeloperoxidase durchgeführt.
  • Materialien und Methoden: Die Materialien und Methoden waren wie die für Beispiel 3 beschriebenen, nur dass das Reaktionsmedium Silimac® Formulierung für Kinder („infant formula", Ross Laboratories, Div. Abbott Laboratories) bei einer verdünnten Lösung der ½ Standardkonzentration enthielt.
  • Die Daten der Tabelle 19 präsentieren die MPO-abhängige bakterizide Wirkung von verschiedenen H2O2-Konzentrationen auf E.coli und Staphylococcus aureus in Anwesenheit einer ½ Standardkonzentration an Similac®. Die MPO-abhängige mikrobizide Wirkung mit verschiedenen H2O2-Konzentrationen wurde zuvor in Beispiel 3 beschrieben und wird durch die Daten der Tabelle 8A veranschaulicht.
  • Similac® ist eine komplexe Suspension von Protein, Fett, Kohlehydrat und Vitaminen. Bei der zum Testen eingesetzten Konzentration enthielt jeder ml des Mediums 10 pmol MPO und die angegebene Menge an H2O2, plus 7,5 mg Protein, 18 mg Fett – davon waren 4,4 mg Linolsäure, 36 mg Kohlehydrat und 30 μg Ascorbinsäure (Vitamin C). Relativ hohe Konzentrationen an konkurrierenden Substraten, wie Linolsäure, und Reduktionsmittel, wie Ascorbinsäure, produzieren eine große Inhibition der mikrobiziden MPO-Wirkung, aber trotz dieser Inhibition bleibt die vorhandene mikrobizide MPO-Kapazität stark. Die Daten der Tabelle 19 zeigen, dass die bakterizide Wirkung mit weniger als 0,6 μmol/ml H2O2 vollständig ist. TABELLE 19 Der Effekt von Similac® Infant Formula auf die MPO-abhängige Abtötungsaktivität von H2O2
    H2O2, MPO, keine MPO, 10 pmol
    Organismus: μmol CFU: CFU:
    E.coli Kein 6,700.000 4,500.000
    700 0 0
    70 0 0
    14 300.000 0
    2,8 3,800.000 0
    0,56 3,900.000 0
    0,112 3,200.000 3,400.000
    0,0224 3,400.000 3,500.000
    0,00448 3,100.000 4,700.000
    0,000896 2,800.000 3,100.000
    Staph.aureus Kein 4,000.000 5,300.000
    700 0 0
    70 0 0
    14 3,000.000 0
    2,8 4,400.000 0
    0,56 4,500.000 0
    0,112 4,900.000 5,500.000
    0,0224 3,600.000 5,900.000
    0,00448 3,000.000 5,300.000
    0,000896 5,300.000 5,300.000
  • Similac® wurde zu ½ Standardkonzentration verwendet. Jeder ml der getesteten Suspension enthielt 7,5 mg Protein, 18 mg Fett, 4,4 mg davon waren Linolsäure, 36 mg Kohlehydrat und 30 μg Ascorbinsäure.
  • Mikrobenbindende Haloperoxidasen können zur Sterilisierung von komplexen Medien in einer relativ niedrigen Konzentration eingesetzt werden. Gleichfalls indizieren die mikrobenspezifischen Eindungs- und Abtötungseigenschaften von Haloperoxidasen, wie in den Beispielen 6 bis 9 beschrieben, ihre potentielle Rolle in der selektiven Steuerung der Florazusammensetzung. Diese Haloperoxidasen können zur Steuerung der Gärungsprozesse sowie zur medizinischen Therapie verwendet werden.
  • Verschiedene Modifikationen und Adaptionen der antiseptischen Methoden und Zusammensetzungen der Erfindung werden für Fachmänner aus dem Vorangegangenem ersichtlich sein. Jede dieser Modifikationen und Adaptionen soll innerhalb des Umfangs der beigefügten Ansprüche liegen, nur nicht, wenn sie durch den Stand der Technik ausgeschlossen sind.

Claims (11)

  1. Verwendung einer Haloperoxidase bei der Herstellung eines flüssigen topischen Medikaments zum Einsatz als antimikrobieller Wirkstoff, der bakterielle Pathogene selektiv tötet, während er die normale Flora selektiv erhält, wobei das Medikament von 0,01 pmol bis 500 pmol pro ml Myeloperoxidase (MPO) oder eosinophile Peroxidase (EPO) und von 10 μmol bis 150 μmol pro ml Chlorid oder von 1 nmol bis 20 μmol pro ml Bromid umfasst.
  2. Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Medikament von 0,1 pmol bis 50 pmol MPO oder EPO pro ml umfasst.
  3. Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Medikament von 0,5 pmol bis 5 pmol MPO oder EPO umfasst.
  4. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Medikament weiters normale Flora umfasst, welche zur Förderung der Rekolonisation der normalen Flora des Wirts effektiv ist.
  5. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Halogenid in Anwesenheit von Halogenid und Peroxid oxidiert wird, und die Disproportionierung des Peroxids zu verbessern, wodurch molekularer Singulett-Sauerstoff gebildet wird.
  6. Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Halogenid Chlorid ist und das Medikament weiters Mittel zum Halten des Verhältnisses von Chlorid zu Peroxid im Bereich von ungefähr 0,1 bis 40.000 bei. der Stelle von pathogenen Mikroben umfasst.
  7. Verwendung nach Anspruch 6, wobei das Mittel das Verhältnis von Chlorid zu Peroxid im Bereich von 200 bis ungefähr 40.000 bei der Stelle von pathogenen Mikroben hält.
  8. Verwendung nach Anspruch 5, wobei die Haloperoxidase EPO ist und das Halogenid Bromid ist.
  9. Verwendung nach Anspruch 8, wobei das Medikament weiters Mittel zum Halten des Verhältnisses von Bromid zu Peroxid im Bereich von 0,1 bis 4.000 umfasst.
  10. Verwendung nach Anspruch 9, wobei das Mittel das Verhältnis von Bromid zu Peroxid im Bereich von 1 bis 1.000 bei der Stelle von pathogenen Mikroben hält.
  11. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei das Medikament weiters ein Peroxid oder einen Wirkstoff umfasst, welcher bei der Verabreichung an ein Subjekt zur Produktion eines Peroxids fähig ist.
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