JPH06503967A

JPH06503967A - 腫瘍感受性非ヒト動物

Info

Publication number: JPH06503967A
Application number: JP4504551A
Authority: JP
Inventors: ダンハウワー、ロウレンス・エイ; ブラッドレイ、アラン; ブテル、ジャネット・エス; スレイグル、ベテイ
Original assignee: ベイラー・カレッジ・オブ・メディシン
Priority date: 1991-01-04
Filing date: 1992-01-03
Publication date: 1994-05-12
Also published as: CA2098827A1; EP0565638A1; AU1236092A; WO1992011874A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】３、該腫瘍抑制遺伝子がｐ５３遺伝子である請求項１または２のいずれかに記載の動物細胞。

４、ヒト細胞である請求項１に記載の動物細胞。

５、非ヒト動物細胞である請求項１に記載の動物細胞。

６、胚幹細胞である請求項５に記載の動物細胞。

７、ＡＴＣＣＣＲＬ１０６３１であり、該腫瘍抑制遺伝子がｐ５３遺伝子である請求項６に記載の胚幹細胞。

８、ゲノムが腫瘍抑制遺伝子の２つの染色体対立遺伝子を含み、該２つの対立遺伝子の少なくとも一方が変異を含有する動物細胞を有する非ヒトトランスジェニックまたはキメラ動物、または胚期にある該動物の子孫、または該動物の祖先。

９、該腫瘍抑制遺伝子がｐ５３遺伝子である請求項８に記載の非ヒト動物。

１０、該動物細胞がヒト細胞である請求項８に記載の非ヒト動物。

１１、該動物細胞が非ヒト細胞である請求項８に記載の非ヒト動物。

１２、該動物細胞が生殖系細胞である請求項１１に記載の非ヒト動物。

１３、該動物細胞が体細胞である請求項１１に記載の非ヒト動物。

１４、該動物および該動物細胞が同じ種のものである請求項１１に記載の非ヒト動物。

１５、該動物および該動物細胞が異なる種のものである請求項１１に記載の非ヒト動物。

１６、請求項６に記載の胚幹細胞を含有する非ヒト動物、または胚期にある該動物の子孫、または該動物の祖先。

１７　請求項７に記載の胚幹細胞を含有する非ヒト動物、または胚期にある該動物の子孫、または該動物の祖先。

１８、腫瘍抑制遺伝子の存在または発現に帰することのできる動物細胞の特性に影響を及ぼし得ると思われる剤の存在を同定する方法であって、（Ａ）所定量の核剤を細胞培養中の動物細胞に投与し、その際、該細胞は該腫瘍抑制遺伝子の２つの染色体対立遺伝子を含むゲノムを有し、該２つの対立遺伝子の少なくとも一方が変異を含有する：（Ｂ）該投与後、所望の時間、該細胞培養を維持し；（Ｃ）核剤の投与が、該腫瘍抑制遺伝子の該対立遺伝子の存在または発現に帰することのできる該動物細胞の特性に影響を及ぼしたか否かを決定することを特徴とする方法。

１９、該腫瘍抑制遺伝子がｐ５３遺伝子である請求項１８に記載の方法。

２０、核剤が、該動物細胞の腫瘍形成能を増大させ得ると思われる請求項１８に記載の方法。

２１、核剤が、該動物細胞の腫瘍形成能を減少させ得ると思われる請求項１８に記載の方法。

２２、該動物細胞がヒト細胞である請求項１８に記載の方法。

２３　該動物細胞が非ヒト動物細胞である請求項１８に記載の方法。

２４、該非ヒト動物細胞が胚幹細胞である請求項２３に記載の方法。

２５、該胚幹細胞がＡＴＣＣＣＲＬ１０６３１である請求項２４に記載の方法。

２６、腫瘍抑制遺伝子の存在または発現に帰することのできる動物細胞の特性に影響を及ぼし得ると思われる剤の存在を同定する方法であって、（Ａ）所定量の核剤を動物に投与し、その際、該動物は、ゲノムが該腫瘍抑制遺伝子の２つの染色体対立遺伝子を含む細胞を有し、該２つの対立遺伝子の少なくとも一方が変異を含有する：（Ｂ）該投与後、所望の時間、該動物を維持し：（Ｃ）核剤の投与が、該腫瘍抑制遺伝子の該対立遺伝子の存在または発現に帰することのできる該細胞の特性に影響を及ぼしたか否かを決定することを特徴とする方法。

２７、該腫瘍抑制遺伝子がｐ５３遺伝子である請求項２６に記載の方法。

２８、核剤が、該動物細胞の腫瘍形成能を増大させ得ると思われる請求項２６に記載の方法。

２９、核剤が、該動物細胞の腫瘍形成能を減少させ得ると思われる請求項２６に記載の方法。

３０、該動物細胞がヒト細胞である請求項２６に記載の方法。

３１、該動物細胞が非ヒト動物細胞である請求項２６に記載の方法。

３２、該非ヒト動物細胞が胚幹細胞である請求項３１に記載の方法。

３３、該胚幹細胞がＡＴＣＣＣＲＬ１０６３１である請求項３２に記載の方法。

３４　該動物および該動物細胞が同じ種のものである請求項２６に記載の方法。

３５、該動物および該動物細胞が異なる種のものである請求項２６に記載の方法。

３６　動物の細胞のゲノムを変化させることを特徴とする遺伝子治療の方法であって、該細胞が、腫瘍抑制遺伝子の２つの染色体対立遺伝子を含むゲノムを有し、該２つの対立遺伝子の少なくとも一方が変異を含有し、それゆえ該対立遺伝子の少なくとも一方が正常な腫瘍抑制遺伝子産物を発現する細胞を生成することを特徴とする方法。

３７、該動物が非ヒト動物である請求項３６に記載の方法。

３８　該動物がヒトである請求項３６に記載の方法。

３９、該腫瘍抑制遺伝子がｐ５３遺伝子である請求項３６に記載の方法。

明細書発明の名称：腫瘍感受性非ヒト動物発明の技術分野：本発明は、腫瘍感受性非ヒト動物に関する。本発明はさらに、そのような動物の抗癌剤の開発および治療への使用に関する。

関連出願との関係：この出願は、米国特許出願第０７／６３７．５６３号（１９９１年１月４日出ＪｉＩ）の一部継続出願である。

発明の背景：１、キメラおよびトランスジェニック動物組換えＤＮＡおよび遺伝子技術の最近の進歩は、所望の遺伝子配列を受容動物に導入し発現することを可能にしている。そのような方法の使用によって、変化を受けていない動物には通常または天然には存在しない遺伝子配列を有するように動物が操作されてきた。これら技術はまた、天然に存在する遺伝子配列の変化した発現を示す動物を産生ずるために用いられてきた。

これら方法の使用によって産生された動物は、「キメラ」または「トランスジェニック」動物として知られる。「キメラ」動物では、動物の細胞のうちい（つかのものだけが導入遺伝子配列を含有および発現しており、他の細胞は変化を受けていない。キメラ動物が導入遺伝子配列をその子孫に伝達する能力は、該導入遺伝子配列が該動物の生殖細胞中に存在するかどうかに依存する。それゆえ、ある種のキメラ動物のみが所望の遺伝子配列をその子孫に伝達することができる。

対照的に、「トランスジェニック」動物のすべての細胞には導入遺伝子配列が含まれる。従って、トランスジェニック動物はすべて導入遺伝子配列を子孫に伝達することができる。

■、トランスジェニック動物の産生：マイクロインジェクンヨン法トランスジェニック動物を産生ずるために最も広く用いられている方法は、受精卵の雄前核中にＤＮＡ分子を注入することを含む（プリンスター（ｆ３　ｒｉｎｓｔｅｒ。

Ｒ，Ｌ、）ら、Ｃｅ１ｌ　２７　＋　２２３　（１９８１）；コスタンチ一二（（：　０５１Ｂｎｔｉｎｉ。

Ｆ、）ら、Ｎａｔｕｒｅ　２９４　：　９２　（１９８１）；バーバーズ（Ｈａｒｂｅｒｓ、　Ｋ、　）ら、Ｎａｔｕｒｅ　２９３　：　５４０　（１９８１）：　ワグナ−（Ｗａｇｎｅｒ、　Ｅ、　Ｆ、　）ら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、ｓｃｉ、　（ＵＳＡ）７８：５０１６　（１９８１）＋ゴートン（Ｇｏｒｄｏｎ、　Ｊ　、Ｗ、　）ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、（ＵＳＡ）　７３　：１２６０　（１９７６）　；スチュアート（Ｓｔｅｗａｒｔ、　Ｔ、　Ａ、　）ら、５ｃｉｅｎｃｅ　２１７　：１０４６−１０４８　（１９８２）；パルミタ−（Ｐａ１ｍ１ｔｅｒ、　Ｒ，Ｄ、　）ら、５ｃｉｅｎｃｅ　２２２　：　８０９　（１９８３）；エパンズ（Ｅ　ｖａｎｓ、　Ｒ、Ｍ、　）ら（米国特許第４．．８７０，００９号））。

導入する遺伝子配列は、いかなる種類の自己複製プラスミドまたはウィルスにも導入する必要はない（ヤニッシュ（Ｊａｅｎｉｓｃｈ、Ｒ，）　、５ｃｉｅｎｃｅ、　２４０　：　１４６８〜１４７４　（１９８８））。確かに、ベクターＤＮＡの存在は多くの場合に望ましくないことがわかっている（ハマ−（Ｈａｍｍｅｒ、　Ｒ，Ｅ、）ら、Ｓ　ｃｉｅｎｃｅ２３５：５３　（１９８７）；チャタ（Ｃｈａｄａ、　Ｋ、　）ら、Ｎａｔｕｒｅ　３１９　：　６８５（１９８６）：：ｌリアス（Ｋｏｌｌｉａｓ、　Ｇ、）ら、Ｃｅ１ｌ　４６　：　８９　（１９８６）；ンーニ（Ｓｈａｎｉ、Ｍ、）　、Ｍｏ１ｅｃ、　Ｃｅ１ｌ、　Ｂｉｏｌ、　６　：　２６２４　（１９８６）　；チャタら、Ｎａｔｕｒｅ　３１４　：　３７７　（１９８５）：タウンズ（Ｔｏｖｎｅｓ、　Ｔ、　）ら、ＥＭＢＯＪ、４　：１７１５　（１９８５）　）。

受容受精卵中に注入された後、ＤＮＡ分子は互いに組換えを起こして伸長した頭 −尾コンカテマーを生成すると思われる。そのようなコンカテマーは、受精卵染色体中の二本鎖ＤＮＡ破損部位にランダムな部位にて起こり、該コンカテマーはそのような部位に挿入され組み込まれることが提唱されている（プリンスターら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、Ｓｃｉ、　（ＵＳＡ）８２　：　４４３８　（１９８５）　）、それゆえ、注入したＤＮＡ分子が受精卵染色体内の幾つかの部位に組み込まれることも可能であるが、たいていの場合、単一の挿入部位のみが観察される（ヤニツシュ、５ｃｉｅｎｃｅ、２４０　：１４６８〜１４７４　（１９８８）　）。

ＤＮＡ分子が受精卵細胞中に注入されたら、この細胞を受容雌の子宮中に移植し、動物まで発育させる。この動物の細胞はすべて移植した受精卵に由来するので、発育した動物の細胞はすべて（生殖細胞を含む）導入遺伝子配列を含むであろう。約３０％で起こることだが、導入遺伝子配列が細胞ゲノム中に組み込まれる前に第一の細胞分裂が起こると、発育した動物はキメラ動物となるであろう。

そのような動物を交配および同系交配することにより、ヘテロ接合およびホモ接合トランスジェニック動物を産生ずることが可能である。そのようなトランスジェニック動物の生成の予測不能性にもかかわらず、これら動物は一般に安定であり、導入遺伝子配列を維持し発現する子孫を産生できることがわかっている。

マイクロインジェクションは、挿入部位における受精卵染色体中のヌクレオチド配列の破砕および変化を伴う過程を通して注入ＤＮＡを受精卵のゲノム中に組み込むので、注入ＤＮＡが挿入された内生の卵遺伝子機能の変化、破砕または喪失となることが観察されている。さらに、挿入ＤＮＡの両側にある内生卵配列の実質的な変化（欠失、重複、転位、および転座）が観察されている（マホン（Ｍａｈｏｎ、　Ｋ、　Ａ、　）ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、（ＬＩＳＡ）　８５　：１１６５　（１９８８）　：コバルビアス（Ｃｏｖａｒｒｕｂｉａｓ、　Ｙ、　）ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　（ＵＳＡ）８３：６０２０　（１９８６）；ｖ−り（Ｍａｒｋ、　Ｗ、　）ら、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒ、　Ｈａｒｂ、　５ｙａｐ、　Ｑｕａｎｔ。

Ｂｉｏｌ、５０　＋　４５３　（１９８５））。確かに、致死変異や著しい形態的異常が観察されティる（ヤニツシュ、５ｃｉｅｎｃｅ　２４０　＋１４６８〜１４７４　（１９８８）；ファースト（Ｆｉｒｓｔ、　Ｎ、　Ｌ、）ら、Ａｍｅｒ、　Ｍｅａｔ　Ｓ　ｃｉ、　Ａｓ５ｎ、　３９　ｔｈ　ＲｅｃｉｐｒｏｃａｌＭｅａｔ　Ｃｏｎｆ、３９：４１　（１９８６））。

重要なことに、マイクロインジェクションしたＤＮＡ分子の所望の遺伝子配列が受容卵ゲノム中に天然に認められるものであっても、該所望の遺伝子配列の組み込みは天然遺伝子の部位ではめったに起こらないことが観察されている（プリンスターら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　（ＵＳＡ）　８６　：　７０８７〜７０９１　（１９８９））。さらに、所望の遺伝子配列の導入は、一般に、もともと存在する卵遺伝子の配列を変化させない。

注入ＤＮＡが最終的に組み込まれる受精卵ゲノムの部位は予測できないが、該動物において所望の遺伝子配列の発現が器官または組織に特異的な仕方で起こるように、該配列の発現を制御することは可能である（ウエストファル（Ｗｅｓｔｐｈａｌ、Ｈ，）、ＦＡＳＥＢ　Ｊ、３　：１１７　（１９８９）；ヤニツシュ、５ｃｉｅｎｃｅ　２４０：１４６８〜１４７４　（１９８８）；ミード（Ｍｅａｄｅ、　Ｈ，）ら（米国特許第４゜８７３．３１６号）に概説されている）。

トランスジェニック動物を産生ずる成功率は、マウスで最も高い。ＤＮＡを注入し雌中に移植したマウス受精卵の約２５％がトランスジェニックマウスになるであろう。ウサギ、ヒツジ、ウシ、およびブタでは、これまでのところ低い率が達成されている（ヤニッシュ、５ｃｉｅｎｃｅ　２４０　：１４６８〜１４７４　（１９８８）、ハマーら、Ｊ、Ａｎｉｍａｌ、Ｓｃｉ、６３　：　２６９　（１９８６）　：ハマーら、Ｎａｔｕｒｅ　３１５　：　６８０　（１９８５）：ワグナーら、Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ　２１　：　２９　（１９８４））。

この低い率は、遺伝子系としてマウスが最もよ（わかっていることを反映しているかもしれず、または多（の飼育動物の受精卵の前核を視覚化することの困難さを反映しているかもしれない（ワグナ−ら、Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ　２１：２９　（１９８４））。

それゆえ、ＤＮＡのマイクロインジェクションによるトランスジェニック動物の産生は、少なくとも２つの主要な欠点を有する。第一に、動物の生活史の単一細胞期の間にしか達成することができない。第二に、ＤＮＡの天然配列の破砕を必要とし、それゆえ、しばしば変異原性または催奇性がある（プリンドリー（Ｇｒｉｄｌｅｙ、　Ｔ、　）　ら、Ｔｒｅｎｄｓ　Ｇｅｎｅｔ、３　：１６２　（１９８７）　）　。

■、キメラおよびトランスジェニック動物の産生：組換えウィルスおよびレトロウィルス法キメラおよびトランスジェニック動物はまた、組換えウィルスまたはレトロウィルス法（多細胞期にある動物に遺伝子配列を導入する）を用いても産生ずることができる。そのような方法では、所望の遺伝子配列をウィルスまたはレトロウィルス中に導入する。このウィルスに感染した細胞は該導入遺伝子配列を獲得する。もしもウィルスまたはレトロウィルスが動物のあらゆる細胞に感染すれば、この方法によりトランスジェニック動物が産生される。しかしながら、もしもウィルスが幾つかの動物細胞にのみ感染すれば、キメラ動物が産生される。

非複製ＤＮＡのマイクロインジェクションを伴う方法と比較した場合の、トランスジェニック動物を産生ずるためのウィルスまたはレトロウィルス法の一般的利点は、単一細胞期に遺伝子操作をする必要がないということである。さらに、感染はＤＮＡを所望の細胞中に導入するのに非常に効率的な手段である。

キメラまたはトランスジェニック動物を産生ずるための組換えレトロウィルス法は、レトロウィルスが宿主ゲノム中に正確に組み込まれるため、一般に、単一のみの組み込まれたレトロウィルスが存在する（複数の挿入も起こるが）という利点を有する。挿入部位における宿主染色体の再配列は、一般に、宿主ウィルスの接合部における宿生ＤＮＡの少数の複製（４〜６塩基対）に限られる（ヤニッシュ、５ｃｉｅｎｃｅ　２４０　：　１４６８〜１４７４　（１９８８）：バームス（Ｖ　ａｎｘｕｓ。

Ｈ，）　、ＲＮＡ−チュ　７　”パイラスイズ（ＲＮＡ　Ｔｕ＋＋ｏｒ　Ｖｉｒｕｓｅｓ）　（バイス（Ｗｅｉｓｓ、　Ｒ，）ら編）、コールドスプリングハーバ−プレス、コールドスプリングハーバ−、ニューヨーク、３６９〜５１２頁（１９８２）をも参照）。しかしながら、この方法は、マイクロインジェクション法と同じくらい変異原性である。

キメラ動物は、たとえば、宿主動物の細胞に感染することのできるウィルス（ウシパピローマウィルスまたはポリオーマなど）中に所望の遺伝子配列を導入することにより産生されている。感染すると、該ウィルスは染色体外エビソームとして感染細胞中に保持され得る（エルブレヒト（Ｅ　１ｂｒｅｃｈｔ、　Ａ、　）　Ｍｏ１ｅｃ、　Ｃｅｌｌ、　Ｂｉｏｌ、７　：１２７６　（１９８７）；レイシー（Ｌａｃｅｙ、　Ｍ、　）ら、Ｎａｔｕｒｅ　３２２　：６０９　（１９８６）；レオボルド（Ｌ　ｅｏｐｏｌｄ、　Ｐ　、　）ら、Ｃｅ１ｌ　５１　：　８８５　（１９８７））。この方法はキメラ／トランスジェニック動物の変異原性を減少させはするが、それは生殖細胞の安定性を減少させ発癌性を高めることによってである。

多分化能性の胚幹細胞（ｒＥＳＪ細胞と称する）は、胚発生の初期の後着末期（ｅａｒｌｙ　ｐｏｓｔ−ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ　ｓｔａｇｅ）前の胚から得られる細胞である。この細胞は培養液中で増殖させることができ、移植するとマウス中で腫瘍としてインビトロまたはインビボで分化することができる。ＥＳ細胞は、正常な核型を有している（エバンスら、Ｎａｔｕｒｅ　２９２　：　１５４〜１５６　（１９８１）；７−チン（Ｍａｒｔｉｎ、　Ｇ、　Ｒ，）　ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、（ＵＳＡ）　７８　：　７６３４〜７６３８　（１９８１））。

発育している胚の胚盤胞中に注入すると、ＥＳ細胞は増殖および分化してキメラ動物が産生されるであろう。ＥＳ細胞は、そのようなキメラ動物の体細胞および生殖細胞系統の両方をコロニー化することができる（ロバートソン（Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ、Ｅ、）ら、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂ、　Ｃｏｎｆ、　Ｃｅ１ｌ　Ｐｒｏｌｉｆ、　１０　：　６４７〜６６３（１９８３）；グラフドリー（Ｂ　ｒａｄｌｅｙ、　Ａ、　）　ら、Ｎａｔｕｒｅ　３０９　：　２５５〜２５６　（１９８４）；グラフドリーら、Ｃｕｒｒ、　Ｔｏｐ、　Ｄｅｖｅｌ、　Ｂｉｏｌ、　２０　；　３５７〜３７１　（１９８６）：ワグナーら、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂ、　Ｓｙｍｐ、　Ｑｕａｎｔ、　Ｂｉｏｌ。

５０　：　６９１〜７００　（１９８５）；　（これら文献を、すべて参照のため本明細書中に引用する））。

この方法では、ＥＳ細胞をインビトロで培養し、目的遺伝子配列を含有するウィルスまたはレトロウィルスベクターで感染させる。レトロウィルスベクターを用いて得られたキメラ動物は、導入遺伝子配列が欠失しているか、または導入配列を含有してはいるが導入配列を発現できる子孫細胞を生成する能力が欠失している生殖細胞を有すことがわかっている（エバンスら、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂ、　Ｓｙｍｐ、Ｑｕａｎｔ、Ｂｉｏｌ、５０　：　６８５〜６８９　（１９８５）　：スチニアートら、ＥＭＢＯＪ、４：３７０１〜３７０９　（１９８５）：Ｏバートソン（Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ、　Ｌ、　）ら、Ｎａｔｕｒｅ　（１９８６）　：これら文献を、参照のため本明細書中に引用する）。

ＥＳ細胞はインビトロで増殖させることができるので、そのような細胞を体細胞遺伝学の技術を用いて操作することができる。それゆえ、変異を有するＥＳ細胞を選択することが可能である（ｈｐｒｔ遺伝子（ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼをコードする）中におけるように（ツーパー（Ｈｏｏｐｅｒ、　Ｍ。

）ら、Ｎａｔｕｒｅ　３２６　：２９２〜２９５　（１９８７）；キ、−ン（Ｋｕｅｈｎ、Ｍ、　Ｒ。

）ら、Ｎａｔｕｒｅ　３２６　：　２９５〜２９８　（１９８７）））、ついで、そのように選択した細胞を用いて活性なＨＰＲＴ酵素を発現することのできないキメラまたはトランスジェニックマウスを産生ずることができ、それゆえ疾患の動物モデルを作成することができる（ＨＰＲＴ欠損を特徴とするレツクス・ナイハン症候群のように）（ドエチｓマン（ＤｏｅｔｓｃｈＩＩｌａｎ、　Ｔ、　）ら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、ｓｃｉ、　（ＩＪＳＡ）８５　：　８５８３〜８５８７　（１９８８）’）。

上記で示したように、同系交配によってキメラ動物（生殖細胞が導入遺伝子配列を含有する）からトランスジェニック動物を生成することが可能である。

上記方法は、トランスフェクションしたＥＳ細胞を胚盤胞中に導入する前に所望の遺伝子変化についてスクリーニングすることができる。しかしながら、これら方法の欠点は、ベクターの組み込みの部位または性質を制御することができないことである。

■、キメラおよびトランスジェニック動物の産生：キメラおよびトランスジェニック動物を産生ずるための上記方法に付随する欠点のため、研究者は、そのような動物を産生ずることのできる別の方法を明らかにすることを試みるようになった。

たとえば、ゴスラー（Ｇｏｓｓｌｅｒ、　Ａ、　）らは、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｎｐｔｌＩ遺伝子）を含有するように修飾したプラスミドベクターを用いて培養中のＥＳ細胞をトランスフェクションすることを記載している。

ｎｐｔＩＩ遺伝子の存在は、該プラスミドによりトランスフェクシヨンしたＥＳ細胞に抗生物質Ｇ４１８に対する耐性を付与する（ゴスラーら、Ｐｒｏｃ−Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、（ＬＩＳＡ）８３　：　９０６５〜９０６９　（１９８６）　、該文献を参照のため本明細書中に引用する）。該プラスミドを受容しＧ４１８に対して耐性となったキメラ動物は、該ベクターが染色体中に組み込まれていることがわかった。

タカハン（Ｔａｋａｈａｓｈｉ、　Ｙ、　）らは、鳥類クリスタリン遺伝子を発現するキメラマウス細胞を産生ずるためのプラスミドの使用を記載している（Ｄｅｖｅｌｏｐｉ＋ｅｎｔ１０２　：　２５８〜２６９　（１９８８）　、参照のため本明細書中に引用する）。この鳥類遺伝子をｎｐｔＩＩ遺伝子を含有するプラスミド中に組み込んだ。得られたキメラ動物は、この鳥類遺伝子を発現することがわかった。

