JPH06502545A - ｃ−ｋｉｔに対するモノクローナル抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ｃ−ｋｉｔに対するモノクローナル抗体本発明は、ヒトｃ−ｋｉｔレセプターに 対するモノクローナル抗体、並びに該ｃ−ｋｉｔレセプターの発現の変化を検出 することにより造血細胞の、精上皮腫又は小細胞肺癌の腫瘍の悪性度を試験する 方法に関する。

多細胞生物の細胞の発育、分化及び代謝機能は、ホルモン及び成長因子によって 調節される。多くの場合における第１段階は、細胞表面上のレセプターへのこれ ら因子の結合である。これらレセプターの幾つかでは、この結合は種々の細胞タ ンパクのチロシン残基のリン酸化を誘発する。これらレセプターチロシンキナー ゼが細胞の成長挙動に決定的な影響を有していることを明らかにするのは可能で あった（ヤーデン（Ｙａｒｄｅｎ）及びユルリッヒ（ＵＩＩｒｉｃｈ）、　Ａｎ ｎ、　Ｒｅｖ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　５７　（１９８８）、　４４３−４７８） 。レセプターチロシンキナーゼに関連するオートクリン調節システムは、腫瘍の ためのモデルシステムとして役立つセルラインの形質転換において及び−次腫瘍 組織においても重要な役割を演じている。ＥＧＦレセプター及びｈｅｒ２／ｎｅ ｕレセプターの如き確定したレセプターチロシンキナーゼの場合には、該レセプ ターの過剰発現と腫瘍の進行の攻撃性との間の直接的な関係が証明されている（ スラモン（Ｓｌａｍｏｎ）ら、　５ｃｉｅｎｃｅ　２４４．１９８９．７０７− ７１２；ジ・フィオレ（Ｄｉ　Ｆｉｏｒｅ）ら、　Ｃｅ１ｌ　５１．　１９８７ ．　１０６３−１０７０）。

レセプターチロシンキナーゼファミリーの更なるメンバーは、ウィルス性腫瘍遺 伝子ｖ−ｋｉｔ（ネコ白血病ウィルスＨｚ４−ＦｅＳＶ）の細胞性相同体として 発見され、クローン化され、そして配列決定されたｃ−ｋｉｔである（ヤーデン ら、　ＥＭＢＯＪｏｕｒｎａｔ　６　（１９８７）、　３３４１−３３５１）　 。それはＰＤＧＦレセプター及びＣ３Ｆ−ルセプタ−（ｃ−ｆｍｓ）と実質的な 相同性を有する。ノーサンプロット法を使用する研究で、異なる組織における該 レセプターの特徴的な分布が示されている。ｃ−ｋｉｔ遺伝子の高発現は、造血 細胞において、時に脳組織、メラニン芽細胞、卵巣及び精巣の幹細胞において検 出された（オーラーウルトレガ−（Ｏｒｒ−Ｕｒｔｒｅｇｅｒ）ら、　Ｄｅｖｅ ｌｏｐｍｅｎｔ　１０９　（１９９０）、　９１１−９２３）。種々の赤血球性 及び骨髄性セルラインについての研究で、分化の初期段階においてｃ−ｋｉｔ遺 伝子の発現が示唆されている（アンドレ（Ａｎｄｒｅ）ら、　Ｏｎｃｏｇｅｎｅ 　４　（１９８９）、　１０４７−１０４９）　６例えば、ダリア芽細胞腫細胞 の如き一定の腫瘍も同じ＜ｃ−ｋｉｔ遺伝子の際立った発現を示す。

一方、大きさが約３０ｋＤのタンパクがマウス線維芽細胞の培養上清からｃ−ｋ ｉｔレセプターの天然リガンドとして単離され、ＭＧＥ＝７スト細胞成長因子（ ウィリアムス（Ｗｉ　Ｉ　Ｉ　ｆａｎｓ）ら、　Ｃｅ１１６３、　（１９９０） 、　１６７−１７４）又は造血成長因子ＫＬ（ファング（Ｈｕａｎｇ）ら、　Ｃ ｅ１ｌ　ｅａ、　（１９９０）、　２２５−２３３）と呼ばれている。対応する タンパクがラット肝臓細胞からも単離され、５ＣＦ＝幹細胞因子と呼ばれている （セポ（Ｚｓｅｂ□）ら、　Ｃｅ１ｌ　ｅａ　（１９９０）、　１９５−２０１ ）。

対応するヒトの因子がマーチン（Ｍａｒｔｉｎ）らによってクローン化され、Ｓ ＣＦ、ＭＧＦ又はスチール・ファクター（Ｓ　Ｆ）と同義に呼ばれている（Ｃｅ ｌｌ　６３　（１９９０）、　２０３−２１１）。

これまで、ｃ−ｋｉｔ遺伝子の発現は、特にノーサンプロット法を使用するｃ− ｋｉｔ　ｍＲＮＡの検出によって、転写レベルで確認されているだけである。し かしながら、例えば、翻訳レベルについての調節プロセス又は形成されたｃ−ｋ ｉｔレセプタータンパクの安定性が全く登録されていないので、この方法は発現 されたタンパクの量について間接的な示度を与えることができるだけである。従 って、診断薬用には、発現されたタンパクの量を直接に測定することが極めて重 要である。これは、ｃ−ｋｉｔレセプターに対するモノクローナル抗体を用いる 結果から得られる所望の特異性によってのみ可能である。

ラーカー（Ｎ、　Ｌｅｒｎｅｒ）ら（Ｂｌｏｏｄ　７７　（１９９１）、　１８ ７６−１８８３）は、急性骨髄性白血病の患者の白血芽細胞に対して向けられた ガツト（Ｇａｄｄ）ら（Ｌｅｕｋ、　Ｒｅｓ、　９　（１９８５）、　１３２９ ）のモノクローナル抗体ＹＢ５．Ｂ８がｃ−ｋｉｔタンパクと反応するであろう ことを示した。しかしながら、ｃ−ｋｉｔレセプターに対するモノクローナル抗 体は、規定されたｃ−ｋｉｔ抗原との免疫感作によってのみ絶対的な確実性で得 られる。

従って、本発明の目的は、ｃ−ｋｉｔレセプターに対するモノクローナル抗体並 びにそれらの製造方法を提供すること、及びこれらの抗体を使用してこのＣ−ｋ ｉｔレセプターの発現の変化の検出を可能にする方法を提供することであった。

この目的は、細胞系ＤＳＭ　ＡＣＣ２００７、ＤＳＭ　ＡＣＣ２００８又はＤＳ Ｍ　ＡＣＣ２００９から得ることができるか、又は細胞系ＤＳＭ　ＡＣＣ２００ ７、ＤＳＭ　ＡＣＣ２００８又はＤＳＭ　ＡＣＣ２００９により産生ずる抗体と 同じようにしてｃ−ｋｉｔレセプターに結合できる、ヒトｃ−ｋｉｔレセプター に対するモノクローナル抗体によって達成される。

