JPH0768279B2 - ｃ−ｋｉｔに対するモノクローナル抗体 - Google Patents
ｃ−ｋｉｔに対するモノクローナル抗体Info
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- JPH0768279B2 JPH0768279B2 JP4510419A JP51041992A JPH0768279B2 JP H0768279 B2 JPH0768279 B2 JP H0768279B2 JP 4510419 A JP4510419 A JP 4510419A JP 51041992 A JP51041992 A JP 51041992A JP H0768279 B2 JPH0768279 B2 JP H0768279B2
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- Japan
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- kit receptor
- cells
- antibody
- kit
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/32—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明は、ヒトｃ−kitレセプターに対するモノクロー
ナル抗体、並びに該ｃ−kitレセプターの発現の変化を
検出することにより造血細胞の、精上皮腫又は小細胞肺
癌の腫瘍の悪性度を試験する方法に関する。
ナル抗体、並びに該ｃ−kitレセプターの発現の変化を
検出することにより造血細胞の、精上皮腫又は小細胞肺
癌の腫瘍の悪性度を試験する方法に関する。
多細胞生物の細胞の発育、分化及び代謝機能は、ホルモ
ン及び成長因子によって調節される。多くの場合におけ
る第１段階は、細胞表面上のレセプターへのこれら因子
の結合である。これらレセプターの幾つかでは、この結
合は種々の細胞タンパクのチロシン残基のリン酸化を誘
発する。これらレセプターチロシンキナーゼが細胞の成
長挙動に決定的な影響を有していることを明らかにする
のは可能であった（ヤーデン（Yarden）及びユルリッヒ
（Ullrich）,Ann.Rev.Biochem.57（1988）,443−47
8）。レセプターチロシンキナーゼに関連するオートク
リン調節システムは、腫瘍のためのモデルシステムとし
て役立つセルラインの形質転換において及び一次腫瘍組
織においても重要な役割を演じている。EGFレセプター
及びher2/neuレセプターの如き確定したレセプターチロ
シンキナーゼの場合には、該レセプターの過剰発現と腫
瘍の進行の攻撃性との間の直接的な関係が証明されてい
る（スラモン（Slamon）ら,Science 244,1989,707−71
2;ジ・フィオレ（Di Fiore）ら,Cell 51,1987,1063−10
70）。
ン及び成長因子によって調節される。多くの場合におけ
る第１段階は、細胞表面上のレセプターへのこれら因子
の結合である。これらレセプターの幾つかでは、この結
合は種々の細胞タンパクのチロシン残基のリン酸化を誘
発する。これらレセプターチロシンキナーゼが細胞の成
長挙動に決定的な影響を有していることを明らかにする
のは可能であった（ヤーデン（Yarden）及びユルリッヒ
（Ullrich）,Ann.Rev.Biochem.57（1988）,443−47
8）。レセプターチロシンキナーゼに関連するオートク
リン調節システムは、腫瘍のためのモデルシステムとし
て役立つセルラインの形質転換において及び一次腫瘍組
織においても重要な役割を演じている。EGFレセプター
及びher2/neuレセプターの如き確定したレセプターチロ
シンキナーゼの場合には、該レセプターの過剰発現と腫
瘍の進行の攻撃性との間の直接的な関係が証明されてい
る（スラモン（Slamon）ら,Science 244,1989,707−71
2;ジ・フィオレ（Di Fiore）ら,Cell 51,1987,1063−10
70）。
レセプターチロシンキナーゼファミリーの更なるメンバ
ーは、ウィルス性腫瘍遺伝子ｖ−kit（ネコ白血病ウィ