Ｖ　体細胞中への遺伝子配列の導入ＤＮＡを体細胞中に導入して変異（キメラ）細胞株を生成した。原栄養細胞株を産生ずるため、ｈｐｒｔ欠失チャイニーズノ＼ムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞をＣＨＯｈｐｒｔ遺伝子でトランスフオームした（グラフ（Ｇｒａｆ、　Ｌ、　Ｈ，）ら、ＳＯｍａｔ、ｃｅｌｌ　Ｇｅｎｅｔ、５　：１０３１〜１０４４　（１９７９））　。フオルガ−（ＦｏＬｇｅｒ）らは、培養哺乳動物細胞の核中にマイクロインジェクションしたチミジンキナーゼ遺伝子（ｔｋ遺伝子）の運命を調べた。受容細胞は、細胞ゲノムの１または幾つかの部位にコンカテマーとして組み込まれた１〜１００コピーの導入遺伝子配列を含有することがわかった（フオルガーら、Ｍｏ１ｅｃ、　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ２：　１３７２〜１３８７　（１９８２））。ＤＮＡを媒体にしたＲＮＡポリメラーゼＩＩ遺伝子のシリアンハムスター細胞中へのトランスフォーメーションもまた報告されティる（イングルズ（Ｉ　ｎｇｌｅｓ、　Ｃ，）ら、Ｍｏ１ｅｃ、　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　２　：　６６６〜６７３　（１９８２）　）。

宿主にネオマイシン耐性およびグアノシンホスホトランスフェラーゼ活性を付与するプラスミドをチャイニーズハムスター卵巣細胞中にトランスフェクションして新規な細胞株が得られている（ロブソン（Ｒｏｂｓｏｎ、　Ｃ，Ｎ、　）ら、Ｍｕｔａｔ−Ｒｅ５．１６３　：２０１〜２０８　（１９８６））。

■　癌遺伝子および腫瘍抑制遺伝子癌が生じる一つの機構は、化学的または放射性の発癌剤に細胞が暴露されることによるものである。そのような暴露は、動物細胞のゲノム中に存在する重要な遺伝子のＤＮＡ配列に損傷を与える。もしもこの損傷が遺伝子発現における障害または変異遺伝子産物の生成となった場合には、細胞は増殖し続け、最終的に腫瘍の生成となる。

そのような重要な遺伝子の１つのクラスは、「癌遺伝子」と呼ばれている。癌遺伝子は、天然には「不活化した」状態にあるが、ＤＮＡ損傷の結果、腫瘍形成（すなわち腫瘍の生成）を誘発し得る「活性化」状態に変化した遺伝子である。

癌遺伝子は、ヒト腫瘍の１５〜２０％において同定されている。癌遺伝子の産物（「癌タンパク質（ｏｎｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ）　Ｊ　）は、細胞内での位置に従って２つの大きなりラスに分けることができる。

細胞の細胞質中で機能する癌遺伝子産物は、容易に同定できる生化学的または生物学的活性を有する（グリーン（Ｇｒｅｅｎ、Ｍ、　Ｒ，）　、Ｃｅ１ｌ　５６　：　１〜３　（１９８９））。細胞の核内で機能する産物は、特徴付けるのが一層困難である。幾つかの核性癌タンパク賀（ＥＪＡおよびｍｙｃなど）は転写制御活性を有し、細胞遺伝子の転写における活性化によってその活性を媒介していると思われる（キックストン（Ｋｉｎｇｓｔｏｎ、Ｒ，Ｅ、）　、Ｃｅ１ｌ　４１　：　３〜５　（１９８５）ン。他の核性癌タンパク質は、活性の複合配列（ｃｏｍｐｌｅｘ　ａｒｒａｙ　ｏｆ　ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ）　（ＤＮＡ結合活性、ウィルスＤＮＡ合成を開始する能力、ＡＴＰアーゼ活性、ヘリカーゼ活性、および転写制御活性など）を有すると思われる（グリーン、Ｃｅ１１５５：ｌ〜３（１９８９））。

変異癌遺伝子の生成は、腫瘍生成に必要な条件の一つにすぎない：腫瘍形成にはまた、第二のクラスの重要な遺伝子：「癌抑制遺伝子」または「腫瘍抑制遺伝子」の不活化をも必要とすると思われる。天然の状態では、これら遺伝子は細胞増殖を抑制するように働く。そのような遺伝子が損傷すると、この抑制が喪失し、それゆえ腫瘍形成となる。それゆえ、細胞増殖の抑制解除（ｄｅｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）は、癌遺伝子の活性化または腫瘍抑制遺伝子の不活化のいずれかによって媒介される（ワインバーブ（Ｗｅｉｎｂｅｒｇ、　Ｒ，Ａ、　）　、５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ａ＋ｅｒ、　、　１９８８年９月号、４４〜５１頁）。

癌遺伝子と腫瘍抑制遺伝子とは、基本的に識別される特徴的性質を有する。これまでに同定されている癌遺伝子は体細胞にのみ生じ、それゆえ、宿主動物の生殖系列にその作用を伝達することはできない。対照的に、腫瘍抑制遺伝子の変異は生殖系列細胞でも同定されており、それゆえ動物の子孫に伝達され得る。

遺伝性の癌の古典的例は、小児における網膜芽腫である。網膜芽腫の発生率は、腫瘍抑制遺伝子、網膜芽腫（ＲＢ）遺伝子により決定される（ワインバーブ、５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ａｌｌ１ｅｒ、　、　１９８８年９月号、４４〜５１頁）、ハンセン（Ｈａｎｓｅｎ　ＭＦ、）ら、Ｔｒｅｎｄｓ　Ｇｅｎｅｔ、４　：　１２５〜１２８　（１９８８））、ＲＢ対立遺伝子の一方に病変をもって生まれた個体は、小児の初期における網膜芽腫の発症の素因を有する（ワインバーブ、５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ａｍｅｒ、　、　１９８８年９月号、４４〜５１頁）：ハンセンら、Ｔｒｅｎｄｓ　Ｇｅｎｅｔ、４　：　１２５〜１２８　（１９８８））ｏこれら感受性個体の体細胞の一つにおける第二のＲＢ対立遺伝子の不活化または変異は、腫瘍生成に導く分子的事象であると思われる（カベニー（Ｃａｖｅｎｅｅ、　Ｗ、　Ｋ。

）ら、Ｎａｔｕｒｅ　３０５　：　７７９〜７８４　（１９８３）：フレンド（Ｆ　ｒｉｅｎｄ、　Ｓ　。

Ｈ）ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、（ＵＳＡ）　８４　：　９０５９〜９０６３　（１９８７）　）。

ＲＢ腫瘍抑制遺伝子は、ヒト第１３染色体に局在している。変異は、罹患個体の生殖系列により容易に伝達される（カベニーら、Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌ、　Ｊ　、　Ｍｅｄ、　３１４１２０１〜１２０７　（１９８６））。この腫瘍抑制遺伝子の天然に存在する２つの対立遺伝子の一方のみに変異を有する個体は、網膜芽腫に対する素因を有する。しかしながら、腫瘍形成にはこれら２つの対立遺伝子の第二の不活化を必要とする（クヌドソン（Ｋｎｕｄｓｏｎ、　Ａ、　Ｇ、　）　、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、（ＵＳＡ）６８・８２０〜８２３　（１９７１）　）。

第二の腫瘍抑制遺伝子はｐ５３遺伝子である（グリーン、Ｃｅ１１５６・１〜３（１９８９）；モワット（Ｍｎｗａｔ）ら、Ｎａｔｕｒｅ　３１４　：　６３３〜６３６　（１９８５））。ｐ５３遺伝子によってコードされるタンパク質は、ＳＶ４０ラージＴ抗原およびアデノウィルスＥＩＢ　５５ｋｄタンパク質の両方と安定な複合体を生成する核性タンパク質である。ｐ５３遺伝子産物は、これらタンパク質と結合することによって不活化される。

最初、ｐ５３遺伝子は、主要な醤歯動物細胞を不死化することができ、ｒａｓ癌遺伝子と共働してトランスフォーメーションを起こすことができるため、腫瘍抑制遺伝子としてよりもむしろ癌遺伝子と考えられた。その後の研究により、これら初期の実験に用いられたｐ５３遺伝子が、正常なｐ５３遺伝子の変異対立遺伝子であることが明らかになった（グリーン、Ｃｅ１ｌ　５６・１〜３　（１９８９）　）。

それゆえ、ｐ５３遺伝子は癌遺伝子であるよりもむしろ腫瘍抑制遺伝子である。

ｐ５３遺伝子の多数の位置のどこに変異が起こっても、ｐ５３遺伝子産物のトランスフオーム能の活性化となる（エリャフ（Ｅ　１ｉｙａｈｕ）ら、Ｎａｔｕｒｅ３１２：６４６〜６４９　（１９８４）：フィンレイ（Ｆ　１ｎｌａｙ）ら、Ｍｏ１ｅｃ、　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　８　：　５３１〜５３９　（１９８８））。このことは、ｐ５３トランスフオーム活性の活性化が正常なｐ５３活性の不活化によるものであることを示唆している（グリーン、Ｃｅ１ｌ　５６　：　１〜３　（１９８９））。

ｐ５３遺伝子は、結腸直腸癌腫において役割を有するようにいわれている（ベーカ−（Ｂａｋｅｒ、Ｓｊ、）　、５ｃｉｅｎｃｅ　２４４　：　２１７〜２２１　（１９８９））、研究の示すところによれば、結腸直腸癌腫の７５％以上において第１７染色体の短腕の対立遺伝子欠失が起こっている。欠失している領域は、その後、ｐ５３遺伝子座を包含していることがわかった（ベーカーら、５ｃｉｅｎｃｅ　２４４　：　２１７〜２２１　（１９８９））。この領域の欠失は、（良性の）腺癌期から（悪性の）癌期への移行の目印となることがわかった（フォーゲルスタイン（Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ、　Ｂ、　）ら、Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌ、Ｊ、Ｍｅｄ、３１９：５２５　（１９８８））。

第１７染色体における同様の欠失が、乳癌および肺癌を含む広範囲の癌において同定されている（マツケイ（Ｍａｃｋａｙ、　Ｊ、）　、Ｌａｎｃｅｔ　ｉｉ：１３８４　（１９８８）　：ノエームズ（Ｊ　ａｗｅｓ、　Ｃ，Ｄ、　）ら、Ｃａｎｃ、Ｒｅｓ、４８：５５４６　（１９８８）；ヤコタ（Ｙａｋｏｔａ、　Ｊ　、　）ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、（ＵＳＡ）８４　：　９２５２　（１９８７）、トグチダ（Ｔｏｇｕｃｈｉｄａ）ら、Ｃａｎｃ、Ｒｅｓ、４８　：　３９３９　（１９８８））ｏ　ｐ５３対立遺伝子の喪失に加えて、ニグロ（Ｎｉｇｒｏ）ら（Ｎａｔｕｒｅ　３４２　：　７０５〜７０８　（１９８９））は、種々のヒト腫瘍（脳、直腸、乳、肺）中の単一の残留ｐ５３対立遺伝子が点変異を担い、これが腫瘍形成となることを示している。フィーロン（Ｆ　ｅａｒｏｎ）らは（Ｃｅｌｌ　６１　：　７５９〜７６７　（１９９０））　、完全に腫瘍形成性の表現型のためには、ｐ５３対立遺伝子における点変異および欠失の両方が必要であるという仮定をたてている。これら所見は、ｐ５３遺伝子が多くのタイプの癌において役割を有していることを示唆している。

■　結論上記技術の応用は、古典的な遺伝学によっては産生ずることのできない動物を産生ずる可能性を有する。たとえば、ヒト疾１！、（ＡＩＤＳ、１！尿病、癌など）に罹っていてそのような疾患の治療を解明するのに価値のある動物を産生ずることがてきる。キメラおよびトランスジェニック動物は、天然の遺伝子発現の解明手段（ｐｒｏｂｅｓ）として実質的な用途を有する。

レダー（Ｌｅｄｅｒ、　Ｐ、　）らは（米国特許第４．７３６．８６６号）、外生的に加えた活性化癌遺伝子配列を有する細胞を含有するトランスジエニ・ツク非ヒト補乳動物の産生を開示している。これら動物は発癌物質をアッセイするのに有用であると開示されているが、加えた癌遺伝子配列の動物内での正確な位置および構造：嘘わかっておらず、実験的に制御することはできない。それゆえ、これら動物の発癌モデルとしての価値は有意に損なわれる。

上記技術の成功にも拘わらず、これら方法は、腫瘍形成の開始に係る条件を研究することができ、適当な抗腫瘍剤および治療法を開発する手段として使用することのできるモデルトランスジェニック動物の開発に至っていない。確かに、不発明以前には、癌遺伝子および「重要な（ｃｒｉｔｉｃａｌ）　Ｊ遺伝子における変異を有するトランスジェニックまたはキメラ動物の研究は、腫瘍抑制遺伝子の染色体性対立遺伝子中に変異を有する生存可能な動物を産生ずることは可能ではないことを示唆していた。そのような動物は生存することができないか、または生存して成熟することはできないと思われていた。ソリアノ（Ｓ　ｏｒｉａｎｏ、　Ｐ　、　）ら、Ｃｅ１１６４　：　６９３〜７０２　（１９９１）Ｃｃ−ｓｒｃｌ　；マ・ンクマホン（ＭｃＭａｈｏｎ−Ａ）およびプラノドリー、Ｃｅ１ｌ　６２　：　１０７３〜１０８５　（１９９０）　［Ｗｎｔ−１］；：Ｉラー（Ｋｏｌｌｅｒ、　Ｂ、　）ら、５ｃｉｅｎｃｅ　２４８　：１２２７〜１２３０（１９９０）［ＭＨＣ−ＩＦ　：チブルウイッツ（Ｔｙｂｕｌｅｖｉｃｚ、　Ｖ、　Ｌ、　Ｊ、）　、Ｃｅ１１６５　：　１１５３〜１１６４　（１９９１）［ｃ−ａｂｌコ　；ムセンスキー（Ｍｕｃｅｎｓｋｉ、Ｍ、Ｌ、）　、Ｃｅ１ｌ　６５　：　６７７〜６９０　（１９９１）　［ｃ−ｍｙｂ］参照。

しかしながら、癌の素因を有する動物を得ることができれば、癌の理解が一層容易になるであろう：それら動物は、食物、廃棄製品等の中に含まれる発癌剤の存在をアッセイするのに用いることができるであろう：それら動物はまた、癌を抑制または予防することのできる剤を同定するのに用いることもできるであろう。

それゆえ、そのような動物は極めて望ましい。本発明は、そのような動物、その製法およびその使用法を提供する。

図面の簡単な説明図１は、本発明のトランスジェニック動物の構築を容易にするために、１１エクソンｐ５３遺伝子のエクソン２〜１０に広がる３、７−ｋｂ断片に施した修飾を示す。

図２は、マウス胚幹細胞中のｐ５３遺伝子を首尾よく不活化するのに使用するターゲティング構築物の構造を示す。５゛および３°を付した矢印は、耐性幹細胞コロニーをＰＣＲによってスクリーニングするのに使用するオリゴヌクレオチド図３は、２つの構築胚幹細胞（１および２）および野性型（ｗｔ）細胞中に存在するｐ５３対立遺伝子の比較サザーンプロットを示す。

図４は、Ｆ＋　［１２９ｘＣ５７ＢＬ／６］キメラマウスの子孫の尾ＤＮＡのサザーンプロット分析を示す。この分析は、マウスの子ｐ１およびｐ３がｎｅｏ遺伝子にハイブリダイズするＤＮＡを含有しており、それゆえ変異したｐ５３構築物を含有していることを明らかにしている。「＋」は陽性コントロール（すなわち、破砕されたｐ５３遺伝子を有する胚幹細胞）を示し、「−」は陰性コントロール（すなわち、正常マウスＤＮＡ）を示す。

図５は、細胞のｐ５３対立遺伝子中に所望の変異を生成するのに使用する手順を示す。

図６Ａは、ｐ５３　ｍＲＮＡのＰＣＲ増幅に使用するプライマーの位置および方向を示す。図６Ｂは、ＰＣＲ増幅の結果を示す。ゲルには１９のレーンが示されており、そのうち最後のもの（Ｍ）は分子量マーカーを含んでいる。最初の１８のレーンは、それぞれ６つの異なるペアのＰＣＲプライマー（１および４ａニアおよび１０；Ｂ−アクチンコントロール；４ｂおよび１０；１および１０：並びに４ｂおよび６）を用いた、正常マウス（＋＋）、ｐ５３ヘテロ接合体マウス（＋−）　、およびｐ５３ホモ接合体マウスで得られた増幅を示す。バンドの出現は、これらプライマーベアが調製物中に存在するｍＲＮＡ種のセグメントを増幅したことを示している。

発明の要約本発明は、癌に対する素因を付与するように前辺て定められた特定の所望な変化を有する、所望の非ヒト動物または動物（ヒトを含む）細胞を提供する。詳しくは、本発明は、ｐ５３遺伝子、ｒｂ遺伝子等の腫瘍抑制遺伝子、最も好ましくはｐ５３遺伝子、の２つの対立遺伝子の少なくとも一方に欠陥のある、遺伝的に変化した非ヒト動物（最も好ましくはマウス）、または培養液中の細胞（非ヒトまたはヒト）に関する。これら腫瘍抑制対立遺伝子の少な（とも一方の不活化により、腫瘍誘発に対して高い感受性を有する動物が得られる。このタイプの遺伝的に変化したマウスは、遺伝性の癌のための有用なモデルとしておよび発癌研究用の試験動物として用いることができる。本発明はさらに、そのような非ヒト動物または動物細胞、およびその子孫の研究および医学における使用にも関する。

詳しくは、本発明は、ゲノムが腫瘍抑制遺伝子（とりわけｐ５３遺伝子）の２つの染色体性対立遺伝子を含み、これら２つの対立遺伝子のうち少なくとも一方に変異を含むトランスジェニックまたはキメラ動物細胞、またはこの細胞の子孫を提供する。

本発明は、対立遺伝子のうちの一方が正常な腫瘍抑制遺伝子産物を発現する上記動物細胞の態様を含む。

本発明は、上記動物細胞がヒト細胞、または非ヒト動物の細胞である態様を含む。本発明は、該細胞が胚幹細胞であり、とりわけ腫瘍抑制遺伝子がｐ５３遺伝子であり、胚幹細胞がＡＴＣＣＣＲＬ１０６３１である態様を含む。

本発明はまた、ゲノムが腫瘍抑制遺伝子の２つの染色体性対立遺伝子を含み、これら２つの対立遺伝子のうち少なくとも一方が変異を有している動物細胞を有する非ヒトトランスジェニックまたはキメラ動物、または胚期にある（好ましくは、１細胞、または受精卵細胞期、および一般に約８細胞期よりも遅くない）該動物の子孫、または該動物の先祖をも含む。

本発明はまた、非ヒト動物の腫瘍抑制遺伝子がｐ５３遺伝子である態様をも含む。

本発明はまた、非ヒト動物の動物細胞がヒト細胞、または（該非ヒト動物と同じ種または異なる種の）非ヒト動物の細胞である態様にも関する。

本発明はまた、非ヒト動物の動物細胞が生殖細胞または体細胞である態様にも関する。

本発明はまた、非ヒト動物の動物細胞が胚幹細胞（とりわけ、胚幹細胞、ＡＴＣＣＣＲＬ１０６３１）である態様にも関する。

本発明はさらに、腫瘍抑制遺伝子の存在または発現に帰することのできる動物細胞の特性に影響を及ぼし得ると思われる剤の存在を同定する方法を提供し、該方法は、（Ａ）所定量の核剤を細胞培養液中にある動物細胞に投与し、該細胞は、腫瘍抑制遺伝子の２つの染色体性対立遺伝子を含むゲノムを有し、これら２つの対立遺伝子のうち少なくとも一方が変異を含んでおり：（Ｂ）該細胞培養を投与後の所望の時間保持し：（Ｃ）核剤の投与が、該腫瘍抑制遺伝子の対立遺伝子の存在または発現に帰することのできる該動物細胞の特性に影響を及ぼしたが否かを決定することを特徴とする。

とりわけ、本発明は、腫瘍抑制遺伝子がｐ５３遺伝子である上記方法の態様を含む。

本発明はまた、核剤が該動物細胞の腫瘍形成能を増大させ得ると思われるこの方法の態様、核剤が該動物細胞の腫瘍形成能を減少させ得ると思われるこの方法の態様、該動物細胞がヒト細胞であるこの方法の態様、および該動物細胞が非ヒト動物細胞（胚幹細胞など、およびとりわけ胚幹細胞、ＡＴＣＣＣＲＬ１０６３１）であるこの方法の態様をも含む。

本発明はまた、腫瘍抑制遺伝子の存在または発現に帰することのできる動物細胞の特性に影響を及ぼし得ると思われる剤の存在を同定する方法をも提供し、該方法は、（Ａ）所定量の核剤を動物に投与し、該動物は、ゲノムが腫瘍抑制遺伝子の２つの染色体性対立遺伝子を含む細胞を有し、これら２つの対立遺伝子のうち少な（とも一方が変異を含んでおり：（Ｂ）該動物を投与後の所望の時間保持し。

（Ｃ）核剤の投与が、該腫瘍抑制遺伝子の対立遺伝子の存在または発現に帰することのできる該細胞の特性に影響を及ぼしたか否かを決定することを特徴とする。

とりわけ、本発明は腫瘍抑制遺伝子がｐ５３遺伝子である上記方法の態様を含む。

本発明はまた、該動物および該動物細胞が同じ種または異なる種であるこの方法の態様を含む。

本発明はさらに、ヒトまたは非ヒト動物の細胞のゲノムを変化させることを特徴とする遺伝子治療の方法であって、該細胞は腫瘍抑制遺伝子の２つの染色体性対立遺伝子を含むゲノムを有し、これら２つの対立遺伝子の少なくとも一方が変異を有し、そのため該対立遺伝子の少な（とも一方が正常な腫瘍抑制遺伝子産物を発現する細胞を生成する方法を提供する。

とりわけ、本発明は、腫瘍抑制遺伝子がｐ５３遺伝子である上記遺伝子治療方法の態様を含む。

好ましい態様の記載よく知られているように、ヒトおよび動物（とりわけ、醤歯類（すなわち、マス９、ラット、ハムスター等）、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、魚、ブタ、ウシおよび非ヒト類火！！りの細胞は「二倍体」細胞であり、それゆえ天然にはそのゲノムの各遺伝子の２つのコピー（「対立遺伝子」）を含む。細胞の「ゲノム」は、その遺伝性のＤＮＡ　（染色体性かまたは非染色体性（すなわち、エピソーム性、ウィルス性等））のすべてからなる。遺伝子のこれら２つの対立遺伝子の一方は動物または細胞の母方の親から提供され；他方のセットはその父方の親から提供される。ヒトおよび動物細胞の二倍体の性質は、デロバーチス（ＤｅＲｏｂｅｒｔ　ｉｓ、　Ｅ、　Ｄ、　Ｐ、　）ら（Ｃｅｌ　ｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、第６版、ソーンダース・カンパニー　−（Ｗ、Ｂ、５ａｕｎｄｅｒｓ　Ｃｏｍｐａｎｙ）、フィラデルフィア、（１９７５））、および細胞生物学の他の同様の論文に記載されている。

ヒトの癌は複数の過程を経て発症し、正常細胞が悪性の表現型を有する細胞に変換するには複数の変化が起こる必要があることを示している。関係する遺伝子の一つのクラスは細胞の癌遺伝子である。変異によって活性化されるかまたは不適当に発現されると、優性に作用する癌遺伝子は正常な細胞制御機構を働くな（させ、抑制のない細胞増殖を促進する。癌の発症において同様に重要と思われる細胞遺伝子の新たに認識されたクラスは、腫瘍抑制遺伝子、しばしば「抗癌遺伝子」とよばれるものを含む。これら遺伝子は細胞増殖を低下させるように機能する；該遺伝子の正常な機能の不活化は、腫瘍細胞の発展における共通の適性であると思われる。細胞中での機能を喪失するには、腫瘍抑制遺伝子の両方の対立遺伝子が不活化される必要がある。一方の対立遺伝子（すなわち、２つの染色体の一方における遺伝子コピー）の不活化は、ある事象が生存対立遺伝子を損なう確率を増加させ、結果として宿主を腫瘍誘発に対して一層感受性にする。