“同じようにして結合できる抗体”という用語は、規定された既知の抗体と検出 可能なエピトープ重複が存在する抗体として理解される。このエピトープ重複は 、競合的試験システムを使用して容易に検出できる。このために、例えば、ある 抗体が規定された抗原又は特定のエピーブへの結合について既知の抗体とどの程 度まで競合するかを試験するために酵素免疫測定法を使用する。

このためには、適当な抗原を、標識された形態にある既知のモノクローナル抗体 及び過剰の研究対象の抗体と共にインキュベートする。次に、研究対象の抗体が 結合に関して規定抗体にどの程度まで置換されるかは、形成された複合体を固定 化し、該固体を液相から分離し、そして２相中の１相における結合した標識を検 出することにより、容易に証明できる。１０’倍過剰で少なくとも５０％置換さ れれば、エピトープ重複が存在することになる。

驚いたことに、得られた抗体は、精上皮腫（ＤＳＭ　ＡＣＣ２００８）又は精上 皮腫及び小細胞肺癌（ＤＳＭ　ＡＣＣ２００７及びＤＳＭ　ＡＣＣ２００９）と のみ特異的に反応し、健康な肺組織とは反応しないことが判明した。

更に、驚いたことに、モノクローナル抗体ＤＳＭ　ＡＣＣ２００７は、幹細胞因 子ＳＣＦによるリンパ球様細胞の増殖の刺激を阻害することも判明した。この抗 体は、ｃ−ｋｉｔレセプターへのＳＣＦの如き成長因子の結合、および、ｃ−ｋ 　ｉ　ｔレセプタ子のＳＣＦ誘発リン酸化反応も、並びにｃ−ｋｉｔレセプター 分子発現におけるＳＣＦ誘発減少をも阻害する。

従って、本発明は、ｃ−ｋｉｔレセプターへの成長因子の結合を阻害するヒトｃ −ｋｉｔレセプターに対するモノクローナル抗体であって、哺乳動物細胞中で発 現され得るｃ−ｋｉｔ配列でトランスフェクションされた哺乳動物細胞で免疫感 作し、該免疫感作された動物の膵臓細胞を不滅化し、ｃ−ｋｉｔレセプターへの 得られた抗体の結合を確認し並びにｃ−ｋｉｔレセプターへの成長因子の結合に 関するこれら抗体の作用を確認することによって所望の抗体を産生ずるそれらハ イブリドーマ細胞を同定し、その培養上清がこの方法における阻害作用を有する それらハイブリドーマ細胞を同定し、これらハイブリドーマ細胞をクローニング し、そして、これらクローンによって産生ずる抗体を既知の方法に従って単離す ることにより得ることができる、モノクローナル抗体にも関する。

本発明は、好ましくは、ＳＣＦによるリンパ球様細胞の増殖の刺激を阻害するヒ トｃ−ｋｉｔレセプターに対するモノクローナル抗体であって、哺乳動物細胞中 で発現され得るｃ−ｋｉｔ配列でトランスフェクションされた哺乳動物細胞で免 疫感作し、該感作された動物の膵臓細胞を不滅化し、ｃ−ｋｉｔレセプターへの 得られた抗体の結合を確認し並びにリンパ球様細胞の増殖に関するこの抗体の作 用を確認することによって所望の抗体を産生ずるそれらハイブリドーマ細胞を同 定し、その培養上清がこの方法における阻害作用を示すそれらハイブリドーマ細 胞を同定し、これらハイブリドーマ細胞をクローニングし、そして、これらクロ ーンによって産生ずる抗体を既知の方法に従って単離することにより得ることが できる、モノクローナル抗体に関する。

免疫感作は、例えば、マウス又はラットの如きこの目的のために普通に使用され る動物内で行う。マウスが好ましく使用される。

Ｃ−ｋ　ｉ　ｔタンパクをコードするｃＤＮＡでトランスフェクションされたＮ ＩＨ−３７３細胞が免疫原として好ましく使用される。このｃＤＮＡは、ヤーデ ンら（ＥＭＩ３０　Ｊ、　６　（１９８７）、　３３４１−３３５１）に記載さ れたようにしてクローン化される。該免疫感作に使用したＮＩＨ−３Ｔ３細胞系 ｃ−ｋｉｔを、寄託番号ＤＳＭ　ＡＣＣ２００６で１９９１年５月２３日に“微 生物及び細胞培養物のドイツ収集協会（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ　Ｓａｍｍｌｕｎｇ　 ｖａｎ　Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ　ｕｎｄ　ＺｅｌｌｋｕＨｕｒｅｎ　 Ｇｍｂ）ｆ）″に寄託した。

免疫感作した動物の膵臓細胞を、好ましくは、Ｊ、　ｏｆ　Ｉｍｍ、　Ｍｅｔｈ 、　３９　（１９８０）　２８５−３０８における方法に従ってミエローマ細胞 系Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３（ＡＴＣＣＣＲＬ　１５８０）との融合によって 不滅化する。これとは別に、当業者によく知られている他の方法も膵臓細胞を不 滅化するのに使用できる（例えば、ＥＢＶ形質転換）。

クローニング用に、該細胞を例えば蛍光活性化セルンーターによって分離する。

ｃ−ｋｉｔに対する所望の抗体を産生ずる不滅化細胞を検出するために、培養上 清のサンプルをｃ−ｋｉｔレセプターとの反応性についてＥＬＩＳＡ試験法で試 験する。ｃ−ｋｉｔレセプターへの成長因子の結合を阻害するか又はＳＣＦによ るリンパ球様細胞の増殖の刺激を阻害するそれら抗体を得るために、ｃ−ｋｉｔ レセプターに結合する抗体を産生ずるそれらクローンの培養上清を、ｃ−ｋｉｔ レセプターへの成長因子結合の阻害及びリンパ球様細胞のＳＣＦ刺激増殖の阻害 について更に試験する。

ｃ−ｋｉｔレセプターへの成長因子結合の阻害は、通常、被験抗体の存在下で標 識した成長因子をｃ−ｋｉｔレセプターと共にインキュベートし、次にレセプタ ー結合成長因子を確認することにより行う。

リンパ球様細胞のＳＣＦ誘発増殖の阻害は、普通の方法で、好ましくは、その増 殖がＳＣＦで刺激されたリンパ球の蛍光標識によって確認する。

その培養上清が陽性反応を示すそれらクローンを増やし、これらクローンよって 産生ずる抗体を既知の方法に従って単離する。

驚いたことに、抗体ＤＳＭ　ＡＣＣ２００７がパラフィンで処理したｃ−ｋｉｔ レセプター並びにパラフィンで処理していなＬ’ｃ−ｋｉｔレセプターに結合す ることが判明した。

