JPH06503469A - キシラン分解活性を有する酵素 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 キンラン分解活性を有する酵素 発明の分野 本発明はキンラン分解活性を有する新規なる酵素に関連する。より詳しくは、本 発明はバチルス　２１主玄ム（ｂ且徂旦　ｐｕｍｉｌｕｓ）株から得られうる新 規なキシラナーゼ、その調製方法及びリグノセルロース系パルプの処理のための これらのキシラナーゼの利用に関する。

背景技術 ！Ｘチルス　ニ火スの構成員は知られ、且つ論文に詳細されており、従ってそれ らはキシラナーゼを生産できることが知られている。

タイ国の土壌から特異的に単離された８、　７’３／ＬｚＸ　Ｉｐｏは、Ｐａｎ ｂａｎｇｒｅｄら著（１９８３）　；　Ｊ、Ａｇｒｉｃ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｓ、 　；　４７　（５）、　９５７−９６３　；及びＦｕｋｕｓａｋｉら著（１９８ ４）　；　ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ、　；　１７１　（２）、　１９７１−２０１に かなり説明されている。日本国特許明細書第８６０３９０３６号において、この 且、プミルスＩＰＯキシラナーゼは組換えＤＮＡ工学によって提供されている。

この明細書は動物の飼料の中に含まれているキンランの分解における、又は濁っ たワインもしくはフルーツジュースの清浄化におけるこの酵素の利用について言 及している。リグノセルロース系パルプの処理におけるその有用性の示唆は全く 挙げられていない。

発明の概要 ｌ、プミルス株から得られうる新規なキシラナーゼがこの度明らかにされた。本 発明のキシラナーゼはリグノセルロース系パルプの処理につい〔の優れた特性を 保有する。

従って、その第一の観点において、本発明は特定の部分アミノ酸配列を含んで成 り、且つＤＳＭ株第６１２４号に由来するキシラナーゼと同一の又はそれに部分 的に同一の免疫化学特性を有するキシラナーゼを提供する。

他の観点において、本発明は特定の部分アミノ酸配列を含んで成り、且つバチル ス　プミルスの株から得られうるか、又はその突然変異体もしくは変異体から得 られうるキシラナーゼを提供する。

本発明は更にキシラナーゼを生産する方法を提供し、この方法は、同化性炭素及 び窒素をその他の必須栄養物と一緒に含む栄養培地の中での旦、ス主夾囚株又は その突然変異体もしくは変異体の培養、それに続く所望の酵素の回収を含んで成 る。

更なる観点において、本発明はキシラナーゼを生産する方法であって；キシラナ ーゼをコードするＤＮＡフラグメントを単離し；このＤＮＡフラグメントを適当 なプラスミドヘクターの中の適当な発現シグナルと組合わせ；このプラスミドヘ クターを適当な宿主の中に、自己復製プラスミドとして、又は染色体の中に組込 むようにして導入し：キシラナーゼの発現をもたらすような条件のもとでこの宿 主生物を培養し；そしてこの培養培地からキシラナーゼを回収すること、を含ん で成る方法を提供する。

更に、本発明はリグノセルロース系パルプの処理におけるキシラナーゼの利用に 関する。より詳しい観点において、本発明はリグノセルロース系化学パルプの処 理のための方法であって、ｐＨ６，５以上、好ましくは７．５以上でパルプをキ シラナーゼにより処理し、その後このように処理したセルロース系パルプを第一 塩素化段階において０．２０以下の活性塩素多重度（ｍｕｌｔｉｐｌｅ）にて塩 素により処理する方法を提供する。

図面の簡単な説明 本発明を添付図面を参照しながら更に説明するが、ここで図１は、Ｆｕｋｕｓａ ｋｉら著（１９８４）（前述）に関する旦、プミルスＩＰＯキシラナーゼのアミ ノ酸配列（上部の配列；以降の配列表に示す配列Ｎ１１ｌと同類）と、本発明の キシラナーゼの部分アミノ酸配列（下部の配列；以降の配列表に示す配列隘２〜 ３と同類）の比較を示しくアミノ酸は確立された一文字コードで表示］　；図２ は本発明のキシラナーゼのｐｔ＋プロフィールを示し；図３は本発明のキシラナ ーゼの温度プロフィールを示し；図４は、Ｆｕｋｕｓａｋｉら著（１９８４）　 （前述）に関するＢ、プミルスＩＰＯキシラナーゼのアミノ酸配列（上部の配列 ；以降の配列表に示す配列１１ｋｌＬ１と同類）と、本発明のキシラナーゼの部 分アミノ酸配列（下部の配列；以降の配列表に示す配列阻５〜８と同類）の比較 を示している〔アミノ酸は確立された一文字コードで表示〕。