本発明は、腫瘍抑制遺伝子の少なくとも一つの変異した染色体性対立遺伝子（および、好ましい嬰様においては、該遺伝子の一つの正常な対立遺伝子）を含む非ヒトトランスジＪニックおよびキメラ動物および細胞の産生に関する。本発明の細胞および非ヒト動物がその染色体性対立遺伝子の両方に変異を有する場合には、そのような変異は同じか、または互いに異なっていてよい。

よく知られているように、対立遺伝子は、細胞中で働く天然の過程により発現することができる。対立遺伝子の発現により、遺伝子産物が生成する。本明細書において使用する「対立遺伝子ｊなる語は、特定遺伝子の発現に影響を及ぼすあらゆるヌクレオチド配列を示す。それゆえ、対立遺伝子は、該遺伝子のエンＩ＼ンサー、プロモーター、プロセシング、介在、コードまたは停止配列または領域、または遺伝子産物を安定化する配列、またはそのｍＲＮＡなどをいう。

遺伝子の対立遺伝子は、（］）細胞または動物中で発現されない、（２）対立遺伝子の発現が、該遺伝子の正常な対立遺伝子の発現に関して変化している、または（３）該対立遺伝子が遺伝子産物を発現するが、該遺伝子産物は該遺伝子の正常な対立遺伝子の遺伝子産物と比べて変化した構造、活性、または特性を有する場合に変異していると言及される。

それゆえ、本明細書において使用する「変異」または「変異した」なる語は、該対立遺伝子のヌクレオチド配列または領域の「正常な」または「野性型の」ヌクレオチド配列における変化を示すものとして用いる。本明細書において使用する「正常な」および「野性型の」なる語は同意語であり、天然において典型的に認められるヌクレオチド配列を意味する。それゆえ、「変異した」および「正常な」なる語は互いに関連して定義される。細胞がヌクレオチド配列の異なる遺伝子の２つの染色体性対立遺伝子を有する場合、本明細書において使用する語の意味においてこれら対立遺伝子の少なくとも一方は「変異した」対立遺伝子である。

「正常な腫瘍抑制遺伝子産物」は、「正常な」腫瘍抑制遺伝子によって発現された遺伝子産物である。

変異は［隠れて（ｃｒｙｐｔｉｃ）Ｊいてもよい。隠れた変異は、該変異した遺伝子の発現および該発現遺伝子産物の活性または機能のいずれにも影響を及ぼさない。隠れた変異はヌクレオチド配列分析によって検出することができる。隠れた変異の例としては、発現された遺伝子産物のアミノ酸配列に変化を生じない変異、並びに該発現遺伝子産物中の特定の位置において等価なアミノ酸の置換となる変異が挙げられる。最も好ましくは、変異は「隠れていない（ｎｏｎ−ｃｒｙｐｔｉｃ）Ｊものであり、それゆえ、対立遺伝子のヌクレオチド配列における変化（対立遺伝子の発現または活性または機能のいずれかを検出可能に変化させる）を導入するであろう。本明細書において使用する「対立遺伝子の発現を検出可能に変化させる変異」とは、該対立遺伝子が転写され、プロセシングされまたは翻訳される程度に影響を及ぼすヌクレオチド配列のあらゆる変化を意味する。

そのような変化は、たとえば、該対立遺伝子のエンハンサ−、プロモーター、コードまたは停止領域、該遺伝子産物を安定化する変異、またはそのｍＲＮＡ等におけるものであってよい。本明細書において使用する「対立遺伝子の活性を検出可能に変化させる変異」とは、該発現された遺伝子産物が該遺伝子産物の機能を媒介する能力を変化させるヌクレオチド配列における変化を意味する。そのような変異としては、発現された産物の１または２以上の機能を減少または不活化させる変化が挙げられる。重要なことに、そのような変異にはまた、該遺伝子産物の機能（たとえば、触媒活性または結合活性）を媒介する該遺伝子産物の能力を増大させる結果となる変化も含まれる。本明細書において使用する「対立遺伝子の機能を検出可能に変化させる変異」とは、結合分子（結合タンパク質など）が該対立遺伝子に特異的に結合する能力を変化させるヌクレオチド配列における変化を意味する。

種々の広範囲の方法（変異原性化合物による処理、自発分離、挿入による不活化、部位特異的挿入、欠失または置換、相同的組換え等）のいずれを用いても、本発明による変異を生成することができる。上２のように、そのような変異が多数知られており、変異はンークエンシング、腫瘍形成性、腫瘍形成性に対するレジリエンス（ｒｅｓ　ｉ　Ｉ　１ｅｎｅｅ）　、結合活性等により容易に同定することができる（たとえば、エリャフら、Ｎａｔｕｒｅ　３１２：６４６〜６４９　（１９８４）：フインレイら、Ｍｏ１ｅｃ、Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、８：５３１〜５３９（］、９８８）；ニグロら、Ｎａｔｕｒｅ　３４２ニア０５〜７０８　（１９８９）、すべて参照のため本明細書中に引用する）。

対立遺伝子は、細胞がその祖先から受け継いだかまたは動物がその親から受け継いだ遺伝子の２つの対立遺伝子の一方であるかまたは一方を置換したものである場合に「染色体性」であると言及される。本明細書において使用するように、対立遺伝子が細胞中に存在する特定遺伝子の対立遺伝子の全数のコピー数を増加させる場合には、該対立遺伝子は「染色体性」ではない。

本発明に従って産生ずることのできる細胞には、「生殖系列」細胞および「体」細胞の両方が含まれる。生殖系列細胞は精子細胞または卵細胞、またはこれらの前駆体または先祖である。そのような細胞は、子孫の動物を生成する際にそのゲノム（変化した腫瘍抑制対立遺伝子を含む）を伝達する能力を有する。体細胞は、生殖系列細胞でない細胞である。そのような細胞は、「天然に存在する汚染物質を実質的に含んでいない」か、または同種または異種の動物中に存在していてよい。細胞、またはその前駆体または子孫細胞が、該細胞が天然に関連している組織（正常、腫瘍など）から精製された場合には、該細胞は「天然に存在する汚染物質を実質的に含んでいない」。２つの種が互いに交配して繁殖力のある子孫を産生ずることができる場合には、これら２つの種は同じであると言及される。

２つの種が交配して生存可能な子孫を産生ずることができないか、または繁殖力のある子孫を実質的に産生ずることができない場合には、これら２つの種は異なると言及される。

本発明は、あらゆる腫瘍抑制遺伝子のための細胞および非ヒト動物の生成を包含する。そのような遺伝子の例としては、ｒｂ遺伝子（ワインバーブ、５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ａｍｅｒ、　、１９８８年９月号、４４〜５１頁；ハンセンら、Ｔｒｅｎｄｓ　Ｇｅｎｅｔ、４　：１２５〜１２８　（１９８８））　、ウイルムス腫瘍に係る遺伝子（マイトランド（Ｍａ　ｉ　ｔ　ｌ　ａｎｄ、　Ｎ、Ｊ、　）ら、Ａｎｔｉｃａｎｃ、Ｒｅｓ、９：１４１７〜１４２６　（１９８９）ニジＥｌ−（Ｓｈａｗ、Ａ。

ｐ、　ｗ、）ら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ　３：１４３〜１５０（１９８８）：コバクス（Ｋｏｖａｃｓ、Ｇ、）ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、（ＵＳＡ）８５　：１５７１〜１５７５　（１９８８）：クマール（Ｋｕｍａｒ、Ｓ、）ら、Ｉｎｔ、Ｊ、Ｃａｎｃ、４０：４９９〜５０４　（１９８７）；７１／：／（Ａｌ　ｆｅｎ。

Ｄ、　Ｍ、　）ら、Ｃｌ１ｎ、Ｒｅｓ、３５：４１６Ａ（１９８７））およびｐ５３遺伝子（レイ：ｚ（Ｌａｎｅ、Ｄ、Ｐ、）ら、Ｇｅｎｅｓ　＆　Ｄｅｖｅｌｏｐ４：１〜８（１９９０））が挙げられる。しかしながら、本発明に従って他の腫瘍抑制遺伝子を用いることもできる（ヒチ（Ｈｉ　ｔ　ｉ、　Ａ、　Ｌ、　）　、Ｍｏ　ｌ　ｅｃ。

Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、９＋４７２２〜４７３０　（１９８９）：／’スチェ（Ｈａｓｔｉｅ、Ｎ、）、Ａｎｔｉｃａｎｃ、Ｒｅｓ、８：１０７４　（１９８８）：ボアダ（Ｂｏａｄａ、Ｍ、Ｂ、）、Ｏｎｃｏｌｏｇｉａ　１０：９〜３０（１９８７）、ガリ−ｒ−（Ｇａｌｌｉｅ、Ｂ、Ｌ、）、Ｊ、Ｃｅ１１．Ｂｉｏｃｈｅｍ、３２：２１５〜２２２　（１９８６）；アルド（Ａｌｔ、Ｆ、Ｗ、）ら、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒ、Ｈａｒｂ、Ｓｙｍｐ、Ｑｕａｎｔ、Ｂｉｏｌ、５１　：９３１〜９４２　（１９８６）：クヌドソン（Ｋｎｕｄｓｏｎ、Ａ、Ｇ、）　、Ｓｙｍｐ、Ｍｏ　ｌｅｃ、Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｍｏ１ｅｃ、Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ、Ｃａｎｃ、４０：６〜１３　（１９８５）：フルコルム（Ｍａ　１　ｃ　ｏ　１ｍ、Ｓ、　）　、Ｍ。

ｌｅｃ、Ｍｅｄ、１　：　７９〜９４　（１９８４）；　トリコリ（Ｔｒｉｃｏｌｉ、Ｊ。

）ら、Ａｍｅｒ、Ｊ、Ｈｕｍ、Ｇｅｎｅｔ、３６：１２１Ｓ　（１９８４）；すべで参照のため本明細書中に引用する）。

ｒｂ遺伝子およびｐ５３遺伝子が、本発明の好ましい腫瘍抑制遺伝子である。

ｒｂ遺伝子のｃＤＮＡおよびゲノム形はクローニングされている（フレンドら、Ｎａｔｕｒｅ　３２３：６４３　（１９８６）：　リー（Ｌｅ　ｅ、Ｗ、）　ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２３５：１３９４　（１９８７）；ファング（Ｆｕｎｇ、Ｙ）ら、Ｓｃｉ　ｅｎｃｅ　２３６　：１６５７　（１９８７）：ホンダ（Ｈｏｎｇ、Ｆ、）ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　（ＵＳＡ）８６　：　５５０２　（１９８９）、すべて参照のため本明細書中に引用する）。網膜芽腫の研究のための可能な方法および動物（トランスジェニックを含む）モデルがり−らのＷＯ９０１０５１８０（参照のため本明細書中に引用する）に論じられている。以下ではｐ５３腫瘍抑制遺伝子に関連して本発明を説明する。この遺伝子を操作することができること、およびそのような変異した対立遺伝子を有する非ヒトトランスジェニック動物を産まできることを、特定の変異対立遺伝子に関して説明する。しかしながら、本発明および本明細書中に開示した方法をｐ５３遺伝子中であらゆる可能な変異を生成するのに用いることができることを理解すべきである。とりわけ、本発明は、下記で説明するリーフラウメニ（Ｌｉ−Ｆｒａｕｍｅｎｉ）症候群に係るｐ５３遺伝子の特定の変異を有する動物細胞および非ヒトトランスジェニックまたはキメラ動物の産生を包含する。

１、ｐ５３遺伝子本発明は、ｐ５３遺伝子の天然に存在する２つのコピーのうち一方が変異（天然に存在するｐ５３５３遺伝子中の欠失、挿入、または置換など）によって非機能性となっている非ヒト動物または動物（ヒトを含む）細胞に関する。　正常なｐ５３遺伝子産物は腫瘍抑制タンパク質である（サガー（Ｓａｇｅｒ、Ｒ−）、５ｃｉｅｎｃｅ　２４６：１４０６〜１４１２　（１９８９）；フィンレイ、ＣｅＩＩ　５７：１０８３（１９８９）、ともに参照のため本明細書中に引用する）。

ｐ５３遺伝子の性質および特性についてはレイン（Ｌａｎｅ、Ｄ、）らによって概説されている（Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖｅｌ、４：１〜８　（１９９０）、参照のため本明細書中に引用する）。ｐ５３遺伝子は、フレンド赤白血病ウィルスのトランスフオーム作用に対して保護的な役割をする（ムンロエ（Ｍｕｎｒｏｅ、Ｄ、）ら、○ｎｃｏｇｅｎｅ　２：６２１　（１９８８））。ｐ５３遺伝子はまた、染色体の安定性、分化および老化、および細胞増殖においても役割を有Ｔると思われるけガー、５ｃｉｅｎｃｅ　２４６：１４０６−１４１２（１９８９））。

上記に示したように、ｐ５３遺伝子座における対立遺伝子欠失が結腸直腸癌腫において同定されている。ｐ５３遺伝子における変異はまた、脳、乳、および肺の腫瘍（細気管支癌、肺外小細胞癌（ｅｘｔｒａｐｕｌｍｏｎａｒｙ　ｓｍａｌｌ　ｃｅｌｌ　ｃａｒｃｉｎｏｍａＬ腺癌、小細胞癌（ｓｍａｌｌ　ｃｅｌｌｃａｒｃｉｎｏｍａＬ腺偏平上皮細胞癌（ａｄｅｎｏｓｑｕａｍｏｕｓ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、肺カルチノイド腫瘍（ｐｕｌｍｏｎａｒｙ　ｃａｒｃｉｎｏｉｄ　ｔｕｍｏｒｓ）を含む、および神経線維骨肉腫（ｎｅｕｒｏｆｉｂｒ。

ｓ　ａ　ｒ　ｃ　ｏｍａ）においてにグロら、Ｎａｔｕｒｅ　３４２ニア０５〜７０８（１９８９）；タカハシら、５ｃｉｅｎｃｅ　２４６：４９１〜４９４　（１９８９）））においても同定されている。そのような対立遺伝子欠失を有する殆どの腫瘍はｐ５３点変異を有しており、その結果、アミノ酸置換を起こしている。そのような変異はそのような対立遺伝子欠失を有する腫瘍に限られるものではな（、親の対立遺伝子を両方とも維持している幾つかの腫瘍においても起こる。腫瘍を生じるｐ５３遺伝子の変異は、ｐ５３遺伝子の最もよく保存されている配列と一致する４つの「ホットスポット（ｈｏｔ−ｓｐｏｔｓ）Ｊと関係しているにグロら、Ｎａｔｕｒｅ　３４２　：　７０５〜７０８　（１９８９）　、参照のため本明細書中に引用する）。

要約すると、ヒｈｐ５３遺伝子が腫瘍抑制遺伝子であるという確固とした証拠が今や存在する（ワインバーブ、５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ａｍｅｒ、、１９８８年９月号、４４〜５１頁）。上記ＲＢタンパク質と同じように、ｐ５３はＳＶ４０ラージＴ抗原と複合体を形成する核性タンパク質である（デカブリオら、Ｃｅ１１５４：２７５〜２８３　（１９８８）：クローフォード（Ｃｒａｖｆｏｒｄ、　Ｌ、　Ｖ、　）、Ｉ　ｎｔ、　Ｒｅｖ、Ｅｘｐｅｒ、Ｐａｔｈｏｌ、２５　：　１〜５０　（１９８３）　）　、これら２つのタンパク質がウィルス腫瘍抗原によって結合するとこれらタンパク質は不活化され、トランスフォーメーションに寄与すると思われる。ｐ５３遺伝子欠失は幾つかのマウス赤白血病細胞株で認められており、網膜芽腫におけるＲＢ遺伝子欠失を想起させる（モヮットら、Ｎａｔｕｒｅ　３１４　：　６３３−６３６　（１９８５）；チョウら、Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　６１：２７７７〜２７８１　（１９８７）：ヒックスら、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、６２　：　４７５２〜４７５５　（１９８８））。ヒト骨原性肉腫に由来する細胞株および腫瘍は、しばしばｐ５３遺伝子の著しい再配列（欠失を含む）を含んでいる（マスダ（Ｍａｓｕｄａ、Ｈ，）　、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　（ＵＳＡ）　８４　：　７７１６〜７７１９　（１９８７））。染色体１７ｐにおける対立遺伝子欠失は、結腸直腸癌腫の７５％以上で生じる（ベイカーら、５ｃｉｅｎｃｅ　２４４　：　２１７〜２２１　（１９８９））。

２つの腫瘍において、残りの非欠失ｐ５３対立遺伝子が、マウスｐ５３遺伝子で変異していることが以前にわかっている高度保存領域中に変異を有していることが示された（ベイカーら、５ｃｉｅｎｃｅ　２４４　＋　２１７〜２２１　（１９８９）　）。

染色体１７ｐにおけるヘテロ接合の喪失（ｌｏｓｓ　ｏｆ　ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｓｉｔｙ）が、小細胞肺癌腫の個体において高率で認められている（ヨコトら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｅａｄ、　Ｓｃｉ、（ＵＳＡ）８４：９２５２〜９５２６　（１９８７）；／’−バー（Ｈａｒｂｏｕｒ。

Ｊ、Ｗ、）ら５ｃｉｅｎｃｅ　２４１　：　３５３〜３５６　（１９８８））、ＨＬ−６０ヒト白血病細胞株においては、ｐ５３遺伝子中の主要な欠失およびｐ５３タンパク質の不在が認められている（ウォルフら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　（Ｕ　Ｓ　Ａ）　８２・７９０〜７９４　（１９８５））。これら結果は、機能性のｐ５３対立遺伝子の不在がヒトおよびマウスにおけるある種の形態の癌と高い相関があることを示しており、ｐ５３の腫瘍抑制的役割を強く示唆している。最後に、フィンレイら（Ｃｅｌｌ　５７　：　１０８３〜１０９３　（１９８９））は、最近、Ｅｌａおよび活性化ｒａｓとともにラット胚細胞をコトランスフェクシミンした後に野性型のマウスｐ５３遺伝子がインビトロでトランスフォーメーションを抑制することを示したが、このことは正常なｐ５３遺伝子の存在がトランスフォーメーションを抑制するように否定的に機能することを示している。

ｐ５３遺伝子のｃＤＮ、Ａおよびゲノム形はクローニングされている（ベニ力（Ｐｅｎｎｉｃａ、　Ｄ、　）ら、Ｖｉｒｏｌ、１３４　：　４７７〜４８２　（１９８４）；ジェンキンス（Ｊ　ｅｎｋｉｎｓ、　Ｊ　、　）ら、Ｎａｔｕｒｅ　３１２　：　６５１〜６５４　（１９８４）；オレン（Ｏｒｅｎ、　Ｍ、　）ら、ＥＭＢＯＪ、２　＋１６３３〜１６３９　（１９８３）；ザフトーハウリ（Ｚａｈｕｔ−Ｈｏｕｒｉ、　Ｒ，）ら、Ｎａｔｕｒｅ　３０６　：　５９４〜５９７　（１９８３）、すべて参照のため本明細書中に引用する）。

最近の知見によると、ｐ５３遺伝子の変異がリーフラウメニ症候群（肴なヒト遺伝疾患）の原因であることが示唆されている（マルキン（Ｍａｌｋｉｎ、　Ｄ、　）ら、５ｃｉｅｎｃｅ　２５０　：１２３３〜１２３８　（１９９０）：マルクス（Ｍａｒｘ、　Ｊ　、　）、５ｃｉｅｎｃｅ　２５０　：１２０９　（１９９０）　、ともに参照のため本明細書中に引用する）。この疾患に罹った個体は、幾つかの悪性腫瘍−乳癌腫、柔組織肉腫、脳腫瘍、骨肉腫、白血病、および副腎皮質癌に対して極めて感受性である。この疾患はまた、黒色腫、生殖腺細胞腫、並びに肺、膵臓および前立朦の癌腫を高い頻度で伴う　（リ　（Ｌｉ、Ｆ、Ｐ、）　ら、Ａｎｎ、　Ｉｎｔｅｒｎ、Ｍｅｄ、　７１　：　７４７　（１９６９）、バーチ（Ｂ　１ｒｃｈ、　Ｊ　、　Ｍ、　）ら、Ｊ、Ｃ１１ｎ、０ｎｃｏ１．８：５８３　（１９９０）　：バーチら、Ｂｒ１ｔ、Ｊ、Ｃａｎｃ、４９：３２５　（１９８４）：りら、Ｃａｎｅ、　Ｒｅｓ、　４８　：５３５８　（１９８８）：ウィリアムス（Ｗｉｌｌｉａｍｓ、　Ｗ、　Ｒ，）ら、Ｆａｍｉｌｉａｌ　Ｃａｎｃ、　、　ｌ　ｓｔ　Ｉ　ｎｔ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｎｆ、　１５１頁（カーガー、バーゼル、１９８５）；ストロング（Ｓｔｒｏｎｇ、　Ｌ、　Ｃ，）ら、Ｊ、Ｎａｔｌ、Ｃａｎｃ、Ｉｎ５ｔ、７９　：１２１３　（１９８７））。

リーフラウメニ症候群は、ｐ５３遺伝子のエクソン７中の特定のセットの変異を伴う（マルキ：／　（Ｍａｌｋｉｎ、　Ｄ、　）ら、５ｃｉｅｎｃｅ　２５０　：１２３３〜１２３８　（１９９０）、参照のため本明細書中に引用する）。リーフラウメニ症候群を引き起こす変異の配列および位置に関する知見により、本発明の方法を用いてこれら変異のいずれかを有する非ヒトトランスジェニック動物を産生ずることができる。

上記で示したように、そのような動物、および診断および遺伝子治療におけるその使用は本発明の態様である。

■　変異ｐ５３遺伝子産物と正常ｐ５３遺伝子産物との相互作用腫瘍形成には変異事象のカスケードが必要であると思われる。このカスケードには、ｌまたは２以上の癌遺伝子の活性化および１または２以上の腫瘍抑制遺伝子の不活化の両方が関与し、でいると思われる（ザガー、５ｃｉｅｎｃｅ　２４６　：１４０６〜１４１２　（１９８９）；フィアソ゛７　（Ｆｅａｒｓｏｎ、　Ｅ、　Ｒ，）ら、Ｃｅ］、１６１７５９〜７６７　（１９９０）　、ともに参照のため本明細書中に引用する）。確かに、少ムくとも４〜５の遺伝子にお＋する変異が悪性腫瘍の生成には必要であると思われる。

腫瘍生成のクローン的性質に関する研究は、腫瘍がモノクローナルな組成を有すること、それゆえ単一の先祖細胞のクローン的な増殖により生じることを示唆している（フィアソニ／ら、５ｃｉｅｎｃｅ　２４７　：　１９３〜１９７　（１９８７））。

機能的なｐ５３５３遺伝子の喪失（変異または欠失による）が結腸ｉｔｓ腫瘍の特性であることがわかっている（フィアソンら、Ｃｅ１ｌ　６１　：　７５９〜７６７　（１９９０））。

腫瘍抑制遺伝子の作用機構を説明する最も簡単なモデルは、悪性化には２つの別々の遺伝的事象が必要であるということである（すなわち、細胞中の両機能的ｐ５３対立遺伝子の欠失または変異による喪失）。天然の２つの対立遺伝子の一方のみの不活化は表現型がす・イ１ノントな劣性変異（第二の変異事象の不在下では悪性とはならない）を引き起こす。

