JPH06502550A

JPH06502550A - αラクトアルブミンを符号化するＤＮＡ配列及び使用方法

Info

Publication number: JPH06502550A
Application number: JP5504341A
Authority: JP
Inventors: ブレック，グリゴリー　ティー; ブレメル，ロバート　ディー
Original assignee: ウィスコンシン　ミルク　マーケティング　ボード
Priority date: 1991-08-13
Filing date: 1992-08-06
Publication date: 1994-03-24
Anticipated expiration: 2020-09-21
Also published as: DK0555435T3; EP0555435A4; AU663101B2; EP0555435A1; DE69230135D1; EP0555435B1; JP3698369B2; WO1993004165A1; DE69230135T2; US5850000A; IL102783A0; NZ243930A; CA2093659A1; AU2411992A; ATE185596T1; US5530177A; CA2093659C

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 αラクトアルブミンを符号化するＤＮＡ配列及び使用方法発明の背景本発明は概略中αラクトアルブミンを符号化するＤＮＡ配列及び遺伝的処理された又は遺伝子導入された乳を分泌する哺乳動物の乳における組み換えタンパク質を含むタンパク質の生産方法に関する。

本発明はまた組み換えタンパク質を分泌する遺伝的処理されたまたは遺伝子導入された哺乳動物に関する。本発明はまた優れた乳を生産する特徴を育する動物を確認するための遺伝的標識形質に係るものである。

引用技術の参照ここで引用される技術の完全な文献引用のために特許請求の範囲に先んする章を参照する。

先行技術の説明 αラクトアルブミンは雌牛の乳牛に見出される主な乳漿タンパク質である（エイゲル他、１９８４）。ｒ乳漿タンパク質」という用語は「乳清」において溶解可能なままな乳タンパク質またはｐＨ４゜６及び２０″Ｃにおける他の乳タンパク質カゼインの沈澱後の乳漿のグループを含む。αラクトアルブミンはこれらの特徴を有する。

αラクトアルブミンは通常乳中の全タンパク質の略２．５％よりなる分泌タンパク質である。αラクトアルブミンは牛移植片培養におけるホルモン調節に応じた乳腺機能の指標（アカース他、１９８Ｉ：グッドマン他、１９８３）及び乳房発育の指標（マクファデン他、１９８６）として使用されてきた。αラクトアルブミンはガラクトシル転移酵素を用いて相互に作用し合って乳糖ラクトースにおいて本質的な役割を演する（プリュー、Ｋ及びＲ，Ｌ、ヒル、１９７５）。ラクトースは乳において重要な要素であり、孔容量オスモル濃度に寄与する。それは雌牛の乳において最も一定な成分である（ラルソン他、１９８５）。αラクトアルブミンは培養された乳房組織における乳汁産生の指標として役に立つ（マクファーデン他、＋９８７）。よってαラクトアルブミンが乳産出を制御するのに重要なタンパク質であり乳房機能の指標として使用され得ると信じられている。

牛αラクトアルブミンのイクスブレツシ３ンは乳牛におけるポテンシャルレートリミテイング過程でよい。αラクトアルブミン遺伝子のより大きいイクスブレッションがなされ得る場合、より多くの乳及び乳タンパク質か生産され得た。言い換えれば、αラクトアルブミンはポテンシャル定量形質位置（ＱＴＬ）である。

発明の要約本発明の目的は牛αラクトアルブミンのイクスブレツションにおける可能遺伝子較差を検出するにある。

本発明の他の目的は規定されたヌクレオチド配列を育する乳房の特定の牛αラクトアルブミンタンパク質を符号化するＤＮＡ配列を提供するにある。

αラクトアルブミン制御領域よりなり乳房組織において特別に活性化される構成物の一以上の複製物の合体を遺伝的処理する方法を提供することがまた本発明の目的である。

これらの目的等は本発明が目指すものであり、それは規定されたヌクレオチド配列を有する牛αラクトアルブミンを符号かするＤＮＡ配列を目指している。

本発明はまたこのＤＮＡ配列よりなるイクスブレツションベクターを目指している。更に、本発明はヌクレオチド配列を有するタンパク質αラクトアルブミンを目指している。

本発明はまた哺乳動物に遺伝子的に合体されたときにその哺乳動物の雌種が所望の組み換えタンパク質をその乳中に生産することを許容する乳房の特定のαラクトアルブミン制御領域よりなるイクスブレッションシステムを目指している。

本発明はまた牛αラクトアルブミンを符号化する規定されたＤＮＡ配列よりなる遺伝子的処理されたまたは遺伝子導入された哺乳動物を目指している。

本発明はまたαラクトアルブミンに関して暗号化するＤＮＡ配列を目指しており、それは乳房の特定のαラクトアルブミンタンノくり質制御に関して暗号化するイクスブレツションシステムまたは乳中または乳房組織中で特別にαラクトアルブミンを活性化するあらゆる制御領域と、乳房組織内のαラクトアルブミンの分泌及び成熟を許容するシグナルペプチドに関して暗号化するＤＮＡ配列を用いて操作的にリンクしている。

本発明はまた乳中または乳房組織中で特別にαラクトアルブミンを活性化するα ラクトアルブミン制御領域よりなる構成物の一以上の複製物の合体を遺伝子的に処理する過程を目指している。制御領域は乳房組織内のαラクトアルブミンの分泌及び成熟を許容するシグナルペプチドに関して暗号化するＤＮＡ配列を用いて所望の組み換えタンパク質に関して暗号化するＤＮＡ配列に操作的にリンクしている。

本発明はまた外因性組み換えタンパク質の哺乳動物の乳への生産及び分泌の過程を目指している。過程は遺伝子的に処理されたまたは遺伝子導入された哺乳動物における乳の生産を含む。乳はαラクトアルブミン制御領域よりなるイクスブレッションシステムによって特徴付けられる。制御領域は乳房組織内の組み換えタンパク質の分泌及び成熟におけるペプチド効果に関するシグナルに関して暗号化するＤＮＡ配列を用いて組み換えタンパク質に関して暗号化する外因性ＤＮＡ配列と操作的にリンクしている。乳は使用するために集められる。その代わりとして、乳から外因性組み換えタンパク質が分離される。

本発明はまた牛αラクトアルブミンを符号化し規定されたヌクレオチド配列を有するＤＮＡ配列よりなる動物を生産する優れた乳及び乳タンパク質を確認する選択特徴を目指している。

本発明はまた哺乳動物を生産する優れた乳及び乳タンパク質を確認する選択特徴を目指している。哺乳動物は哺乳動物のＤＮＡ構造における遺伝的材料によって特徴付けられる。遺伝的材料は牛αラクトアルブミンに関する少なくとも一つの所望の優性選択可能標識を符号化する。そのような標識の一つはアデノシンであり、それはαラクトアルブミンの関するＤＮＡ配列の制御領域上の一１３位置に位置する。本発明はまた前述の選択特徴を確認することよりなる動物における優れた乳及び乳タンパク質を予測する方法を目指している。

本発明は更に規定されたヌクレオチド配列を有する牛αラクトアルブミンを符号化するＤＮＡ配列を装着することよりなる哺乳動物における乳組成変更方法を目指している。

ＤＮＡ配列とそれを使用する様々な方法は酪農業者、人工受精組織、遺伝的標識会社、及び受精卵移植及びクローニング会社等が利用するのに潜在的に有益であろう。

この遺伝的標識の利用は優れた核移植受精卵の確認及びクローンするための優れた受精卵の確認を含む。

本発明はまた種雄の後代検定において補助的役割を果たす。規定されたＤＮＡ配列は乳生産及び乳タンパク質生産の見地から可能な優良種雄を確認するための遺伝的標識として使用され得る。これは優秀な乳牛の購入の信頼性を向上させる。

本発明はまた種雄選択及び選択的淘汰等の農業経営管理決定において補助的役割を果たす。生理的標識は雌牛の血統に加えて将来の生産性能を決定するにあたって補助的役割を果たす。この情報から、本発明のαラクトアルブミンを符号化するＤＮＡ配列を用いて若雌牛を購入または保存し、適当な配列無しに若雌牛を淘汰することを考慮することかできる。

図面の簡単な説明図１は本発明の牛αラクトアルブミンの部分限定マ・ツブの図である。配列は５ °　フランキング領域の２．０キロベース、暗号づけ領域の１．７キロベース及び３゛　フランキング領域の８．８キロベースを含む。Ｈｐａ　Ｉとの消化は全ての５°　フランキング領域を含む２．８キロベ一ス断片を産出する。

図２はプラスミドＡラクＰｒｏ／ｐＩＣ２ＯＲのマ・ノブの外形図を示す。ゲノミッククローンのＨｐａ　Ｔ断片はｐＩＣ２ＯＲのＥｃｏＲＶ部位に装着される。Ｈｐａ　Ｉ断片は５゛フランキングＤＮＡの２．１ｋｂ、αラクトアルブミンのシグナルペプチド暗号づけ領域及び成熟ａラクトアルブミンタンノくり質を符号化する８ベースを含む。配列に対して様々な遺伝子を付着するために６個のユニーク酵素部位が利用できる。

図３はプラスミドｐＩＣ２０ＲのＥｃｏＲＶ部位においてクローンされたαラクトアルブミン５°　フランキング領域の詳細マ・ノブ図である。（配列ＩＤ　ＮＯ：１．配列ＩＤ　ＮＯ：２）図４は８．０キロベ一スＢｇｌ　ＩＩ断片の詳細マ・ツブ図である。