発明の詳細な開示 本発明は新規なキシラナーゼを提供する。これらの新規なキシラナーゼはリグノ セルロース系パルプの処理に特に有用である。

静−案 本発明の新規なキシラナーゼはバチルス　プミルスＤＳＭ第６１２４号（ブタベ スト条約の規定のもとでトイチェ　ザムルンク　フオンミクロオルガニズメンに １９９０年７月２３日に寄託）又はその突然変異体もしくは変異体より得られう るちのである。

酵素変異体又は突然変異した酵素は、親遺伝子又はその誘導体のＩＩＮＡヌクレ オチド配列の変質により得られる酵素を意味する。この酵素変異体又は突然変異 した酵素は、該酵素をコードするＤＮＡヌク１／オチド配列を適当な宿主生物の 中の適当なヘクターの中に挿入したときに発現且つ生産される。この宿主生物は 親遺伝子が由来する生物と同しである必要はない。

本発明のキシラナーゼは図１及び配列表の配列Ｎα２〜４で示されているアミノ 酸配列を含んで成る。図において、上部のアミノ酸配列はＦｕｋｕｓａｋｉら著 （１９８４）　（前述）に詳細されている旦、プミルスＩＰＯのキシラナーゼを 表わしく配列Ｎｏ、　１　）　、そして下部の配列は本発明のキシラナーゼのア ミノ酸配列に保有されている配列を表わして（する（配列障２〜４）。

下部の配列はキシラナーゼのタンパク質分解の後に見い出せる。

決定された１６３個のアミノ酸残基のうちで、２６個が公開された見。

プミルスＩＰＯのキシラナーゼのアミノ酸配列と異なっていた。図において、こ の二種の配列の間で異なっている位置を太文字で示し、同一のアミノ酸残基は枠 で囲んだ。

本発明のキシラナーゼはＤＳｈ株第６１２４号に由来するキシラナーゼと同−又 は部分的に同一な免疫化学特性を有する。

免疫化学特性は交差反応同定試験によって免疫学的に決定できる。

この同定試験はよく知られたアウターローニーの二重免疫拡散手順によるか、又 はＮ、Ｈ，Ａｘｅｌｓｅｎ著のＨａｎｄｂｏｏｋ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃ ｉｐｉｔａｔｉｏｎ−ｉｎ−Ｇｅｌ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　：　Ｂｌａｃｋｗ ｅｌｌ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ　（１９８３）第５ 及び１４章に従うタンデム交差免疫電気泳動により実施できる。

１抗原的同一」及び「部分的抗原的同一」なる語が前記の木の第５．１９及び２ ０章の中に詳細されている。

本発明のキシラナーゼの分子量は、Ｓ０５−　ＰＡＧＥによる測定に従し）、約 ２２ｋＤａ　と見積もられた。

該キシラナーゼはｐ１１５〜ｐＨ１ｌの範囲のｐＨにおいてキシラン分解活性を 有する。ｐＨ５で９０％以上の比活性が測定された。該キシラナーゼの最適ｐＨ はｐＨ５〜ｐＨ１の範囲にあり、ｐＨ６付近である。

咳キシラナーゼに関する温度プロフィールは非常に広く、そして該キシラナーゼ は顕著な温度最適性を有さない。該キシラナーゼは６０’Ｃでほぼ活性であり、 ４０°Ｃと比較して比活性を約９５％保持する。

最適温度は７０°Ｃ以下であると見い出され、７０″Ｃでは約５％のキシラナー ゼ活性しか保持されない。

精製したキシラナーゼに関するｐｉは８．０〜９．５の範囲内にあり、８．８付 近であることが見い出された。

該キシラナーゼのアミノ酸配列を酸加水分解の後に決定し、そして表１に示す通 り、特にセリン及びグリシンの含有において旦、１ミルスＩＰＯのキシラナーゼ のアミノ酸配列と異なっていることが見い出せた。

濠−−Ｙ 皿−袈 本発明のキシラナーゼはバチルス　プミルス、特に旦、プミルスＤＳ−第６１２ ４号、又はその突然変異体もしくは変異体のキシラナーゼ生産株の培養によって 生産できる。

キシラナーゼ生産性旦、プミルス株は、同化性炭素及び窒素をその他の必須栄養 物と一緒に含む栄養培地の中で好気適条件のもとで培養することができる。この 培地は当業界において知られる原理に従って構成されうる。

培養の間、この細胞はキシラナーゼを細胞外的に分泌するので、キシラナーゼの 回収は、好ましくは例えば濾過又は遠心による、細胞溶解を回避しながら細胞培 地から細胞塊を分離することを含んでいる。

得られる細胞培養物は、例えばエバポレーション又は限外濾過による任意的な濃 縮の後に利用できうる。所望するならば、該キシラナーゼは常法、例えばカラム クロマトグラフィーによって所望の程度にまで分離且つ精製されうる。