変異したＩ〕５３遺伝子を含有するＤＮＡを舊歯類の細胞中に導入することにより、そのような細胞をトラ二ノスフォームできることが観察されている。このトランスフォーメーションは、変異したｐ５３遺伝子産物とｒａｓ癌遺伝子の遺伝子産物との共働作用によるものである。そのような細胞はまた正常なｐ５３遺伝子をも発瑠するので、ｐ５３対立遺伝子の一方のみの不活化は表現型がサイレントとならないことが提唱されている（フィアソンら、Ｃｅ１ｌ　６１　：　７５９〜７６７（１９９０））。正常ｐ５３遺伝子産物および変異したｐ５３遺伝子産物の両方の存在下でこれら細胞がトランスフォーメーションを行い得ることは、これら２つの遺伝子産物力湘互作用してその作用を発揮することを示唆している。ｐ５３変異／′正常対立遺伝子相互作用の混合優性−劣性特性の一つの説明は、活性にはオリゴマー化が必要であること、および変異および正常ｐ５３対立遺伝子の両方を有する細胞中に形成されたオリゴマーがこれら対立遺伝子の遺伝子産物の混合物を含有することである（エリャフ（Ｅ　１ｉｙａｈｕ）ら、○ｎｃｏｇｅｎｅ　３　：　３１３〜３２１　（１９８８）：クライス（Ｋｒａｉｓｓ）ら、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、６２：４７３７〜４７４４　（１９８８）　）。そのような混合オリゴマー中には変異したｐ５３遺伝子産物が存在するため、該オリゴマーは腫瘍形成を抑制する能力が減少していることが予期される（フィアソンら、Ｃｅ１ｌ　６１　：　７５９〜７６７　（１９９０）　、参照のため本明細書中に引用する）。この説明と一致するのは、変異ｐ５３遺伝子産物が野性型ｐ５３遺伝子産物とヘテロダイマーを形成するという知見である（フィンレイら、Ｃｅ１ｌ　５７　：１０８３　（１９８９））。

トランスジェニック動物は、腫瘍抑制遺伝子の生物学的意義を調べるのに用いることができる（カペツチ（Ｃａｐｅｃｃｈｉ、Ｍ、Ｒ，）　、５ｃｉｅｎｃｅ　２４４　：１２８８−１２９２　（１９８９））、ラビゲール（Ｌａｖｉｇｕｅｕｒ、　Ａ、　）らは、内生の２つの野性型ｐ５３対立遺伝子に加えて単一の変異ｐ５３遺伝子を加えたトランスジェニックマウスを構築した。このマウスおよびその子孫は、加えたｐ５３遺伝子を過剰発現した（ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｅｄ）。このマウスは、肺、骨、およびリンパ腫瘍を高い頻度で有することがわかった（ラビゲールら、Ｍｏ１ｅｃ、　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏ］、　９・３９８２〜３９９１　（１９８９））。これらマウスにおける高レベルの変異ｐ５３は、調べた１１２匹のマウスのうち２２匹で腫瘍が生成する結果となった。変異ｐ５３遺伝子産物の過剰発現のため、およびこの変異タンパク質が正常ｐ５３遺伝子産物の生物学的活性を損なう能力のため、ラビゲールらのトランスジェニックマウスはすべての正常な内生ｐ５３遺伝子産物活性が機能的に不活化した動物の表現型を示す（ラビゲールら、Ｍｏ１ｅｃ、Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、９　：３９８２〜３９９１（１９８９）：サガー、５ｃｉｅｎｃｅ　２４６　：１４０６〜１４１２　（１９８９））。

それゆえ、ラビゲールらによって記載された（Ｍｏｌｅｃ、　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　９　：　３９８２〜３９９１　（１９８９））マウスは、２つの正常なｐ５３遺伝子の他に加えた癌遺伝子性ｐ５３対立遺伝子を含んでいた。重要なことに、そのような動物における遺伝子投与量の効果はわかっていない。さらに、そのような動物中における該添加ｐ５３遺伝子が、正常な上流および下流制御要素のすべてを含有しているかどうかはわかっていない。たとえそのような要素がすべて存在したとしても、構築物の組込み様によっては該遺伝子の制御を異常なものにするかもしれない。

これらの理由により、ｐ５３遺伝子が発癌に及ぼす役割を評価するに際しての該マウスの有用性は明らかではない。

ケノムに一つの正常で機能性のｐ５３対立遺伝子と一つの非機能性の（変異）ｐ５３対立遺伝子が含まれるトランスジェニック動物を産生ずるのが望ましいであろう。そのような動物は、一つのｐ５３対立遺伝子の喪失の結果を研究するのに使用することができ、それゆえ発癌および腫瘍形成のプロセスを解明するのに一層明らかに手助けとなるであろう。そのような動物はまた、潜在的な発癌物質のスクリーニング、新規な抗新生形成治療剤の開発、および遺伝子治療においても有用であろう。本発明はそのような動物を提供する。

■　相同的組換え本発明では、動物細胞、最も好ましくは胚幹（ＥＳ）ｍ胞の天然に存在するｐ５３配列中に特定の変異を導入するために相同的組換え法を用いる。ついで、非ヒト動物の変異したＥＳ細胞を適当な細胞培地中で培養するか、または適当な受容動物の子宮中に導入して非ヒト動物に発育させることができる。

別の態様として、本発明の方法はまた、非ヒト動物の体細胞を変化させてキメラ非ヒト動物を産生ずるのに用いることができる。

それゆえ、本発明を完全に正しく認識するために相同的組換え法（ワトソン（Ｗａｔｓｏｎ、　Ｊ　、　Ｄ、　）　、モレキュラー・バイオロジー・オブ・ザ・ジーン（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｇｅｎｅ）　、第３版、ベンジャミン、メンロパーク、カリフォルニア州（１９７７）、参照のため本明細書中に引用する）を理解することが望ましい。

簡単に説明すると、相同的組換えはよく研究された天然の細胞で起こる過程であり、同一または実質的に同様の配列（すなわち「相同な」）を有する２つの核酸分子の切断、およびそれぞれ最初に存在した分子の一つの領域が他の最初に存在した分子の領域にライゲートされるような仕方でこれら２つの分子のライゲーションが起こる（セジビー（Ｓｅｄｉｖｙ、　Ｊ、Ｍ、）　、Ｂｉｏ−Ｔｅｃｈｎｏｌ、　５　：　ｌ　ｌ　９２〜１．１９６　（１９８８）　、参照のため本明細書中に引用する）。

それゆえ、相同的組換えは、細胞が一つのＤＮＡ分子から他のＤＮＡ分子へＤＮＡの「領域」を移動させることのできる、配列特異的な過程である。本明細書において使用するＤＮＡの「領域」とは、一般にあらゆる核酸分子を意味する。

領域は、単一の塩基から染色体の実質的な断片にいたるまでいかなる長さであってもよい。

２つのＤＮＡ分子の間で相同的組換えが起こるためには、これら分子がお互いに「相同な領域」を有することが必要である。そのような相同領域は、少なくとも２つの塩基対の長さでなければならない。相同的組換えが起こり得るほどに一方の分子が第二の分子中の領域と配列が類似した領域を有する場合に、これら２つの分子は「相同な領域」を有する。

組換えは、原核細胞および真核細胞の両方に天然に存在する酵素によって触媒される。ＤＮＡの領域の移動は、複数工程の過程により起こると考えることができる。

２つの関与する分子のいずれかが環状分子である場合は、組換え事象の結果、該環状分子が他方の受容分子中に組み込まれる。

重要なことに、特定の領域の両側が相同領域（同じであってもよいが、異なる方が好ましい）である場合、２つの組換え事象が起こり、その結果、２つのＤＮＡ分子間でＤＮＡの領域が交換される。組換えは「相互的」であってよく、それゆえ、２つの組換えＤＮＡ分子間でＤＮＡ領域が交換される。別の態様として、組換えは「非相互的」（「遺伝子変換」とも称される）であってもよく、同じヌクレオチド配列を有する両組換え核酸分子となってもよい。２事象組換え交換において交換される領域のサイズまたは配列に関しては特に制限はない。

２つのＤ　Ｎ　、Ａ分子間に起こる組換えの頻度は、組換えを刺激する剤で導入ＤＮＡを処理することによって高めることができる。そのような剤の例としては、トリメチルブソラレン（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｐｓｏｒａｌｅｎ）　、ＵＶ光などが挙げられる。

■　キメラおよびトランスジェニック動物の産生：遺伝子ターゲティング法定められた特定の遺伝子変化を有する動物を産生ずるための一つの方法では、腫瘍細胞中および二倍体ヒト線維芽細胞と四倍体マウス赤白血病細胞との間の融合細胞中の導入マーカー遺伝子配列の組込み部位を制御するために相同的組換えが用いられている（スミシーズ（Ｓ　ｍ１ｔｈｉｅｓ、０）ら、Ｎａｔｕｒｅ　３１７　：　２３０〜２３４　（１９８５））。

この方法はトーマス（Ｔｈｏｍａｓ、　Ｋ、　Ｒ，）および彼の共同研究者によってさらに開発されており、トーマスらはトランスジェニック動物を産生ずるため、ＥＳ細胞の前以て選択した所望の遺伝子配列に変異をターゲティングするための「遺伝子ターゲティング」として知られる一般法を記載している（マンスール（Ｍａｎｓ。

ｕｒ、Ｓ、Ｌ、）ら、Ｎａｔｕｒｅ　３３６　：　３４８〜３５２　（１９８８）；カペツチ、Ｔｒｅｎｄｓ　Ｇｅｎｅｔ、５　：　７０〜７６　（１９８９）　；カベツチ、５ｃｉｅｎｃｅ　２４４　：１２８８〜１２９２　（１９８９）：カペツチら、カレント・コミュニケーションズ・イン・モレキュラー−バイオロジー（Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ　ｉｎ　ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ）　、カペツチ（編）、コールドスプリングハーバ−プレス、コールドスプリングハーバ−、ニューヨーク州（１９８９）、４５〜５２頁：フローマン（Ｆ　ｒｏｈｍａｎ、　Ｍ、　Ａ、　）ら、Ｃｅ１ｌ　５６　：１４５〜１４７　（１９８９）　、すべて参照のため本明細書中に引用する）。

いまやマウス中のあらゆる遺伝子を意図的に変化させることができる（カペツチ、Ｔｒｅｎｄｓ　Ｇｅｎｅｔ、５　：　７０−７６　（１９８９）　：フローマンら、Ｃｅ１１５６１４５〜１４７　（１９８９））。遺伝子ターゲティングには、選択した遺伝子座のクローニングＤＮＡ配列中に所望の変異を導入するための標準的な組換えＤＮＡ法の使用が含まれる。ついで、この変異を相同的組換えにより多分化能性の胚由来幹（Ｅ　Ｓ）細胞のゲノム中に移動させる。変化させた幹細胞をマウス線維芽細胞中にマイクロインジェクションし、発生過程のマウス胚に導入して最終的にキメラ動物に発育させる。幾つかの場合には、該キメラ動物の生殖系細胞は遺伝的に変化したＥＳ細胞に由来し、変異した遺伝的型は交配により伝達することができる。

遺伝子ターゲティングは、β２−ミクログロブリン遺伝子座中にｎｐｔｌＩ遺伝子を挿入したキメラおよびトランスジェニックマウスを産生ずるのに用いられている（コラ−ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　（ＵＳＡ）　８６　：８９３２〜８９３５　（１９８９）；ジジュルストラ（Ｚ　ｉ　ｊｌｓｔｒａ、　Ｍ、　）ら、Ｎａｔｕｒｅ　３４２　：　４３５〜４３８　（１９８９）：ジジュルストラら、Ｎａｔｕｒｅ　３４４　：　７４２〜７４６　（１９８９）：ブチアバ（Ｄ　ｅ　Ｃｈｉａｂａ）ら、Ｎａｔｕｒｅ　３４５　：　７８〜８０　（１９９０））。同様の実験により、ｎｐｔＩＩ遺伝子の挿入により破砕されたＣ−ａｂｌ遺伝子を有するキメラおよびトランスジェニック動物の産生が可能となった（シュバルツベルグ（Ｓ　ｃｈｗａｒｔｚｂｅｒｇ、　Ｐ　、　Ｌ、　）ら、５ｃｉｅｎｃｅ　２４６　：　７９９〜８０３　（１９８９））、この技術は、ｅｎ−２遺伝子がｎｐｔＩＩ遺伝子の挿入によって破砕されたキメラマウスの産主に使用されている（シミイナー（Ｊｏｙｎｅｒ、　Ａ、　Ｌ、　）ら、Ｎａｔｕｒｅ　３３８　：　１５３〜１５５　（１９８９））。

遺伝子ターゲティングはまた、ｈｐｒｔ　ＥＳ細胞株におけるｈｐｒｔ欠損を修復するためにも用いられている。欠損を修復した細胞を用いてキメラ動物が産生されている。重要なことに、修復した細胞はすべてｈｐｒｔ遺伝子座の両側の領域の著しい破砕を示した；試験したすべての細胞は、欠損を修復するために使用したベクターの少な（とも１つのコピーがｈｐｒｔ遺伝子座に組み込まれているのがわかった（トンプソン（Ｔ　ｈｏｍｐｓｏｎ、　Ｓ　、　）ら、Ｃｅ１ｌ　５６　：３１３〜３２１　（１９８９）；：ｌラーら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　（ＵＳＡ）　８６　：　８９２７〜８９３１　（１９８９）’）。

「遺伝子ターゲティング」法を利用するには、目的遺伝子を前以てクローニングし、イントロン−エクソンの境界を決定しておく必要がある。この方法の結果、目的とする特定遺伝子の翻訳領域中にマーカー遺伝子（すなわち、ｎｐｔｌＩ遺伝子）が挿入される。それゆえ、遺伝子ターゲティング法の使用は、目的遺伝子の著しい破壊という結果になる。

最近、ホメオボソクスｂｏｘ１．１対立遺伝子を有するキメラマウスが遺伝子ターゲティング法の修飾法を用いて産生された（ライマー（Ｚ　１ｍｌｌ１ｅｒ、　Ａ　、　）ら、Ｎａｔｕｒｅ　３３８　：　１５０〜１５４　（１９８９））、この修飾法においては、付随するベクター配列を全く使用せず、ｂｏｘｌ、１対立遺伝子の部分のみを含有する直線状ＤＮＡを用いてＥＳ細胞をマイクロインジェクションすることによりベクター配列の組み込みが回避された。このＤＮＡは、細胞性ｂｏｘ対立遺伝子の遺伝子変換を引き起こすことがわかった。「変換されたＪＥＳ細胞の回収を容易にするために選択は用いず、複製連鎖反応（ｒＰＣＲＪ）を用いて同定した。「変換された」細胞からクローン精製した細胞の約５０％が導入ｂｏｘ１．１対立遺伝子を含有することがわかり、ライマーらに染色体の不安定性または試料の汚染を示唆していた。いずれのキメラマウスも「変換された」遺伝子をその子孫に伝達できないことがわかった（ライマーら、カレント・コミュニケーションズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、カベツチ（ａ）　、コールドスプリングハーバ−プレス、コールドスプリングハーバ−、ニューヨーク州（１９８９）　、５３〜５８頁）。

重要なことに、細胞の遺伝子を変化させるために遺伝子ターゲティングを用いると該遺伝子の配列の著しい変化を生じる結果となる。遺伝子ターゲティングの効率は多数の変数に依存し、構築物ごとに異なる。本明細書において使用するｐ５３遺伝子構築物については、そのような効率は約１／３００である。

Ｖ　キメラおよびトランスジェニック動物の産生：挿入ベクターの使用上記方法とは対照的に、本発明は、ヒトまたは動物細胞中のｐ５３遺伝子の２つの対立遺伝子の一方の配列中に巧妙で正確で前以て決定した変異を生じさせることのできる方法を使用する。下記に記載する方法は細胞のｐ５３遺伝子の両対立遺伝子を変異させることができるが、そのような相互変異事象は容易に同定することができる（たとえば、ＰＣＲ（下記）、または他の方法の使用により）。

そのような相互変異事象の頻度は単一の変異事象の頻度の二乗であるので、そのｐ５３対立遺伝子の両方に変異を有する細胞は変異した細胞の全集団のうち非常に小さい比率にすぎないであろう。

本発明には幾つかの態様がある。最も簡単な態様においては、挿入ベクターを用いて細胞のｐ５３遺伝子の２つの対立遺伝子のうちの一方のヌクレオチド配列を変異させる。このベクタータイプを第二の選択復帰事象と組合せて用いることにより、該ベクターの選択マーカー遺伝子（たとえば、ｎｐｔｌ！遺伝子）によるかまたは他のベクター配列による染色体の破砕が防がれる。それゆえ、受容染色体の著しい歪みが回避される。この遺伝子ターゲティングの効率は上記遺伝子ターゲティング法よりも実質的に大きい。

最も好ましくは、受容細胞中に導入すべきＤＮＡ分子は、ｐ５３遺伝子の領域と相同な領域を含有している。好ましい態様において、該ＤＮＡ分子は細胞のｐ５３遺伝子と相同な２つの領域を含有しているであろう。これらの相同領域は、ｐ５３遺伝子中に組み込もうと思っている正確な配列の両側にあるのが好ましいであろう。上記のように、相同領域は２塩基長以上のいかなるサイズであってもよい。最も好ましくは、相同領域は１０塩基長以上であろう。

上記ＤＮＡ分子は一本鎖であってもよいが、好ましくは二本鎖である。該ＤＮＡ分子は１または２以上のＲＮＡ分子として細胞中に導入して、これを逆転写酵素によりまたは他の手段によってＤＮＡに変換してもよい。好ましくは、ＤＮＡ分子は二本鎖線状分子であろう。本発明を実施するのに最良の態様においては、そのような分子は閉じた共有（ｃｏｖａｌｅｎｔ）環状分子を開裂して線状分子を形成させることにより得られる。好ましくは、該分子を単一部位で開裂して平滑末端または付着末端の線状分子を産生じ得る制限エンドヌクレアーゼを用いる。

最も好ましくは、この制限部位の各両側のヌクレオチドは、導入するＤＮＡ分子とｐ５３遺伝子との間の相同な好ましい２つの領域の少な（とも部分を含んでいるであろう。

それゆえ、本発明は、天然のｐ５３遺伝子中に「所望の遺伝子配列」を導入することにより該ｐ５３遺伝子配列を変化させる方法を提供する。該「所望の遺伝子配列」はいかなる長さであってもよく、いかなるヌクレオチド配列であってもよい。該遺伝子配列は、完全なタンパク質をコードする１または２以上の遺伝子配列、そのような遺伝子配列の断片、調節配列などからなる。重要なことに、所望の遺伝子配列は受容細胞の天然遺伝子とごく僅かに異なっていてもよい（たとえば、天然遺伝子に対して単一または複数の塩基の変化、挿入または欠失を含有していてもよい）。そのような所望の遺伝子配列を用いることにより、受容細胞のｐ５３遺伝子中に巧妙で正確な変化を生成させることができる。それゆえ、本発明は、ｐ５３遺伝子の発現および制御を操作および修飾する手段を提供する。

とりわけ、本発明は、天然に存在するｐ５３遺伝子配列を「非選択ｊ　「所望遺伝子配列」で置換することにより、ｐ５３５３遺伝子およびタンパク質１ｓ造を操作および修飾する手段を提供する。ある遺伝子配列の受容細胞中での存在または発現が、使用した培養条件下で細胞に対してなんらの生存の利点を提供しない場合には、該遺伝子配列は非選択的である。それゆえ、定ｉｌ！二より、ｐ５３遺伝子中に「非選択的」遺伝子配列を受容した細胞を選択することはできない。

対照的に、「優性」遺伝子配列は、ある種の環境下で受容細胞に生存の利点を提供することのできる配列である。ｎｐｔ　Ｉ　Ｉ遺伝子によって与えられるネオマイシン耐性は、ネオマイシンまたは０４１８の存在下で培養される細胞に対する生存の利点である。それゆえ、ｎｐＬＩＩ遺伝子は非選択遺伝子配列であるというよりは優性配列である。

とりわけ、本発明により、受容細胞の天然に存在するｐ５３遺伝子配列を「類似」配列と置換することが可能である。ある配列と他の配列とが実質的に配列が類似しているが、互いに単一の塩基置換、欠失、または挿入に対応する配列においてわずかな変化を有する場合、またはこれら配列が「小さな」複数の塩基変化を有している場合、これら配列は互いに類似していると言われる。そのような変化は、優性な選択マーカー遺伝子の挿入を排除することを意図するものである。

受容細胞のｐ５３遺伝子配列と相同な領域で両側をはさまれた所望の遺伝子配列を線状二本鎖分子（その末端は相同領域に対応する）として該受容細胞中に導入した場合、該細胞のＤ５３遺伝子との単一の組換え事象はトランスフェクションした細胞の約５％で起こるであろう。そのような単一の組換え事象により、上記全線状分子が受容細胞のゲノム中に組み込まれるであろう。

上記線状分子の組込みにより生じた構造は、引き続（第二の組換え事象（細胞世代当たり約１０−Ｓ〜１０−’）を引き受けるであろう。この第二の組換え事象の結果、相同フランキング領域を除く全ＤＮＡおよび所望のＤＮＡ配列が、該組み込まれた構造から除去されるであろう。それゆえ、この第二の組換え事象の帰結は、該細胞のｐ５３遺伝子中の相同フランキング領域の間に通常存在するＤＮＡ配列が所望のＤＮＡ配列で置換されることであり、遺伝子置換の不安定性を除（ことである。

所望の遺伝子配列を含有するＤＮＡ分子は、導入したＤＮＡがその相同領域で組換えを起こすことのできるようないかなる方法によっても多分化能性細胞中に導入することができる。直接的マイクロインジェクションやリン酸カルシウムトランスフォーメーシ５ンなどの幾つかの方法では、組込み時に導入した分子にコンカテマーが形成される。これらコンカテマーはそれ自身を分解して非フンカテマー性組込み構造を形成する。コンカテマーの存在は望ましくないので、コンカテマーを形成する方法は好ましくない。好ましい態様においては、ＤＮＡはエレクトロポレーションにより導入される（トネグッツォ（Ｔ　ｏｎｅｇｕｚｚｏ、　Ｆ、　）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、１６　：　５５１５”５５３２　（１９８８）　：クイレット（Ｑｕｉｌｌｅｔ、　Ａ、　）ら、Ｊ、Ｉ＋ａａ＋ｕｎｏ１．１４１　：１７〜２０　（１９８８）；マシー（Ｍａｃｈｙ、Ｐ、）ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、（ＵＳＡ）８５　：　８０２７〜８０３１　（１９８８）：すべて参照のため本明細書中に引用する）。

ＤＮＡ分子を導入した後、当該技術分野で知られているようにして細胞を通常条件下で培養する。

所望の遺伝子配列を含有するＤＮＡ分子を受容した細胞を回収するのを容易にするため、検出可能なマーカー遺伝子配列も含有する第二の遺伝子配列とともに、該所望の遺伝子配列を含何するＤＮＡ配列を導入するのが好ましい。本発明の目的のためには、細胞中での存在が認識可能であり該細胞をクローン的に単離することのできるいかなる遺伝子配列をも検出可能なマーカー遺伝子配列として用いることができる。

一つの態様において、受容細胞中での検出可能なマーカー配列の存在は、ハイブリダイゼーションによって、放射性標識ヌクレオチドの検出によって、または該検出可能なマーカー配列の発現を必要としない他の検出アッセイによって認識される。好ましくは、そのような配列はＰＣＲを用いて検出する（ムリス（Ｍｕｌｌｉｓ、　Ｋ、　）ら、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｓｙｍｐ、　Ｑｕａｎｔ、　Ｂｉａｓ、　５１　＋　２６３〜２７３　（１９８６）ニー１− −リッヒ　（Ｅｒｌｉｃｈ、　Ｈ，）　ら、ＥＰ　５０，４２４；ＥＰ　８４゜７９６、ＥＰ　２５８．０１７、ＥＰ　２３７．３６２：ムリスら、ＥＰ　２０１．１８４：ムリスら、米国特許第４．６８３．２０２：エーリッヒ、米国特許第４．５８２．７８８；およびサイキ（Ｓ　ａｉｋｉ、　Ｒ，）ら、米国特許第４．６８３，１９４）、参照のため本明細書中に引用する）。　ＰＣＲは、増幅しようとする特定の核酸配列の領域に相補的な２つのオリゴヌクレオチドブライマーを用いて該配列の増幅を行う。これらプライマーを組み込んだ伸長生成物は、ついでその後の複製工程の鋳型となる。ＰＣＲは、特定の配列を有する核酸分子が前辺て精製しておらず特定試料中にわずかに単一のコピーで存在している場合でも、該分子の濃度を選択的に増加させる方法を提供する。この方法は、一本鎖または二本鎖のいずれをも増幅させるのに用いることができる。