図５は牛αラクトアルブミンタンパク質の制御０／エンハンサー領域のヌクレオチド配列（配列ＩＤ　ＮＯ：３）を示す。

図６は牛αラクトアルブミンー牛βカゼイン遺伝子構成物を含むプラスミドのマツプの外形図である。

図７は４つのヌクレオチド配列突然変異の３つをかこむ、推定ステロイド反応要素に関する本発明米国牛配列（配列　ＩＤ　Ｎｏ：４）１人間配列（配列　ＩＤ　ＮＯ：５）及びフランス牛（配列ＩＤ　Ｎｏ・６）の間並びにＲＮＡポリメラーゼ結合領域に関する本発明米国牛配列（配列　ＴＤ　ＮＯニア）、人間配列（配列　ＩＤ　ＮＯ：８）及びフランス牛（配列　ＴＤ　ＮＯ：９）の間の牛αラクトアルブミンタンパク質の５゛　フランキング領域（こお（する人間と牛との遺伝子の配列比較を示す。

図８は牛αラクトアルブミン５゛　フランキング配列を人間αラクトアルブミン配列の同じ領域と比較したＤＯＴＰＬＯＴＴＭグラフである。

図９は牛αラクトアルブミン５゛　フランキング配列をてんしくわずみαラクトアルブミン配列の同じ領域と比較したＤＯＴＰＬＯＴ１グラフである。

図１Ｏは牛αラクトアルブミン５°　フランキング配列をう・ストαラクトアルブミン配列の同じ領域と比較したＤＯＴＰＬＯＴ”グラフである。

図１１は３つのαラクトアルブミン遺伝子導入マウスラインの各々において見たイクスブレツションレベルを示すグラフである。

図１２はＭｎ　Ｉ　Ｉ消化されたＰＣＲ生成物の４％ニューシーブオートラジオグラフィックゲルである。

図１３は図１２における各データと更に３つの遺伝子覆の各々の関する平均値との散布区分を示す図である。

好ましい実施例の詳細な説明説明において次の用語を使用する：遺伝的処理、操作または変更：　細胞の外で生成された核酸分子をあらゆるウィルス、細菌性プラスミドまたは他のベクターシステムに装着しそれによってそれらの合体をそこではそれら：よ通常発生しないがそれらは少なくとも宿主生体の寿命の間に連続して増殖することができる宿主生体へ許容することによる材料の新たな組み合わせの構成体。この用語は遺伝子導入変化を組み入れるが、ゲノミック配列の操作は永続的でなくてはならなＩ、ｓとし１つこと（よなり）、即ち、遺伝的処理は直接操作される動物のみ（＝影響を及１ｆす。

遺伝子導入動物：新たなりＮＡ配列を卵の付加によって生殖細胞系へ導入することによって生産される永続的遺伝的処理された動物。

発明に関してあらゆる哺乳動物を使用することは本発明の範囲内である。哺乳動物の例は雌牛、羊、やぎ、マウス、雄牛、らくだ、水牛、ラマ、及びブタを含む。好ましい哺乳動物は大量の乳を生産し長い乳分泌期間を育するものを含む。

本発明は牛αラクトアルブミンを符号化する遺伝子を０指している。この遺伝子は分離され特徴付けられている。遺伝子の５′　フランキング領域は遺伝的処理された哺乳動物を生産するにおいて乳房の特定の制御領域として使用するための６ベクターにクローンされている。この制御領域の調節のより深い理解のために５°　フランキング領域の２．０キロベースが配列されている。αラクトアルブミン５′　フランキング配列は遺伝的処理されたまたは遺伝子導入された哺乳動物の乳において新規で有用なタンパク質のイクスブレッションを促進することができたであろう処理遺伝的構成物に関する有用な乳房に特有な「制御／エンハンサ−複合体」として作用する。

この結果、乳生産及び乳中のタンパク質組成が増加し、乳及び／または乳中のタンパク質組成が変化し、遺伝的処理されたまたは遺伝子導入された哺乳動物の乳牛で様々なタンパク質が生産される。このようなタンパク質はインシュリン、成長ホルモン、成長ホルモン放出因子、ソマトスタチン、組織プラスミノーゲン活性化因子、腫瘍壊死因子、リポコルチン、凝固因子ｖＩＩＩ及びＩＸ、インターフェロン、コロニー刺激因子、インタールケンス、ウロキニーゼ、セルラーゼ等の工業酵素、ヘミセルラーゼ、パーオキシダーゼ、及び熱安定エクザイムを含む。

αラクトアルブミン遺伝子はそれが乳房の特有なタンパク質５′制御領域であるためその過程において好ましい遺伝子である。それはまた全ての乳タンパク質の乳分泌制御を最も厳しく作用させる。

更に、それは他の乳タンパク質から独立して調節され乳分泌動物によって多量に生産される。

全配列乳タンパク質牛αラクトアルブミンを符号化する遺伝子は牛ゲノミックライブラリから分離された（ウオイチック、１９８２）。

チャロン２８ラムダライブラリは牛αラクトアルブミンｃ　ＤＮＡ（ハーレー、１９８７）及び７７０ベ一スベアαラクトアルブミンポリメラーゼ連鎖反応産出物を使用して厳密に調べられた。ポジティブラムダクローンは装着された牛配列の１２．５キロベースを含み、５′フランキング（制ｉ！０／エンハンサ−）領域の２．０キロベース、１．　７キロベ一ス暗号づけ領域及び３′フランキング領域の８．８キロベースからなる。クローンの部分限定図を図１に示す。

シグナルペプチド暗号づけ領域に沿った２、０キロベースを含む２．８キロベースＨｐａ　Ｉ断片はプラスミドｐｌｃ　２ＯＲのＥｃｏＲＶ部位にクローンされた。そのプラスミドは図２の外形図に示される。

２．０キロベース５°　フランキング制御領域、１．７キロベ一ス暗号づけ領域、３゛　フランキング領域の３．０キロベース、ラムダＤＮＡの１．　２キロベースを含む８．　０キロペニスＢｇｌ　ＩＩ断片はまた分離された。８．０キロベ一ス断片のマツプの関して図４を参照されたし。遺伝子導入マウスがＢｇｌ　ＩＩ断片を使用して生産された。

制御／エンハンサ−領域２．０キロベース５゛　フランキング領域がベクターＰｉｃ　２０Ｒ及びブルースクリプトＫＳ＋ヘクローンされた。ｐｌｃ　２０ＲのＥｃｏＲＶ部位においてクローンされたαラクトアルブミン５′フランキング制御領杯の図が図２及び図３に示される（配列　ＩＤＮ０：１．配列　ＩＤ　ＮＯ＋２）。

シグナルペプチド暗号づけ領域の下流に存する構成物のマルチプルクローニング部位は様々な遺伝子がαラクトアルブミン制御領域に付着することを許容する。

よ−ってこのベクターは遺伝子の特定の暗号化された配列の容易な付着を許容する。それは乳中のタンパク質のイクスブレソソヲンに必要な全ての要素、即ち、乳房の特定な制御領域、乳房の特定のソゲナルペプチド暗号づけ領域及び乳腺に割は入ることかできる成熟したタンパク質のシグナルベブ千ド接合部位を含む。

ベクターはまたクローニングを容易にするために多数のユニーク制限酵素部位を含む。この制御領域への遺伝子の付着はこれらの構造物か哺乳動物に配置されたときに遺伝子の乳房イクスブレノノヨンを許容する。これらのベクターはまた乳分泌する動物の乳ヘイクスプレスされたタンパク質が適当に移動することを許容するαラクトアルブミンシグナルペプチド暗号づけ配列を含む。

制ｔａＩ＋領域＋１１１造物は遺伝子導入マウスにおける所望のタンパク質の乳房イクスブレソンヨンを促進した。１ｍｇ／ｍｌを超える牛αう酵素ばかりでなく牛βカゼイン遺伝子に付着された２　０キロベースを含む構造物（ボウリンク、Ｊ、他、１９８８）が我々の研究所で生成された。図６は牛αラクトアルブミン牛βカゼイン遺伝子構造物を含むプラスミドの図である。牛βカゼイン遺伝子を含むアノミックＤＮＡ配列は牛αラクトアルブミン５′フランキング配列の５゛　フランキング配列に付着された。そのベクターは５゛　フランキングＤＮＡの略！００ベースペアに沿ったβカゼインのポリアゾニレ−ジョン部位を含む。

５゛　フランキングＤＮＡの１００ベースベアはにおいて一１００位置牛αラクトアルブミン５′フランキング領域に付着される。その構造物はβカゼインの近位プロモータ要素とαラクトアルブミンの遠位制御領域要素とを使用する。βカゼイン構造物は例に示される如く遺伝子導入マウスの生産に使用されてきた。

制御／エンハンサ−領域の制御の理解のために５゛　フランキング領域の２．０キロベースか配列された。その配列の一本鎖複製物を図５に記載する（配列　ＩＤ　ＮＯ：３）。配列は下線が付されたシグナルペプチド暗号づけ領域と共に５゛から３°迄か記載されて′いる。

調節配列牛αラクトアルブミンの５′　フランキング領域内に含まれる潜在調節配列か確認された。３′　フランキング領域内の他にイントロン内に可能調節領域がある。個々の雌牛の乳及び乳タンパク質生産に関することのあった個体郡において可能配列較差に関して疑わしい制御領域の部分か検査された。αラクトアルブミンの調節領域における較差はαラクトアルブミンｍＲＮＡのイクスブレッションにおける較差に導かれることが予想される。ｍＲＮＡの増加された細胞性含量は結果的に最終的に乳及び乳タンパク質生産の増加に到る乳糖合成における随伴増加と共にαラクトアルブミンタンパク質のイクスブレッションを増加させる。この種の機構はαラクトアルブミンによる乳及び乳タンパク質生産上の主な遺伝子効果と考えて良いであろう。この変化は乳及び乳タンパク質生産における変化に相関的ではなく因果的にリンクしていると見られる。相関的にリンクされた形質は量的形質上の直接衝撃を有する知られていない遺伝子座と密接に連体しているものである。