ルスHZ4−FeSV）の細胞性相同体として発見され、クロ
ーン化され、そして配列決定されたｃ−kitである（ヤ
ーデンら,EMBO Journal 6（1987）,3341−3351）。それ
はPDGFレセプター及びCSF−１レセプター（ｃ−fms）と
実質的な相同性を有する。ノーザンブロット法を使用す
る研究で、異なる組織における該レセプターの特徴的な
分布が示されている。ｃ−kit遺伝子の高発現は、造血
細胞において、時に脳組織、メラニン芽細胞、卵巣及び
精巣の幹細胞において検出された（オーラ−ウルトレガ
ー（Orr−Urtreger）ら,Development 109（1990）,911
−923）。種々の赤血球性及び骨髄性セルラインについ
ての研究で、分化の初期段階においてｃ−kit遺伝子の
発現が示唆されている（アンドレ（Andre）ら,Oncogene
4（1989）,1047−1049）。例えば、グリア芽細胞腫細
胞の如き一定の腫瘍も同じくｃ−kit遺伝子の際立った
発現を示す。
ーは、ウィルス性腫瘍遺伝子ｖ−kit（ネコ白血病ウィ
ルスHZ4−FeSV）の細胞性相同体として発見され、クロ
ーン化され、そして配列決定されたｃ−kitである（ヤ
ーデンら,EMBO Journal 6（1987）,3341−3351）。それ
はPDGFレセプター及びCSF−１レセプター（ｃ−fms）と
実質的な相同性を有する。ノーザンブロット法を使用す
る研究で、異なる組織における該レセプターの特徴的な
分布が示されている。ｃ−kit遺伝子の高発現は、造血
細胞において、時に脳組織、メラニン芽細胞、卵巣及び
精巣の幹細胞において検出された（オーラ−ウルトレガ
ー（Orr−Urtreger）ら,Development 109（1990）,911
−923）。種々の赤血球性及び骨髄性セルラインについ
ての研究で、分化の初期段階においてｃ−kit遺伝子の
発現が示唆されている（アンドレ（Andre）ら,Oncogene
4（1989）,1047−1049）。例えば、グリア芽細胞腫細
胞の如き一定の腫瘍も同じくｃ−kit遺伝子の際立った
発現を示す。
一方、大きさが約30kDのタンパクがマウス線維芽細胞の
培養上清からｃ−kitレセプターの天然リガンドとして
単離され、MGE＝マスト細胞成長因子（ウィリアムス（W
illiaml）ら,Cell 63,（1990）,167−174）又は造血成
長因子KL（フアング（Huang）ら,Cell 63,（1990）,225
−233）と呼ばれている。対応するタンパクがラット肝
臓細胞からも単離され、SCF＝幹細胞因子と呼ばれてい
る（セボ（Zsebo）ら,Cell 63（1990）,195−201）。対
応するヒトの因子がマーチン（Martin）らによってクロ
ーン化され、SCF、MGF又はスチール・ファクター（SF）
と同義に呼ばれている（Cell 63（1990）,203−211）。
培養上清からｃ−kitレセプターの天然リガンドとして
単離され、MGE＝マスト細胞成長因子（ウィリアムス（W
illiaml）ら,Cell 63,（1990）,167−174）又は造血成
長因子KL（フアング（Huang）ら,Cell 63,（1990）,225
−233）と呼ばれている。対応するタンパクがラット肝
臓細胞からも単離され、SCF＝幹細胞因子と呼ばれてい
る（セボ（Zsebo）ら,Cell 63（1990）,195−201）。対
応するヒトの因子がマーチン（Martin）らによってクロ
ーン化され、SCF、MGF又はスチール・ファクター（SF）
と同義に呼ばれている（Cell 63（1990）,203−211）。
これまで、ｃ−kit遺伝子の発現は、特にノーザンブロ
ット法を使用するｃ−kit mRNAの検出によって、転写
レベルで確認されているだけである。しかしながら、例
えば、翻訳レベルについての調節プロセス又は形成され
たｃ−kitレセプタータンパクの安定性が全く登録され
ていないので、この方法は発現されたタンパクの量につ
いて間接的な示度を与えることができるだけである。従
って、診断薬用には、発現されたタンパクの量を直接に
測定することが極めて重要である。これは、ｃ−kitレ
セプターに対するモノクローナル抗体を用いる結果から