本発明の好ましい態様においては、その培養上清がパラフィン処理ｃ−ｋｉｔレ セプターとも反応するそれら抗体を含有するそれらハイブリドーマ細胞をクロー ン化し、これらクローンによって産生ずる抗体を既知の方法に従って単離する。

Ｃ−ｋｉｔに対する所望の抗体を産生ずる不滅化細胞の検出は、該培養上清のサ ンプルをパラフィン処理組織片とインキュベートし、この組織片中に存在するＣ −ｋｉｔレセプターに結合した抗体を検出することによって、この好ましい態様 で行う。

驚いたことに、モノクローナル抗体ＤＳＭ　ＡＣＣ２００９は、幹細胞因子ＳＣ Ｆにより誘発されたリンパ球様細胞の増殖を共働的に刺激する。加えて、それは ｃ−ｋｉｔレセプターのＳＣＦ誘発リン酸化反応を刺激してｃ−ｋｉｔレセプタ ー発現のＳＣＦ誘発減少を僅かに遅延させる。

従って、本発明は、更に、リンパ球様細胞のＳＣＦ誘発増殖を刺激するヒトｃ− ｋｉｔレセプターに対するモノクローナル抗体であって、補乳動物細中で発現さ れ得るｃ−ｋｉｔ配列でトランスフェクションされだ哺乳動物細胞で免疫感作し 、該免疫感作された動物の膵臓細胞を不滅化し、該ｃ−ｋｉｔレセプターへの得 られた抗体の結合を確認し並びにリンパ球様細胞の増殖についてのこの抗体の作 用を確認することにより所望の抗体を産生ずるそれらハイブリドーマ細胞を同定 し、その培養上清がこの方法における刺激作用を有するそれらハイブリドーマ細 胞を同定し、これらハイブリドーマ細胞をクローニングし、そして、これらクロ ーンによって産生ずる抗体を既知の方法に従って単離することにより得ることの できる、モノクローナル抗体に関する。

リンパ球様細胞のＳＣＦ誘発増殖の刺激は、普通の方法で、好ましくは、その増 殖がＳＣＦで刺激されたリンパ球の蛍光標識によって確認する。

本発明は、更に、哺乳動物細胞中で発現され得るｃ−ｋｉｔ配列でトランスフェ クションされた哺乳動物細胞で免疫感作し、そして、該免疫感作された動物の膵 臓細胞を不滅化し、それによって、ヒトｃ−ｋｉｔレセプターに対する抗体を産 生ずるそれらハイブリドーマ細胞をクローン化し、そして、これらクローンによ って産生ずる抗体を既知の方法に従って単離する、ヒトｃ−ｋｉｔレセプターに 対するモノクローナル抗体を産生ずる方法に関する。

本発明は、また、好ましくは、ヒトｃ−ｋｉｔレセプターへの成長因子の結合を 阻害するヒトｃ−ｋｉｔレセプターに対するモツクローナル抗体であって、哺乳 動物細胞中で発現され得るＣ　−ｋｉｔ配列でトランスフェクションされた哺乳 動物細胞で免疫感作し、該免疫感作された動物の膵臓細胞を不滅化し、該ｃ−ｋ ｉｔレセプターへの得られた抗体の結合及び該ｃ−ｋｉｔレセプターへの成長因 子の結合についてのこの抗体の作用を確認することにより所望の抗体を産生ずる それらハイブリドーマ細胞を同定し、その培養上清がこの方法の阻害作用を有す るそれらハイブリドーマ細胞を同定し、これらハイブリドーマ細胞をクローニン グし、そして、これらクローンにより産生ずる抗体を既知の方法に従って単離す ることにより得ることのできる、モノクローナル抗体を産生ずる方法に関する。

本発明は、特に好ましくは、ＳＣＦによるリンパ球様細胞の増殖の刺激を阻害す るヒトｃ−ｋｆｔレセプターに対するモノクローナル抗体であって、哺乳動物細 胞中で発現され得るｃ−ｋｉｔ配列でトランスフェクションされた哺乳動物細胞 で免疫感作し、該免疫感作された動物の膵臓細胞を不滅化し、該ｃ−ｋｉｔレセ プターへの得られた抗体の結合を確認し並びにリンパ球様細胞の増殖についての この抗体の作用を確認することにより所望の抗体を産生ずるそれらハイブリドー マ細胞を同定し、その培養上清がこの方法における阻害作用を有するそれらハイ ブリドーマ細胞を同定し、これらハイブリドーマ細胞をクローン化し、そして、 これらクローンにより産生ずる抗体を既知の方法に従って単離することにより得 ることのできる、モノクローナル抗体を産生ずる方法に関する。

本発明は、更に特に好ましくは、リンパ球様細胞のＳＣＦ誘発増殖を刺激するヒ トｃ−ｋｉｔレセプターに対するモノクローナル抗体であって、哺乳動物細胞中 で発現され得るｃ−ｋｉｔ配列でトランスフェクションされた哺乳動物細胞で免 疫感作し、そして、該免疫感作された動物の膵臓細胞を不滅化し、該ｃ−ｋｉｔ レセプターへの得られた抗体の結合を確認し並びにリンパ球様細胞の増殖につい てのこの抗体の作用を確認することにより所望の抗体を産生ずるそれらハイブリ ドーマ細胞を同定し、その培養上清がこの方法における刺激作用を有するそれら ／％イブリドーマ細胞を同定し、これらハイブリドーマ細胞をクローニングし、 そして、これらクローンにより産生ずる抗体を既知の方法に従って単離すること により得ることのできる、モノクローナル抗体を産生ずる方法に関する。

セルラインＤＳＭ　ＡＣＣ２００７、ＤＳＭ　ＡＣＣ２００８及びＤＳＭ　ＡＣ Ｃ２００９も本発明の主題である。

驚いたことに、治療のために価値のある知見を提供する本発明によれば、ｃ−ｋ ｉｔに対するモノクローナル抗体を使用して、造血細胞、精上皮腫並びに小細胞 肺癌の領域における腫瘍の悪性度を評価することが可能であることが判明した。

従って、本発明は、組織検体をｃ−ｋｉｔレセプターに対する少なくともｌのモ ノクローナル抗体と共にインキュベートし、次に、既知の方法によって結合した 抗体を確認する、造血細胞、精上皮腫及び小細胞肺癌の腫瘍の悪性度を検出する 方法にも関する。

好ましい態様においては、組織サンプルをｃ−ｋｉｔレセプターに対する本発明 抗体と共にインキュベートする。この場合、■ｇＧアイソタイプの抗体を使用す るのが好ましい。Ｆａｂ又はＦ（ａｂ“）２断片も使用できる。