知られていない品種のフランス雌牛（バイオレット他、１９８７）及び米国ホルスタインの間の配列較差が５′　フランキング領域内の４つの位置で見出された。確認された一つの配列はそれがステロイドホルモン反応要素であったということを示すであろう配列を育する。他の二つの較差はＲＮＡポリメラーゼ結合領域内で注目され４番目は遺伝子のシグナルペプチド暗号づけ領域内で注目された。

これらの配列と哺乳類の遺伝子の知られた制御配列との関係の故に、全ての異形は生産されたｍＲＮＡの量の調節において必要とされると予想されるであろう領域で発生する。更に、３つの領域へ結合する因子において発生する遺伝的異形がまた変化を引き起こすと予想されるであろう。

図７は推定ステロイド反応要素に関する（夫々配列　ＩＤ　Ｎｏ−４，配列ＩＤ　ＮＯ：５．及び配列　ＩＤ　ＮＯ：６）及びＲＮＡポリメラーゼ結合領域に関する（夫々配列　ＩＤ　ＮＯニア。

配列　ＩＤ　ＮＯ：８．及び配列　ＴＤ　ＮＯ：９）本発明米国牛配列１人間（ホール他、１９８７）及びフランス牛（バイオレット、１９８７）の間の５゛　フランキング領域内で観察された配列突然変異体を示す。全ての異形はこの領域を人間αラクトアルブミン遺伝子の同じ領域と比較することによって分かる如く遺伝子の高度に維持された部分において発生する。図７はまた牛遺伝子が異なるその部分か牛と異なる人間の遺伝子の部分と同じであることを示す。これらのデータはそのベースか潜在的に重要な制御領域の部分であることを示す。

転写の最初から一１３位置、即ちシグナルペプチド暗号づけ領域から１３ベースにおける突然変異体の２つの間の明快な鑑別を提供する方法か考案された。その２つの突然変異体は（αラフ（−１３）Ａ）及び（αラフ（−１３）Ｂ）と名付けられる。αラフ（−１３）Ａ遺伝子型は一１３位置におけるアデニンベースでありαラフ（−１３）Ａ遺伝子型は−１３におけるグアニン、チミンまたはシトシンベースの内の何れかである。それらは特定の制限酵素（Ｍｎｉｌ）を使用した増幅されたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）産物の単純な制限酵素消化物を用いて確認され得る。制限酵素Ｍｎ１Ｉの特定性の故に制限分析はこれらの異なる可能性を区別することができない。αラフ（−１３）Ａ対立遺伝子はゲル上で観察されるより小さい帯域を提供する余分なＭｎｌＩ部位を一１３位置に含む。

ＤＮＡの適切な領域を増幅するために、関心の配列をフレームするすりゴヌクレオチドか合成された。これらのオリゴヌクレオチドはそれらの特定化学特徴の故に選択された。これらのオリゴヌクレオチドはαラクトアルブミン遺伝子のフレームされた部分を増幅するためにポリメラーゼ連鎖反応において使用された。オリゴヌクレオチドは次の配列を有する： αラフ配列ｌ　（配列　ＴＤ　ＮＯ：１０）αラフ配列２（配列　ＩＤ　ＮＯ＋１１）５１ＡＧＣＡＴＣＡＧＧＭＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＴＧＧＧＴＧＧＣＡＴＧＧＡＡＴＡＧＧＡＴ　３’制制限片分析（サンブロック、Ｊ、他、１９８９）かい（つかの牛品種から動物を検査するために使用された。多くの品種において、即ち、シャーシー、ガーンジー、ブラウンスイス、シンメンタル及びブラーマン種において、二つの遺伝子型の内のたった一つが見出される。これはαラフ（−１３）Ｂ遺伝子型である。しかし、牛品種の内の最も有名で高度の乳生産をする品種、ホルスタインにおいて、この位置に二つの遺伝子型が発生する。Ａ遺伝子型の頻度はランダムなサンプルにおいて２７％であったが、Ｂ遺伝子型の頻度は７３％であった。ホルスタインは現在使用されている雄親の系統を検査することによって判断された如く米国ホルスタイン個体郡において最近の二手間で発生したとみられる別個の遺伝子型のみではなく他の品種において見出された遺伝子型の両方を含む。この遺伝子型は伝統的な動物選択を使用するために知られないで選択されてきたとみられる。同種及び異種の動物がホルスタイン個体郡内で見出される。遺伝子型（αラフ（−１３））は乳及び乳タンパク質生産との相関に関して検査されてきた。加えて３つの異形が牛個体におけるそれらの較差の頻度及びそれらの乳及び乳タンパク質生産との相関を判断するために検査されている。これらの遺伝子型の可能な連関がまたＤＮＡ配列を使用して検査されている。この技術の最終的な姿はαラクトアルブミンに関して最適な調節遺伝子型を確認し動物をそれらの個々の特徴を用いて選択するこいうことである。

４つの遺伝的突然変異体の検出と選択 αラフ（−１３）異形か発生する配列の領域はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（サンブロック池、＋９８９）及び開発した次の二つのプライマーを使用して増幅され得る。各プライマーはαラクトアルブミン遺伝子の特定の部分の増幅を許容する。記載されたプライマーの組み合わせは下に記載したプライマー位置のいかなる二つの間においても使用され得る。

プライマー　Ｎｏ、＼　ブライ７−　配列　プライマー位置（配列ＩＤ　ＮＯ：）　（翻訳開始部位から）特定の領域の増幅の後、ＤＮＡは配列較差の検出のために制限酵素を用いて消化されまたは配列される。αラフ（−１３）異形の場合、配列較差は制限酵素Ｍｎ１Ｉ　（５’　ＣＴＣＣ３’認識部位）を使用して調べられる。ＰＣＲＤＮＡ産物はＭｎ１ｌを用いて消化され染色体の多望を観察するために４％ニューシーブアガロースゲル上に流される。

全ての４つの異形を含む６５０ベ一スベア配列はユニーク配列技術を使用して検査されている。ＰＣＲはαラクトアルブミン５°　フランキング領域の７７０ベ一スペア部分を増幅するために最初に使用されている。次に他のＰＣＲ反応が最初の反応の部分と次に示すプライマー（夫々配列　ＩＤ　ＮＯ＋ＩＯ及び配列　ＩＤ　Ｎｏ：１１）とを使用して行われる・ α　ラフ１ＦＩ　１　５’八へａｃｒ’ｒａ’ｒ入八へ八へａＡｃｃａｃｃｘｃ τＴＣＡττＣτＣｋＧτＣ丁ＣテＧＴＧＧＴ３−αテア暴すリ　２　５’ＡＧＣｋＴＣＡＧＧｈｋＡＣＡＧＣｒｋＴＧＡＣＣＴＧＧＧＴＧＧｃＡ’ＦｔＧｋＡＴｋＧＧｋＴ　３’上に記載されたプライマーは両方のＭ２Ｓ　ＤＮＡ配列プライマーのみではなくαラクトアルブミン遺伝子の部分も含む。そのプライマーはＰＣＲＤＮＡ産物上の両方の方向において実行されるべきＤＮＡ配列を許容するよう設計されている。最終的なＰＣＲ産物は４つの遺伝的突然変異体、二つのＭ１３配列ブライミング領域及び５つの「ダミーベース」を含むαラクトアルブミンの領域をＭ１３プライマー結合において補助的役割を果たすように最後に含むであろう。

種間のαラクトアルブミンの５°　フランキング領域の高度に維持された部分の比較牛αラクトアルブミン配列を人間（図８）、てんしくねずみ（図９）、及びラット（図１０）の同じ領域と比較するＤＯＴＢＬＯＴＴＭグラフ図８乃至ＩＯを参照されたし。図８（人間）の領域は８１９ベースペアに及ぶ。その配列は略７００ベースペアに高度に維持される。図９（てんしくねずみ）の領域は１３８１ベースベアに及ぶ。その配列は略７００ベースペアに高度に維持されるがそこで拡散する。図１０（ラット）の領域は１３３７ベースペアに及ぶ。その配列は略７００ベースペアに高度に維持されるがそこで拡散する。

′＃ＩＳ領域内の種較差は配列の非維持領域で発生すると予想されるであろう。

牛αラクトアルブミンの他の牛タンパク質遺伝子との比較αラクトアルブミン５ ′フランキング領域を用いて高度に維持された他の牛乳タンパク質遺伝子（αｓｌ及びαｓ２カゼイン、βカゼイン、Ｋカゼイン、及びβラクトグロブリン）の５′フランキング領域の部分が確認された。これらの領域内の配列較差はまた最終的なタンパク質生産ばかりではなくｍＲＮＡ生産においても効果を有することか予想される。これらの高度に相同な２例を下に記載する。

遺伝子の同じ領域に対応する牛βカゼイン配列（配列　ＩＤ　ＮＯ：１８）と比較された（−１６１）−（−１１５）からの牛αうクトアルブミン配列（配列　ＩＤ　ＮＯ：Ｉ７）。類似パーセントは４６ベースに関して６９％である。

（−１４２０）−（−１３５１）からの牛αラクトアルブミン配列（配列　［）　ＮＯ：１９）か遺伝子の同じ領域に対応する牛βカゼイン配列（配列　ＩＤ　Ｎｏ・２０）と比較された。類似パーセントは６９ベースに関して７５％である。

その含まれたデータは遺伝的処理された哺乳動物の分野で使用される様々な制＠／エンハンサ−及び遺伝子ばかりでなく牛αラクトアルブミン遺伝子が乳牛産業において選択用道具として有用となるであろうことを示している。我々がクローンした制御領域は我々の乳及び乳タンパク質生産及び配列異形データによって示される如くの「高イクスブレッシング遺伝子梨」ばかりではなく遺伝的処理された哺乳動物において遺伝子をイクスプレスするために必要な調節要素を含む。これらの事実によってこれは産業及び調査分野の双方で有用な遺伝子となる。これらの技術の他の乳タンパク質への適用はβカゼイン、αｓ１及びαＳ、カゼイン及びにカゼイン遺伝子及びβラクトグロブリン遺伝子に対応する様々な遺伝子型の選択を許容するであろう。