しかしながら、最も好ましくは、検出可能なマーカー遺伝子配列が受容量胞中で発現され、選択可能な表現型となることであろう。そのような好ましい検出可能な遺伝子配列の例としては、ｈｐｒｔ遺伝子（リトルフィールド（Ｌ　１ｔｔｌｅｆｉｅ１ｄ、Ｊ、Ｗ、）　、５ｃｉｅｎｃｅ　１４５　：　７０９〜７１０　（１９６４）　、参照のため本明細書中に引用する）、ｔｋ遺伝子（すなわちチミジンキナーゼ遺伝子）および特に単純ヘルペスウィルスのｔｋ遺伝子（ギファヒトーガスラー（Ｇｉｐｈａｒｔ−Ｇａｓｓｌｅｒ、　Ｍ、　）ら、Ｍｕｔａｔ、Ｒｅｓ、２１４　：　２２３〜２３２　（１９８９）　、参照のため本明細書中に引用する）、ｎｐｔｌｌ遺伝子（トーツス（Ｔｈｏｍａｓ、　Ｋ、　Ｒ，）ら、Ｃｅ１ｌ　５１　：５０３〜５１２　（１９８７）；？ンスール（Ｍａｎｓｏｕｒ、　Ｓ、　Ｌ、　）ら、Ｎａｔｕｒｅ　３３６　：３４８〜３５２　（１９８８）　、ともに参照のため本明細書中に引用する）、またはアミノ酸またはヌクレオシド類似体、または抗生物質などに対する耐性を付与する他の遺伝子などが挙げられる。

活性なＨＰＲＴ酵素を発現する細胞は、ある種のヌクレオシド類似体（６−チオグアニン、８−アザプリンなど）の存在下では増殖できないが、ＨＡＴ　（ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジン）を添加した培地中では増殖できる。逆に、活性なＨＰＲＴ酵素を発現できない細胞は、ＨＡＴＧを含有する培地中で増殖できないが、６−チオグアニンなどの閤似体に対して耐性である（リトルフィールド、５ｃｉｅｎｃｅ　１４５　：　７０９〜７１０　（１９６４））　。活性なチミジンキナーゼを発現する細胞は、ＨＡＴＧを含有する培地中で増殖することができるが、５−アザシチジンなどのヌクレオシド類似体を含有する培地中では増殖できない（ギファヒトーガスラーら、Ｍｕｔａｔ、Ｒｅｓ、２１４　：　２２３〜２３２　（１９８９））。活性なＨ３Ｖ　−ｔｋ遺伝子を含有する細胞は、ガングシロビール（ｇａｎｇｃｙｌｏｖｉｒ）または類似の剤の存在下で増殖できない。

検出可能なマーカー遺伝子は、認識できる細胞の欠損を補足し得る遺伝子でありでもよい。それゆえ、たとえば、ＨＰＲＴ活性を欠（細胞を用いた場合には、ＨＰＲＴの遺伝子を検出可能なマーカー遺伝子配列として用いることができる。それゆえ、この剤は、変異細胞を選択するため、または正常な機能を再獲得した細胞を「陰性選択する」ために用いることのできる剤の一例である。

ｎｐｔｌｌ遺伝子（サザーン（５ｏｕｔｈｅｒｎ、　Ｐ、　Ｊ　、　）ら、Ｊ　９Ｍｏｌｅｃ、　Ａｐｐｌ、　Ｇｅｎｅｔ、１　：　３２７〜３４１　（１９８２）；スミシーズら、Ｎａｔｕｒｅ　３１７：２３０〜２３４　（１９８５）、参照のため本明細書中に引用する）は、最も好ましい検出可能なマーカー遺伝子配列である。ｎｐｔＩＩ遺伝子とｔｋ遺伝子またはｈｐｒｔ遺伝子のいずれかの両方を含有する構築物が特に好ましい。

Ａ、検出可能なマーカー配列と所望な遺伝子配列の両方を含有する単一ＤＮＡ分子の使用第一の好ましい態様において、両側がｐ５３遺伝子と相同な領域である検出可能なマーカー遺伝子配列は、所望の遺伝子配列を含有する同じＤＮＡ分子上で受容細胞に提供される。すでに記載したように、このＤＮＡ分子は線状分子であるのが好ましい。

所望のＤＮＡ分子を組み込んだ（たとえば、検出可能なマーカー遺伝子配列が発現し得るｎｐＨＩ遺伝子配列である場合はＧ４１８耐性で選択することにより）細胞を選択した後、細胞を培養し、導入したＤＮＡ分子の存在を上記のようにして確認する。約１０７個の細胞を培養し、第二の組換え事象（上記）が起こって天然の配列（すなわち、受容細胞中に通常および天然に存在する遺伝子配列）と所望の遺伝子配列との置換となった細胞についてスクリーニングする。

第二の組換え事象の起こった細胞を同定するため、種々の方法のいずれをも用いることができる。クローン直接スクリーニング、ＰＣＲの使用、ハイブリダイゼーションプローブの使用など、すべてこの目的のために用いることができる。

好ましい態様において、該ＤＮＡ分子は、所望の遺伝子配列、相同フランキング領域および検出可能なマーカー遺伝子配列に加えて、第二の組換え事象の起こった細胞の選択または認識を可能とするような別の遺伝子配列を含有している。この別の遺伝子配列は、第二の組換え事象の直接的な結果として細胞のｐ５３遺伝子から切り出されるであろう。それゆえ、この目的に適した遺伝子配列には、細胞からの喪失を検出または選択することのできるあらゆる遺伝子配列が含まれる。

そのような「陰性選択」遺伝子配列の例としては、ｈｐｒｔ遺伝子、およびｔｋ遺伝子（とりわけ、単純ヘルペスウィルスのｔｋ遺伝子）が挙げられる。

第一の好ましい態様において、第二の組換え事象の頻度は約１０弓である。しかしながら、「陰性選択」遺伝子配列を用いることにより、そのような組換え細胞を約１００％の頻度で同定することができる。

該ＤＮＡ分子は、意図している挿入部位に位！して異種（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｙ）領域を有していてもよい。そのようなベクターの挿入により、該挿入部位（他の可能な部位ではなく）で組換えの起こった組換え体を選択することができる。

組換えが所望の挿入部位で起こると、該ＤＮＡ分子の該意図した挿入部位に位置する異種配列の喪失となる（たとえば、Ｈ３ＶｔＫ）。他の組換え事象の結果としての挿入は、該異種配列を保持しているであろう。それゆえ、アッセイできる遺伝子産物をコードする異種領域または「陰性選択」マーカーとして用いることのできる異種領域を用いることにより、受容細胞の挿入の遺伝子座が所望の正確な配列を含有していることを容易に決定することができる。そのようなベクターの効率は約０．５％である。

該ＤＮＡ分子の挿入部位に導入する異種領域は、短くても、実質的なサイズ（たとえば、２ｋｂ）であってもいずれでもよい。線状化（ｌｉｎｅａｒｉｚａｔｉｏｎ）の部位は、５°、３′、または異種領域内であってよい。線状化の部位が異種領域内である場合は、遺伝子ターゲティングの効率は約２％である。

異種領域は、所望の組換えが起こる相同領域に対して内側の部位に位置していてもよい。そのような構築物は、所望の組換え部位以外の部位で細胞遺伝子の遺伝子座に巧妙な変異を導入したい場合に用いることができる。

Ｂ、検出可能なマーカー配列および所望の遺伝子配列を提供するための異なるＤＮＡ分子の使用第二の好ましい態様において、検出可能なマーカー遺伝子配列（両側が相同領域である）は、所望の遺伝子配列を含有するＤＮＡ分子とは異なるＤＮＡ分子上にて受容細胞に提供されるであろう。これら分子は線状分子であるのが好ましい。

別々のＤＮＡ分子上で提供される場合、検出可能なマーカー遺伝子配列および所望の遺伝子配列は、コニレフトロボレーションによって、または他の同等の技術によって受容細胞に提供されるのが最も好ましいであろう。

そのような受容体を選択した後（好ましくはｎｐｔｌＩ遺伝子を発現し、それゆえ抗生物質６４１８に対する細胞耐性を付与する検出可能なマーカー配列を使用することにより）、細胞を増殖させ、スクリーニングして挿入事象を確認する（好ましくはＰＣＲを用い）。

いかなる選択も存在しないと、１０７のうち１個の細胞のみが予測される組換え構造を有することが期待される。しかしながら、検出可能なマーカー配列（ｎｐｔｆｌ遺伝子など）を含有し発現する受容細胞を選択する場合、両ＤＮＡ分子を取り込んだ細胞について１０’〜１０５倍の富化を得ることができる。典型的に、そのような富化により、わずか８００〜１，５００細胞をスクリーニングすることによって所望の受容細胞（導入ＤＮＡが細胞ゲノム中に組み込まれている）を同定することができる。そのようなスクリーニングは、ＰＣＲまたは同等の他の方法を用いて行うのが好ましい。そのような陰性選択法を用い、ベクターのコピー数を操作することができる。

導入された２つのＤＮＡ分子は、一般に受容細胞のゲノムの同じ部位には組み込まれないであろう。それゆえ、ある場合には、所望の遺伝子配列は、相同フランキング領域の間にある天然の細胞性遺伝子配列を置換するような仕方で組み込まれるであろう。検出可能なマーカー遺伝子の組込みの遺伝子座は本発明の目的のためには重要ではないが、ただし、ｐ５３遺伝子の遺伝子座と遺伝的に連結していてはならない。しかしながら、所望なら、陰性選択可能な遺伝子配列を、検出可能なマーカー配列を含有するＤＮＡとともに組み込むこともできる。それゆえ、導入した選択マーカー遺伝子配列ＤＮＡを喪失した細胞を最終的に選択Ｔることができる。

Ｃ９相同的組換え事象の同定のための直接的選択の使用細胞のｐ５３対立遺伝子の一方が変異して所望の遺伝子配列を含有する細胞の単離は上記好ましい態様のすべてによって可能であるが、それぞれの態様は、所望の組換え細胞を同定するために相当数の候補細胞のスクリーニングを必要とする。しかしながら、上記態様の変更を用いることによって所望の組換え細胞を直接選択することが可能である。

所望の細胞の直接選択法は、標的細胞と非標的細胞との表現型の相違並びに陽性および陰性の両方の選択に使用できる単一の遺伝子の使用に依存する。　典型的に、挿入ベクターを用いて行う相同的組換え実験では、３つの集団の細胞が生成される。第一のクラスの細胞は、所望のＤＮＡ分子を受容できなかった細胞であろう。このクラスは、実験の完了時に単離される候補細胞の実質的にすべての細胞からなるであろう。第二のクラスの細胞は、所望の遺伝子配列がランダムな挿入部位（すなわち、ｐ５３遺伝子中以外の部位）にて組み込まれた細胞であろう。１０３〜１０４の全細胞のうち約１個の細胞がこのクラスに入るであろう。第三のクラスの細胞は、所望の遺伝子配列が相同的組換えによってｐ５３遺伝子中の部位に組み込まれた細胞であろう。１０’〜１０６の全細胞のうち約１個の細胞がこのクラスに入るであろう。

上記態様において、第一のクラスの細胞（トランスフェクションしていない細胞）は陽性選択によって除くことができ、それゆえ、所望の組換え体細胞を同定するために約１．０００個の細胞のみをスクリーニングする必要がある。本発明の態様において、第三のクラスの細胞（相同的組換え体）を第二のクラスの細胞（ランダムな挿入）から選択するには、これら２つのクラスの細胞の間に表現型の相違が存在すればよい。

ランダムな組込み部位は少数の単一コピークローンとコンヵテマーを生成する傾向があるので（細胞をトランスフェクションするＤＮＡ濃度に依存して）、そのような組込み事象は本来的に不安定である。それゆえ、そのようなコンヵテマー性構築物は典型的に染色体内組換えを起こすであろう。そのような組換えは常に、ゲノム中にベクターの一つの完全なコピーを残すであろう。それゆえ、陰性選択マーカーがベクター中に含まれる場合には、すべてのランダムな組換え事象は該集団から陰性選択することができる。

対照的に、所望の遺伝子配列が相同的組換えによりｐ５３遺伝子中に組み込まれた細胞は、比較的高頻度（細胞分裂当たり１０’〜１０’に約１（複製された構造のサイズに依存する））で復帰して、ベクター配列を含有しない変異したｐ５３遺伝子を生成するであろう。それゆえ、ベクターが陰性選択遺伝子配列を含有していても、そのような細胞は陰性選択を生き残り、回収することができる。復帰変異を起こさなかった小％の相同的組換え体細胞もまた、陰性選択によって除かれるであろう。

好ましい陰性選択マーカーはｈｐｒｔ遺伝子である（活性なＨＰＲＴ酵素を発現する細胞は、６−チオグアニジンなどのある種のヌクレオシド類似体の存在下では増殖することができない）。６−チオグアニジンを陰性選択剤として用いた場合、６−チオグアニジン選択の効率は細胞密度に依存するので、１０フ細胞の密度を用いるのが好ましい。１０７のトランスフェクション細胞を用いた典型的な実験では、連続的な選択の後、約１０の復帰変異体細胞が得られる。復帰体クローンの相対収率は、第１回目の選択のときに「ポリＡ選択」を用いることによって実質的に増加させることができる。

そのような「ポリＡ選択」においては、導入ＤＮＡ分子が宿主染色体中にランダムに組み込まれる場合には、一般に、必要な３′ポリアデモる部位においては組み込まれないという事実を利用している。それゆえ、そのようなランダムに挿入された構築物の転写により生成されるｍＲＮＡは、一般にポリアデニル化を欠いている。この事実は、導入した遺伝子配列の天然のポリアデニル化部位に隣接した組込みとなる組換え事象について選択することが可能なベクターを用いることにより活用することができる（すなわち、ランダムな挿入よりも相同的な組換えによって）。上記のように、所望の組換え細胞を得る頻度は約１０−３である。

ポリＡ選択を用いることにより、所望の細胞を約１０４の頻度で回収することができる。それゆえ、ポリＡ選択からは、全体の効率が１０倍近く上昇する結果が得られる。それゆえ、ポリＡ選択は、ランダム組換え体と相同的組換え体とを同定するためにコロニーのスクリーニングを最小にしもしくは回避したい状況の場合に有利に用いることができる。

Ｄ、異種配列を含有する変化したｐ５３対立遺伝子の産生上記のように、所望の遺伝子配列はいかなる長さであってもよく、いかなるヌクレオチド配列を有していてもよい。とりわけ、細胞の前辺て選択した遺伝子中に単一または複数の塩基の変化、挿入または欠失を生成させるために所望の遺伝子配列の配列を設計することができる。

そのような変化がｐ５３遺伝子配列の翻訳領域内にある場合は、ｐ５３遺伝子産物の新たなタンパク質変化体を得ることができる。

本発明は、天然のｐ５３遺伝子を、変化した遺伝子配列、または異種ｐ５３遺伝子で置換した細胞を産生ずるのに用いることができる。ｐ５３遺伝子がトランスジェニック細胞の種以外の種に由来する場合には、該遺伝子は該トランスジェニック細胞に対して異種であると言われる。

一つの態様において、この置換は単一の工程において行うことができる。そのような置換を行うため、所望の遺伝子配列およびｐ５３遺伝子と相同な領域を含有するＤＮＡ分子を受容細胞に導入する。選択マーカー遺伝子もまた該細胞中に導入し、組換えを起こした細胞を選択するのに用いる。この方法の結果、相同領域に隣接した正常配列が所望のＤＮＡ配列の異種配列で置換される。

第二の態様において、この置換は２工程で行うことができる。上記態様のように、所望の遺伝子配列およびｐ５３遺伝子と相同な領域を含有するＤＮＡ分子を細胞に供する。該ＤＮＡ分子はまた、組換え事象が起こった結果、相同部位において染色体中に該導入ＤＮＡ分子が挿入された細胞を選択するのに用いる選択マーカー遺伝子をも含有している。

重要なことに、この態様においては、導入ＤＮＡ分子はまた、第二の組換え事象が起こった結果、該挿入ＤＮＡの喪失となった細胞を選択するのに用いることができる「陰性選択」マーカー遺伝子をも含有している。

遺伝子置換を完全にするため、第二のＤＮＡ分子を用いる。この第二のＤＮＡ分子は、選択マーカー遺伝子を含有している必要はない。この第二のＤＮＡ分子が受容されると第二の組換え事象が起こり、該「第二のＪ　ＤＮＡ分子と該「第一のＪ　ＤＮＡ分子（該分子上に含まれる所望のＤＮＡ配列、選択マーカー配列、および「陰性選択」マーカー配列を含む）とが交換される。　本発明の他の態様において、陽性選択マーカー（ｎｐｔＩＩ遺伝子やｇｐｔ遺伝子など）および陰性選択マーカー（ｔｋ遺伝子など）の両方を含有する「カセット」構築物を用いて所望の遺伝子座中に巧妙な変異を導入することができる。この態様において、まず該構築物の陽性選択能を用いて上記２つの選択マーカーを所望の遺伝子座に導入する。ついで、所望の変異を含有するＤＮＡ分子を細胞に供給することにより所望の巧妙な変異（置換、挿入、欠失など）を導入する。「カセット」の喪失について選択することにより（陰性選択マーカーを用い）、「カセット」配列と所望の変異を含有するＤＮＡ配列との置換となった組換え事象について選択することができる。

本発明はまた、染色体の隣接する領域を所望の遺伝子配列で置換するのに用いることもできる。それゆえ、本発明は、変化または置換させてよいＤＮＡ領域のサイズを限定するものではない。本発明のこの観点は、一連の５工程として考えることができる。染色体の大きな領域を所望の配列で置換する際の第一工程は、最初の標的を調製することを含む。この工程において、全所望の置換配列の「第一断片」を含有するＤＮＡ分子を受容細胞に供給する。この所望の置換配列の「第一断片」は、その末端に選択マーカー配列（最も好ましくはｎｐｔＩＩ遺伝子）を含有している。

該ＤＮＡ分子はまた、陽性および陰性選択の両方が存在する遺伝子配列の非機能的断片をコードする「二重選択」遺伝子配列をも含有する。そのような遺伝子の例は、ｈｐｒｔ細胞との関連で使用するｇｐｔ遺伝子である。機能的なｇｐｔ遺伝子を発現する細胞は、ＨＡＴ培地中で増殖する能力によって選択することができる１機能性のｇｐｔ遺伝子を欠く細胞は、６−チオグアニンの存在下で増殖する能力により選択することができる。

相同的組換えの結果、相同領域にて細胞のゲノム中に該ＤＮＡ分子が挿入される。重要なことに、この工程からはゲノムが選択マーカー遺伝子を含有する細胞が生成する結果となるので、所望の組換え事象を選択することができる。

この方法の第二の工程において、第二のＤＮＡ分子が細胞に提供される。この第二のＤＮＡ分子は、該所望の置換配列の「第二断片」並びに二重選択遺伝子（内部欠失のため機能的な遺伝子産物をコードすることができない）の配列を含有している。相同的組換えの結果、機能的な二重選択遺伝子を生成するような仕方で該第二のＤＮＡ分子が該細胞のゲノム中に挿入される。組換えはまた、該二重選択遺伝子の非機能的断片の組み込みという結果ともなる。重要なことに、この工程の結果、ゲノムが機能的な二重選択遺伝子を含有する細胞が生成されるので、所望の組換え事象について選択することができる。

この方法の第三の工程において、第三のＤＮＡ分子が細胞に提供される。この第三のＤＮＡ分子は、該所望の置換配列の「第一」および「第二」断片の両方を含有する。相同的組換えの結果、上記機能的な二重選択遺伝子を欠失させるような仕方で第三のＤＮＡ分子が細胞のゲノム中に挿入される。上記二重選択遺伝子の非機能的断片（工程２で生成）は該組換えによって影響されず、保持される。

重要なことに、この二種の結果、ゲノムが二重選択遺伝子を欠いた細胞が生成されるので、所望の組換え事象について選択することができる。

この方法の第四の工程において、第四のＤＮＡ分子が細胞に提供される。この第四のＤＮＡ分子は、該所望の置換配列の「第三断片」並びに二重選択遺伝子（工程２のように、内部欠失のために機能的な遺伝子産物をコードすることができない）の配列を含有する。相同的組換えの結果、機能的な二重選択遺伝子を生成するような仕方で該第四のＤＮＡ分子が該細胞のゲノム中に挿入される。組換えはまた、該二重選択遺伝子の非機能的断片の組み込みという結果ともなる。重要なことに、この工程の結果、ゲノムが機能的な二重選択遺伝子を含有する細胞が生成されるので、所望の組換え事象について選択することができる。

この方法の第五の工程において、第五のＤＮＡ分子が細胞に提供される。この第五のＤＮＡ分子は、該所望の置換配列の「第二」および「第三」断片の両方を含有する。相同的組換えの結果、上記機能的な二重選択遺伝子を欠失させるような仕方で第五のＤＮＡ分子が細胞のゲノム中に挿入される。上記二重選択遺伝子の非機能的断片（工程４で生成）は該組換えによって影響されず、保持される。

重要なことに、この工程の結果、ゲノムが二重選択遺伝子を欠いた細胞が生成されるので、所望の組換え事象について選択することができる。

評価されるであろうように、上記工程の正味の効果は、ゲノムが特定の所望遺伝子の「第一」、「第二」および「箪三」　「断片」を隣接して含有するように遺伝子操作した細胞が産生されることである。これら工程は、細胞ゲノム中にさらに別の「断片」を導入するために所望により繰り返すことができる。このようにして、単一のベクターを用いては導入することのできない異種遺伝子、染色体断片、または染色体を含有する細胞を構築することができる。上記に示したように、この方法の各二稈について選択することができる。

■、キメラおよびトランスジェニック動物の産生本発明のキメラまたはトランスジェニック動物細胞は、１または２以上のＤＮＡ分子を前駆多分化能性細胞、最も好ましくはＥＳ細胞、または等価物中に導入することにより産生ずる（ロバートソン、カレント・コミュニケーションズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、カベッチ（編）、コールドスプリングバーバーブ］ノス、コールトスブリ〉・グハーバー、ニューヨーク州（１９８９）　、３９〜・４４頁、参照のため本明細書中に引用する）。「前駆」なる語は、該多分化能性細胞が、本発明の教示に従って調製した所望の（「トランスフェクションした」）多分化能性細胞に対して前駆細胞であるというだけのことを示す。多分化能性（前駆またはトランスフェクションした）細胞は、当該技術分野で知られた仕方で（エバンスら、Ｎａｔｕｒｅ　２９２　：　１５４〜１５６　（１９８１））インビボで培養してキメラまたはトランスジェニック動物を産生ずることができる。

いかなるＥＳ細胞をも本発明に従って用いることができる。しかしながら、ＥＳ細胞の第一単離物を用いるのが好ましい。そのような単離物は、ロバートソンのカレニノト・コミュニケーションズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、カベ・ッヂ（編）、コールドスプリングハーバ−プレス、コールドスプリングハーバ −、ニューヨーク州（１９８９）　、３９〜４４頁に開示されているＣＣＥ細胞などの胚から直接、または該ＣＣＥ細胞株からのＥＳ細胞のクローン性単離物（シコワルツベルグ（Ｓ　ｃｈｗａｒｔｚｂｅｒｇ、　Ｐ　、　Ａ　、　）ら、５ｃｉｅｎｃｅ　２４６　：　７９９〜８０３　（１９８９）、参照のため本明細書中に引用する）から得ることができる。そのようなりローン性単離は、ロバートソンの方法（テラトカルンノマズ・アンド・エンブリオニック・ステム・セルズ　ア・プラクティカル・アプローチ（Ｔｅｒａｔｏｅａｒｃｉｎｏ＋ａａｓ　ａｎｄ　Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅ１ｌｓ　：　Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ）　、（ｏｚ＜| トソン編）、ＩＲＬプレス、オックスフォード、１９８７、該文献および方法を参照のため本明細書中に引用する）に従って行うことができる。そのようなりローン性増殖の目的は、動物への分化効率の一層高いＥＳ細胞を得ることにある。

クローン的に選択したＥＳ細胞は、先祖の細胞株ＣＣＥに比べてトランスジェニック動物を産生ずる効率が約１０倍以上である。本発明の組換え法の目的のためには、クローン性選択による利点はない。胚からクローン的に由来するＥＳ細胞の例としては、ＥＳ細胞株、ＡＢＩ　（ｈｐｒｔつまたはＡＢ２．１　（ｈｐ　ｒ　ｔ−）が挙げられる。