該キシラナーゼは本質的に当業界において知られている方法による組換えＤＮＡ 工学によって、例えばキシラナーゼをコードするＤＮＡフラグメントを単離し； このＤＮＡフラグメントを適当なプラスミドヘクターの中の適当な発現ソゲナル と組合わせ；このプラスミドヘクターを適当な宿主（即ち、盃１り」リヒア　２ ’）　（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ匹旦）、又は二±四ス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ） 　、アスベノリしあム属（勧月月匡■Ｕ）もしくはストレプトマイシス属（Σｕ ！ｌ堕□すμ狙）の構成員）の中に、自己複製プラスミドとして、又は染色体の 中に組込むようにして導入し；この宿主生物をキシラナーゼの発現をもたらす条 件のもとで培養し；そしてこの培養培地から該キシラナーゼを回収すること、に よっても得られうる。

該キシラナーゼ゛は日本国特許明細書第８６０３９０３６号に本質的に記載の通 りに生産することもできる。

斐久−！」四刃−二玉Ｊｆｆｌ　’−ビらλ延理本発明のキシラナーゼはリグノ セルロース系パルプの処理にとって有用である。

植物のヘミセルロースの土要成分であるキンランは、β−１，４−キノロース結 合により連結したＤ−キシロースのポリマーである。

キノランは酸又は酵素加水分解によりキシロースとキノローオリゴマーへと分解 されうる。キシランの酵素加水分解は、酸により生成される副産物（例えばフラ ン）を伴うことなく遊離糖を生成する。

パルプ及び製紙工業は、漂白したパルプの白さを高めるため、塩素化段階に用い る塩素の量を減らずため、及び再生紙の処理におけるパルプのｔｉ離度（ｆｒｅ ｅｎｅｓｓ　）を高めるため、漂白工程においてキ支Ｊｕｒａｓｅｋ、−↓、　 （１９８８）　；　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ　ａｎｄ　Ｂｉｏｅｎｇ、、　３２． ２３５−２３９　：Ｐｏ＋＊ｍ１ｅｒ、　Ｊ、Ｃ，：　Ｆｕｅｎｔｅｓ、　Ｊ、 Ｌ、　：　＆をｉｏｍａ、　Ｇ、　（１９８９）　；　ＴａｐｐｉＪｏｕｒｎａ ｌ、１８７−１９１）　。

リグノセルロース系パルプの処理に関する工程は論文において広、Ｎｏｅ、　Ｐ 、　、；−（１９８６）　；　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｗｏｏｄ　Ｃｈｅｍｉｓ ｔｒｙ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ。

６　（２）、　１６７〜１８４．又はヨーロッパ特許出願第３８６，８８８号を 参照のこと。

リグノセルロース系パルプの処理のための本発明のキシラナーゼの利用に関して 、特定の工程が国際特許公開番号ｗｏ　９１１０２８３９号に詳細されており、 この公開内容は本明細書に参考として組込まれる。

本発明を以下の実施例でより詳しく説明するが、これらは本発明の範囲を制限す る意図はない。

実施例１ バチルス　プミル囚−先ｌ立±二九■主意ビ／ｌ ペプトン、Ｄｉｒｃｏ　（商標）６．０酵母抽出物　３．０ Ｐｅｐｔｉｃａｓｅ　（商標）４・０ 牛肉抽出物　１．５ グルコース　１．０ 寒天、Ｍｅｒｃｋ　（商標）　２０．０Ｈ，０１０１００Ｏ オートクレーブにかける前にｐＨを７．３に調整。

オートクレーブは、２５分／１２１°Ｃ０それぞれＡ３−寒天スラントより接種 せしめたＸＹＬ−８培地１５０１を有する１２０本の振盪フラスコを４日間、３ ７°Ｃで、約２Ｃ１１の振幅により２５０ｒｐ曙で培養した。

ＸＹＬ−８培土−一　・ ｇ／ｌ ハクトペブトン、Ｄｉｒｃｏ　（商標）　１０．０酵母抽出物　１０．０ に、）ＩＰｏ、　１５．０ ＨｇｓＯａ　７ＬＯＯ，５ ＫＣＩ　Ｑ、ｌ Ｆｅ５Ｏ−・７Ｈｚ０　０．０１ ぶなの木のキシラン、Ｌｅｎｚｉｎｇ　（商標）６．０オー１〜／７レーブにか ける前にｐＨを７．０に調整。

オートクレーブは２５分／　１２１’ｃ。

この培地を３０分間、４０００ｒｐｍで遠心した（６０００Ａのローターの付い た５ＯＲＶＡ１１、ｌ？ｃ−３Ｒ遠心機）。７．３１の上清液を１０μｍのナイ ロンフィルターで濾過し、次いで門１１１ｉｐｏｒｅ社のＰｅ１ｌｉｃｏｎ装置 により、１０、ＯＯＯＭ−のカットオフ値の膜を用いて限！Ａａ、遇し、次いで 一容量の水で２回洗った。これは５４ｋｌの４Ｗ４物をもたらした。次にこの濃 縮物を凍結乾燥し、これにより８．８ｇの粉末が得られた。