暗号づけ領域 αラクトアルブミンタンパク質の暗号づけ領域は１．７キロベ一ス配列を含む。

３°　フランキング領域３′　フランキング領域は所望の組か換えタンパク質に関してＤＮＡ配列暗号づけの下流の８．８キロベースフランキング領域を含む。

この領域はイクスブレッションシステムのＲＮＡ転写を明白に安定させ、よってイクスブレッションシステムからの所望のタンパク質の産出を増加させる。

操作上記のイクスブレッションシステムは公知技術の方法で用意され得る。例は従来のリンカ−１制限部位他を使用した様々な結紮技術を含む。これらのイクスブレッソヨンシステムはより大きいプラスミドの部分であることか好ましい。

分離と浄化の後、イクスプレッションシステムまたは構造物は遺伝的に変更されるべき遺伝子プールに付加される。

遺伝的処理された哺乳動物に関する方法は公知技術である。動物の遺伝的処理及び遺伝子導入変化の教科書的記述に関してアルバート、Ｂ、他、１９８９及びレウィン、８．１９９０を参照されたし。

簡単に説明すると、遺伝的処理はイクスブレッションベクターの構造を含みよってｃＤＮＡクローンまたはゲノミック構造が直接ＤＮＡ転写に関して強いプロモータとして作用するＤＮＡ配列に接続される。遺伝的処理によって、乳房組織等の哺乳類細胞は有用なタンパク質の大量な生産を引き起こす。

本発明の目的に関して、「遺伝的処理」という用語は単一系統変化、即ち、生殖細胞系永続性無しの影響を及ぼされた動物の寿命の間のみの遺伝的変化、を含む定義リスト内で前に定義した。その構造物は乳腺及び哺乳類幹細胞等の哺乳類腺において遺伝的に合体され得る。

遺伝的処理はまた遺伝子導入変化、即ち、影響を及ぼされた動物及びあらゆる子孫のゲノミック構造への遺伝子配列の永続的装着、を含む。哺乳動物を遺伝子導入によって変化させることは発育している動物の細胞中に保存されるへき構造物の一以上の複製物を発生させるために受精した哺乳類の卵の前核へＤＮＡ構造物を顕微注射することを含む。遺伝子導入された動物において、処理された遺伝子はその動物の生殖細胞系に永続的に装着される。遺伝的処理された哺乳動物はそこて乳房組織内の組み換えタンパク質の分泌及び成熟において効果的なソゲナルペプチドに関するＤＮＡ配列暗号づけを用いて組み換えタンパク質に関する外因性ＤＮＡ配列暗号づけに操作的にリンクするαラクトアルブミン制御領域よりなるイクスブレッションシステムによって特徴付けられる。哺乳動物の乳へ組み換えタンパク質を生産及び分泌するため、遺伝子導入哺乳動物は乳を生産することか許容されなければならず、その後に乳か集められる。そこで乳は標準の製造工程において使用されればよい。外因性組み換えタンパク質はまた知られた技術によって乳から分離され帰因１のαラクトアルブミン制御／エンハンサ−配列はまた優れたまたは優良な乳を生産する哺乳動物を確認するための選択特徴として重要である。現在、乳牛産業におけるそれらは系統情報にたよるのみであり、それはしばしば哺乳動物、特に中種における乳及び乳タンパク質を予測するために役に立たない。生理的標識の乳及び乳タンパク質生産を判断するための手段としての研究はいくらかの興味を持たれている。乳牛におして研究されたもっとも一般的な生理的標識形質はホルモン、酵素、及び異なる血液代謝産物である。免疫性システムの成分かまた研究されてきた。乳産出に関する可能なｆｆ識形質として記載された形質は放射性サイロキシン、血液尿素窒素、成長ホルモン、インシュリン様成長因子及びインシュリン、及びグルコース及び遊離脂酸である。これらの技術は乳牛における乳及び乳タンパク質生産の予測においていくらかの効果か見られるが、現在これらの特徴を予測する他の信頼できる手段か無い。

本発明は遺伝的材料か牛αラクトアルブミンに関して支配的な選択可能な標識を符号化する哺乳動物の遺伝的構造において発生するＤＮＡである遺伝された遺伝的材料よりなる優れた乳及び乳タンパク質を生産する哺乳動物を確認するための選択特徴を提供する。

ここて開示されたＤＮＡ配列は優良孔生産哺乳動物に関する特徴標識として役に立つ。

下の例ではここで開示された発明を述へるが、本発明がこの例の限定及び範囲に限定されるというように理解されることは全く無い。

例例１・αラフ（−１３）異形研究。

ＵＷ郡の範囲内で広い範囲の乳及び乳タンパク質生産能力の哺乳動物を提供するために４２唾乳動物か階層的にランダムな方法で選ばれた。

ＤＮＡはウィスコンシンマディソン郡の大学における４２ホルスタイン乳牛雌牛のランダムなサンプルから知られた技術の過程によって分離された。各哺乳動物は前に述べた如くにＭｎ１ｌ消化ＰＣＲ産物の４％ニューシーブゲルを用いてα ラクトアルブミン（−１３）異形に関して遺伝子型が検出された。

この個体郡における遺伝子頻度はαラフ（−１３）Ａに関しては２８％でありα ラフ（−１３）Ｂに関しては７２％である。各々の区別された遺伝子型は図１２でゲル上に示される。図１２のゲルに関する説明を次に示す：レーン１　分子量標準レーン２〜３　異種接合　αラフ（−１３）ＡＢレーン４・　同型接合　αラフ（−１３）ＢＢレーン５　異種接合　αラフ（−１３）ＡＢレーン６　同型接合　αラフ（−１３）ＢＢレーン７　同型接合　αラフ（−１３）ＡＡレーン８　異種接合　αラフ（−１３）ＡＢ４２哺乳動物の遺伝的能力の分析はグラフ（− １３）対立遺伝子によって引き起こされまたグラフ（−１３）対立遺伝子へリンクされた可能な主な遺伝子効果を示す。３つの遺伝子型の各々の平均値ばかりではなく各データ点のの散布図が［１３に示される。ホルスタイン雌牛が乳に関するそれらの予想された伝達能力を用いて比較された。

データはグラフ（−１３）Ａ遺伝子型は乳及び乳タンパク質生産に好ましいということを示している。下に示す表１は下に記載した形質に関する各遺伝子型間で観察された乳及び乳タンパク質生産能力における較差の統計的関連を示す。分散とＴ試験（ＬＳＤ）の分析がデータに大して行われた。全ての生産産出形質はグラフ（−１３）Δ対立遺伝子と正相関であった。乳タンパク質パーセンテージはグラフ（−１３）Ａ対立遺伝子と負相関であった。

表１形質／遺伝子型　遺伝子型グラフ（−１３）ＡＡ　グラフ（−１３）ＡＢ　グラフ（−１３）８ＢＰＴＡ　（乳）／ＡＡ　−−−−−Ｎ、　Ｓ、　ｐ＜０．　０２ＰＴＡ　（乳）／ＡＢ　Ｎ、　Ｓ、　−−−−−ｐ＜０．　０２ＭＥ３０５　（乳）／ＡＡ−−−一−Ｎ、Ｓ、　Ｎ、Ｓ。

ＭＥ３０５　（乳）／ＡＢ　Ｎ、　Ｓ、　−−−−−ｐ＜０．　１ＰＴＡ　（タンパク質＃）／ＡＡ　−−−−−Ｎ、Ｓ、　Ｎ、　Ｓ。

ＰＴＡ　（タンパク質＃）／ＡＢ　Ｎ、Ｓ、　−−−−−ｐ＜０．　１ＰＴＡ　（タンパク質％）／ＡＡ　−−−−−Ｎ、Ｓ、　ｐ＜０．　０　１ＰＴＡ　（タン八り質％）／ＡＢ　Ｎ、Ｓ、　−−−−−ｐ＜０．　０１例２．牛αラフトアルブミン遺伝子イクスブレッションの調節の研究のための遺伝子導入マウスの生産。

ミツクライブラリから分離された（ウオイコツク、１９８２）。ゲノミックライブラリは次の過程によってスクリーンされた。略ｌ。

５００．０００ラムダプラークがマニアテイス池（１９８９）によって記載された過程を用いてナイロン膜から移転した。αラクトアルブミンｃＤＮＡ（ハーレー、１９８７）または７７０ベースペアＰＣＲ産物がａ−Ｐ３２標識ｄＣＴＰを用いてニックトランスレート（ＢＲＬ）された。プロットは夜通しく６５Ｃ）で予め交雑されその後６５Ｃで１６時間交雑された。プロットは６５Ｃで洗浄（２Ｘ　ＳＳＣ１％　ＳＤＳで２回、０、ＩＸ　ＳＳＣＯ。

１％　ＳＤＳで一回）されオートラジオグラフィーのためにコダック　Ｘ−ＯＭＡＴフィルム上に載置される。αラクトアルブミン遺伝子を含む８．０キロベ一ス断片が図４に示す如く浄化された。８゜０キロベ一ス断片は５゛フランキング領域の２．１キロベース、１゜７キロベ一ス暗号づけ領域及び３′フランキング領域の２．６キロベースを含んでいた。

遺伝子導入マウス成熟したＣ５７Ｂ６　Ｘ　ＤＢＡ２Ｊ　Ｆｌ　（Ｂ６Ｄ２）雌が前核顕微注入のための受精卵を産出するために過剰排卵（ＰＮＳＧ及びｈＣＧ）ＬＩＣＲまたはＢ６Ｄ２雄と交配した。卵はレイツ顕微操作器とニクソン倒立顕微鏡を用いて顕微注入された。４０正常出現２細胞胚胎が各擬受胎宿主に移転された。（ウイスコンシンマディソン　バイオテクノロジーセンター　遺伝子導入マウス設備、ジャン　ハイデマン博士）。