ｃ−ｋｉｔレセプターに対し結合した抗体を検出するために、該ｃ−ｋ　ｉ　を 抗体への結合の前後に、例えば、標識したマウスＦＣδに対する第２抗体と共に インキュベーションを行う。通常は、酵素、又は蛍光性若しくは化学発光性染料 を標識として使用する。

造血細胞の悪性腫瘍と悪性精上皮腫はこの方法において正のシグナルを示し、細 胞系ＤＳＭ　ＡＣＣ２００７又はＤＳＭ　ＡＣＣ２００９により産生ずる抗体と 同様にしてｃ−ｋｉｔレセプターに結合するモノクローナル抗体を使用するとき は、更に小細胞肺癌もこの方法において正のシグナルを示す。

ＳＣＦによるリンパ球様細胞の増殖の刺激を阻害する本発明によるヒトｃ−ｋｉ ｔレセプターに対するモノクローナル抗体の更なる用途は、骨髄性白血病治療用 の治療剤を製造するためにそれらを使用することである。

本発明によるセルラインＤＳＭ　ＡＣＣ２００６、ＤＳＭＡＣＣ２００７、ＤＳ Ｍ　ＡＣＣ２００８及びＤＳＭ　ＡＣＣ２００９は、１９９１年５月２３日にＤ −３３００ブラウンシユヴアイク、マツシエローダ−（Ｍａｓｃｈｅｒｏｄｅｒ ）の“微生物及び細胞培養物のドイツ収集協会”に寄託した。

図面を参照しながら以下の実施例により本発明を説明する。

図１は、モノクローナル抗体ＤＳＭ　ＡＣＣ２００９によるリンパ球様細胞のＳ ＣＦ誘発増殖の刺激及びモノクローナル抗体ＤＳＭ　ＡＣＣ２００７によるリン パ球様細胞のＳＣＦ誘発増殖の阻害を示す。各場合において、増殖している細胞 の比率は、培地（・）、１００μｇ／ｍ１ｓｃＦ　（）、２μｇ／ｍｌのモノク ローナル抗体ＤＳＭ　ＡＣＣ２００７（マ）又はモノクローナル抗体ＤＳＭ　Ａ ＣＣ２００９（△）との３７℃でのＡＭＬ細胞のインキュベーション後、並びに ＳＣＦでの刺激前の、モノクローナル抗体ＤＳＭ　ＡＣＣ２００７（ロ）及びＤ ５ＭＡＣＣ２００９（ム）との４℃での３０分間のブレインキュベーション後に 示されたものである。

ヤーデンら（ＥＭＢＯＪｏｕｒｎａｌ　６巻（１９８７）、　３３４１−３３５ １）に記載されたようにしてヒトｃ−ｋｉｔ遺伝子をクローン化し、ＮＩＴ−３ ７３細胞内で発現させる。Ｂａ１ｂ／ｃｖウスを、ｃ−ｋｉｔを発現するこれら トランスフェクション済ＮＩＴ−３Ｔ３細胞５ｏｏｏ、ｏｏｏで腹腔内に免疫感 作する。この免疫感作は約４週間の間隔で繰り返す。総免疫感作期間は６力月で ある。次に、麦芽凝集素で富化したｃ−ｋｉｔ（実施例２を参照のこと）で該動 物を更に２回免疫感作する；これら免疫感作の最終の回は静脈内に行う。この最 終免疫感作の３日後に該免疫感作した動物の膵臓細胞をミエローマ細胞系Ｐ３Ｘ ６３−Ａｇ３．６５３　（ＡＴＣＣＣＲＬ１５８０）で不滅化する。

該膵臓細胞のミエローマ細胞系との融合は、Ｊ、　ｏｆ　１ｍｍ、　Ｍｅｔｈ。

、　３９　（１９８０）、　２８５−３０８による標準方法に従って行う。膵臓 細胞の融合割合：この場合はミエローマ細胞がｌ：１である。該融合物をグレイ ナ−（Ｇｒｅｉｎｅｒ）社の２４ウエル培養プレート上に５Ｘ１０４の該マウス の腹腔浸出細胞と共に播く。蛍光活性化セルソーター（ベクトン・ディッキンラ ン（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）　）を使用して融合後２週間目に陽性 の一次培養物（実施例３により確認した）をクローン化する。これのために、該 細胞を９６ウエルマイクロタイタープレート中に個別に配置してＨＥＣ８培地（ テクノマラ（Ｔｅｃｎｏｍａｒａ）　）を供給する。次に、１０％ウシ胎児血清 を含有する市販ＲＰＭＩ−１６４０培地を培養培地として使用する。

モノクローナル抗体を産生ずるために、このようにして得られたハイブリドーマ 細胞クローンをｉｎ　ｖｉｖｏで増やす。これのために、ブリスタン（シグマ） で前処理したマウスに５ＸｌＯ’のハイブリドーマ細胞を腹腔内接種する。１０ 〜１５日後、それぞれのマウスから腹水を２〜３ｍｌ採取し、慣用法に従いこれ からモノクローナル抗体を単離する。収率は約５ｍｇ　！ｇＧ／ｍｌ腹水である 。

実施例２ 麦芽凝集素アガロースによるｃ−ｋｉｔレセプタータンパクの濃縮 ｃ−ｋｉｔを発現するトランスフェクションＮＩＴ−３Ｔ３，１８１１胞系ｃ− ｋｉｔを、１０％ＦＣ３及び２ｍｍｏｌ／ｌのグルタミンを含有するＤＭＥＭ／ Ｆ１２　（１：　１）培地中で、ローラーフラスコ内に集密するまで培養する。

次に、２０ｍ１の細胞溶解緩衝液中で該細胞を溶解する。該細胞溶解緩衝液は、 ５０　ｍｍｏｆ／　Ｉ　Ｈｅｐｅｓ　ｐＨ７，５；　１５０ｍｍｏｌ／１塩化ナ トリウム；　１．５　ｍｍｏｌ／ＩＭｇＣＬ；　１ｍｍｏｌ／Ｉ　ＥＧＴＡ　； 　１％トリトンＸ−１００；１０％グリセロール及び４μｇ／ｍｌ　ＰＭＳＦを 含有する。

該細胞溶解産物を１０００００ｇで１時間遠心分離し、上澄み液をＨｅｒ２ｘ緩 衝液でｌ：ｌに希釈して一夜４０℃でバッチ法で麦芽凝集素アガロース（シグマ ）に結合させる（Ｈｅｒ２ｘ緩衝液：５０ｍｍｏｌ／ｌ　Ｈｅｐｅｓ　ｐＨ７， ２；１５０ｍｍｏｌ／ｌ塩化ナトリウム；１％トリトンＸ−１００，１０％グリ セロール及び４μｇ／ｍｌ　ＰＭＳＦ）。次に、該麦芽凝集素アガロースを１０ 倍容量のＨｅｒ２ｘ緩衝液で洗浄し、最後にｃ−ｋｉｔレセプタータンパクをＨ ｅｒ２ｘ緩衝液中で０．３ｍｏｌ／Ｉ　Ｎ−アセチルグルコサミンで溶離する。