実施例２ １例− 該キンノー）ナーゼを７つの工程で精製した。

杓５００＋＊　ｌの発酵培地を５．０００ｒｐｍで３０分間遠、＋、’−Ｌ、た 。次にその上清液を５０％（ｗ　／　ｗ　）の硫酸“アンモニウムで沈殿させた 。この沈殿物を２０ａ＋Ｍのトリス−）ＩＣＩ　緩衝液、ｐｎ　７．Ｑ中に溶か 二、次いで脱塩し、そして３ｋＤのカットオフ値の膜を伴うＦｉｌｔｒｏｎ限外 濾過器を用いて導伝率が１ｍ、Ｓ、／ｃｍ以下となるまで濃縮した。

この４１ｉ！物を２０１のトリス−１１ｃＩ緩衝液、ｐＨ７，０で平衡にし１こ ２５ｍ１の陰・イオン交換体（Ｑ−セファローズＦ、Ｆ、）に適用した。

素通り画分を同し緩衝液で平衡にした２５１の陽イオン交換体（Ｓ−セファロー ズＦ、Ｆ、　）に適用した。このカラムを、上記の緩衝液２００ｍ１、及び５０ 抛ＨのＮａＣ１が加えられたちの２００ｓ　ｌより成る線状勾配により７容出さ せた。

キシラナーゼ活性を有する両分のほとんどの残留プロテアーゼはｐＨ７，０での アフィニティークロマトグラフィーによって除去された。

この素通り画分に硫酸アンモニウムを２０％（Ｗ／Ｗ）の濃度となるまで加え、 そしてｌｋｌのフェニル−セファローズＣＬ　−４Ｂに適用した。このカラムを 、２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ　緩衝液、ｐＨ７，０，２０％（Ｗ／Ｗ）の硫酸ア ンモニウム７５０ＩＩｌ、及び硫酸アンモニウムを含まないこれと同一の緩衝液 ７５０ｍ　ｌより成る線状勾配により溶出させた。

キシラナーゼ活性を有する画分を、ＤＤＳ　ＧＲ９０ＰＰ膜を伴うＡｍ１ｃｏｎ 限外濾過装置８２００を用いて濃縮した。キシラナーゼの濃度が約１００ｍｇ／ ｍｌ、且つ導伝率が２０ＩＩＳ／ｃ１１となったとき、キシラナーゼは結晶化し 始めた。

収率は１００％近くであった。この結晶を２０＋ｓＭのトリス−）ＩＣＩ　緩衝 液、ｐＨ７，０，２５％（ｗ　／　ｗ　）のグリセロールに溶かした。

実施例３ キシラナーゼ　゛　るための　法 キシラナーゼは、かばの木（ｂｉｒｃｈ）のキンランから遊離する還元糖につい てアッセイすることにより測定した（ＸＵ法）。

このアッセイは、基質として、４０ｍＭのＢｒ１ｔｔｏｎ−Ｒｏｂｉｎｓｏｎｉ ｌ衝液（使用する前に３０分間ｌＯＯ°Ｃで熱処理）の中で調製した０、５％の かばの木のキシラン（ＲＯＴＨＧｍｂｒ　Ａｔｒ、　７５００）を用いて行った 。このアッセイは０．１０抛ｌの酵素溶液１　（３５，１ｇのＮａＪＰＯａ　− ２ＨｚＯ；　４０．ＯｇのＫＮａＣ４ＨａＯｂ　＋　４８ｚＯＣ５００ｎｌの脱 イオン水に懸濁）；４２ｍ１のｆｉＨｚｓＯａ；６、ＯｇのＮａＪＡｓＯ４・７ Ｈ，Ｏ；総容量が１リツトルとなるように脱イオン水を添加）を用いで４０’Ｃ で２０分間行った。　２．０＋＊ｌの脱イオン水を加え、次いで吸光度計（ＰＹ Ｅ　ＩＪｎｉ　ＣＡＭ　ＰＩ　８６００　ｕｖ、’ｖｌｓ、　Ｐｈｌｌｌｉｐｓ 社）により２５０ｎ−での吸光度を測定した。キシロースより作成した標準曲線 （４０−４００μｇ／ｌ）から還元糖を計算した。ＩＸＵは、１１ヌは１ｇの培 養培地当り、１秒間当りに放出されるキシロースｌｎｍｏｌに相当する。

実施例４ ｐｆｌνと斗芋−徴イ水−１丈 キ、・ラナーゼのｐ）Ｉの特徴は、実施例１及び２に従って精製したキシラナー ゼ調製物、並びに実施例３に記載のＸＵ法を利用して決定した。

この特徴付けはｐＨ５〜ｐＨ１ｌの範囲内で行った。全てのアッセイは４０°Ｃ で２０分行った。プロフィールを図２に示す。

この特徴付けより、本発明のキシラナーゼはｐｉ（５〜ｐＨ１１にてキンラン分 解活性を有することが明らかにされた。ｐＨ５では９０％以上の比活性が測定さ れた。ｐＨ１１では１０％以−ヒの比活性が測定された。