ＰＣＲを用いた遺伝子導入マウスのスクリーニング尾ＤＮＡがコンスタンチニ他（１９８６）によって記載された方法を用いて抽出された。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）が１０ｍ１　１０ｘ　ＰＣＲ反応緩衝液（プロメガ会社、マデイソン、Ｗｌ。

）、各２００ｍＭ　ｄＮＴＰ（ファルマシア　Ｉｎｔｌ、、ミルウオーキー、Ｗｌ、）、各１．　０μｍプライマー（上流プライマー２５ｍｅｒ　−７１２〜− ６８７（５’ＣＡＡＴＧＴＧＧＴＡＴＣＴＧＧＣＴＡＴＴＴＡＧＴＧ　３’　）（配列　ｒＤＮｏ：１４）、下流ブライ７−　２０ｍａｒ　＋３９〜＋５９　（５’　ＡＧＣＣＴＧＧＧＴＧＧＣＡＴＧＧＡＡＴＡ　３’　）（配列　ＩＤ　ＮＯ＋１５）、１ユニツトタツクＤＮＡポリメラーゼ（プロメガ会社、マディソン、Ｗｌ、　）及び１ｍｇ　ゲノミックＤＮＡを用いて行われた。体積は２回蒸留した無菌水を用いて１０（１ｍｌに調整され反応は重い鉱油で上敷きされた。サンプルは３０サイクル（９４Ｃ２分、５０Ｃ１，５分、７２Ｃ１，５分）を受けさせた。産物はエチディウム臭素を用いて１％アガロースゲルに調整された。

マウス搾乳マウスはそれらの一腹子から４時間分離されそして麻酔をかけられた（０．０１ｍ１／ｇ　体重　ＩＰ、　３６％プロピレングリコール、ｌ０１５％エチルアルコール（９５％）、４１．５％無菌水、及び１２％ペンタバルビトール（５０ｍｇ／ｍｌ）の注射）。

麻酔をかけられた後マウスは０．３１．Ｕ、オキシトシンに１．Ｍ。

を注射され小さい真空搾乳機を用いて搾乳された。５１匹の生きた子の内の３匹はポリメラーゼ連鎖反応を用いて遺伝子導入のものであることが確認された。３つのαラクトアルブミン遺伝子導入マウス系統の各々において観察されるイクスブレッションレベルを示すグラフに関する図１４を参照されたし。

ＥＬＴＳＡ一つの系統からの第２世代の哺乳動物が搾乳され次の過程によって牛ａラクトアルブミンに関してＥＬＴＳＡ（酵素結合免疫吸着検定法）が行われた： ■、ヌンクイミューノプレートｌマキシトーブ上に各ウェル（０，０５Ｍ炭酸塩緩衝液内、ｐＨ９，６）毎に１／４０に牛ａラクトアルブミン抗血清１００ｍ１を塗布。

２、洗浄緩衝液（ＰＢＳ内００２５％ツイーン２０　ｐＨ７゜２）を用いて４ｘ洗浄。

３．５０ｍ１分析緩衝液（０，０４Ｍ　ＭＯＰＳ、０．１２ＭＮａＣ１，０，ＯＩＭ　ＥＤＴＡ、Ｏ，１％　ゼラチン、０．　０５％　ツイーン２０，０．００５％　クロルヘキサダイン　ディグ　−ルコナーテ、ローイブテイン５０ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ７，４）を付加。

４．５０ｍ１標準及びサンプルを二倍で付加。

５．５０ｍ１　１／１００ｋ希釈したαラクトアルブミン　ビオチン接合体を付加。

６．４０で夜通しインキュベート。

７、洗浄緩衝液を用いて４ｘ洗浄。

８．１００ｍ１　１／１０に分析緩衝液希釈されたエクストラビンディンペルオキシダーゼ（シグマ）を付加。ＲＴで２時間インキュベート。

９、洗浄緩衝液を用いて４ｘ　２回洗浄。

ｔｏ、１２５ｍ１　新鮮基質緩衝液（２００ｍｌ　テトラメチルベンジンダイン　２０ｍｇ／ｍｌ）ＤＭ３０．６４ｍ１　０．５Ｍ過酸化水素、１９．７６ｍ１アセテートナトリウム、ｐＨ４，８）を付加。

１１、ＲＴで１２分インキュベート。

１２、基質反応を停止させるために５０ｍ１　Ｏ，５Ｍ硫酸を付加。

１３、吸光度をＥＩＡ自動読取器で４５０　ｎｍｍビイナス００ｎｍで読み取る。

牛αラクトアルブミンが１．０ｍｇ／ｍｌのレベル迄及びそれ以上濃縮したマウス乳に存していた。イクスブレッションは次の過程にてウェスタンブロッティングによって判断された。１４％ＰＡＧＥゲルがイモビリンＰ膜（ミリボア）へ移転され、それは０．０２Ｍリン酸ナトリウム、０．１２Ｍ　ＮａＣ１，０，０１％ゼラチン、００５％ツイーン２０．ｐＨ＝７．２でブロックされそして抗生α ラクトアルブミン（１／２０００希釈）を用いて２時間室温でインキュベートされた。ゲルは２回（２分）ＥＬＩＳＡ洗浄緩衝液を用いて洗浄されそして室温で２時間ヤギ抗つサギＩｇＧ−ＨＲＰを用いてインキュベートされ、引き続いて洗浄緩衝液を用いて３回洗浄されそして２回蒸留水を用いて一回洗浄された。ゲルは基室溶液（２５ｍｇ　３．３’　ジアミノベンジダイン、Ｈ３中の１ｍ１１％　ＣＯＣｌ２．４９ｍＩ　ＰＢＳ　ｐＨ７，４及び０．０５ｍ１３０％　Ｈ，Ｏ，’）内に位置し発色現象の間に観察された。膜は空気乾燥された。

本発明はここに示され記載された個々の構造及び配列に限定されることはなく引用文献目録に続く特許請求の範囲の範囲内で改良された形が容認されることが理解される。

引用文献の目録アカース、Ｒ，Ｍ、他、１９８１．　ｒベリバーチユリエンド雌牛における乳分泌の黄体刺激ホルモン調節及び乳房上皮細胞の生化学的鑑別」。内分連字、＋０９：２３゜アルバート、Ｂ、他、細胞の分子生物学（第２版）、ガーランド出版会社、ニューヨーク、２６５〜２７１頁。

ボウリング、Ｊ、他、１９８８．　ｒ牛ベータカゼイン遺伝子の完全ヌクレオチド配列Ｊ、Ａｕ５ｔ、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｓｅｔ、、４１　：　５２７−５３７゜プリュー、Ｋ、及びＲ，Ｌ、ヒル、１９７５、［ラクトース生金エイゲル、Ｗ、Ｎ、他、１９８４．　ｒ雌牛の乳のタンパク質の命名：第５版ＪｏＪ、Ｄａｉｒｙ　Ｓｃｉ、、６４：１５９９゜グツドマン、ＧＴ、他、１９８３．　ｒビトロにおいて培養された牛乳房細胞からのアルファラクトアルブミン分泌のホルモン調節」、内分連字、！１２：１３２４゜ホール、Ｌ、他、１９８７．　ｒ人間αラクトアルブミンの構成及ハーレー、Ｗ、　Ｌ、及びり、　Ａ、シュルター、１９８７．　ｒ牛αラフトアルブミンｃＤＮＡの分子クローニング及びヌクレオチド配列」、遺伝子、６１：１１９−１２２゜ラルソン、Ｂ、Ｌ、、＋９８５．　ｒ乳の生合成及び細胞分泌」、Ｉｎ・乳分泌、１２９〜１６３頁、Ｂ、　Ｌ、ラルソン編、アイオワ州大学出版、Ａｍｅｓ。