ＥＳ細胞は、ロバートソンにより記載されているように（テラトカルシノマズ・アンド・エンブリオニック・ステム・セルズ：ア・プラクティカル・アプローチ、（ロバ−Ｉ・ソン編）、ＩＲＬプレス、オックスフォード、１９８７．７１〜１〕２頁、参照のため本明細書中に引用する）、間質細胞（ＳＴＯ細胞（とりわけ５ＮＣ４ＳＴＯ細胞）および／または第一（ｐｒｉｍａｒｙ）胚線維芽細胞など）上で培養するのが好ましい。キメラマウスの産生および分析法は、グラツドリ−（テラトカルシノマズ・アンド・エンブリオニック・ステム・セルズ：ア・プラクティカル・アプローチ、（ロバートソン編）、ＩＲ，Ｌプレス、オックスフォード、１９８７、］７〕３〜１５］頁、参照のため本明細書中に引用する）によって開示されている。間質（および／または繊維芽）細胞は、異常なＥＳ細胞のクローン性過剰増殖を除く働きをする。最も好ましくは、これら細胞を白血球抑制因子（ｒｌｉｆＪ）の存在下で培養する（グー（Ｇｏｕｇｈ、　Ｎ、　Ｍ、　）ら、Ｒｅｐｒｏｄ、　Ｆ　ｅｒｔｉｉ、　Ｄｅｖ、ｌ　：２８１〜２８８　（１９８９）；ヤマモリ（Ｙ　ａｍａｍｏｒｉ。Ｙ）ら、Ｓ　ｃｉｅｎｃｅ２４６　＋１４１２〜１４１６　（１９８９）　、ともに参照のため本明細書中に引用する）。ｌｉｆをコードする遺伝子はクローニングされているので（グーら、Ｒｅｐｒｏｄ、Ｆｅｒｔｊ、１．Ｄｅｖ、　］、　：　２８１〜２８８　（１９８９）　）　、当該技術分野で知られた手段により該遺伝子で間質細胞をトランスフオームし、ついで培地中にｌｉｆを分泌するトランスフオームした間質細胞上で該ＥＳ細胞を培養するのが特に好ましい。

ＥＳ細胞株はいかなる種（たとえば、ニワトリなど）から由来しまたは単離してもよいが、冨歯類（すなわち、マウス、ラッ）・、ハムスターなど）、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、魚、ブタ、ウシ、霊長類およびヒトなどの哺乳類から由来しまたは単離した細胞が好まし２い。

■　本発明の使用本発明は、細胞のゲノム中の２つのｐ５３対立遺伝子の一方に所望の遺伝子配列を含有するヒトまたは動物細胞を提供する。

第一の態様において、本発明はまた、そのような配列を細胞中に含有する非ヒトキメラまたはトランスジェニック動物を産生ずる手段をも提供する。記載する方法を応用することによって産生ずることのできる動物としては、ニワトリ、非ヒト哺乳動物（とりわけ、翫歯類（すなわち、マウス、ラット、ハムスターなど）、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、魚、ブタ、ウシおよび非ヒト霊長類）が挙げられる。

本発明の細胞および非ヒト動物は、診断および治療の固有用性を有する。

Ａ　診断的有用性本発明はｐ５３遺伝子のＪｖ−の機能的対立遺伝子を含有する細胞、またはトランスジェニックまたはキメラ非ヒト動物を提供するので、またそのような細胞は該機能的対立遺伝子が非機能的形態へ変異することによって腫瘍細胞となるので、本発明は、腫瘍抑制遺伝子の存在または発現に得することのできる動物細胞の特性に影響を与え得る剤の同定に用いることができる。動物細胞の特性は、腫瘍抑制遺伝子の不在または欠失によって変化する場合に、「該腫瘍抑制遺伝子の存在または発畢に帰することができる」と言われる。そのような特性の例としては、腫瘍形成性、腫瘍形成に対するレンリエンス、腫瘍の程度、分布、頻度、位置、等級などが挙げられる。

一つの態様において、そのような剤は、細胞または動物の腫瘍形成（または新生物形成）能を減少させる。そのような剤は、本発明の治療可能性に関連して下記に記載する。

第二の態様において、そのような剤は細胞または動物の腫瘍形成（または新生物形成）能を増大させる。それゆえ、本発明の細胞および非ヒト動物は、腫瘍形成作用について潜在的または疑いのもたれる発癌物資を試験するうえで有用性を有する。本発明の細胞および非ヒト動物は、たとえば、環境（空気、水または土における環境汚染など）中に存在するか、または化学物質、放射性同位元素などに環境で暴露されて生じる剤の腫瘍形成効果を同定および評価するのに用いる。

大発明の細胞および非ヒト動物はまた、発癌に及ぼす食物の影響の研究を容易にするのに用いることもできる。本発明の細胞および非ヒト動物は、可能性のあるまたは現在の食品添加物、化学廃棄産物、化学工程副生物、水源、提唱されているまたは現在使用されている医薬、化粧品などが腫瘍形成作用を有するかどうかを決定するのに用いることができる。本発明の細胞および非ヒト動物はまた、種々のエネルギー形態（ＵＶ線、Ｘ線、電離放射線、元素の同位元素のγ線など）の腫瘍形成能を決定するのにも用いることができる。

変異事象が起こる頻度は、変異原性化学剤の濃度、または変異原性放射線の強度に依存する。それゆえ、単一の細胞で２つの変異事象が起こる頻度は単一の変異が起こる頻度の２乗であるので、本発明の細胞および非ヒト動物は、天然の細胞または動物で新生物形成変化を誘発するのに必要な濃度よりも遥かに低い濃度の新生物形成（腫瘍形成）剤を同定することができる。

一つの特に好ましい細胞は、天然のｐ５３対立遺伝子の一方が機能的ヒトｐ５３対立遺伝子で置換され、天然のｐ５３対立遺伝子の他方が変異して非機能的形態となっている非ヒト細胞である。別の態様として、２つの天然のｐ５３対立遺伝子がヒ）ｐ５３遺伝子の機能的および非機能的対立遺伝子で置換された非ピト細胞を用いることができる。

そのような細胞は、上記方法に従い、ヒトｐ５３対立遺伝子を含有する細胞中で剤の新生物形成能を評価するのに用いることができる。さらに好ましくは、そのような細胞は、天然の機能的ｐ５３対立遺伝子を含有しないが機能的なヒトｐ５３対立遺伝子を１つだけ含有する非ヒト動物を産生ずるのに用いる。そのような非ヒト動物は、ヒトｐ５３遺伝子産物を発現する非ヒト動物中で剤の腫瘍形成能を評価するのに用いることができる。

１、インビトロアッセイ一つの態様において、本発明の細胞をインビトロ細胞培養において用い、腫瘍形成能を測定すべき所定量の剤の存在下でそのような細胞をインキュベートすることができる。それゆえ、この態様は腫瘍形成作用のインビトロアッセイを構成する。

多くの発癌剤はその腫瘍形成作用を直接媒介するが、ある種の剤は、代謝されるまで、または１または２以上の「補助発癌（ｃｏ−ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｉｃ）　Ｊ因子とともに感受性細胞に呈示されるまでは腫瘍形成能を示さないであろう。本発明は、そのような「潜在的（ｌａｔｅｎｔ）　Ｊ発癌剤および「補助発癌」剤の同定を可能とするものである。本発明のこの態様に従い、細胞または動物を候補剤に暴露し続けるだけで「潜在的」発癌剤の存在を同定することができる。別の態様として、本発明の細胞を「使い古しの（ｓｐｅｎｔ）　Ｊ培地（すなわち、本発明の細胞を培養するのに使用する前に他の細胞を培養するのに用いた、候補剤を含有する培地）中でインキュベートすることができる。

本発明により、第二の剤の存在下で新生物形成作用を誘発し得る補助発癌因子の同定が可能である。そのような因子は、２またはそれ以上の候補剤の同時存在下で本発明の細胞を培養し、ついで新生物形成についてアッセイすることにより同定することができる。

これら細胞の新生物形成状態へのトランスフォーメーションは、アッセイした剤の腫瘍形成（または新生物形成）作用を示している。そのような新生物形成状態は、細胞形態の変化によって、接触阻止の喪失によって、軟寒天中での増殖能の獲得によって、または最も好ましくは腫瘍抗原の発現の開始によって認めることができる。

新生物形成作用を検出する手段としての腫瘍抗原の使用は、そのような抗原を容易に検出することができるので好ましい。

当該技術分野でよく知られているように、抗体、または抗体の断片を用いて細胞表面上の抗原の存在腫瘍を定量的または定性的に検出することができる。本発明のｐ５３変異細胞を生成するためにいかなる細胞タイプ（すなわち、肺、腎臓、結腸など）を用いることができるので、剤が組織特異的腫瘍形成能を有するかどうかを決定することができる。この目的を達成するため、候補とされる剤を種々の組織タイプのいずれかに由来するｐ５３変異細胞の存在下でインキュベートする。腫瘍は腫瘍特異的な抗原を有するので、またそのような抗原に結合することのできる抗体が単離されているので、そのような抗体を用い、ｐ５３変異細胞により発現される腫瘍抗原を特徴付けることができる。

そのような検出は、種々のイムノアッセイのいずれを用いても行うことができる。たとえば、抗体または抗体断片を放射性標識することにより、ラジオイムノアッセイの使用により抗原を検出することができる。ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）の良好な記載は、ラボラトリ−・テクニークス・アンド・バイオケミストリー・イン・モレキユラー・バイオロジー（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ａｎｄ　Ｂｉ。

ｃｈｅａ＋１ｓｔｒｙ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ）　（ワーク（Ｗｏｒｋ、　Ｔ、　Ｓ　、　）ら、ノースホランドパブリシングカンパニー　（Ｎｏｒｔｈ　Ｈｏ１ｌａｎｄ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏｍｐａｎｙ）　、ニューヨーク州（１９７８）、とりわけチャード（Ｃｈａｒｄ、Ｔ、）による「アン・イントロダクション・トウ・ラジオイミューン・アッセイ・アンド・リレイテッド・テクニークス（Ａｎ　Ｉ　ｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｔｏ　Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｅ　Ａｓ５ａｙ　ａｎｄ　Ｒｅ１ａｔｅｄ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）　Ｊと題する章、参照のため本明細書中に引用する）に掲載されている。

適当な放射性同位元素標識の例としては、’ＨＳＩｌ’Ｉｎ、”Ｓｉ、１３１１　、　Ｓｉｐ、３５８Ｓ　１４（Ｓ　！＋（ｒ、５〕ＴｏＳ　”ＣＯＳ　”Ｆｅｓ　フ’Ｓ　ｅ、”Ｅｕ、”Ｙ、’フＣＬＬ　””Ｃｉｓ　”’Ａｔｓ　Ｈ！ｐｂ、　４７Ｓｃ、”’Ｐｄなどが挙げられる。

別の態様として、酵素標識、非放射性同位元素標識、蛍光標識、化学ルミネッセンス標識または他の適当な標識を用いることができる。

適当な酵素標識の例としては、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、スタフィロコッカスのヌクレアーゼ、デルタ−５−ステロイドイソメラーゼ、酵母−アルコールデヒドロゲナーゼ、アルファーグリセロールリン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、ベーターガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼ、アセチルコリンエステラーゼなどが挙げられる。

適当す非放射性同位元素標識ノ例としテハ、”Ｇｄ、　５ｓＭｎ、　１６”Ｄｙ、”Ｔｒ、”Ｆｅなどが挙げられる。

適当な蛍光標識の例としては、１ｉＥｕ標識、フルオレセイン標識、インチオシアネート標識、ローダミン標識、フィコシアニン標識、フィコシアニン標識、アロフィコンアニン標識、０−フタルアルデヒド標識、フルオレサミン標識などが挙げられる。

化学ルミネッセンス標識の例としては、ルミナール標識、イソルミナール標識、芳香族アクリジニウムエステル標識、イミダゾール標識、アクリジニウム塩標識、ンユウ酸エステル標識、ルシフェリン標識、ルシフェラーゼ標識、エクオリン標識などが挙げられる。

当業者であれば、本発明に従って用いることのできる他の適当な標識がわかるであろう。これら標識の抗体またはその断片への結合は、当業者に一般に知られた標準的技術を用いて行うことができる。典型的な技術はケネディー（Ｋｅｎｎｅｄｙ。

Ｊ、Ｈ，）ら（Ｃ１ｉｎ、　Ｃｈｉｍ、Ａｃｔａ　７０　：　１〜３１　（１９７６）　）およびシャーズ（Ｓ　ｃｈｕｒｓ、Ａ、Ｈ，Ｗ、Ｍ、）　ら　（Ｃ１ｉｎ、Ｃｈｉｍ、Ａｃｔａ　８１　：１−４０　（１９７７）　）によって記載されている。後者の文献で言及されているカップリング技術は、グルタルアルデヒド法、過ヨウ素酸法、シマレイミド法、ｍ−マレイミドベンジル−Ｎ−ヒドロキシースクシンイミドエステル法（これら方法のすべてを参照のため本明細書中に引用する）である。

上記インビトロアッセイは、現在使用されているアッセイに比べて潜在的コストが低いこと、および多数の剤を容易にスクリーニングする能力という有利な特性を有する。この態様の使用により、異なる時間および条件下で得られる試験結果の比較が容易になる。さらに、そのようなアッセイにおいては非常に多数の細胞を用いることができるので、非常に低濃度の腫瘍形成剤の腫瘍形成作用も検出することができる。最後に、この態様はヒト細胞を用いて行うことができるので、被験化合物の腫瘍形成（または新生物形成）能をヒト細胞上で決定する手段が提供される。

２、インビボアッセイ第二の態様において、本発明の非ヒト動物を用い、そのような動物に腫瘍形成能を測定すべき剤の所定量を提供することができる（たとえば、吸入、食物摂取、注射、移植などにより）。そのような動物における腫瘍の生成（目による直接視覚化により、または生検、造影、腫瘍抗原の検出などにより認められる）は、アッセイした剤の腫瘍形成作用を示す。

本発明の非ヒト動物の使用は天然に存在する非ヒト動物よりも好ましい。なぜなら、そのような天然の動物は２つの機能的ｐ５３対立遺伝子を含有するため、機能的ｐ５３作用の喪失に導くためには２つの変異事象が必要であるからである。

対照的に、本発明の非ヒト動物は機能的ｐ５３対立遺伝子を一つだけ有するので、ｐ５３機能の全喪失を引き起工Ｔには１の変異事象しか必要としない。

そのような動物中の腫瘍の検出は、生検、造影により、または腫瘍抗原を発現する細胞の存在について該動物をアッセイすることにより行うことができる。

たとえば、そのような検出は、被験体から組織試料を取り出し、ついで該単離試料を上記適当に標識した抗体（または抗体断片）で処理することにより行うことができる。好ましくは、そのようなインシチ二検出は、被験体から組織試料を取り出し、ついでそのような試料に標識抗体を供することにより行う。抗体（または断片）は、組織試料に標識抗体（または断片）を適用または重層することによって供するのが好ましい。そのような手順を用いることにより、抗原の存在のみならず、調べた組織上の該抗原の分布をも決定することができる。本発明を用い、そのようなインンチュ検出を達成するために、当業者は広範囲の組織学的方法（染功法など）のいずれをも修飾することができることが容易にわかるであろう。

別の態様として、腫瘍細胞の検出はインビボ造影法によって行うことができ、その際、標識抗体（またはその断片）を被験体に提供し、組織試料を前辺て取り出すことなく腫瘍の存在を検出する。そのようなインビボ検出法は、他の検出法に比べて侵襲性が小さいこと、さらに患者から容易に取り出せない組織中の抗原発現細胞の存在を検出することができるという利点を有する。

さらに、体液（血液、リンパ液など）、排泄物、または細胞抽出物中の腫瘍抗原の存在をアッセイすることができる。そのようなイムノアッセイにおいて、下記に示すように、抗体（または抗体断片）を液相中でまたは固相担体に結合して利用することができる。

インビボアッセイの使用は幾つかの有利な性質を有する。インビボアッセイでは腫瘍形成剤を同定できるのみならず、核剤によって誘発された腫瘍の種類、生成した膿瘍の数および位置（すなわち、器官または組織特異的）、およびそのような生成した腫瘍の等級（臨床的重要性）をも評価することができる。インビボアッセイは、さらに、導入した剤の可能な天然代謝を本来的に考慮した腫瘍形成性、導入した剤（またはその代謝副産物）が受容動物の特定組織または器官中に選択的ｌ：蓄積する可能性、受容動物が腫瘍生成を認識および修復または防御する可能性の評価をも可能とする。簡単に言えば、そのようなアッセイは、生きた非ヒト動物中で剤の臘瘍形成能を研究および評価するための真の生物学的モデルを提供する。

３、腫瘍抗原のイムノアッセイ抗体（または抗体の断片）を用いた腫瘍抗原のインビトロ、インソチュ、またはインビボ検出は、担体の使用により改良することができる。よく知られた担体としては、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然および修飾セルロース、ポリアクリルアミド、アガロース、および磁鉄鉱が挙げられる。担体の性質は、本発明の目的のためにある程度可溶性であるかまたは不溶性のいずれであってもよい。支持体物質は、カップリングした分子が抗原を結合することができる限り、実質的にいかなる可能な構造立体配置を有していてもよい。それゆえ、支持体の立体配置は、ビーズのように球形であっても、試験管の内面、または棒の外表面のように円筒状であってもよい。別の態様として、該表面はシート、試験ストリップなどのように平面であってもよい。当業者であれば、モノクローナル抗体を結合するために多くの他の適当な担体を認識するであろうし、日常的な実験の使用によってそのような担体を確かめることができるであろう。

本発明の結合分子はまた、免疫測定アッセイ（「２一部位」または「サンドイッチ」アッセイとしても知られる）における利用のために適合させることもできる。

典型的な免疫測定アッセイにおいては、試験しようとする流体（すなわち、血液、リンパ液、液状排泄物、組織ホモジネートなど）に不溶性の固相支持体に所定量の非標識抗体（または抗体の断片）を結合させ、所定量の検出可能に標識した可溶性抗体を加えて、固相抗体、抗原、および標識抗体の間で形成される３成分複合体の検出および／または定量をできるようにする。

典型的な免疫測定アッセイには「前ｉ＠　（ｆｏｒｗａｒｄ）　Ｊアッセイが含まれ、該アッセイにおいては、まず固相に結合した抗体を試験しようとする試料と接触させて２成分固相抗体−抗原複合体を生成することにより該試料から抗原を抽出する。

適当なインキュベーション期間の後、固相支持体を洗浄して残留する流体試料（未反応抗原を含む、もし存在するなら）を除き、ついで未知量の標識抗体（「リポータ−分子」として機能する）を含有する溶液と接触させる。第二のインキュベーション期間で該標識抗体を該固相に結合した該抗原に該非標識抗体を介して複合体を形成させた後、該固相支持体を第二の時間洗浄して未反応の標識抗体を除（。このタイプの前進サンドイッチアッセイは、抗原が存在するかどうかを決定する単純な「イエス／ノー」アッセイであってもよいし、または標識抗体の測定値を既知量の抗原を含有する標準試料で得られた測定値と比較することによって定量的にすることもできる。そのような「２一部位」または「サンドイッチ」アッセイは、ワイド（Ｗｉｄｅ）によりラシオイミューン・アッセイ・メソッド（Ｒａｄｉｏｉａｕｓｕｎｅ　Ａｓ５ａｙ　Ｍｅｔｈｏｄ）　、カークハム（）（ｉｒｋｈａｍ）およびハンター（Ｈｕｎｔｅｒ）編、Ｅ、＆Ｓ、リビングストン、エンンバラ、１９７０．１９９〜２０６頁に記載されている。

腫瘍抗原を同定するのに同様に有用な他のタイプの「サンドイッチ」アッセイにおいては、いわゆる「同時」および「逆」アッセイを用いる。同時アッセイは、試験しようとする試料に固相支持体および標識抗体の両方ともを同時に加えるので単一のインキュベーション工程を含む。インキュベーションが完了した後、固相支持体を洗浄して残留する流体試料および複合体を形成しなかった標識抗体を除く。ついで、通常の「前進」サンドイッチアッセイにおけるように、面相支持体に結合した標識抗体の存在を決定する。

「逆」アッセイにおいては、流体試料への標識抗体の溶液の最初の添加、ついで適当なインキュベーション期間の後、固相支持体に結合した非標識抗体の添加からなる段階的添加を利用する。第二のインキュベーションの後、面相を通常の仕方で洗浄して、試験すべき試料および未反応標識抗体の溶液の残留分を該固相から除く。ついで、「同時」および「前進」アッセイにおけるように、固相支持体に結合した標識抗体を測定する。

上記で説明したように、抗原の免疫測定アッセイでは特定の結合分子を「リポータ−分子」で標識することが必要である。これらリポータ−分子または標識は、上記で定めたように、通常のものであり、当該技術分野でよく知られている。本発明を実施するに際しては、酵素標識が好ましい顎様である。それぞれの考えられる免疫測定アッセイにおいて標識として使用するのに理想的な単一の酵素は存在しない。そうではなく、どの酵素が特定のアッセイ系に適しているか決定する必要がある。酵素選択の重要な基準は、純粋な酵素のターンオーバー数（単位時間当たりに酵素部位当たりに生成物に変換される基質分子の数）、酵素調製物の純度、その生成物の検出の感度、酵素反応の検出の容易さおよびスピード、試験流体中の妨害因子または酵素様活性の不在、酵素およびその結合体の安定性、酵素およびその結合体の利用可能性および費用などである。本発明の免疫測定アッセイにおいて好ましい標識として使用できる酵素としては、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、グルコースオキシダーゼ、グリコアミラーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、およびグルコース− ６−リン酸デヒドロゲナーゼが挙げられる。ウレアーゼは、その活性を裸眼で容品に視覚化できる色素発生ｐＨ指示体のため一層好ましい酵素標識である。

Ｂ、治療的有用性重要なことに、本発明の細胞および動物は、該細胞または動物の腫瘍形成（または新生物形成）能を減少させる剤を同定するのに用いることができる。そのような剤は、「抗腫瘍剤」および／または「化学防御剤Ｊ　（ｃｈｅｍｏｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ　ａｇｅｎｔｓ）であり得る。「抗腫瘍剤」は、細胞の増殖（またはキメラまたはトランスジェニック動物中の腫瘍の発育、播種、または転移）を減少させる働きをする。

「化学防御剤」は、新たな腫瘍の形成を抑制する働きをする。そのような剤は、普遍的な活性（すべての新たな腫瘍形成を抑制する）を有していてもよいし、または特定器官および組織中の特定のタイプの腫瘍の分布、頻度、等級等を抑制する特異的な活性を有していてもよい。それゆえ、本発明は、新規な抗新生物形成治療剤を同定することが可能である。腫瘍抑制活性の上記アッセイのいずれをも、この目的のために用いることができる。

本発明のトランスジェニック細胞および非ヒト動物は、ｐ５３遺伝子のヒト遺伝子制御を研究するのに用いることができる。たとえば、そのような細胞および動物は、ｐ５３遺伝子と癌遺伝子または他の腫瘍抑制遺伝子との相互作用を調べるのに用いることができる。それゆえ、そのような細胞および動物は、新生物形成または腫瘍形成を損なうかまたは防御する能力を有する治療剤を同定するのに用いることができる。そのような剤は、ヒトおよび動物において癌の処置および治療において有用である。

重要なことに、可能な治療剤は、ある動物モデルにおいては毒性作用を誘発するが他の動物モデルにおいてはそうではないことがしばしばわかっている。そのような剤の可能性を解決するため、種々の種において代謝パターンを決定すること、および該代謝物の毒性を決定することがしばしば必要である。本発明は、そのような決定を容易にするトランスジェニック細胞または動物を産生ずることを可能にする。

本発明の治療剤を細胞または動物に提供する場合、薬理学的に許容し得る担体（すなわち、リポソーム等）を用いるのが好ましい。そのような剤は、薬理学的に有用な組成物を調製するための公知方法に従って調合することができ、それによってこれら物質、またはその機能的誘導体を薬理学的に許容し得る担体ビヒクルと混合する。適当なビヒクルおよびその調合は、たとえば、ニコラウ（Ｎｉｃｏｌａｕ、Ｃ，）ら（Ｃｒｉｔ、　Ｒｅｖ、　Ｔｈｅｒ、　Ｄｒｕｇ　Ｃａｒｒｉｅｒ　５ｙｓｔ、　６　：　２３９〜２７１　（１９８９）、参照のため本明細書中に引用する）に記載されている。