ハイブリドーマ細胞の培養上清中の抗体の特異性を確認するために酵素結合免疫 吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）を使用する。

これのために、９６ウエルマイクロタイタープレート（ヌンク（Ｎｕｎｃ））を １００μ１ｃ−ｋｉｔ抗原（実施例２に従って単離する；炭酸緩衝液中５μｍ／ ｍｌベーリンガーマンハイム、カタログＮｏ、　７２６５５９）で被覆し、１０ ０μｌ培養上清（（ダルベツコ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ）とボート（Ｖｏｇｔ）、　 Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、　９９　（１９５４）、　１６７−１８２に従って） ＰＢＳで１＝２５に希釈する）と共に２時間室温でインキュベートし、３ｘ３５ ０μＩＰＢＳ１０．０５％ツイーン２０で洗浄する。その後、それをＰＯＤ標識 ヒツジ抗マウスＩｇＧ（１０ｍＵ；ベーリンガーマンハイム、カタログＮｏ、１ ３１７３７７　）と共に１５分間室温でインキュベートし、３ｘ３５０μＩＰＢ Ｓ１０、０５％ツイーン２０で洗浄して、３．２５　ｍｍｏｌ／　１過ホウ酸ナ トリウム（ベーリンガーマンハイム、カタログＮｏ、　１２０４５３０）を含有 する４　０　ｍｍｏｌ／　ｌクエン酸緩衝液（ｐＨ４，４）中、１００μＩ　Ａ ＢＴＳ■（１ｍｇ／ｍｌ、ベーリンガーマンハイム、カタログＮｏ、　７５６４ ０７）で試験反応を開始する。室温で２０分間インキュベーションした後、光度 計で４０５ｎｍにおける吸収を確認する。

実施例４ 産生じた抗体の、リンパ球様細胞のＳＣＦ誘発増殖及び成長因子の結合における 作用の確認 密度勾配遠心（“リンパ球分離媒体（Ｌｙｍｐｈｏｚｙｔｅｎ−Ｔｒｅｎｎｍｅ ｄｉｕｍ）″ベーリンガーマンハイム社、カタログＮｏ、２９５９４９　）によ ってリンパ球を単離し、完全ＲＰＭ１１６４０　（１０％ウシ胎児血清、２　ｍ ｍｏｌ／　ｌグルタミン、１％ビタミン溶液（ベーリンガーマンハイム社、カタ ログＮｏ、２１０３０７）、１００ＩＵ／ｍｌペニシリン及び１００μｇ／ｍｌ ストレプトマイシン）中、ｌＸｌ０’細胞／ｍｌの細胞力価に調節する。この細 胞懸濁液１００μｌをｌＯμｌの組み換えヒトＳＣＦ　（アムゲン・ソウザンド ・オークスＵＳＡ、最終濃度１１００ｎ／ｍｌ）及び２　ｔ、ｔ　ｇ／ｍ　ｌの 被験モノクローナル抗体と一緒に平行実験において３７℃で３０分間インキュベ ートする。更に行った２つの平行実験において、まず、２μｇ／ｍｌの被験モノ クローナル抗体とのブレインキュベーションを４℃で３０分間行い、次に１１０ ０ｎ／ｍ１ｓｃＦを添加する。次に、被験モノクローナル抗体に結合したそれら 細胞をヒツジからのＦＩＴＣ結合抗マウスイムノグロブリン（ベーリンガーマン ハイム社、カタログＮｏ、８２１４６２　）による蛍光標識によって染色し、そ してこれら細胞のＤＮＡを０．０５　ｍｇ／ｍ　ｌヨウ化プロビジウム（シグマ ）と０．１％クエン酸ナトリウムの低張性溶液で該細胞を処理することによって 染色し、ＦＡＣ８ＩＶセルソーター（ベクトン・ディッキンラン）で該標識を検 査する。励起を４８８　ｎｍで行ってＦＩＴＣ標識細胞を５３０ｎｍで測定し、 ヨウ化プロピジウムで標識した核を６１０ｎｍで測定する。増殖している細胞の パーセンテージは、Ｓ相並びにＧ２相及びＭ相にあるヨウ化プロピジウムで標識 された細胞の比率の合計（％Ｓ十％Ｇ　２　／Ｍ）によって得られる。図１は、 リンパ球様細胞のＳＣＦ誘発増殖についてのモノクローナル抗体ＤＳＭ　ＡＣＣ ２００９の刺激作用並びにリンパ球様細胞のＳＣＦ誘発増殖についてのモノクロ ーナル抗体ＤＳＭ　ＡＣＣ２００７の阻害作用を示す。

更に、モノクローナル抗体ＤＳＭ　ＡＣＣ２００７は、Ｃ−ｋｉｔレセプターへ のＳＣＦの結合の阻害を起こす。この作用を検出するために、上記のようにして 単離したリンパ球を０．０１％ＮａＮｚ及び２μｇ／ｍｌのモノクローナル抗体 ＤＳＭ　ＡＣＣ２００７を含有するＰＢＳ中で、氷上で３０分間インキュベート する。次に、１２５ｎｇ／ｍｌのビオチニル化ＳＣＦを添加して該細胞をストレ ブトアビジンーフイコエリトリン（ダイアツバ）で染色する。ＦＡＣ８ＩＶセル ソーター（ベクトン・デイツキンラン）中で、４８８ｎｍの励起波長及び５７０ ｎｍの測定波長で評価する。モノクローナル抗体ＤＳＭ　ＡＣＣ２００７と共に インキュベートしなかったコントロール試料と比較して、モノクローナル抗体Ｄ ＳＭ　ＡＣＣ２００７によるリンパ球へのＳＣＦ結合の阻害は９８％である。