該キシラナーゼにとって最適ｐＨはｐＨ５〜ｐ１１７の範囲にあり、ｐＨ６付近 である。

実施例５ 蘇０）　＠−ｆｌ！Ｊｔ−炎を 咳キシラナーゼの温度の特徴は、実施例１及び２に従って精製したキシラナーゼ 調製物、並びに実施例３に記載のＸｌｌ法を利用して決定した。

この特徴付けは４０〜１００°Ｃの温度範囲で行った。全てのアッセイはｐＨ６ で２０分間行った。このプロフィールを図３に示す。

この特徴付けより、温度プロフィールに関する曲線は非常に広く、従ってキシラ ナーゼは顕著の最適温度を有さないことが明らかとなった。

該キシラナーゼは６０°Ｃでほぼ活性であり、４０℃と比較して比活性を約９５ ％保持することが見い出せた。温度の最適は７０°Ｃより低い温度にあることが わかり、７０°Ｃでは５％のキシラナーゼ活性しか保持されなかった。最適性は ３５〜６５°Ｃの範囲内、より詳しくは４０〜６０°Ｃの範囲内にある。

実施例６ 且勿肚道仕ザ 該キシラナーゼのｐｒの特徴は、実施例１及び２に従って精製したキシラナーゼ 調製物、並びにｐｉｔ　３．５〜９．５でのＬＫＢ両性電解性ＰＡＧプレートを 用いて決定した。

電気泳動の後、ゲルを水の中で１回、トリス−緩衝液、ｐｏ　９．０の中で１回 づつ、１５分間にわたって２回洗い、次いで０．５％ノスヘルト小麦（ｏａｔ　 ５ｐｅｌｔ）のキンラン、１％のアガロース、ｐＨ９より成る検出寒天の薄膜を その上に覆った。この覆ったゲルを５０°Ｃで一夜インキュベートした。

コンゴレッド染色を利用してキシラナーゼ活性を識別化させた（０．１％のコン ゴレッドで１０分間染色し、次いでＩＭのＮａＣｌ中で１５分間、２回脱色した ）。

精製キシラナーゼに関するｐＩは８以上であり、８．０〜９．５の範囲内であり 、８．８付近であることが見い出せた。

実施例７ ヱまム皿■死 旦、プミルスのキシラナーゼに由来するペプチドを得る及びソーケンス化する標 準的な方法（Ｆｉｎｄｌａ　ａＧｅｉｓｏｗ　（Ｗ）　（１９８９）　；　Ｐｒ ｏｔｅｉｎｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ−実用的な手法；　ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ　）を 利用し、１６３個のアミノ酸残基が同定された。更に、Ｃ末端のアミノ酸はイソ ロイシンとして同定された。

精製した酵素の直接的なシーケンシングの間に、このＮ末端は部分的にブロック されていることが見い出された。

Ｂ、プミルス　キシラナーゼの部分配列対旦、プミルスＩＰＯキシラナーゼ（Ｐ ｕｋｕｓａｋｉら著（１９８４）前述）のアミノ酸配列の並びを図１に示す、全 部で２６箇所の相違が見い出され、そしてそれを太文字で示す、同一のアミノ酸 残基で占められている２つの配列における位置を枠で囲んだ、上記の２６個のア ミノ酸の他に、本発明の８．７’Ｓ／ｌ／Ｘ　キシラナーゼのＣ末端は、且、プ ミルスＴＰＯキシラナーゼに関して詳細されているものよりアミノ酸残基が２個 少なかった。

実施例８ ヱｌム並皿爪 酸加水分解〔門ｏｏｒｅと５ｔｅｉｎ　（１９６３）　；　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅ ｎｚｙｍｏｌ、６．、８１９−８３１］の後、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔ ｅ＋ｗｓ　４２０Ａアミノ酸分析システムを用いて旦、プミルス　キシラナーゼ のアミノ酸組成を決定した。加水分解混合物中のアミノ酸は、フェニルイソチオ シアネートによるプレカラム誘導化の後での逆相）ＩＰＬＣを利用して定量した （ＨｅｉｎｒｉｋｓｏｎとＭｅｒｅｄｉｔｈ　（１９８４）　；　Ａｎａｌ、Ｂ ｉｏｃｈｅｍ、１３６．　６５−７４　’Ｊ　。

トリプトファンの量は、Ｅｄｅｌｈｏｃｈの方法（Ｅｄｅｌｈｏｃｈ　（１９６ ７）　；Ｂｉｏｃｈｅ＋５ｉｓｔｒｙ　６　、１９４８〜１９５４）を利用して 吸光度的に決定した。