ローウィン、Ｂ、、１９９０．遺伝子　ＩＶ、オックスフォード大学出版、ニューヨーク、６９１〜７０２頁。

マクファーデン、Ｔ、Ｂ、他、１９８７．　ｒ牛血溝におけるアルニアル（第２版）、コールドスプリングハーバ−研究所出版。

バイオレット、Ｊ、他、１９８７．　ｒ牛αラクトアルブミン遺伝子の完全ヌクレオチド配列：そのラットカウンターパートとの比０ニア１９７−７２１０　（１９Ｂ２）。

配列リスト（１）一般情報。

（ｉ）出願人　ＢＬＥＣＫ、ＧＲＥＧＯＲＹ　Ｔ。

ＢＲＥＭＥＬ、ＲＯＢＥＲＴ　Ｄ。

（１、発明の名称、牛アルファーラクトアルブミンを符号化するＤＮＡ配列及び使用方法（ｉｉｉ）配列数　２０（ｉｖ）連絡アドレス（Ａ）受信人・アントリユース、シエールズ、スターク及びサジル（Ｂ）Ｊす：スート１１００．　ライスコンシンアベニュー、＋００Ｅ（Ｃ）町：ミルウす−キー（Ｄ）州：ＷＩ（Ｅ）国：米国（Ｆ）郵便番号：５３２０２−４１７８（Ｖ）コンピュータ続出可能形式（Ａ）媒体形式：フロッピーディスク（Ｂ）コンピュータ＋ｒＢＭＰＣコンバーチプル（Ｃ）オペレーティングシステム：　ＰＣ−ＤＯ３／ＭＳ−（Ｄ）ソフトウェア：Ｐａｔｅｎｔｌｎ　Ｒｅ１ｅａｓｅ＃１．０．Ｖｅｒｓｉｏｎ＃１．２５（ｖｉ）現在のアプリケーションデータ：（Ａ）アプリケーション番号：（Ｂ）ファイリング期日：（Ｃ）分類：（ｖｉｉ）代理人情報（Ａ）名称：サラ、チャールズ　５（Ｂ）登録番号・３０，４９２（Ｃ）参照／事件番号・Ｆ、３２６２−１（ｉｘ）を語情報（Ａ）　Ｍ、話・　（６０８）２５５−２０２２（Ｂ）ファックス：　（６０８）２５５−２１８２（Ｃ）テレックス：２６８３２　ＡＮＤＳＴＡＲＫ（２）配列　ＩＤＮ０：Ｉ情報・（ｉ）配列特徴：（Ａ）長さ二２６ベースペア（Ｂ）型・核酸（Ｃ）鎖状聾、単一（Ｄ）トポロジー−リニア（ｉｉ）分子形式：ＤＮＡ（ゲノミツク）（ｘｉ）配列記載：配列　ＩＤＮ０：１：ＡＴＧＡＣＣＡＷＡ　ＴＴＡＣＧＡＡＴＴｅ　ＡＴＣＯＴＡ　２６（２）配列　ＩＤ　ＮＯ：２情報：（ｉ）配列特徴・（Ａ）長さ二８８ベースペア（Ｂ）盟：核酸（Ｃ）鎖状ｇ、二単− （Ｄ）トポロジー：リニア（ｆｉ）分子形式：ＤＮＡ（ゲノミツク）（ｘ　ｉ）配列記載：配列　ＩＤ　ＮＯ：２：（２）配列　ＩＤＮ０：３情報：（ｉ）配列特徴；（Ａ）長さ：２０４４ベースペア（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖状態　１１ｉ、− （Ｄ）トポロジー　リニア（１１）分子形式　ＤＮＡ　（ゲノミック）（ｉｘ）特徴（Ａ＞名称／キー　シグナルペプチド暗号づけ領域（Ｂ）位置：１９４３．．２０４３（ｉｘ）特徴：（Ａ）名称／キー、ａラクトアルブミンに関する遺伝性側＠領域（Ｂ）位置：１９６６（ｉｘ）特徴・（Ａ）名称／キー、推定ステロイド反応要素（Ｂ）位置：１４３３．．１４６６（ｉｘ）特徴。

（Ａ）名称／キー：ＲＮＡポリメラーゼ結合領域（Ｂ）位置　１９６１．．１９７８（ｘ　ｉ）　配列記載：配列　ＩＤ　ＮＯ：２：Ｃ入＾ＣＣＣＡＣ’ｒＣ丁ＡＧＴｋＣＴＣＴＴＡＣＣ？Ｃ（＋＾入八へＴ’ｒＣＣＡＴＧＧ＾ｅｘａ＾ａａ＾ＧＣＣ丁？Ｃ丁入＾ＱｃＴＡｃm１４０１７ｉＣテＴＣＡＣＣ入ａＣ丁ＧＩｕＣＴＡＣＣＡＩＪπＧ入Ｔ＾ＣτｋＣＴＣＣ）Ａ丁＾アＴｋＭｆ；１：Ｑｅｒ丁ＡＡ＾Ｇ丁ＣＣ１１４O （２）配列　ＴＤ　ＮＯ：４情報：（ｉ）配列特徴：（Ａ）長さ：１４ベースペア（Ｂ）梨・核酸（Ｃ）鎖状態二車− （Ｄ）トポロジｍ：リニア（１１）分子形式：ＤＮＡ（ゲノミック）（ｘｌ）配列記載：配列　ＩＤ　ＮＯ：４ＣＡＴＸＴＴＣＴＡττＣＴＡ　１４（２）配列　ＴＤ　ＮＯ：５情報：（１）配列特徴：（Ａ）長さ：１５ベースペア（Ｂ）型、核酸（Ｃ）鎖状態、単一（Ｄ）トポロジー　リニア（１１）分子形式　ＤＮＡ　（ゲノミック）（ｘｌ）配列記載　配列　ＩＤＮ０：５：ＣＲＴＸＴＴＣＴＡ丁　τＣＣｒＡ　ユ５（２）配列　１［ＮＯ：６情報（ｉ）配列特徴（Ａ）長さ・１５ベースペア（Ｂ）梨：核酸（Ｃ）ｊＪＩ状態、単一（Ｄ）トポロジー・リニア（１１）分子形式：ＤＮＡ（ゲノミック）（ｘｉ）配列記載：配列　ＩＤ　ＮＯ：６：。ＡＴＡＴＴＣＴＡＴ　ＴＴＣＴＡ　１５（２）配列　ＩＤ　ＮＯニア情報。

（ｉ）配列特徴：（Ａ）長さ：１８ベースベア（Ｂ）型　核酸（Ｃ）鎖状態二車− （Ｄ）トポロジー：リニア（１１）分子形式：ＤＮＡ（ゲノミック）（ｘｉ）配列記載：配列　ＩＤ　ＮＯニア：ＴＣＴＴＧＡＧＧＧＧ　ＴＡＡＣ（ＪＡＡ　ｉｌ＋（２）配列　ＩＤ　ＮＯ：８情報・（ｉ）配列時＠：（Ａ）長さ：１７ベースペア（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖状態・単一（Ｄ）トポロジー　リニア（１１）分子形式　ＤＮＡ　（、ゲノミック）（ｘｉ）配列記載　配列　［）Ｎｏ、８丁ＣＴＴにＧＧＧＧＴ　ＡＧＣＣ八ＡＡへ　ニア　−（２）配列　ＩＤ　Ｎｏ・９情報（ｉ）配列特徴（Ａ）長さ：１８ベースペア（Ｂ）型・核酸（Ｃ）鎖状態、単一（Ｄ）トポロジー：リニア（ｉｉ）分子形式：ＤＮＡ（ゲノミック）（ｘ　ｉ）配列記載　配列　ＩＤ　ＮＯ：９：Ｔｃ？ＴＧＣ；ＧＧＧＱ　ＴＣＡＣ（：ＭＡ　１８（２）配列　ＩＤ　ＮＯ：１０情報：（ｉ）配列特徴。

（Ａ）長さ・４３ベースペア（Ｂ）型、核酸（Ｃ）鎖状態、単一（Ｄ）トポロジー：リニア（ｉｉ）分子形式：ＤＮＡ（ゲノミツク）（ｘｉ）配列記載：配列　ＩＤ　Ｎ○ ＝ｌＯ：ＡＣＧＣＴＴＩ；ＴＡＡ　ＡＡＣＧＡＣＧＧｃｃ　ＡＣ２ＴＴにＡＴＴＣＴ　ＣｋＧＴＣＴＣＴＧＴ　ＧＧＴ　４３（２）配列　ＩＤＮ０：１１情報：（ｉ）配列特徴：（Ａ）長さ・４３ベースペア（Ｂ）型、核酸（Ｃ）鎖状ｆｌ：単一（Ｄ）トポロジー、リニア（１１）分子形式：ＤＮＡ（ゲノミツク）（ｘｉ）配列記載、配列　ＩＤＮ０：ＩＩ＾０ＣＡＴＣＡＧＧＡ　ｋＡｃＪｈＧｃ’ｒＡＴＧ　ＡＣＣＴＧＣＧＴＧＧ　ＣＡＴＧＧＡＡＴ八〇　〇ＡＴへ　４３（２）配列　Ｉ［ＮＯ：１２情報：（ｉ）配列特徴：（Ａ）長さ：２１ベースペア（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖状態：単一（Ｄ）トポロジー、リニア（ｉ　ｉ）分子形式：ＤＮＡ（ゲノミック）（ｘ　ｉ）配列記載、配列　ＩＤ　ＮＯ：１２：ＣＴＣＴＴＣＣ’ｒＧＯ＾ＴＧＴλＡｃｃｃ’ｒ　τ　２１（２）配列　ＴＤ　ＮＯ：１３情報：（ｉ）配列特＠：（Ａ）長さ＝２４ベースペア（Ｂ）型、核酸（Ｃ）鎖状態二車− （Ｄ）トポロジー：リニア（ｉ　ｉ）分子形式：ＤＮＡ（ゲノミック）（ｘｉ）配列記載：配列　ＩＤ　ＮＯ：１３：ＴＣＣＦ−ＧＯＴＧＧ　ＴＣｋＴＴＧＡＡｋＧ　ＧＡｅＴ　２４（２）配列　ＩＤ　ＮＯ：１４情報：（ｉ）配列特徴：（Ａ）長さ：２５ベースベア（Ｂ）盟：核酸（Ｃ）ｌ状態・単一（Ｄ）トポロジー　リニア（ｉ　ｉ）分子形式　ＤＮＡ　（ゲノミック）（ｘ　ｉ）配列記載：配列　ＩＤ　ＮＯ：Ｉ４：ＣＡＡＴＯＴＧＧＴＡ　ＴＣ’ｒＯＯＣＴＡＴ＋ｒ　ＴＡＧＴＧ　２５（２）配列　ＩＤ　ＮＯ：Ｉ５情報（１）配列特徴。