培地（完全ＲＰＭＩ　１６４０） ４４０ｍｌ　ＲＰＭ１１６４０ （ベーリンガーマンハイムＢＭ　２０９９４５）５０ｍｌ　ウシ胎児血清（Ｆｅ ２）　（ＢＭ　２１０４７１）５ｍｌ　グルタミン溶液、２００　ｍｍｏｌ／　 ｌ　（Ｂ　Ｍ　２１０２７７）５ｍｌ　ビタミン溶液（１％”）　（ＢＭ　２１ ０３０７）１ｍｌ　ペニシリン（５００００１Ｕ）及びストレプトマイシン（５ ０ｍｇ） ビタミン溶液（ＢＭ　２１０３０７）　：ｍｇ／　１００ｍ１　ｍｇ　／　１０ ０ｍ１Ｃａ−Ｄ（＋）−パントテン酸　１０．０　ニコチンアミド　１０．０塩 化コリン　１０．０　ピリドキサール・ＨＣＬ　１０．０葉酸　１０．０　リボ フラビン　１．０メソ−イノシトール　２０．０　チアミン・ＨＣＬ　１０．０ ある抗体のモノクローナル抗体ＤＳＭ　ＡＣＣ２００７とのエピーブ重複を検出 するために、競合酵素免疫測定を行う。これのために、実施例２に従って濃縮し たｃ−ｋｉｔレセプタータンパクを、まず、Ｄ−ビオチニル−ε−アミドカプロ ン酸−Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドエステル（ベーリンガーマンハイム、カタ ログＮｏ、　１００８９６０）で製造業者の説明書に従ってビオチニル化する。

ａｏｏｎｇのこのビオチニル化抗原を、室温で１時間インキュベートすることに より、１００μＩＰＢＳ中でストレプトアビジン被覆マイクロタイタープレート （ＥＰ−Ａ　０３４４５７８に従って作る）に結合させる。ＰＢＳｌｏ、０５％ ツイーン２０で４回洗浄した後、それをペルオキシダーゼ（最終濃度２５０ｍＵ ／ｍｌ）で標識したモノクローナル抗体ＤＳＭ　ＡＣＣ２００７及び評価すべき 抗体と共に室温で９０分分間時にインキュベートする。

再度、ＰＢＳｌｏ、０５％ツイーン２０で４回洗浄した後、それを酵素−基質溶 液ＡＢＴＳ■と共に過ホウ酸ナトリウム含有緩衝液中で室温にて３０分間インキ ュベートし、次に、結合したＰＯＤ標識モノクローナル抗体ＤＳＭ　ＡＣＣ２０ ０７の量の測定値として４０５　ｎｍの吸収を測定する。この値をモノクローナ ル抗体ＤＳＭ　ＡＣＣ２００７を単独でインキュベートしたときに得られた吸収 と比較した。モノクローナル抗体ＤＳＭ　ＡＣＣ２００７酵素複合体（２５０ｍ Ｕ／ｍｌ、）について、１０’倍過剰の評価すべき抗体で少なくとも５０％の競 合が検出できる場合、エピーブ重複が存在する。

実施例６ 異なる組織及び腫瘍におけるｃ−ｋｉｔレセプタータンパクの発現の確認 被験組織片をｃ−ｋｉｔに対するモノクローナル抗体（ＤＳＭＡＣＣ２００７、 ＤＳＭ　ＡＣＣ２００９又はＤＳＭ　ＡＣＣ２００８、いずれの場合も２０μｇ ／ｍｌ）と共に４℃で２時間インキュベートする。洗浄工程（Ｐ　Ｂ　Ｓ１０． ０５％ツイーン２０中で５分間を３回）後、該組織片をヒツジ抗マウスＩｇＧ（ １００μｇ／ｍｌ、ベーリンガーマンノ１イム、カタログＮｏ、　１０９２６１ ８）と共に室温で１時間インキュベートする。結合した抗体をペルオキシダーゼ とマウス抗ペルオキシダーゼ抗体の複合体（２５０ｍＵ／ｍｌ、ベーリンガーマ ンハイム、カタログＮｏ、　１０９２６２６、室温で１時間インキュベーション ）によって検出する。試験反応はジアミノベンジジン（１ｍｇ／ｍｌ）で始まり 、顕微鏡で評価する。

以下の表は、この方法によって確認された、細胞系ＤＳＭ　ＡＣＣ２００７、Ｄ ＳＭ　ＡＣＣ２００Ｂ及びＤＳＭ　ＡＣＣ２００９から得られたモノクローナル 抗体の反応性を示す。

モノクローナル抗体 組織　ＤＳＭ　ＡＣＣ２００７ＤＳＭ　ＡＣＣ２００８ＤＳＭ　ＡＣＣ２００９ 精上皮腫　＋　＋　＋ 小細胞肺癌　＋　＋ 健康な肺組織　−−− Ｆｉｇ、１ インキュベーション期間（日数） 補正書の写しく翻訳文）提出書 （特許法　第１８４条の８） 平成５年１１月２５日 １、国際出願番号 ＰＣＴ／ＥＰ９２１０１１１７ ２、発明の名称 ｃ−ｋｉｔに対するモノクローナル抗体３、特許出願人 名称　ベーリンガー　マンハイム　ゲーエムベーハー（ほか１名） ４、代　理　人 住　所　東京都港区虎ノ門２丁目７番７号虎ノ門中田ビル２Ｆ ６、添付書類の目録 請求の範囲 ■、細胞系ＤＳＭ　ＡＣＣ２００７、ＤＳＭ　ＡＣＣ２００８又はＤＳＭ　ＡＣ Ｃ２００９から得ることができるか、又は細胞系ＤＳＭ　ＡＣＣ２００７、ＤＳ Ｍ　ＡＣＣ２００８及びＤＳＭ　ＡＣＣ２００９により産生ずる抗体と同様にｃ −ｋｉｔレセプターに結合できる、ヒトｃ−ｋｉｔレセプターに対するモノクロ ーナル抗体。

２、　抗体ＤＳＭ　ＡＣＣ２００７と同様にｃ−ｋｉｔレセプターに結合でき、 かつ、ｃ−ｋｉｔレセプターへの成長因子の結合を阻害するヒトｃ−ｋｉｔレセ プターに対するモノクローナル抗体であって、哺乳動物細胞中で発現され得るｃ −ｋｉｔ配列でトランスフェクションされた哺乳動物細胞で免疫感作し、該免疫 感作された動物の膵臓細胞を不滅化し、ｃ−ｋｉｔレセプターへの得られた抗体 の結合を確認し並びにｃ−ｋｉｔレセプターへの成長因子の結合に関するこれら 抗体の作用を確認することによって目的とする抗体を産生ずるそれらハイブリド ーマ細胞を同定し、その培養上清がこの方法における阻害作用を有するそれらハ イブリドーマ細胞を同定し、これらハイブリドーマ細胞をクローニングし、そし て、これらクローンによって産生ずる抗体を既知の方法に従って単離することに より得ることができる、モノクローナル抗体。