キシラナーゼにおける独立システィン（Ｃｙｓ）残基の存在は、５゜５′−ジチ オビス−（２−二トロ安息香酸）による滴定を介して決定したＣ７　（１９８３ ）　；　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、但、　４９−６０　）　。

酸加水分解後での微量のみでのシスティンの存在は、ジスルフィド架橋の存在を Ｐ測させる。

まとめた結果を表１に示（−でいる。更に、該−３、１区り火）、キノ酸組成と の比較を示し、これはいくつかの相違、特にセリン（Ｓｅｔ　）及びグリシン（ Ｇｌｙ）の含有量における相違を示している。

実施例９ リグノセルロースニバルブの几 未漂白の硬質材ブラウンストンクを以下の条件でｙ＜　％　）（７Ｘ　７’　３ 旦から調製したヘミセルラーゼ（実施例１に従って生産）により処理した： 時　間二も＝３時間 温度：Ｔ＝５０°Ｃ ｐＨ：ｐＨ＝８゜０ 稠度：ＤＳ＝１０％ 投入量：　７１５ＥＸ［＋／ドライパルプのｋｇ酵素処理の後、バルブを水で洗 い、そして３段階の漂白工程、（Ｃ５０Ｃ３０）　Ｅ　Ｄにおいて漂白した。

コントロールは、同一の方法であるが酵素の添加を伴わずに処理した。

以下の表２は酵素処理の後のバルブのカッパー値を示す。

（０５０Ｃ３０）　Ｅ　Ｄ漂白工程は以下の条件のもとで行った：朝と１１時間 ：ｔ＝２０分 温度：Ｔ−ｓｏｏＣ 稠度：ＤＳ＝５％ 置　換−Ｃ１０□（活性塩素として）で５０％塩素多重度：　０．２０ 五二殺階　時　間゛Ｉ−川時開 時間：Ｔ−６０°Ｃ 稠度＋ＤＳ＝ｌＯ％ ＮａＯＨ投入！＝ドライパルプに基づいて２．０％（ｗ　／　ｗ　）ｐニ一段錯 −時　間＝し一３時間 温度・’ｒ＝７０°Ｃ 稠度：ＤＳ−１０％ 両者のバルブとも、　（０５０Ｃ３０）　ＩＥ段階の後には３．５のカノノぐ一 値まで漂白された。コントロールにとっては、２．８％（ｗ　／　ｗ　）の活性 塩素がこのカッパ・−値となるために（０５０Ｃ３０）一段階において必要とさ れた。酵素処理したバルブにとっては、３．５のカッパー値となるために２．３ ８％（Ｗ／Ｗ）の活性塩素のみを必要とした。これは、所望のカッパー値に到達 するだめの、コントロールと比較しての、酵素処理パルプにとっての活性塩素（ ａｃｌ）の１４％の削減に相当する。

最後のＤ一段階において、　（０５０Ｃ３０）　Ｈの後に３．５のカッパー値を 有する両者のバルブを、その対応の明るさの最高限度にまで漂白させる。

酵素処理したバルブに関しては、バルブを明度８７．２％（ＩＳＯ）の明るさに するには０９９％（ｗ、／ｗ）の二酸化塩素の投入量が必要とされる６−フント ロールに関しては、８５％（＋５０）の最終明度が達せられるＧこは１．２％（ ｗ／ｗ）の二酸化塩素の投入量が必要とされる。このこ七：よ、この酵素処理か 最終り段階における二酸化塩素の投入量を１７５％少なくし、且つ同時にバルブ の明度の最高限度を２．２％のＩｓＯ明度で高めることをＩｉ丁能とすることを 示している。

バルブの酵素処理は強度又は収率の低下のいづれをももたろさない。

実施例１Ｏ リグノセルロースニバルブのル Ｏ７脱リグニン化クラフト松林パルプを以下の条件にて、Ｌ±上−み　ブー肛匹 λから調製した精製へミセルラーゼ調製物により処理した（実施例１に従って生 産し、且つ実施例２に従って精製）二時　間、Ｌ−３時間 温　度：Ｔ＝５０°Ｃ ｐＨ：　ｐＨ＝８．５ 稠　度：ＤＳ＝１０％（重量） 投入量・８１５ＥＸｌｊ／ドライパルプのｋｇＢｒｉｔｔｏｎ−Ｒｏｂｉｓｏｎ 緩衝液を用いてｐＨはコントロールした。酵素処理の後、バルブを水で洗い、そ して二段階の漂白工程（０５０Ｃ３０）　Ｅで漂白した。

コントロールは同一の方法であるが、酵素溶液の代わりに脱鉱物水を添加して処 理した。

以下の表３は酵素処理後のバルブのカッパー値を示す。

二酸化塩素の５０％置換を利用し、以下の条件で（Ｃ５０Ｃ３０）　Ｅ漂白段階 を行った。

（０５０Ｃ３０）一段階　Ｅ一段階 温度＝４０°Ｃ６０°Ｃ 時　間　２４５分　６０分 稠度：　５％　１２％ （０５０Ｃ３０）−一段階における塩素の多重度は０．２０とし、これは２．９ ８％の活性塩素（ａＣｌ）と同じである。Ｅ一段階に適用したＮａＯＨの量は（ ０５０Ｃ３０）一段階における活性塩素（ａｃｌ）の投入量に従って調整し、即 ち ０．５（％Ｃ１十％ＣＩＯ□）＋０．３　＝　１．８％とした。