（Ａ）長さ・２０ベースペア（Ｂ）盟：核酸（Ｃ）ｌ状態二車− （Ｄ）トポロジー：リニア（ｉｉ）分子形式：ＤＮＡ（ゲノミック）（ｘ　ｉ）配列記載：配列　ＩＤ　ＮＯ：１５：ｋＧｃｃＴＧＧＧＴＧ　ＧＣＡτＧＧ入入τ八　へ　２゜（２）配列　ＩＤ　ＮＯ：１６情報：（ｉ）配列特徴：（Ａ）長さ：２０ベースベア（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖状態：単一（Ｄ）トポロジー：リニア（ｉ　ｉ）分子形式：ＤＮＡ（ゲノミック）（ｘｉ）配列記載：配列　ＩＤ　ＮＯ：ｌＢ：（２）配列　ＩＤＮ０：１７情報：（ｉ）配列特徴：（Ａ）長さ：４６ベースペア（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖状態：単一（Ｄ）トポロジｍ：リニア（ｉｉ）分子形式：ＤＮＡ（ゲノミック）（ｘｉ）配列記載：配列　ＩＤ　Ｎ○ ＝１７・＾ＧＧｋＡＧＣＴＣｋ　Ｍ℃噌ゴＣ？？Ｔ　Ｏ７℃ＣＴＴＴＴＡ　Ｃ？ＣＧＣσ■ゴＣ７℃τＣ＾　４６（２）配列　ＩＤ　ＮＯ：１８情報：（ｉ）配列特徴：（Ａ）長さ　４５ベースペア（Ｂ）型、核酸（Ｃ）鎖状匹：単一（Ｄ）トポロジｍ：リニア（１１）分子形式：ＤＮＡ（ゲノミック）（ｘｉ）配列記載：配列　ｒＤ　ＮＯ：１８ＡＧＧＡＧＣＣＴＡＴ　ＴＣＴ？ＴＣＣＴＴＴ　ＴＷＴＣＴＡＴＡＣＴＧＴＣＴＴＣＧＣＴ　ＣＴＴＣ八　４５（２）配列　ＩＤ　ＮＯ：１９情報。

（ｉ）配列特徴・（Ａ）長さ二６９ベースペア（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖状態二車− （Ｄ）トポロジｍ：リニア（ｉｉ）分子形式：ＤＮＡ（ゲノミック）（ｘｌ）配列記載：配列　ＩＤ　ＮＯ：１９：（２）配列　ＩＤ　ＮＯ：２０情報・（ｉ）配列特徴：（Ａ）長さ：５５ベースベア（Ｂ）盟、核酸（Ｃ）鎖状態・単一（Ｄ）トポロジー、リニア（１１）分子形式：ＤＮＡ（ゲノミック）（ｘｉ）配列記載：配列　［）Ｎｏ・２０：ＴＣＴＣＡＧｆｉＪＪ％Ｔ　ＣＡＣＡＣＴＴＴ！Ｔ　ｔＧｃｃＴＯ’ｍＧｃ　３ＱＣｋｋＣＣｋＭＡＧｃＴｋＡｃ　ＡＣＡＴＡ　５５０　エＡうつ　Ｐｒｏ／ｐＩＣ２０ＲＥ２Σ］α　ラクトフルフミン　プ１〕も−９楠戚ロニヌ］　ｐＩＣ２０Ｒアうスミ、・７ド　ルｌり・〕［＝＝コ　）１し千ブ１し　りＤ−二−り　令ｐ位０　０　ｏ　ｏ　ｏ　Ｏｏ　ロ　ロー　−Ｎ　ｌ’ｌ’ｌ　？　Ｌｌ’ｌ　％Ｏｒ’−中　ンＦＩＧ、６ＡＬＡＣＣＫ：　８，２９０．８４９　Ｔｏ　２，２３００．０　０．２　０．４　０．６　０．８　１．０　１．２７ルフ？−：１９ト？ルつミー／　−ｔりｘっ°し、、ｔｐａン　（ｍｇ／ｍ１）ＦＩＧ、ｌｌＦＩＧ、１２ｎｓ４　ｎｘ１２　ｎ＝２４７＋ｌｊ？一つＱ）−７’ｌシザミン←１３）を仏÷シＬ補正書の写しく翻訳文）提出１ｉＦ（特許法第１８４条の７第１項）平成　５年　４月１２日１、国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ　９２１０６５４９２、発明の名称 αラクトアルブミンを符号化するＤＮＡ配列及び使用方法マディソン　イクセルシア　ドライブ　８４１８番地氏名（名称）　ライスコンシン　ミルク　マーケティング　ボード（国籍　アメリカ合衆国）補正特許請求の範囲（１９９２年１２月１４日国際局によって受け取られた。

元の特許請求の範囲第２．　５．　９乃至ＩＩ、１９．２４乃至３１゜３３．３５乃至４５項は削除；元の特許請求の範囲第１．　３．　６．　８．　１２．　１３．　１５．　１７゜１８．２０乃至２３．３２は補正。

他の特許請求の範囲は変更無しく４頁分））１、突然変異体はシグナルペプチド暗号づけ領域の開始から一１３位置である牛αラクトアルブミン５′　フランキング領域調節配列の突然変異体よりなる乳分泌動物の乳房細胞におけるｍＲＮＡの乳房特定イクスブレッションをプロモートする分離されたＤＮＡ配列。

３、特許請求の範囲第１項のＤＮＡ配列であって該−１３位置はアデニンによって占められている。

４、特許請求の範囲第１項のＤＮＡ配列であって牛αラクトアルブミンの制御領域におけるＤＮＡ配列（配列　ＩＤ　ＮＯ：１９）よりなる。

τへτ入ＡＧＡＡＡＴＣＡＧＧＣＴｒＴＡＧＡＧＡＣＴＧＡＴＣＴＡＧＡＧＡＧＡＡＴＧＡＧＣＣＣＴＧＧＣＡＴＡＣＣＡＧＪｕＧＣＴＡＡＣＡＧＣＴＡ。

６、特許請求の範囲第１項のＤＮＡ配列であって牛αラクトアルブミンの５°　フランキング領域としての図５に記載されたＤＮＡ配列（配列　ＩＤ　ＮＯ：３）よりなる。

７、特許請求の範囲第１項のＤＮＡ配列よりなるイクスブレッションベクター。

８、シグナルペプチドに関して暗号づけするＤＮＡ配列に操作的にリンクされた乳房特定αラクトアルブミン制御領域よりなり、非人間哺乳動物に遺伝的に合体されたときにその哺乳動物の雌種がその孔内に所望の組み換えタンパク質を生産することを許容する、イクスブレッションシステム。

１２、特許請求の範囲第８項のイクスブレッションシステムであって構造物は牛 βカゼインＤＮＡ配列に付着された５′　αラクトアルブミンフランキング領域よりなる。

１３、特許請求の範囲第１２項のイクスブレッションシステムであって構造物は βカゼイン５°　フランキング領域のポリデニレーション部位を含む。

！４．特許請求の範囲第１２項のイクスブレッションシステムであって構造物は第１の乳タンパク質からの近位プロモータ及び第２の乳タンパク質からの遠位制御領域を含む。

１５、特許請求の範囲第１４項のイクスブレッションシステムであって第１及び第２の乳タンパク質はαラクトアルブミン、βラクトアルブミン、βカゼイン、 αＳ１カゼイン、αＳ、カゼイン及びにカゼインよりなるグループから選択される。

１６、特許請求の範囲第１２項のイクスブレッションシステムであって構造物は βカゼインの近位プロモータ及びαラクトアルブミンの遠位制御領域を含む。

１７、乳房組織における分泌及び成熟において効果的なシグナルペプチドに関して暗号づけするＤＮＡ配列を用いて孔内にイクスプレスされるべき所望のタンパク質に関して暗号づけする外因性ＤＮＡ配列に操作的にリンクされたαラクトアルブミン制御領域としての図５に記載されたＤＮＡ配列（配列　ＩＤ　ＮＯ：３）よりなるイクスプレッシコンシステムを含む遺伝子導入非人間哺乳動物。

１８、特許請求の範囲第１７項の遺伝子導入非人間哺乳動物であって該αラクトアルブミン制御領域は牛αラクトアルブミンを符号化し牛αラクトアルブミンにおいて下記のヌクレオチド配列（配列　ＩＤ　Ｎｏ・１９）を育する乳房特定ＤＮＡ配列を含む：２、特許請求の範囲第１７項の遺伝的処理された非人間哺乳動物によって生産される産物。

２、特許請求の範囲第１７項の遺伝子導入非人間哺乳動物によって生産される精液。

２、特許請求の範囲第１７項の遺伝子導入非人間哺乳動物によって生産される乳。

２、特許請求の範囲第１７項の遺伝子導入非人間哺乳動物。

３２、外因性組み換えタンパク質の非人間哺乳動物への生産及び分泌の過程であうで、ａ、乳房組織での組み換えタンパク質の分泌及び成熟に効果的なシグナルペプチドに関して暗号づけするＤＮＡ配列に操作的にリンクされた乳房特定αラクトアルブミン制御領域よりなるイクスブレッシ３ンシステムを含む遺伝的処理された帆尿道物において乳を生産し、ｂ、抜孔を集め、Ｃ１該乳から外因性組み換えタンパク質を分離する過程よりなる。

３４、特許請求の範囲第３２項の過程であって、該イクスブレッシジンシステムはまたＤＮＡ配列の上流でシグナルペプチドに関して暗号づけする５′フランキング領域を含む。

フロントページの続き（８１）指定回　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＳＥ）、０Ａ（ＢＦ、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、ＣＩ、　ＣＭ、　ＧＡ、　ＧＮ、　ＭＬ、　ＭＲ，ＳＮ、　ＴＤ、　ＴＧ）、　ＡＴ、　ＡＵ、　ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＣＡ、　ＣＨ，Ｃ３゜ＤＥ、ＤＫ、ＥＳ、ＦＩ、ＧＢ、ＨＵ、ＪＰ、ＫＰ、ＫＲ，ＬＫ、　ＬＵ、　ＭＧ、　ＭＮ、　ＭＷ、　ＮＬ、　Ｎｏ、　ＰＬ、　ＲＯ，ＲＵ、　ＳＤ、５Ｅ（７２）発明者　ブレメル、ロバート　ディーアメリカ合衆国　ライスコンシン　５３５９７ワウナキー　トール　オークス　５６４０番地