得られる所望の特異性によってのみ可能である。
ット法を使用するｃ−kit mRNAの検出によって、転写
レベルで確認されているだけである。しかしながら、例
えば、翻訳レベルについての調節プロセス又は形成され
たｃ−kitレセプタータンパクの安定性が全く登録され
ていないので、この方法は発現されたタンパクの量につ
いて間接的な示度を与えることができるだけである。従
って、診断薬用には、発現されたタンパクの量を直接に
測定することが極めて重要である。これは、ｃ−kitレ
セプターに対するモノクローナル抗体を用いる結果から
得られる所望の特異性によってのみ可能である。
ラーナー（N.Lerner）ら（Blood 77（1991）,1876−188
3）は、急性骨髄性白血病の患者の白血芽細胞に対して
向けられたガッド（Gadd）ら（Leuk.Res.9（1985）,132
9）のモノクローナル抗体YB5.B8がｃ−kitタンパクと反
応するであろうことを示した。しかしながら、ｃ−kit
レセプターに対するモノクローナル抗体は、規定された
ｃ−kit抗原との免疫感作によってのみ絶対的な確実性
で得られる。
3）は、急性骨髄性白血病の患者の白血芽細胞に対して
向けられたガッド（Gadd）ら（Leuk.Res.9（1985）,132
9）のモノクローナル抗体YB5.B8がｃ−kitタンパクと反
応するであろうことを示した。しかしながら、ｃ−kit
レセプターに対するモノクローナル抗体は、規定された
ｃ−kit抗原との免疫感作によってのみ絶対的な確実性
で得られる。
従って、本発明の目的は、ｃ−kitレセプターに対する
モノクローナル抗体並びにそれらの製造方法を提供する
こと、及びこれらの抗体を使用してこのｃ−kitレセプ
ターの発現の変化の検出を可能にする方法を提供するこ
とであった。
モノクローナル抗体並びにそれらの製造方法を提供する
こと、及びこれらの抗体を使用してこのｃ−kitレセプ
ターの発現の変化の検出を可能にする方法を提供するこ
とであった。
この目的は、細胞系DSM ACC 2007、DSM ACC 2008又
はDSM ACC 2009から得ることができるか、又は細胞系
DSM ACC 2007、DSM ACC 2008又はDSM ACC 2009に
より産生する抗体と同じようにしてｃ−kitレセプター
に結合できる、ヒトｃ−kitレセプターに対するモノク
ローナル抗体によって達成される。
はDSM ACC 2009から得ることができるか、又は細胞系
DSM ACC 2007、DSM ACC 2008又はDSM ACC 2009に
より産生する抗体と同じようにしてｃ−kitレセプター
に結合できる、ヒトｃ−kitレセプターに対するモノク
ローナル抗体によって達成される。
“同じようにして結合できる抗体”という用語は、規定
された既知の抗体と検出可能なエピトープ重複が存在す
る抗体として理解される。このエピトープ重複は、競合
的試験システムを使用して容易に検出できる。このため
に、例えば、ある抗体が規定された抗原又は特定のエピ
トープへの結合について既知の抗体とどの程度まで競合
するかを試験するために酵素免疫測定法を使用する。こ
のためには、適当な抗原を、標識された形態にある既知
のモノクローナル抗体及び過剰の研究対象の抗体と共に
インキュベートする。次に、研究対象の抗体が結合に関
して規定抗体にどの程度まで置換されるかは、形成され
た複合体を固定化し、該固体を液相から分離し、そして
２相中の１相における結合した標識を検出することによ
り、容易に証明できる。105倍過剰で少なくとも50％置
換されれば、エピトープ重複が存在することになる。
された既知の抗体と検出可能なエピトープ重複が存在す
る抗体として理解される。このエピトープ重複は、競合
的試験システムを使用して容易に検出できる。このため
に、例えば、ある抗体が規定された抗原又は特定のエピ
トープへの結合について既知の抗体とどの程度まで競合
するかを試験するために酵素免疫測定法を使用する。こ
のためには、適当な抗原を、標識された形態にある既知
のモノクローナル抗体及び過剰の研究対象の抗体と共に
インキュベートする。次に、研究対象の抗体が結合に関
して規定抗体にどの程度まで置換されるかは、形成され