（０５０Ｃ３０）　Ｅ段階の後、パルプのカッパー値を測定した。その結果を以 下の表４に示す。

パルプの酵素処理は強度又は収率の低下をもたらさなかった。

本実施例は、本発明の精製酵素調製物の漂白促進作用を実証する。

配列表 （１）一般情報： （ｉ）出願人：ノボ　ノルディスクＡ／Ｓ、　ＮＮ（１１、発明の名称：新規酵 素 （ｊｉ）配列の数二８ （２）配列ＮＯ：ｌの情報： （ｉ）配列のｖＦ徴。

（Ａ）長さ＝２０１個のアミノ酸 （Ｂ）種類二アミノ酸 （Ｃ）鎖　ニー末鎖 （Ｄ）トポロジー・直鎖 （１１）分子の型：タンパク譬 （ｖｉｌｌ起源： （Ａ）生物：バチルス　プミルス （Ｂ）株　：　ＩＰＯ （ｘ）公開物の情報： （Ａ）著者：　Ｆｕｋｕｓａｋｉ、　Ｅ。

Ｐａｎｂａｎｇｒｅｄ、　Ｈ。

５ｈｉｒ＋＋ｓｙｏ、　Ａ。

０ｋａｄａ、　Ｈ。

（Ｂ）題名：バチルス　プミルスのキシラナーゼ遺伝子（ｘｙｎＡ）の完全ヌク レオチド配列 （Ｃ）雑誌：　ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ。

（Ｄ）巻　：１７１ （Ｅ）号　：２ （Ｆ）頁　：　１９７−２０１ （Ｇ）日付け：　１９８４ （ｘｉ　）配列の詳細：配列ＮＯ：ｌ：Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｔｒｐ　Ｌｙｓ　Ａｓ ｐ　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｍｅｔ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ａｓ ｎ　Ａｓｎ　ＧｌｙＧｌｙ　Ａｌａ　Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｔｒｐ 　Ａｓｎ　Ａｓｎ　Ｉｌｅ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　Ａｒｃ Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｐｈｅ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ａｒｇ　 Ｔｈｒ　Ｈｉｓ　Ｈｉｓ　Ｇｌｎ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ１ｉｅ　Ｓｅｒ　ｌ ｉｅ　Ａｓｎ　Ｔｙｒ　Ａｓｎ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｐｈｅ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　Ｓ ｅｒ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ｔｙｒ（ｖ）フラグメントの弘Ｉ・力無 Ａｓｎ　Ｇｉｎ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｉｌｅ　Ｉｌｅ　Ｇｌｙ　ｌｉｅ　Ａｌａ　 Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　Ｌｙｓ　Ｇｉｎ　Ｔｙｒ　Ｔｒｐ　５ｅｒ（２）配列ＮＯ：２ の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ・２８個のアミノ酸 （Ｂ）種類：アミ７ノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖 （Ｖ）フラグメントの型：Ｎ−末端 （ｖｉ）起源： （Ａ）生物：バチルス　プミルス （Ｂ）株　・ＤＳＭ　６１２４ （ｘｌ）配列の詳細：配列ＮＯ：２： （２）配列Ｎ０＝３の情報： （１）配列の特徴： （Ａ）長さ２３１個のアミノ酸 （Ｂ）種類、アミノ酸 （Ｄ）トポロジー・直鎮 （２）配列Ｎｏ二５の情報： （１）配列の特徴・ （Ａ）長さ、１６個のアミノ酸 （Ｂ）種類二アミノ酸 （Ｃ）鎖　ニー末鎖 （Ｉ））ｌ−ポロンー：直鎖 （１１）分子の型：ペプチド （ｌフラグメントの型：内部 （ｘｉ　）配列の詳細、配列ＮＯ＋５：（２）配列ＮＯ：６の情報： （１）配列の特徴： （Ａ）長さ・２３個のアミノ酸 （Ｂ）種類二アミノ酸 （Ｃ）鎖　ニー末鎖 （Ｄ）トポロジー、直鎖 （１１）分子の型：ペプチド （Ｖ）フラグメントの型；内部 （ｘｉ）配列の詳細・配列〜０：６： （２）配列ＮＯニアの情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ１８個のアミノ酸 （Ｂ）種類二アミノ酸 （１１）分子の型・ペプチド （Ｖ）フラグメントの型：内部 （ｘｉ　）配列の詳細：配列ＮＯニア：（２）配列Ｎｏ二８の情報： （ｉ）配列の特＠： （Ａ）長さ：５個のアミノ酸 （Ｂ）種類二アミノ酸 （Ｃ）鎖　ニー末鎖 （Ｄ）トポロジー二直鎖 （＋１）分子の型：ペプチド （Ｖ）フラグメントの型：内部 （ｘｉ　）配列の詳細：配列Ｎｏｂｓ：Ｂ、プミルスキシラナーゼのｐＩＩプロ フィール４　５　６　フ　８　９　１０　１１　１２Ｈ Ｂ、プミルスキシラナーゼ 比活性２ 温度°Ｃ 補正書の翻訳文提出書 （特許法第１８４条の８） 平成５年２月２２日