Claims

【特許請求の範囲】

１．牛ａラクトアルブミンを符号化し哺乳動物の遺伝子イクスプレッションにおいて量的較差をプロモートする乳房特定ＤＮＡ配列であって、ＤＮＡ配列は牛ａラクトアルブミンの制御領域における遺伝子構造における異形によって特徴付けられる。
２．特許請求の範囲第１項のＤＮＡ配列であって該異形の一つが該ＤＮＡ配列の −１３位置である。
３．特許請求の範囲第２項のＤＮＡ配列であって該−１３位置はアデニンによって占められている。
４．特許請求の範囲第１項のＤＮＡ配列であって牛ａラクトアルブミンの制御領域における下記のＤＮＡ配列（配列　１Ｄ　ＮＯ：１９）よりなる：【配列があります】
５．特許請求の範囲第１項のＤＮＡ配列であって牛ａラクトアルブミンの制御領域における下記のＤＮＡ配列（配列　ＩＤ　ＮＯ：１７）よりなる：【配列があります】
６．特許請求の範囲第１項のＤＮＡ配列であって牛ａラクトアルブミンの制御領域における図５に記載されたＤＮＡ配列（配列　ＩＤ　ＮＯ：３）よりなる。
７．特許請求の範囲第１記載のＤＮＡ配列よりなるイクスプレッションベクター。
８．哺乳動物に遺伝的に合体されたときに該哺乳動物の雌種が所望の組み換えタンパク質をその乳中に生産することを許容する乳房特定ａラクトアルブミン制御領域構造物よりなるイクスプレッションシステム。
９．特許請求の範囲第８項のイクスプレッションシステムであってシグナルペプチド及びａラクトアルブミンに関するＤＮＡ配列暗号づけに操作的にリンクした少なくとも一つのａラクトアルブミン制御領域構造物よりなる。
１０．特許請求の範囲第８項のイクスプレッションシステムであってａラクトアルブミンに関して暗号づけするＤＮＡ配列の下流で３′フランキング領域よりなる。
１１．特許請求の範囲第１０項のイクスプレッションシステムであって構造物はシグナルペプチドに関して暗号づけするＤＮＡ配列の上流で５′フランキング領域を含む。
１２．特許請求の範囲第８項のイクスプレッションシステムであって構造物は牛 βカゼイン遺伝子に付着した５′フランキング領域よりなる。
１３．特許請求の範囲第１２項のイクスプレッションシステムであって構造物は βカゼインのポリアデニレーション部位と５′フランキング量的の略１００ベースペアを含む。
１４．特許請求の範囲第１２項のイクスプレッションシステムであって構造物は第１の乳タンパク質からの近位プロモータと第２の乳タンパク質の遠位制御領域とを含む。
１５．特許請求の範囲第１４項のイクスプレッションシスイムであって該第１及び第２の乳タンパク質はａラクトアルブミン、βカゼイン、ａＳ１カゼイン、ａｓ２カゼイン及びＫカゼインからなるグループから選択される。
１６．特許請求の範囲第１２のイクスプレッションシスイムであって構造物はβ カゼインの近位プロモータとａラクトアルブミンの遠位制御領域とを含む。
１７．乳房組織におけるタンパク質の分泌及び成熟において効果的なシグナルペプチドに関して暗号づけするＤＮＡ配列を用いて乳においてイクスプレスされるべき所望のタンパク質に関して暗号づけする外因性ＤＮＡ配列に操作的にリンクされたａラクトアルブミン制御領域よりなるイクスプレッションシスイムによって特徴付けられた遺伝的処理された哺乳動物。
１８．特許請求の範囲第１７項の遺伝的処理された哺乳動物であって該ａラクトアルブミン制御領域は牛ａラクトアルブミンを符号化し牛ａラクトアルブミンの制御領域において下記のヌクレオチド配列（配列　ＩＤ　ＮＯ：１９）を有する乳房特定ＤＮＡ配列を含む：【配列があります】
１９．特許請求の範囲第１７項の遺伝的処理された哺乳動物であって該ａラクトアルブミン制御領域は牛ａラクトアルブミンを符号化し牛ａラクトアルブミンの制御領域において下記のヌクレオチド配列（配列　ＩＤ　ＮＯ：２０）を有する乳房特定ＤＮＡ配列を含む：【配列があります】
２０．特許請求の範囲第１７項の遺伝的処理された哺乳動物によって生産される生産物。
２１．特許請求の範囲第１７項の遺伝的処理された哺乳動物によって生産される精液。
２２．特許請求の範囲第１７項の遺伝的処理された哺乳動物によって生産される乳。
２３．特許請求の範囲第１７項の遺伝子導入哺乳動物。
２４．乳房組織におけるａラクトアルブミンの分泌及び成熟を許容するシグナルペプチドを用いて、乳房特定ａラクトアルブミンタンパク質制御領域、または乳または乳房組織にやいてａラクトアルブミンを特別に活性化するあらゆる制御領域のイクスプレッションシステムにおいて操作的にリンクされたａラクトアルブミンに関し０暗号づけするＤＮＡ配列。
２５．特許請求の範囲第２４項のＤＮＡ配列であって牛ａラクトアルブミンの制御領域における下記のＤＮＡ配列（配列　ＩＤ　ＮＯ：１９）よりなる：【配列があります】
２６．特許請求の範囲第２４項のＤＮＡ配列であって牛ａラクトアルブミンの制御領域における下記のＤＮＡ配列（配列　１Ｄ　ＮＯ：１９）よりなる：【配列があります】
２７．特許請求の範囲第２４項のＤＮＡ配列であって牛ａラクトアルブミンの制御領域における図５に記載されたＤＮＡ配列（配列ＩＤ　ＮＯ：３）よりなる。
２８．乳房組織におけるａラクトアルブミンの分泌及び成熟を許容するシグナルペプチドに関して暗号づけするＤＮＡ配列を用いて所望の組み換えタンパク質を暗号づけするＤＮＡ配列に操作的にリンクされた、ａラクトアルブミン制御領域または乳房組織において特別に活性化されたあらゆる制御領域配列よりなる構造物の一以上の複製物の合体を遺伝的処理する過程。
２９．特許請求の範囲第２８項の過程であって構造物は遺伝的に哺乳動物に合体され組み換えタンパク質産物はその後イクスプレスされ乳分泌遺伝的処理哺乳動物の乳に分泌されまたはそれに加えられる。
３０．特許請求の範囲第２９項の過程であって構造物は哺乳類胚胎、哺乳類乳腺、または哺乳類幹細胞に遺伝的に合体される。
３１．特許請求の範囲第２８項の過程であって哺乳動物は雌牛、羊、ヤギ、マウス、雄牛、ラクダ、水牛、ラマ、及びブタである。
３２．外因性タンパク質を哺乳動物の乳に生産及び分泌する過程であって、ａ．乳房組織内の組み換えタンパク質の分泌及び成熟に効果的なシグナルペプチドに関して暗号づけするＤＮＡ配列を用いた組み換えタンパク質に関して暗号づけする外因性ＤＮＡ配列に操作的にリンクされたａラクトアルブミン制御領域よりなるイクスプレツシヨンシステムによって特徴づけられた遺伝的処理された哺乳動物において乳を生産し、ｂ．該乳を集め、ｃ．外因性組み換えタンパク質を該乳から分離する過程よりなる。
３３．特許請求の範囲第３２項の過程であって、該イクスプレッションシステムはまたＤＮＡ配列の下流でａラクトアルブミンに関して暗号づけする３′フランキング領域を含む。
３４．特許請求の範囲第３２項の過程であって、該イクスプレッションシステムはまたＤＮＡ配列の上流でシグナルペプチド関して暗号づけする５′フランキング領域を含む。
３５．牛ａラクトアルブミンを符号化するＤＮＡ配列よりなり牛ａラクトアルブミンの制御領域において図５に記載されたＤＮＡ配列（配列　ＩＤ　ＮＯ：３）を有する優秀乳生産哺乳動物を確認するための選択特徴。
３６．牛ａラクトアルブミンを符号化し哺乳動物の遺伝子イクスプレッションにおける量的較差をプロモートする乳房特定ＤＮＡ配列である遺伝性遺伝的材料よりなる優秀乳生産哺乳動物を確認するための選択特徴であって、該ＤＮＡ配列は牛ａラクトアルブミンの制御領域における遺伝子構造における異形によって特徴付けられる。
３７．特許請求の範囲第３６項の選択特徴であって該異形の一つはＤＮＡ配列の −１３位置である。
３８．特許請求の範囲第３７項の選択特徴であって該−１３位置はアデノシンによって占められている。
３９．特許請求の範囲第３６項の選択特徴であって牛ａラクトアルブミンの制御傾城における下記のＤＮＡ配列（配列　ＩＤ　ＮＯ：１９）よるなる：【配列があります】
４０．特許請求の範囲第３６項の選択特徴であって牛ａラクトアルブミンの制御領域における下記のＤＮＡ配列（配列　ＩＤ　ＮＯ：２０）よるなる：【配列があります】
４１．特許請求の範囲第３６項の選択特徴であって牛ａラクトアルブミンの制御領域における図５に記載されたＤＮＡ配列（配列ＩＤ　ＮＯ：３）よるなる。
４２．優秀乳及び乳タンパク質に関して知られた哺乳動物からのａラクトアルブミンに関する制御領域のＤＮＡ配列上の相似位置を用いて被験哺乳動物においてａラクトアルブミンに関する遺伝性制御領域のＤＮＡ配列上の選択された位置の比較よりなる哺乳動物における優秀乳及び乳タンパク質生産予想方法。
４３．特許請求の範囲第４２の方法であって該選択された位置の一つはＤＮＡ配列の制御領域上の−１３位置である。
４４．特許請求の範囲第４３の方法であって該−１３位置はベースアデニンによって占められている。
４５．特許請求の範囲第４２の方法であって選択されたＤＮＡ配列はステロイド反応要素よりなる。