た複合体を固定化し、該固体を液相から分離し、そして
２相中の１相における結合した標識を検出することによ
り、容易に証明できる。105倍過剰で少なくとも50％置
換されれば、エピトープ重複が存在することになる。
驚いたことに、得られた抗体は、精上皮腫（DSM ACC
2008）又は精上皮腫及び小細胞肺癌（DSM ACC 2007及
びDSM ACC 2009）とのみ特異的に反応し、健康な肺組
織とは反応しないことが判明した。
2008）又は精上皮腫及び小細胞肺癌（DSM ACC 2007及
びDSM ACC 2009）とのみ特異的に反応し、健康な肺組
織とは反応しないことが判明した。
更に、驚いたことに、モノクローナル抗体DSM ACC 20
07は、幹細胞因子SCFによるリンパ球様細胞の増殖の刺
激を阻害することも判明した。この抗体は、ｃ−kitレ
セプターへのSCFの如き成長因子の結合、および、ｃ−k
itレセプターのSCF誘発リン酸化反応も、並びにｃ−kit
レセプター分子発現におけるSCF誘発減少をも阻害す
る。
07は、幹細胞因子SCFによるリンパ球様細胞の増殖の刺
激を阻害することも判明した。この抗体は、ｃ−kitレ
セプターへのSCFの如き成長因子の結合、および、ｃ−k
itレセプターのSCF誘発リン酸化反応も、並びにｃ−kit
レセプター分子発現におけるSCF誘発減少をも阻害す
る。
従って、本発明は、ｃ−kitレセプターへの成長因子の
結合を阻害するヒトｃ−kitレセプターに対するモノク
ローナル抗体であって、哺乳動物細胞中で発現され得る
ｃ−kit配列でトランスフェクションされた哺乳動物細
胞で免疫感作し、該免疫感作された動物の脾臓細胞を不
滅化し、ｃ−kitレセプターへの得られた抗体の結合を
確認し並びにｃ−kitレセプターへの成長因子の結合に
関するこれら抗体の作用を確認することによって所望の
抗体を産生するそれらハイブリドーマ細胞を同定し、そ
の培養上清がこの方法における阻害作用を有するそれら
ハイブリドーマ細胞を同定し、これらハイブリドーマ細
胞をクローニングし、そして、これらクローンによって
産生する抗体を既知の方法に従って単離することにより
得ることができる、モノクローナル抗体にも関する。
結合を阻害するヒトｃ−kitレセプターに対するモノク
ローナル抗体であって、哺乳動物細胞中で発現され得る
ｃ−kit配列でトランスフェクションされた哺乳動物細
胞で免疫感作し、該免疫感作された動物の脾臓細胞を不
滅化し、ｃ−kitレセプターへの得られた抗体の結合を
確認し並びにｃ−kitレセプターへの成長因子の結合に
関するこれら抗体の作用を確認することによって所望の
抗体を産生するそれらハイブリドーマ細胞を同定し、そ
の培養上清がこの方法における阻害作用を有するそれら
ハイブリドーマ細胞を同定し、これらハイブリドーマ細
胞をクローニングし、そして、これらクローンによって
産生する抗体を既知の方法に従って単離することにより
得ることができる、モノクローナル抗体にも関する。
本発明は、好ましくは、SCFによるリンパ球様細胞の増
殖の刺激を阻害するヒトｃ−kitレセプターに対するモ
ノクローナル抗体であって、哺乳動物細胞中で発現され
得るｃ−kit配列でトランスフェクションされた哺乳動
物細胞で免疫感作し、該感作された動物の脾臓細胞を不
滅化し、ｃ−kitレセプターへの得られた抗体の結合を
確認し並びにリンパ球様細胞の増殖に関するこの抗体の
作用を確認することによって所望の抗体を産生するそれ
らハイブリドーマ細胞を同定し、その培養上清がこの方
法における阻害作用を示すそれらハイブリドーマ細胞を
同定し、これらハイブリドーマ細胞をクローニングし、
そして、これらクローンによって産生する抗体を既知の
方法に従って単離することにより得ることができる、モ
ノクローナル抗体に関する。
殖の刺激を阻害するヒトｃ−kitレセプターに対するモ
ノクローナル抗体であって、哺乳動物細胞中で発現され
得るｃ−kit配列でトランスフェクションされた哺乳動
物細胞で免疫感作し、該感作された動物の脾臓細胞を不
滅化し、ｃ−kitレセプターへの得られた抗体の結合を
確認し並びにリンパ球様細胞の増殖に関するこの抗体の
作用を確認することによって所望の抗体を産生するそれ