３、　抗体ＤＳＭ　ＡＣＣ２００７と同様にｃ−ｋｉｔレセプターに結合でき、 かつ、ＳＣＦによるリンパ球様細胞の増殖の刺激を阻害するヒトｃ−ｋｉｔレセ プター・に対するモノクローナル抗体であって、哺乳動物細胞中で発現され得る ｃ−ｋｉｔ配列でトランスフェクションされた哺乳動物細胞で免疫感作し、該感 作された動物の膵臓細胞を不滅化し、ｃ−ｋｉｔレセプターへの得られた抗体の 結合を確認し並びにリンパ球様細胞の増殖に関するこの抗体の作用を確認するこ とによって目的とする抗体を産生ずるそれらハイブリドーマ細胞を同定し、その 培養上清がこの方法における阻害作用を示すそれらハイブリドーマ細胞を同定し 、これらハイブリドーマ細胞をクローニングし、そして、これらクローンによっ て産生ずる抗体を既知の方法に従って単離することにより得ることができる、モ ノクローナル抗体。

４、リンパ球様細胞のＳＣＦ誘発増殖を刺激するヒトｃ−ｋｉｔレセプターに対 するモノクローナル抗体であって、哺乳動物細胞中で発現され得るｃ−ｋｉｔ配 列でトランスフェクションされた哺乳動物細胞で免疫感作し、該免疫感作された 動物の膵臓細胞を不滅化し、該ｃ−ｋｉｔレセプターへの得られた抗体の結合を 確認し並びにリンパ球様細胞の増殖についてのこの抗体の作用を確認することに より目的の抗体を産生ずるそれらハイブリドーマ細胞を同定し、このようにして 同定した目的のハイブリドーマ細胞をクローニングし、そして、これらクローン によって産生ずる抗体を既知の方法に従って単離することにより得ることのでき る、モノクローナル抗体。

５、哺乳動物細胞中で発現され得るｃ−ｋｉｔ配列でトランスフェクション形質 移入された哺乳動物細胞で免疫感作し、該免疫感作された動物の膵臓細胞を不滅 化し、ヒトｃ−ｋｉｔレセプターに対する抗体を産生ずるそれらハイブリドーマ 細胞をクローニングし、そして、これらクローンによって産生ずる抗体を既知の 方法に従って単離する、ヒトｃ−ｋｉｔレセプターに対するモノクローナル抗体 の産生方法。

６、培養上清がパラフィンで処理したｃ−ｋｉｔレセプターと反応する抗体を含 有するそれらハイブリドーマ細胞をクローシ化し、これらクローンによって産生 ずる抗体を既知の方法に従って単離する、請求項５記載の方法。

７、ｒＩｆＡ乳動物細胞中で発現され得るｃ−ｋｉｔ配列でトランスフェクショ ンされた哺乳動物細胞で免疫感作し、該免疫感作された動物の膵臓細胞を不滅化 し、ヒトｃ−ｋｉｔレセプターへの得られた抗体の結合を確認し並びに該ｃ−ｋ ｉｔレセプターへの成長因子の結合についてのこの抗体の作用を確認することに より目的の抗体を産生ずるそれらハイブリドーマ細胞を同定し、その培養上清が この方法における阻害作用を有するそれらハイブリドーマ細胞を同定し、これら ハイブリドーマ細胞をクローニングし、そして、これらクローンにより産生ずる 抗体を既知の方法に従って単離することによる、抗体ＤＳＭ　ＡＣＣ２００７と 同様にＣ−ｋｉｔレセプターに結合でき、かつ、ヒトｃ−ｋｉｔレセプターへの 成長因子の結合を阻害するヒトｃ−ｋｉｔレセプターに対するモノクローナル抗 体の産生方法。

８、′＠乳動物細胞中で発現され得るｃ−ｋｉｔ配列でトランスフェクションさ れた哺乳動物細胞で免疫感作し、該免疫感作された動物の膵臓細胞を不滅化し、 ヒトｃ−ｋｉｔレセプターへの得られた抗体の結合を確認し並びにリンパ球様細 胞の増殖についてのこの抗体の作用を確認することにより目的の抗体を産生ずる それらハイブリドーマ細胞を同定し、その培養上清がこの方法における阻害作用 を有するそれらハイブリドーマ細胞を同定し、これらハイブリドーマ細胞をクロ ーニングし、そして、これらクローンにより産生ずる抗体を既知の方法に従って 単離することによる、抗体ＤＳＭ　ＡＣＣ２００７と同様にｃ−ｋｉｔレセプタ ーに結合でき、かつ、ＳＣＦによるリンパ球様細胞の増殖の刺激を阻害するヒト ｃ−ｋｉｔレセプターに対するモノクローナル抗体の産生方法。

９、ｒＩＦ４乳動物細胞中で発現され得るｃ−ｋｉｔ配列でトランスフェクショ ンされた哺乳動物細胞で免疫感作し、該免疫感作された動物の膵臓細胞を不滅化 し、ヒトｃ−ｋ　ｉ　ｔレセプターへの得られた抗体の結合を確認し並びにリン パ球様細胞のＳＣＦ誘発増殖についてのこの抗体の作用を確認することにより目 的の抗体を産生ずるそれらハイブリドーマ細胞を同定し、この方法で同定した目 的のハイブリドーマ細胞をクローニングし、そして、これらクローンにより産生 ずる抗体を既知の方法に従って単離する、リンパ球様細胞のＳＣＦ誘発増殖を刺 激するヒｔ−ｃ−ｋｉｔレセプターに対するモノクローナル抗体の産生方法。

１０゜ＤＳＭ　ＡＣＣ２００７、ＤＳＭ　ＡＣＣ２００８及びＤＳＭ　ＡＣＣ２ ００９からなる群より選ばれる、ヒトｃ−ｋｉｔ　＋／セプターに対するモノク ローナル抗体を産生ずる細胞系。

１１、組織検体を請求項１ないし請求項４のいずれかｌの請求項の少なくとも１ つのモノクローナル抗体と共にインキュベートし、次に、既知の方法によって結 合した抗体を検出する、造血細胞の腫瘍、精上皮腫又は小細胞肺癌の悪性度を試 験する方法。

フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，５識別記号庁内整理番号ＧＯＩＮ　３３１５７７　 Ｂ　９０１５−２Ｊ（８１）指定回　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、　ＳＥ）、ＪＰ、　 ＵＳ （７２）発明者　コスト力、グンター ドイツ連邦共和国　Ｄ−８０００ミュンヘン−４０バレールシュトラーセ　７４ Ｉ （７２）発明者　ナオヨックス、タルトドイツ連邦共和国　Ｄ−８１２２ペンツ バーク　ビュッヘンシュトラーセ　３ （７２）発明者　ウルリッヒ、アクセルドイツ連邦共和国　８０００　ミュンヘ ン−４０アダルバートシユトラーセ　（番地な し）