Claims (19)

【特許請求の範囲】
1. １．図１及び配列表の配列ＮＯ：２〜４に記載の部分アミノ酸配列を含んで成り 、且つ株ＤＳＭ第６１２４号に由来するキシラナーゼと同一又は部分的に同一な 免疫化学特性を有するキシラナーゼ。
2. ２．図１及び配列表の配列ＮＯ：２〜４に記載の部分アミノ酸配列を含んで成り 、且つバチルスプミルスの株又はその突然変異体もしくは変異体から得られるこ とができるキシラナーゼ。
3. ３．株ＤＳＭ第６１２４号又はその突然変異体もしくは変異体より得られうる、 請求項２に記載のキシラナーゼ。
4. ４．約２２ｋＤａの分子量を有することを特徴とする、請求項１〜３のいづれか １項に記載のキシラナーゼ。
5. ５．ｐＨ５〜７の範囲におけるｐＨ最適性、７０℃以下の温度最適性；及び８． ０〜９．５の範囲におけるｐｌを有することを更に特徴とする、請求項１〜４の いづれか１項に記載のキシラナーゼ。
6. ６．図４及び配列表の配列ＮＯ：５〜８に記載のアミノ酸配列を含んで成るキシ ラナーゼ。
7. ７．バチルスプミルスのキシラナーゼ生産株より得られうる、請求項６に記載の キシラナーゼ。
8. ８．Ｂ．プミルスのＤＳＭ第６１２４号又はその突然変異体もしくは変異体より 得られうる、請求項６又は７のいづれかに記載のキシラナーゼ。
9. ９．請求項１〜８のいづれか１項に記載のキシラナーゼを生産する方法であって 、同化性炭素及び窒素をその他の必須栄養物と一緒に含む栄養培地の中でのＢ． プミルス又はその突然変異体もしくは変異体の株の培養、それに続く所望の酵素 の回収を含んで成る方法。
10. １０．Ｂ．プミルスＤＳＭ第６１２４号又はその突然変異体もしくは変異体の株 の培養を含んで成る、請求項９に記載の方法。
11. １１．キシラナーゼをコードするＤＮＡフラグメントを単離し；このＤＮＡフラ グメントを、適当なプラスミドベクターの中の適当な発現シグナルと組合わせ； このプラスミドベクターを適当な宿主の中に、自己複製プラスミドとして、又は 染色体の中に組込まれるようにして導入し；この宿主生物をキシラナーゼの発現 をもたらすような条件のもとで培養し；そしてこの培養培地からキシラナーゼを 回収すること、を含んで成る、請求項１〜８のいづれか１項に記載のキシラナー ゼを生産する方法。
12. １２．宿主生物がエッシェリヒアコリであるか、又はバチルス属、アスペルギル ス属もしくはストレプトマイシス属の構成員である、請求項１１に記載の方法。
13. １３．リグノセルロース系パルプの処理における、請求項１〜８のいづれか１項 に記載のキシラナーゼの利用。
14. １４．リグノセルロース系パルプをｐＨ６．５以上、好ましくは７．５以上でキ シラナーゼにより処理し、その後このようにして処理したセルロース系パルプを 塩素により、第一塩素化段階において、０．２０以下の活性塩素多重度で処理す る、リグノセルロース系化学パルプの処理のための請求項１３に記載の方法。
15. １５．キシラナーゼ処理を４０〜１００℃、好ましくは４０〜８０℃、より好ま しくは５０〜７０℃の温度で行う、請求項１４に記載の方法。
16. １６．キシラナーゼ処理を１５分〜２４時間、好ましくは３０分〜５時間、最も 好ましくは３０分〜３時間の時間にわたって行う、請求項１３〜１５のいづれか １項に記載の方法。
17. １７．キシラナーゼ処理を５〜３５％、好ましくは８〜２５％、最も好ましくは ８〜１５％の稠度で行う、請求項１３〜１６のいづれか１項に記載の方法。
18. １８．キシラナーゼ処理と塩素処理の間に（ＥＯＰ）処理を導入する、請求項１ ３〜１７のいづれか１項に記載の方法。
19. １９．塩素多重度が０．１０〜０．２０である、請求項１３〜１８のいづれか１ 項に記載の方法。