有効な投与に適した薬理学的に許容し得る組成物を調製するため、そのような組成物は適量の担体ビヒクルとともに有効量の所望の遺伝子配列を含有している作用の持続時間を制御するため、他の薬理学的方法を用いることができる。制御放出調製物は、所望の遺伝子配列と複合体を形成するかまたは該遺伝子配列を吸着するポリマーを使用することにより達成することができる（付随する担体を用いるかまたは用いないで）。制御放出は、放出を制御するために、適当な巨大分子（たとえば、ポリエステル、ポリアミノ酸、ポリビニル、ピロリドン、エチレンビニルアセテート、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、またはプロタミン、硫酸塩）および巨大分子の濃度並びに導入法を選択することにより行うことができる。制御放出調製物により作用の持続時間を制御するための他の可能な方法は、ポリエステル、ポリアミノ酸、ヒドロゲル、ポリ（乳酸）またはエチレンビニルアセテートコポリマーなどのポリマー性物賃の粒子中に核剤を組み込むことである。別の態様として、これら剤をポリマー性粒子中に組み込む代わりに、たとえば、コアセルベーション法により、または界面重合により調製したマイクロカプセル、たとえば、それぞれヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン−マイクロカプセルおよびポリ（メチルメタクリレート）マイクロカプセル中、またはコロイド状薬物放出系中、たとえばリポソーム、アルブミンミクロスフェア、ミクロエマルジョン、ナノ粒子、およびナノカプセルまたはマクロエマルジョン中にこれら物質を捕捉させることができる。

Ｃ研究および遺伝子治療における使用本発明の細胞および非ヒト動物は、獣医学およびヒト医学における使用に加えて、動物における遺伝子の制御、発現および構成を調べるのに用いることができる。本発明の方法は、天然ｐ５３遺伝子配列の制御領域中に変化を生成するのに用いることができる。それゆえ、本発明は、ｐ５３遺伝子の転写もしくは翻訳の性質もしくは制御を変化させる手段、またはｐ５３遺伝子自体を変化させる手段を提供する。たとえば、本発明によって、増大したまたは減少した遺伝子発現となる変異を導入することが可能である。同様に、本発明により、天然ｐ５３遺伝子の発現を減少または増大させるために該遺伝子の転写能を損ないまたは促進することができる。それゆえ、本発明は、ｐ５３遺伝子の操作および切開を可能にする。

そのような能力は、とりわけ遺伝子治療プロトコールにおいて、および癌の改良動物モデルの開発において価値がある。

本発明の一つの態様において、癌の治療を提供するため（すなわち、「遺伝子治療」）、機能的ｐ５３遺伝子、該遺伝子の変化体、またはｐ５３遺伝子の活性に影響を与える他の遺伝子のいずれかをコードするＤＮＡを動物（とりわけヒトを含む哺乳動物）の体細胞中に導入する。最も好ましくは、この目的のためにウィルスベクターまたはレトロウィルスベクターを用いる。

遺伝子治療の原理については、オールドハム（Ｏｌｄｈａｍ、Ｒ，Ｋ、　）　（プリンシブルズ・オブ・バイオセラピー（Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ｏｆ　Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ）　、ラベンプレス、ニューヨーク州、１９８７）および同様のテキストによって開示されている。遺伝子治療のための方法および使用の開示は、ポッグズ（Ｂｏｇｇｓ、Ｓ、Ｓ、）　（Ｉｎｔ。

Ｊ、Ｃｅ１ｌ　Ｃ１ｏｎ、８　：　８０〜９６　（１９９０）　）　；カーソン（Ｋａｒｓｏｎ、　Ｅ、　Ｍ、　）（Ｂｉｏｌ、Ｒｅｐｒｏｄ、　４２　：　３９〜４９　（１９９０）　）　；リドレイ（Ｌｅｄｌｅｙ、　Ｆ、　Ｄ、　）（バイオテクノロジー、ア・コンプリヘンツブ・トリーテイス（Ｂ　ｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ。

Ａ　Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ　Ｔｒｅａｔｉｓｅ）　、　ｖｏｌｕｍｅ　７　Ｂ、、　Ｇｅｎｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＶＣＨノ（ブリッシャーズ、ニューヨーク州、３９９〜４５８頁（１９８９））によって提供される（すべて参照のため本明細書中に引用する）。

上記のように、そのような遺伝子治療は存在する新生物形成状態を治療する（すなわち、抑制する、弱くする、または緩解を起こさせる）ために受容者に提供することができるが、本発明の原理は、遺伝した遺伝子変異または体細胞変異のためにｐ５３５３遺伝子の損なわれた（たとえば、ｐ５３遺伝子の機能的対立遺伝子が一つしかない）細胞を含有する個体に予防的遺伝子治療を提供するのに用いることができる。そのような治療は、該個体の素因が疾患に移行するのを少なくするために癌の検出に先立って投与する。

本発明を一般的に記載してきたので、下記実施例を参照することにより本発明が一層容易に理解されるであろう。これら実施例は説明のために提供するものであり、特に断らない限り本発明を限定することを意図するものではない。

実施例１マウスにおけるｐ５３腫瘍抑制遺伝子の不活化　実験の概要ｐ５３腫瘍抑制遺伝子の構造的変化は、広範囲のヒト癌と関係している。腫瘍形成および哺乳動物の発育におけるｐ５３の役割を調べるため、相同的組換えの後にｎｅｏ”遺伝子（たとえば、ｔｎ５のｎｐｔＩＩ遺伝子）の挿入により２つの内生ｐ５３対立遺伝子の一方が不活化された胚幹（Ｅ　Ｓ）細胞株を生成した。

遺伝子ターゲティング法において、両側がＨ３Ｖ　ＴＫ遺伝子で、ｐｏｌ　ＩＩプロモーターにより駆動されるポリＡ−ｎｅｏ’遺伝子によってエクソン５中が中断されたマウスｐ５３　３．７ｋｂゲノム構築物を利用した。この３．７ｋｂ断片は、マウスｐ５３のゲノムプラスミドクローンに由来する（オレン（Ｏｒｅｎ、Ｍ）ら、ＥＭＢＯＪ、２　：１６３３〜１６３９　（１９８３）；ピン／％　ン（Ｐ　１ｎｈａｓｉ）ら、Ｍｏ１ｅｃ、Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、４　：　２１８０〜２１８６　（１９８４））、このＤＮＡは正常Ｂａ１ｂ／ｃマウスの肝臓細胞からクローニングした。ＥＳ細胞中への遺伝子移動およびＧ４１８／ＦＩＡＵ選択（上記）の後、期待される変化したｐ５３遺伝子構造を有する２つのクローンをＰＣＲおよびサザーン分析により同定した（図３）。この目的のために３つのプローブを用いた。第一のプローブ（ｎｅＯプローブ）は、幹細胞中のネオマイシン耐性決定子の存在を示す。第二および第三のプローブ（エクソン１〜２プローブおよびエクソン５〜１０プローブ）は、これら２つの胚幹細胞には野性型および変異対立遺伝子が存在するが、野性型細胞には変異対立遺伝子が存在しないことを示す。これら３つのプローブが変異胚幹細胞において同じバンドを同定するという事実は、予想されるように、これら細胞中のｎｅｏ決定子がｐ５３遺伝子と連関していることを示している。

これらへテロ接合ＥＳクローンの一つをＣ５７ＢＬ／６受容線維芽細胞に注入し、偽妊娠Ｃ５７ＢＬ／６雌マウス中に移植した。このＥＳクローンをＥＳΔｐ５３と称した。

胚幹細胞株ＥＳΔｐ５３（図３で確認されたように、図２のｐ５３ターゲティング構築物を含有する）は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ロックビル、メリーランド州）に１９９０年１２月２７日に寄託してあり、ＡＴＣＣ受託番号：ＣＲＬ１０６３１が付与された。

上記ＥＳ細胞の線維芽細胞中への注入および該線維芽細胞のマウス子宮内への移植の結果得られた子孫は、高度にキメラであった。下記に記載するように、これらキメラ雄を交配し、生殖系へテロ接合体を生成した。ついで、これらへテロ接合体を増大した腫瘍感受性について調べ、交配してｐ５３無接合（ｎｕｌｌｉｚｙｇｏｕＳ）状態が胚発育に及ぼす影響を決定した。

実施例２組換え原性（ｒｅｃｏｍｂｉｎｏｇｅｎｉｃ）　ｐ　５３構築物の生成相同的組換え事象を含有するＥＳ細胞を生成し選択する能力を最大にするため、マンスール（Ｍａｎｓｏｕｒ、　Ｓ　、　Ｌ　、　）らの方法を利用した（マンスールら、Ｎａｔｕｒｅ３３６・３４８〜３５２　（１９８８）　、参照のため本明細書中に引用する）。この方法では、導入した変異ＤＮＡを安定に組み込んだ細胞を単離するための陽性選択法、および相同的組換え事象の起こらなかった細胞に対する陰性選択を用い、所望の相同的組換え事象の起こった細胞を富ませた。ｐ５３遺伝子中への相同的組換えを得るためのこれら手順の適用は、図１に概略を示しである。

上記のように、マウスｐ５３遺伝子からのゲノム配列のセグメント（１１のエクソン遺伝子のうちエクソン２から１０にわたる３．７−ｋｂ断片）をプラスミドｐ３ＶｐｃＧ３　（ビンハンら、Ｍｏ１ｅｃ、Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、４　：　２１８０〜２１８６（１９８４））から得た。図１に示すように、このＤＮＡの配列を２通りの仕方で修飾した。まず、ＭＣＩプロモーターエンハンサ−によって駆動されるｎｅ。

マーカー遺伝子を、ＥＳ細胞中で高レベルの発現が得られるように設計した（トーマス（Ｔｈｏｍａｓ、　Ｋ、　Ｒ，）ら、Ｃｅ１ｌ　５１　：　５０３〜５１２　（１９８８））　。この配列をエクソン５中の唯一のＢａ１１部位に挿入した。この挿入により、ＥＳ細胞中への安定な遺伝子移動のための陽性選択マーカー（ｎ　ｅ　ｏ）が提供さね、ｐ５３のコード配列を破砕し、相同的組換えが首尾よくいった後に不活性な対立遺伝子が産生じた。第二の変化は、該遺伝子ターゲティング構薬物（図２）の３°末端への単純ヘルペスウィルスチミジンキナーゼ遺伝子（Ｈ３Ｖ　ＴＫ）の結合を伴っていた。この結合により、ターゲティング構築物のランダムな組込みを有する細胞に対して陰性選択（Ｈ５Ｖ−ＴＫ−特異的チミジン類似体ＦＩＡＵ（１−（２デオキシ、２−フルオロ、β−Ｄアラビノフラノシル）−５〜ヨードウラシル）を使用）が提供された。

実施例３ＥＳ細胞中への構築物の移動および相同的組換え事象を有する細胞の同定上記ｐ５３ターゲティング構築物（図２）を生成した後、該構築物をエレクトロポレーションにより培養ＥＳ細胞中に導入した。ＥＳ細胞をロバートソンの記載（テラトカル７ノマズ・アンド・エンブリオニック・ステム・セルズ：ア・プラクティカル・アプローチ、（ロバートソン編）、ＩＲＬプレス、オックスフォード、１９８７．７１−１１２頁）に従って培養した。エレクトロポレーションのだめの細胞を６０〜８０％集密にてトリプシン処理により回収し、沈降さ也２５Ｕ／ｍｌのＤＮＡとともに緩衝食塩水中に再懸濁した。エレクトロポレーションを行うため、１０７細胞／ｍｌをバイオ−ラドシーンパルサー（、２４０ボルト、５００μＦ、０．４ｃｍキュベツト）からの単一パルスで処理する。これら条件下、約１０−３の安定な遺伝子移動効率が得られた。パルス処理後、Ｇ４１８／ガンンクロビル（ｇａｎｃｙｃｌｏｖｉｒ）　ｙｌｌ択のためにＥＳ細胞を５Ｘ１０６細胞／６−０ｍプレートにてフィーダー細胞（上記）上にブレーティングした。選択を１０〜１２日間（コントロールプレートがコロニーを示さな（なるまで）行った。

Ｇ４１８／ＦＩＡＵ−耐性の一団を単離し、増幅し、約５０〜１００の個々のＲＡＭ物からゲノムＤＮＡを精製した。これらＤＮＡをＨｉｎｄｌ　Ｉ　Ｉ、ＥｅｏＲ■およびＰｖｕＩ　Ｉで制限処理した。各コロニーを半分ずつに分けた：各コロニーの一方の半分を界面活性剤で溶解し、ターゲティング構築物の境界の外側のｎｅＯ遺伝子配列およびｐ５３遺伝子配列に由来するオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲに供した。相同的組換えにより構築物の挿入が起こっておれば、１．２ｋｂ断片が生じるであろう。試験した１００のコロニーのうち２つから、期待された１、２ｋｂ　ＰＣＲバンドが得られた。ついで、これら陽性コロニーからのＤＮＡをアガロースゲル電気泳動、サザーンブロッティング、および３つのプローブへのハイブリダイゼーションに供した。使用したプローブは、ｐ５３エクソン４プローブ（１３０ｂｐ）　、ｘクソン】１プローブ（２００ｂｐ）、およびｎｅ。

プローブ（１ｋ　ｂ）であった。これら各プローブは、相同的組換え事象の診断のためのサザーン断片とハイブリダイズした。これらをまとめると、サザーンハイプリダイゼーションは、相同的組換えにより生成したｐ５３遺伝子破砕を有するコロニーを断固として同定した。

最初の構築物ではＭＣＩ−ｎｅｏ遺伝子を利用した；これら構築物はうまく機能しなかった。うまくいった構築物は−ＰｏｌＩＩ−ｎｅｏ−ポリＡ−−遺伝子構築物であった。

実施例４特定ＥＳ細胞クローンからのマウスキメラ体の構築ブラッドレイの記載（テラトカルシノマズ・アンド・エンブリオニック・ステム・セルズ　ア・プラクティカル・アプローチ、（ロバートソン編）、ＩＲＬプレス、オックスフォード、１９８７．１１３〜１５１頁）に従い、適当なりローンからキメラ体を構築した。簡単に説明すると、交尾３日後にＣ５７ＢＬ雌の切開した子宮管から３５日齢の線維芽細胞期の胚を回収した。１２〜１５個の個々の細胞を該線維芽細胞期の胚の腔内にマイクロインジェクションし、短い培養期間の後、精管切除術を施した雄との交尾２日後の偽妊娠Ｆｌ　（ＣＢＡＸＣ５７ＢＬ）里母親の子宮角（ｕｔｅｒｉｎｅ　ｈｏｒｎｓ）中に戻した。

ＥＳ細胞を線維芽細胞中に導入する方法および子孫を産生ずる方法は記載されており、当業者によく知られた技術からなる（マンスールら、Ｎａｔｕｒｅ　３３６　：３４８〜３５２　（１９８８）；カペソチ、Ｔｒｅｎｄｓ　Ｇｅｎｅｔ、　５　：　７０〜７６　（１９８９）：カベツチ、５ｃｉｅｎｃｅ　２４４　：１２８８〜１２９２　（１９８９）：カベノチら、カレント・コミュニケーションズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、カペソチ（編）、コールドスプリングハーバ−プレス、コールドスプリングハーバ−、ニューヨーク州（１９８９）、４５〜５２頁：フローマンら、Ｃｅ１１５６　：１４５〜１４７　（１９８９）：すべて参照のため本明細書中に引用する）。

適当を数の高品ｉｔ（すなわち、ドナー細胞の高い貢献）キメラ体を＆５ｉさせるため、線維芽細胞注入実験を数週間の期間繰り返した。約５３の線維芽細胞注入を行った。

胚の移動後、１７日後に子が生まれる。この時点でキメリズムレベルを評価することはできなかった。というのは、使用した細胞株がブラックアグーチ外被色マーカーを有しており、該胚がブラック非アグーチであるからである。アグーチマーカーは８日目にコート中に目に見えるようになる。この時期にキメラ体を評価し、非キメラ動物を廃棄した。ドナー細胞株中のＹ染色体の存在により、生殖系の貢献の大部分が雄キメラ体の生殖系によるものであることが確実になった。

加えて、Ｙ染色体の優性効果は、幾つかの雌胚を表現型の雄に変換することにょうてキメラ子孫の中で性比が雄に傾くように偏ったものにした。従つて、性比は実験集団中のキメリズムレベルの有効な早期測定手段であり、このことは生殖系キメリズムを反映していると思われる。

マウスは、完全なブラック（すなわち、キメリズムなし）から９０％以上のアグーチ（すなわち、非常に高いキメリズム）にわたった。上記間質フィーダー細胞法を用いた場合、注入した子マウスの５０％以上が高程度のキメリズムを示した（子孫におけるブラック外被色に対するアグーチ外被色の比によって決定される）。

実施例５生殖系の貢献をアッセイするためのキメラ体の試験交配およびペテロ接合体の同定５３の注入した線維芽細胞のうち、高いキメリズムから非常に高いキメリズム（すなわち、外被にけるアグーチ毛の貢献レベルが５０％を越えるもの）を示す約１２匹の雄マウスが得られた。これらマウスを同系交配に供し、下記に記載するようにさらに分析した。

上記１２匹の雄キメラマウスが性的に成熟したときに（約８退部）試験交配した。試験交配は、１匹の生殖系キメラ体を２匹の未受精Ｃ５７ＢＬ雌とともに篭に入れ、自然に交配させることにより行った。８日齢の後に連続する同腹子を評価した。これら同腹子中の優性なアグーチ外被色の存在は、生殖系の定着が成功したことを示していた。この方法は、ｒｂ遺伝子の場合と同様、単一の正常な生殖系対立遺伝子が正常なｐ５３機能を付与し得ること、および遺伝子投与量の効果は重要ではないことを仮定していた。

予期しないことに、この仮定は確認されなかった。１２匹のキメラマウスのうち、４匹（＃９６、＃１０１、＃１０２および＃１０３）のマウスしか子孫マウスを生じなかったことがわかった。これらマウスの子の大部分′（約９５〜９７％）は出産後約２４時間で死亡した。にもかかわらず、幾つかの同腹子の後、親之１０１および＃１０２から５匹の生存できる子マウス（ｐｌ−ｐ５と称する）が得られた。これら親マウス（＃］、０１および＃１０２）は本発明の目的にとって等価であることがわかった。これら５匹の子マウスは青年期まで成育し、完全に生存可能である。

これら５匹の子マウスが変異ｐ５３対立遺伝子を有するかどうかを決定するため、尾ＤＮＡのサザーンブロットハイプリダイゼーションにより試験した。それゆえ、これら子マウスが６〜８週齢に達したとき、約１インチの尾を切り取り、マウス胚および／または卵黄のうから高分子量ＤＮＡを調製するための下記プロトコールに従って高分子量のＤＮＡを調製するのに用いた：この手順において、ゲノムに使用するために材料および溶液（エッペンドルフ管、プロトコ−ルに１蒸留水（ｄＨ２０）　、フェノール、フェノール／クロロホルム、クロロホルム、イソプロパツール、ＴＥなど）を保存しておき、ゲノムＤＮＡの試料を調製する場合にのみそのような材料を使用するのが望ましい。

プロトコールの手順：１、要求される妊娠の胚を化マウスの組織から注意深く単離する。ついで、これら胚および／または卵黄のうを、２５０μｍのカッティング（Ｃｕｔｔｉｎｇ）緩衝液（５０ｍＭｔ−リスｐＨ７，５，５０ｍＭ　ＥＤＴＡ　ｐＨ８，ｏ、１００ｍＭＮａＣＬ　５ｍＭ　ＤＴＴ、０．５ｍＭスペルミジン）を入れたエツペンドルフ管中に入れる。これら胚は、ＤＮＡの単離のためにそれぞれの卵黄のうを用い、別々に処理するかまたは染色固定することができる。

２、肝組織を鋏で細かく切り刻む。別のやり方としては、ｌｃｃの注射器に付けた２６Ｇ　５／８”５ｕｂ−Ｑ針に２回通すことにより破砕することもできる。

卵黄のうは非常に柔らかい組織であり、溶解中に容易に破砕される；それゆえ、特に必要な操作はない。

３．２５０μｌの溶解緩衝液（５０ｍＭトリスｐＨ７，５，５０ｍＭ　ＥＤＴＡｐＨ８，０１１００ｍＭ　ＮａＣ１，５ｍＭ　ＤＴＴ、０．５ｍＭスペルミジン、２％５ＤＳ）および１０μｌの新たに調製した１０ｍｇ／ｍｌ　プロトコ−ルＫを容管に加える。

４、これら管を５５℃にて一夜、穏やかに揺する。

５、容管に５００μｍのフェノールを加え、管を５〜１０ｒｐｍにて１５〜２０分間回転させる。ついで、管を最大速度にて１０分間、ミクロ遠心管中で遠心分離にかける。ついで、先端を切り取ったピペットの先端を用いてＤＮＡを清浄なエッペンドルフ管に移す。［ゲノムＤＮＡ試料をピペット処理する場合は、先端を切り取ったピペットの先端を用いるのが好ましい。このことにより、ＤＮＡの切断を防ぎ、平均サイズが８０〜１００ｋｂを越えるように保持する。］Ｃ６容管に５００μｍのフェノール／クロロホルムを加え、手順５を繰り返す。

７、容管に５００μｌのクロロホルムを加え、手順５を繰り返す。ＤＮＡを清浄な管に移す場合には、移した容量を記録するようにする。

８、ＤＮＡの容量と等容量のイソプロパツールを容管に加える。管を数回逆さにしてＤＮＡを沈澱させる。

９、管を最大速度にて１０分間、ミクロ遠心管中で遠心分離にかける。

１０、上澄み液を注意深く吸引して除く。ベレット化したＤＮＡを１ｍｌの７″ Ｏ％エタノール（Ｅ　ｔ　ＯＨ）で濯ぐ。管を再び最大速度にて１０分間、ミクロ遠・小管中で遠心分離にかける。

１１、ＥｔＯＨを注いで除き、残留ＥｔＯＨが見えなくなるまでペレットを空気乾燥させる。このＤＮＡを１５μｍのＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリスｐＨ８，０，１ｍＭ　ＥＤＴＡ　ｐＨ８，０）中に再懸濁する。

１２．３０の試料ウェルを有する２０ｃｍｘ１５ｃｍアガロースゲルの少なくとも１つのレーンについて充分なりＮＡを調製することができる：通常、２００μ ｇのＤＮＡが得られる。このＤＮＡを、２μｍの適当なＩＯＸ緩衝液、２μｌのｄＨ２０、および１μｍの適当な制限酵素を加えることにより消化する（すなわち、反応が２０μｍの全容量で起こるように）。

１３、このサイズのウェル（この中で電気泳動緩衝液を置換しなければならない）にゲノムＤＮＡを負荷するのは困難であるので、運転緩衝液中に沈める前にベンチにてゲルを負荷する。

ＤＮＡが得られたら、その濃度をＵＶ分光光度計でＡ！６゜測定することにより決定した。ついで、５〜１０μｇのＤＮＡをＢａｍＨＩかＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレアーゼのいずれかで３７℃にて数時間開裂した。切断したＤＮＡを０８％アガロースゲル上に負荷し、水平潜水（ｓｕｂｍａｒｉｎｅ）ゲル装置上、１００ｖにて約３時間電気泳動に付した。ついで、ＤＮＡをゼータプローブ（Ｚ　ｅｔａｐｒｏｂｅ）（バイオラド）ナイロン膜にブロッティングし、２０％デキストラン硫酸−３ＸＳＳＰＥ中でハイブリダイズした（両生類ともリードおよびマン（Ｍａｎｎ）のプロトコールに従った（リード（Ｒｅｅｄ、　Ｋ、　Ｃ，）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１３ニア２０７〜７２２１　（１９８５））。ハイブリダイゼーション用のプローブは、フエインバーグおよびフォーゲルスタイン（Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ）のプロトコールに従って３２ｐ−標識した（フエインバーグ（Ｆ　ｅｉｎｂｅｒｇ、　Ａ、　）ら、Ａｎａｌ、　Ｂ　ｉｏｃｈｅｍ、　１３２．６〜１３　（１９８３））。リードおよびマンのプロトコールの従い（リードら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、１３　：　７２０７〜７２２１　（１９８５））　、ハイブリダイゼーションを６８℃で一夜続け、フィルターを洗浄した。図４のプローブ　′は、ｐｏｌ　ＩＩ−ｎｅｏプローブであった。このプローブのＰｏｌＩＩ部分は、すべてのマウス中に存在するＰｏ１ｌＩ遺伝子の４．０ｋｂ断片とＩ＼イブリダイズする。このプローブのＮｅ０部分は、ｐ５３ターゲティング生殖系へテロ接合マウスにのみ存在する一層大きな６．７ｋｂ断片とハイブリダイズする。