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. １．細胞系ＤＳＭ　ＡＣＣ　２００７、ＤＳＭ　ＡＣＣ　２００８又はＤＳＭ　 ＡＣＣ　２００９から得ることができるか、又は細胞系ＤＳＭ　ＡＣＣ　２００ ７、ＤＳＭ　ＡＣＣ　２００８及びＤＳＭ　ＡＣＣ　２００９により産生する抗 体と同様にしてｃ−ｋｉｔレセプターに結合できる、ヒトｃ−ｋｉｔレセプター に対するモノクローナル抗体。
2. ２．ｃ−ｋｉｔレセプターへの成長因子の結合を阻害するヒトｃ−ｋｉｔレセプ ターに対するモノクローナル抗体であって、哺乳動物細胞中で発現され得るｃ− ｋｉｔ配列でトランスフェクションされた哺乳動物細胞で免疫感作し、該免疫感 作された動物の脾臓細胞を不滅化し、ｃ−ｋｉｔレセプターへの得られた抗体の 結合を確認し並びにｃ−ｋｉｔレセプターへの成長因子の結合に関するこれら抗 体の作用を確認することによって目的とする抗体を産生するそれらハイプリドー マ細胞を同定し、その培養上清がこの方法における阻害作用を有するそれらハイ ブリドーマ細胞を同定し、これらハイブリドーマ細胞をクローニングし、そして 、これらクローンによって産生する抗体を既知の方法に従って単離することによ り得ることができる、モノクローナル抗体。
3. ３．ＳＣＦによるリンパ球様細胞の増殖の刺激を阻害するヒトｃ−ｋｉｔレセプ ターに対するモノクローナル抗体であって、哺乳動物細胞中で発現され得るｃ− ｋｉｔ配列でトランスフェクションされた哺乳動物細胞で免疫感作し、該感作さ れた動物の脾臓細胞を不滅化し、ｃ−ｋｉｔレセプターへの得られた抗体の結合 を確認し並びリンパ球様細胞の増殖に関するこの抗体の作用を確認することによ って目的とする抗体を産生するそれらハイプリドーマ細胞を同定し、その培養上 清がこの方法における阻害作用を示すそれらハイプリドーマ細胞を同定し、これ らハイブリドーマ細胞をクローニングし、そして、これらクローンによって産生 する抗体を既知の方法に従って単離することにより得ることができる、モノクロ ーナル抗体。
4. ４．リンパ球様細胞のＳＣＦ誘発増殖を刺激するヒトｃ−ｋｉｔレセプターに対 するモノクローナル抗体であって、哺乳動物細胞中で発現され得るｃ−ｋｉｔ配 列でトランスフェクションされた哺乳動物細胞で免疫感作し、該免疫感作された 動物の脾臓細胞を不滅化し、該ｃ−ｋｉｔレセプターへの得られた抗体の結合を 確認し並びにリンパ球様細胞の増殖についてのこの抗体の作用を確認することに より目的の抗体を産生するそれらハイブリドーマ細胞を同定し、このようにして 同定した目的のハイブリドーマ細胞をクローニングし、そして、これらクローン によって産生する抗体を既知の方法に従って単離することにより得ることのでき る、モノクローナル抗体。
5. ５．哺乳動物細胞中で発現され得るｃ−ｋｉｔ配列でトランスフェクションされ た哺乳動物細胞で免疫感作し、該免疫感作された動物の脾臓細胞を不滅化し、ヒ トｃ−ｋｉｔレセプターに対する抗体を産生するそれらハイプリドーマ細胞をク ローニングし、そして、これらクローンによって産生する抗体を既知の方法に従 って単離する、ヒトｃ−ｋｉｔレセプターに対するモノクローナル抗体を産生す る方法。
6. ６．その培養上清がパラフィンで処理したｃ−ｋｉｔレセプターと反応するそれ ら抗体を含有するそれらハイブリドーマ細胞をクローン化し、これらクローンに よって産生する抗体を既知の方法に従って単離する、請求項５記載の方法。
7. ７．哺乳動物細胞中で発現され得るｃ−ｋｉｔ配列でトランスフェクションされ た哺乳動物細胞で免疫感作し、該免疫感作された動物の脾臓細胞を不滅化し、ヒ トｃ−ｋｉｔレセプターへの得られた抗体の結合を確認し並びに該ｃ−ｋｉｔレ セプターへの成長因子の結合についてのこの抗体の作用を確認することにより目 的の抗体を産生するそれらハイブリドーマ細胞を同定し、その培養上清がこの方 法における阻害作用を有するそれらハイブリドーマ細胞を同定し、これらハイブ リドーマ細胞をクローニングし、そして、これらクローンにより産生する抗体を 既知の方法に従って単離することによる、ヒトｃ−ｋｉｔレセプターへの成長因 子の結合を阻害するヒトｃ−ｋｉｔレセプターに対するモノクローナル抗体を産 生する方法。
8. ８．哺乳動物細胞中で発現され得るｃ−ｋｉｔ配列でトランスフェクションされ た哺乳動物細胞で免疫感作し、該免疫感作された動物の脾臓細胞を不滅化し、ヒ トｃ−ｋｉｔレセプターへの得られた抗体の結合を確認し並びにリンパ球様細胞 の増殖についてのこの抗体の作用を確認することにより目的の抗体を産生するそ れらハイブリドーマ細胞を同定し、その培養上清がこの方法における阻害作用を 有するそれらハイプリドーマ細胞を同定し、これらハイブリドーマ細胞をクロー ニングし、そして、これらクローンにより産生する抗体を既知の方法に従って単 離することによる、ＳＣＦによるリンパ球様細胞の増殖の刺激を阻害するヒトｃ −ｋｉｔレセプターに対するモノクローナル抗体を産生する方法。
9. ９．哺乳動物細胞中で発現され得るｃ−ｋｉｔ配列でトランスフェクションされ た哺乳動物細胞で免疫感作し、該免疫感作された動物の脾臓細胞を不滅化し、ヒ トｃ−ｋｉｔレセプターへの得られた抗体の結合を確認し並びにリンパ球様細胞 のＳＣＦ誘発増殖についてのこの抗体の作用を確認することにより目的の抗体を 産生するそれらハイブリドーマ細胞を同定し、この方法で同定した目的のハイプ リドーマ細胞をクローニングし、そして、これらクローンにより産生する抗体を 既知の方法に従って単離する、リンパ球様細胞のＳＣＦ誘発増殖を刺激するヒト ｃ−ｋｉｔレセプターに対するモノクローナル抗体を産生する方法。
10. １０．ＤＳＭ　ＡＣＣ　２００７、ＤＳＭ　ＡＣＣ　２００８及びＤＳＭ　ＡＣ Ｃ　２００９からなる群より選ばれる、ヒトｃ−ｋｉｔレセプターに対するモノ クローナル抗体を産生するセルライン。
11. １１．組織検体をｃ−ｋｉｔレセプターに対する少なくとも１のモノクローナル 抗体と共にインキュベートし、次に、既知の方法によって結合した抗体を検出す る、造血細胞の、精上皮腫又は小細胞肺癌の腫瘍の悪性度を試験する方法。