試験した５匹のマウスのうちの２匹（子マウスｐ１およびｐ３）が生殖系中に変異したｐ５３対立遺伝子を有することがわかった（図４）。図４は、Ｆ＋　［１２９ｘＣ５７ＢＬ／６］キメラマウスの子孫の尾ＤＮＡのサザーンプロット分析を示す。このＤＮＡをＢａｍＨＩで制限処理し、上記３２Ｐ−標識Ｐｏ１ＩＩ− ＮｅＯプローブとハイブリダイズした。子孫とコントロールとの間にあるバンドは、該プローブと偶然ハイブリダイズしたマーカーである。それゆえ、この分析は、子マウスｐ１およびｐ３がｎｅｏ遺伝子とハイブリダイズするＤＮＡを含有しており、それゆえ変異したｐ５３構築物を含有していることを明らかにした。

生殖系のキメリズムが示された後、最初のＦ＋　（Ｃ５７ＢＬｘ１２９）雄を株１２９雌と交雑して一層大きな集団のへテロ接合体マウスを生成させた。子孫への変異ｐ５３対立遺伝子の生殖系伝達は、制限マツピング分析により確認することができる。

それゆえ、要約すると、非常に高いキメリズムを示す１２匹のうち４匹（＃９６、＃１０１、＃１０２および＃１０３）が、自然に交配させた場合に良好な種畜であることがわかった。これら４匹のマウスのうち、マウス＃１０１および＃１０２がアグーチ表現型を有する生存できる子孫を産生ずることがわかった。それゆえ、これらキメラマウスは、生殖系キメラ動物であることが示された（すなわち、これらマウスは所望のｐ５３構築物を有する生殖細胞を含有し、この構築物を子孫動物に伝達することができる）。確かに、日常的な交配によりマウス＃１０１および＃１０２の子孫動物が得られた。これら子孫動物のうち２匹（ｐｌおよびｐ３）がその生殖系に変異したｐ５３対立遺伝子を有しており、それゆえさらに日常的な交配により将来の世代に該遺伝子をいつまでも伝達することができた。

実施例６リーフラウメニおよび他のｐ５３変異対立遺伝子を有するトランスジェニック動物の産生上記非ヒトトランスジェニック動物はｐ５３遺伝子に変異を有する。同じ方法は、この遺伝子中に他の変異を有する動物を産生ずるのに用いることができる（図５）。それゆえ、所望の変異（欠失、挿入または点変異）を有するターゲティング構築物が調製される。この構築物を胚幹細胞中に導入し、該細胞のｐ５３対立遺伝子と相同的組換えを起こさせる。この過程により該構築物が該幹細胞のｐ５３遺伝子座中に組み込まれ、その結果、該遺伝子座におけるｐ５３遺伝子の重複となる。この重複は染色体内組換えによって分離して、所望の変異ｐ５３対立遺伝子を有する胚幹細胞が得られる（図５）。

実施例７ヘテロ接合動物における腫瘍頻度のアッセイ一方が破砕したｐ５３対立遺伝子を有するＦ１マウスの相当な大きさのグループ（ｎ＝５０〜１００）を、自然発生腫瘍の徴候、異常な徴候または早い死亡について１２〜２４力月にわたって観察する。死亡および腫瘍頻度を注意深く記録し、正常なｐ５３対立遺伝子のホモ接合体であるＦ１マウスのコントロール集団と比較する。マウスを３か月、６か月、１２力月、および１８力月の年齢で層殺し、異常な組織病理について剖検する。苦しみ、疾患の徴候、または腫瘍の形跡を示すマウスを層殺し、検査して疾患の正確な性質を確立する。

グループのマウスを標準的な方法（ブチル（Ｂ　ｕｔｅｌ、　Ｊ　、　Ｓ、　）ら、Ｊ　、　Ｖ　１ｒｏｌ。

３８　＋５７１〜５８０　（１９８１）；クネッパー（Ｋｎｅｐｐｅｒ、　Ｊ　、　Ｅ、　）ら、Ｉ　ｎｔｌＪ、Ｃａｎｃ、４０　：　４１４〜４２２　（１９８７）　、ともに参照のため本明細書中に引用する）に従ってＤＭＢＡなどの公知発癌物質で処理し、腫瘍の形成を観察する。

トランスジェニックマウスをフレンドマウス白血病ウィルス（Ｆ−ＭｕＬｖ）に感染させ、赤白血病の発病時期および重篤度をアッセイする。ｐ５３遺伝子の一方または両方の対立遺伝子中へのＦ−ＭｕＬｖの組み込みは、ウィルス−感染マウスにおける赤白血病と関連する（モワット（Ｍｏｗａｔ）ら、Ｎａｔｕｒｅ　３１４　：６３３〜６３６　（１９８５）：チョウ（Ｃｈｏｗ）ら、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、　６１　＋　２７７７〜２７８１　（１９８７）；ヒソクス（Ｈｉｃｋｓ、　Ｇ、　Ｇ、　）ら、Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　６２　：　４７５２〜４７５５　（１９８８））。

正常マウスとへテロ接合マウスとの間で腫瘍の発生率に差が観察される場合には、標準的な統計法によりデータを分析して、得られた結果の有意性を決定する。

一層大スケールの確認研究および発癌物質感受性研究を用い（研究および発癌物質のスクリーニング手段としてのマウスの有用性を詳細に記載Ｌｐ５３ヘテロ接合マウスにおける腫瘍発生率の有意な増大が好ましくは確立される。

ｐ５３が劣性致死遺伝子であるかどうかを決定するため、およびもしそうであるなら胚発生のどの時期が影響を受けるのかを決定するため、トランスジェニックマウスを通常の弁組換え法により同系交配する。発生が有意に進行するならば、最も影響を受ける器官および組織を同定する。ｐ５３ヘテロ接合体に由来する腫瘍をスクリーニングして、残りの「正常な」ｐ５３対立遺伝子における変異の範囲を決定する。胚線維芽細胞培養は、通常の培養条件下で癌遺伝子によるトランスフェクションまたは発癌物質による処理後にトランスフォーメーションのどのパラメーターが影響を受けるかを決定するために変化させた動物に由来する。

ｐ５３ヘテロ接合体を同系交配して、両方のｐ５３対立遺伝子が変異構築物を含有するトランスジェニック動物を得る。

ｐ５３ヘテロ接合体を、活性化された優性癌遺伝子を有する他のトランスジェニックマウス（たとえば、レダー（Ｌｅｄｅｒ、　Ｐ、　）らのトランスジェニックマウス（米国特許第４．７３６．８６６号））と交配して、両変異遺伝子を有する子孫の腫瘍生成率が促進されるかどうかを決定する。

実施例８ｐ５３欠損マウスの特徴付は上記Ｔ）５３へテロ接合マウスを得、同系交配して子孫を産生させた。これら子孫のうちにｐ５３ホモ接合動物が同定された。それゆえ、予期しないことに、本発明はｐ５３ヘテロ接合マウスとｐ５３ホモ接合マウスとの両方を単離および増殖させることができた。

Ａ、ｐ５３ホモ接合体は完全なｐ５３ＲＮＡまたはタンパク質を有しないマウス生殖系におけるｐ５３対立遺伝子の遺伝子ターゲテイングがナル（ｎｕｌｌ）変異を生成したことを断固として示すため、ホモ接合体の組織および細胞からのｐ５３ＲＮＡおよびタンパク質を分析した。理論的根拠は、破砕されたｐ５３遺伝子が完全に不活化されている場合、完全なｐ５３　ＲＮＡまたはタンパク質が存在してはならないということであった。ホモ接合体中のｐ５３ＲＮＡレベルを評価するためにＲＮＡ−ＰＣＲ法を用いた。というのは、組織ｐ５３ＲＮＡレベルはしばしば低すぎるためノーザン分析は検出に不適当であるからである。

５セツトのプライマー（図６Ａ）を用い、野性型、ヘテロ接合体、およびホモ接合体マウスの膵臓、腎臓、および精巣から精製した全ＲＮＡから合成したｃＤＮＡを増幅した。全膵臓ＲＮＡを用いたこれらＲＮＡ−ＰＣＲア、ソセイの結果（図６Ｂ）は、完全なｐ５３　ｍＲＮＡが野性型およびホモ接合体マウスにおいてのみ合成されることを明らかに示した。エクソン５ｎｅｏ挿入部位を包含する断片を増幅するプライマーについてはホモ接合体において明らかなＰＣＲ断片は存在せず、ホモ接合体が完全なメツセージを生成できなかったことを示していることに注意すべきである。しかしながら、エクソン７および１０プライマーはホモ接合体ｃＤＮＡから強い断片を生成する。これらデータは、ｎｅｏ挿入部位のＲＮＡ生成３゛がｐｏｌｌｌプロモーターによって開始されるハイブリ・ラドｎｅ。

ｐ５３メツセージの部分であるという結論を支持している。エクソン１および４プライマーは、野性型のｃＤＮＡと比較してホモ接合体ｃＤＮＡからは非常にかすかなＰＣＲバンドを増幅した。このバンドが低量であることは、ホモ接合体中の内生ｐ５３プロモーターからの転写がｎｅｏカセット挿入の結果、不安定な先端欠失転写物となると思われることを示している。

ホモ接合体では正常なｐ５３タンパク質が発現されないことを示すため、正常な胚、ヘテロ接合の胚、およびホモ接合の胚から得られる第三期の胚線維芽細胞に由来するタンパク質について免疫沈降アッセイを行った。ポリクローナルｐ５３抗血清を用い、野性型およびヘテロ接合体細胞は沈降するｐ５３を含有するがホモ接合体細胞は含有しないことがわかった。

ホモ接合体中で完全なまたは先端欠失ｐ５３分子が発現されたか否かをさらに調べるため、コントロール抗体（Ｅｌａ特異的抗体Ｍ７３（〕〕１−ロウＨａｒｌｏｗ。

Ｅ）ら、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、５５　：　５３３〜５４６　（１９８５））および６種の１）５３特異的なモノクローナル抗体：ＰＡｂ２４２　（ニーデル（Ｙｅｗｄｅｌｌ、　Ｊ　、Ｗ、　）ら、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、５９　：　４４４〜４５２　（１９８６））；　ＰＡｂ２４６　（−Ｌ−デルら、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、５９　：　４４４〜４５２　（１９８６））；　ＰＡｂ２４８　（−Ｌ−デルら、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、５９　：　４４４〜４５２　（１９８６））：　ＰＡｂ４２１　（ｚ＼　Ｏつら、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、３９　：　８６１〜８６９　（１９８１））；　Ｒ，Ａ３．２Ｃ２（：Ｌｙフマン（Ｃｏｆｆｍａｎ、　Ｒ，Ｌ、）　ら、Ｊ、Ｅｘｐｅｒ、Ｍｅｄ、１５３　：　２６９〜２７９　（１９８１））：および２００．４７　（ディボルド（Ｄｉｐｐｏｌｄ）ら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　（ＵＳＡ）７８　：１６９５〜１６９９　（１９８１））のセットから選択した３つの異なるｐ５３特異的モノクローナル抗体）を用いて免疫プロット分析を行った。これら抗体により同定したエピトープをマツピングした（ガノン（Ｇａｎｎｏｎ、　Ｊ　、　Ｖ、　）ら、ＥＭＢＯＪ、９　：１５９５〜１６０２　（１９９０）＋ウェイトーエバンス（Ｗａｄｅ−Ｅ　ｖａｎｓ、　Ａ、　）ら、ＥＭＢＯＪ、４：６９９〜７０６　（１９８５）＋モール（Ｍｏ１ｅ、　Ｓ、　Ｅ、）ら、Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、１７：３３１９　（１９８９）；ニーデルら、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、　５９　＋　４４４〜４５２　（１９８６））。細胞溶解液を最初に（１）ＰＡｂ２４２、ＰＡｂ２４６、およびＰＡｂ２４８の集合で免疫沈降してそれぞれアミノ酸１４〜２５．８８〜１０９および１４〜６９に位！するｐ５３エピトープをマツピングするか、または（２）ＰＡｂ４２１、ＲＡ３．２Ｃ２、および２００．４７の集合で免疫沈降してそれぞれアミノ酸３７０〜３７８．４１〜６９および４１〜１１１に位置するｐ５３エピトープをマツピングした。ついで、これら免疫沈降物をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、ついで該タンパク質をナイロンに移した。ついで、これらプロットを上記６種の抗ｐ５３モノクローナル抗体のすべてでプローブした。これら結果は、ホモ接合体が、このアッセイによって検出可能な完全または先端欠失ｐ５３を全く含有しないことを明らかに示していた。

結論として、これらＲＮＡおよびタンパク質データは、完全または先端欠失ｐ５３のいずれもホモ接合体で産生されないこと、およびターゲテイングしたｐ５３変異が確かにナル変異を表していることを示している。

Ｂ、ｐ５３ホモ接合マウスは腫瘍感受性であるｐ５３陰性ホモ接合マウスは発生的には正常にみえるが、自然発生的腫瘍形成に対して明らかに感受性である（６力月齢未満のマウスにおいては自然に発生する腫瘍は希である（マジソン（Ｍａｄｉｓｏｎ、　Ｒ，Ｍ、　）ら、Ｊ　、　Ｎａｔ’　１．　Ｃａｎｅ、　Ｉ　ｎ５ｔ４０：６８３〜６８５　（１９６８）；フイタ（Ｍａｉｔａ、　Ｋ、　）ら、Ｔｏｘｉｃｏｌ、　Ｐａｔｈｏｌ、１６　＋３４０〜３４９　（１９８８）ニスクワイア（Ｓｑｕｉｒｅ、Ｒ，Ａ、）ら、バソロジー・オブ・ラボラトリ−・アニマルズ（Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ　ｏｆ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ａｎｉｍａｌｓ）　、Ｖｏｌｕｍｅ　ＩＩ、（ベナーンユケ（Ｂ　ｅｎｉｒｓｈｋｅ、　Ｋ、　）ら編）、１０５４〜１０５５（スブリンガーーフェアラーク、ニューヨーク州、１９７８））　）。

キメラマウスおよび生殖系ｐ５３へテロ接合体およびホモ接合体を腫瘍または他の異常について毎日モニターした。腫瘍の発生率はキメラマウスが１４力月齢であり、最も年のいったベテロ接合体が９力月齢を越え、最も年のいったホモ接合体が約６カ月齢のときに、調べた（表１、年齢は週または月で示す）。その時点で正常なコントロールマウスには腫瘍は観察されず、ホモ接合マウスには種々の腫瘍が検出され（表１；ケース＃１〜２０）、ヘテロ接合マウスでは２つの腫瘍が検出され（表１、ケース＃２１および＃２２）、キメラマウスでは３つの腫瘍が検出された（表１、ケース＃２３および＃２４；ケース＃２３では、表現型が雄のマウスが、認識できる卵巣組織によって取り囲まれた絨毛癌を有していた）。

７０匹以上の野性型マウス、１００匹のへテロ接合体、および６０匹のホモ接合体を分析した。マウス腫瘍に関して集めたデータは、ホモ接合マウスが早期の年齢で腫瘍に感受性であることを示している。６力月までに５０％以上のホモ接合体から腫瘍が発生する。それゆえ、そのようなマウスにおける腫瘍発生率は、変異ｐ５３トランスジーンを有するマウスにおいて１８力月齢までに２０％の発生率が観察されるのに比べるとはるかに高い（ラビゲールら、Ｍｏ１ｅｃ、　Ｃｅ１ｌ、　Ｂ　ｉｏｌ、９・３９８２〜３９９１　（１９８９）　）。４匹のホモ接合マウスは、異なる細胞タイプ起源の複数の原発性（ｐｒｉｍａｒｙ）腫瘍を有することがわかった。より年齢の高いキメラおよびヘテロ接合マウスにおける腫瘍は、単一の変異ｐ５３対立遺伝子を有するマウスも腫瘍に感受性であることを示唆しているが、ホモ接合体に比べると低い割合である。現在のところ野性型のコントロールマウスからは腫瘍の発生は観察されなかった。それゆえ、これら結果は、ｐ５３対立遺伝子の一方または両方の喪失がマウスを癌に対して素因にするという結論を支持している。ホモ接合マウスにおいて同定される種々の腫瘍は、ｐ５３が多くの組織および細胞タイプにおいて腫瘍形成に関与していることを示している。

発育的に正常なみかけを有するにも拘わらず、有意な数のホモ接合体動物が明らかな腫瘍が存在せずに早死した（組織の自己分解のため、ある場合には完全な病理学的分析ができなかった）。これら死亡の幾つかは未解決の感染と係しているように思われ、ホモ接合体において免疫系の微妙な欠陥が存在することを示唆していた。それゆえ、そのような免疫欠陥は、これら動物における促進された腫瘍発生率に貢献し得るように思われる。

本発明を特定の態様と関連して記載したが、さらに修飾することが可能であり、この出願は、一般に本発明の原理に従ってなされる、また、本発明の技術分野における公知または慣用の実施に含まれ、また上記の本質的特徴に適用され、さらには添付の請求の範囲に従うような本発明の開示からの変更を含む、本発明のあらゆる変更、使用、または適用を包含することを意図する。

ＦＩＧ、１ｐ５３−ＮＥＯＲＨ５Ｖ−ＴＫ−［Ｇ４１８Ｒ，ＧＡＮＣ”ＩＦｆＧ、ＩＡｐ５３”　ＮＥＯＲ）ＩＳＶ−ＴＫ”　（Ｇ４１８Ｒ，ＧＡＮＣ５）ＦＩＧ、　１Ｂ１２ｗｔ　１２ｗｔ　ｉ２ｗｔＦＩＣ，３子孫　コントロールＦ　ｉ　０−４＝やプライマ：　１−４ａ　７−１０　β−アクｆン４ｂｌＯ１−１０４ｂ−６ＭＦ　Ｉ　Ｃ，６国際調査報告ｌｎ電・ｎｖｔｉｏ−＾−＋ｏｌ＋ａｍｔｌ＊ｅＮｏ、ＮＷＮａ＠ＨＡコ−１１％フロントページの続き（５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号Ｃｌ２Ｎ　１５／１２（７２）発明者　ブチル、ジャネット・ニスアメリカ合衆国７７０２５テキサス、ヒユーストン、ミスシン４０５１番Ｉ（７２）発明者　スレイグル、ベテイアメリカ合衆国７７００８テキサス、ヒユーストン、ターンバイク１６０幡

Claims

【特許請求の範囲】

１．ゲノムが腫瘍抑制遺伝子の２つの染色体対立遺伝子を含み、該２つの対立遺伝子の少なくとも一方が変異を含有することを特徴とするトランスジェニックまたはキメラ動物細胞。
２．該対立遺伝子の一方が正常な腫瘍抑制遺伝子産物を発現する請求項１に記載の動物細胞。
３．該腫瘍抑制遺伝子がｐ５３遺伝子である請求項１または２のいずれかに記載の動物細胞。
４．ヒト細胞である請求項１に記載の動物細胞。
５．非ヒト動物細胞である請求項１に記載の動物細胞。
６．胚幹細胞である請求項５に記載の動物細胞。
７．ＡＴＣＣ　ＣＲＬ１０６３１であり、該腫瘍抑制遺伝子がｐ５３遺伝子である請求項６に記載の胚幹細胞。
８．ゲノムが腫瘍抑制遺伝子の２つの染色体対立遺伝子を含み、該２つの対立遺伝子の少なくとも一方が変異を含有する動物細胞を有する非ヒトトランスジェニックまたはキメラ動物、または胚期にある該動物の子孫、または該動物の祖先。
９．該腫瘍抑制遺伝子がｐ５３遺伝子である請求項８に記載の非ヒト動物。
１０．該動物細胞がヒト細胞である請求項８に記載の非ヒト動物。
１１．該動物細胞が非ヒト細胞である請求項８に記載の非ヒト動物。
１２．該動物細胞が生殖系細胞である請求項１１に記載の非ヒト動物。
１３．該動物細胞が体細胞である請求項１１に記載の非ヒト動物。
１４．該動物および該動物細胞が同じ種のものである請求項１１に記載の非ヒト動物。
１５．該動物および該動物細胞が異なる種のものである請求項１１に記載の非ヒト動物。
１６．請求項６に記載の胚幹細胞を含有する非ヒト動物、または胚期にある該動物の子孫、または該動物の祖先。
１７．請求項７に記載の胚幹細胞を含有する非ヒト動物、または胚期にある該動物の子孫、または該動物の祖先。
１８．腫瘍抑制遺伝子の存在または発現に帰することのできる動物細胞の特性に影響を及ぼし得ると思われる剤の存在を同定する方法であって、（Ａ）所定量の該剤を細胞培養中の動物細胞に投与し、その際、該細胞は該腫瘍抑制遺伝子の２つの染色体対立遺伝子を含むゲノムを有し、該２つの対立遺伝子の少なくとも一方が変異を含有する：（Ｂ）該投与後、所望の時間、該細胞培養を維持し；（Ｃ）該剤の投与が、該腫瘍抑制遺伝子の該対立遺伝子の存在または発現に帰することのできる該動物細胞の特性に影響を及ぼしたか否かを決定することを特徴とする方法。
１９．該腫瘍抑制遺伝子がｐ５３遺伝子である請求項１８に記載の方法。
２０．該剤が、該動物細胞の腫瘍形成能を増大させ得ると思われる請求項１８に記載の方法。
２１．該剤が、該動物細胞の腫瘍形成能を減少させ得ると思われる請求項１８に記載の方法。
２２．該動物細胞がヒト細胞である請求項１８に記載の方法。
２３．該動物細胞が非ヒト動物細胞である請求項１８に記載の方法。
２４．該非ヒト動物細胞が胚幹細胞である請求項２３に記載の方法。
２５．該胚幹細胞がＡＴＣＣＣＲＬ１０６３１である請求項２４に記載の方法。
２６．腫瘍抑制遺伝子の存在または発現に帰することのできる動物細胞の特性に影響を及ぼし得ると思われる剤の存在を同定する方法であって、（Ａ）所定量の該剤を動物に投与し、その際、該動物は、ゲノムが該腫瘍抑制遺伝子の２つの染色体対立遺伝子を含む細胞を有し、該２つの対立遺伝子の少なくとも一方が変異を含有する：（Ｂ）該投与後、所望の時間、該動物を維持し；（Ｃ）該剤の投与が、該腫瘍抑制遺伝子の該対立遺伝子の存在または発現に帰することのできる該細胞の特性に影響を及ぼしたか否かを決定することを特徴とする方法。
２７．該腫瘍抑制遺伝子がｐ５３遺伝子である請求項２６に記載の方法。
２８．該剤が、該動物細胞の腫瘍形成能を増大させ得ると思われる請求項２６に記載の方法。
２９．該剤が、該動物細胞の腫瘍形成能を減少させ得ると思われる請求項２６に記載の方法。
３０．該動物細胞がヒト細胞である請求項２６に記載の方法。
３１．該動物細胞が非ヒト動物細胞である請求項２６に記載の方法。
３２．該非ヒト動物細胞が胚幹細胞である請求項３１に記載の方法。
３３．該胚幹細胞がＡＴＣＣＣＲＬ１０６３１である請求項３２に記載の方法。
３４．該動物および該動物細胞が同じ種のものである請求項２６に記載の方法。
３５．該動物および該動物細胞が異なる種のものである請求項２６に記載の方法。
３６．動物の細胞のゲノムを変化させることを特徴とする遺伝子治療の方法であって、該細胞が、腫瘍抑制遺伝子の２つの染色体対立遺伝子を含むゲノムを有し、該２つの対立遺伝子の少なくとも一方が変異を含有し、それゆえ該対立遺伝子の少なくとも一方が正常な腫瘍抑制遺伝子産物を発現する細胞を生成することを特徴とする方法。
３７．該動物が非ヒト動物である請求項３６に記載の方法。
３８．該動物がヒトである請求項３６に記載の方法。
３９．該腫瘍抑制遺伝子がｐ５３遺伝子である請求項３６に記載の方法。