らハイブリドーマ細胞を同定し、その培養上清がこの方
法における阻害作用を示すそれらハイブリドーマ細胞を
同定し、これらハイブリドーマ細胞をクローニングし、
そして、これらクローンによって産生する抗体を既知の
方法に従って単離することにより得ることができる、モ
ノクローナル抗体に関する。
免疫感作は、例えば、マウス又はラットの如きこの目的
のために普通に使用される動物内で行う。マウスが好ま
しく使用される。
のために普通に使用される動物内で行う。マウスが好ま
しく使用される。
ｃ−kitタンパクをコードするcDNAでトランスフェクシ
ョンされたNIH−3T3細胞が免疫原として好ましく使用さ
れる。このcDNAは、ヤーデンら（EMBO J.6（1987）,334
1−3351）に記載されたようにしてクローン化される。
該免疫感作に使用したNIH−3T3細胞系ｃ−kitを、寄託
番号DSM ACC 2006で1991年５月23日に“微生物及び細
胞培養物のドイツ収集協会（Deutsche Sammlung von Mi
kroorganismen und Zellkulturen GmbH）”に寄託し
た。
ョンされたNIH−3T3細胞が免疫原として好ましく使用さ
れる。このcDNAは、ヤーデンら（EMBO J.6（1987）,334
1−3351）に記載されたようにしてクローン化される。
該免疫感作に使用したNIH−3T3細胞系ｃ−kitを、寄託
番号DSM ACC 2006で1991年５月23日に“微生物及び細
胞培養物のドイツ収集協会（Deutsche Sammlung von Mi
kroorganismen und Zellkulturen GmbH）”に寄託し
た。
免疫感作した動物の脾臓細胞を、好ましくは、J.of Im
m.Meth.39（1980）285−308における方法に従ってミエ
ローマ細胞系P3X63−Ag8.653（ATCC CRL 1580）との
融合によって不滅化する。これとは別に、当業者によく
知られている他の方法も脾臓細胞を不滅化するのに使用
できる（例えば、EBV形質転換）。
m.Meth.39（1980）285−308における方法に従ってミエ
ローマ細胞系P3X63−Ag8.653（ATCC CRL 1580）との
融合によって不滅化する。これとは別に、当業者によく
知られている他の方法も脾臓細胞を不滅化するのに使用
できる（例えば、EBV形質転換）。
クローニング用に、該細胞を例えば蛍光活性化セルソー
ターによって分離する。ｃ−kitに対する所望の抗体を
産生する不滅化細胞を検出するために、培養上清のサン
プルをｃ−kitレセプターとの反応性についてELISA試験
法で試験する。ｃ−kitレセプターへの成長因子の結合
を阻害するか又はSCFによるリンパ球様細胞の増殖の刺
激を阻害するそれら抗体を得るために、ｃ−kitレセプ
ターに結合する抗体を産生するそれらクローンの培養上
清を、ｃ−kitレセプターへの成長因子結合の阻害及び
リンパ球様細胞のSCF刺激増殖の阻害について更に試験
する。
ターによって分離する。ｃ−kitに対する所望の抗体を
産生する不滅化細胞を検出するために、培養上清のサン
プルをｃ−kitレセプターとの反応性についてELISA試験
法で試験する。ｃ−kitレセプターへの成長因子の結合
を阻害するか又はSCFによるリンパ球様細胞の増殖の刺
激を阻害するそれら抗体を得るために、ｃ−kitレセプ
ターに結合する抗体を産生するそれらクローンの培養上
清を、ｃ−kitレセプターへの成長因子結合の阻害及び
リンパ球様細胞のSCF刺激増殖の阻害について更に試験
する。
ｃ−kitレセプターへの成長因子結合の阻害は、通常、
被験抗体の存在下で標識した成長因子をｃ−kitレセプ
ターと共にインキュベートし、次にレセプター結合成長
因子を確認することにより行う。
被験抗体の存在下で標識した成長因子をｃ−kitレセプ
ターと共にインキュベートし、次にレセプター結合成長
因子を確認することにより行う。
リンパ球様細胞のSCF誘発増殖の阻害は、普通の方法
で、好ましくは、その増殖がSCFで刺激されたリンパ球
の蛍光標識によって確認する。
で、好ましくは、その増殖がSCFで刺激されたリンパ球
の蛍光標識によって確認する。
その培養上清が陽性反応を示すそれらクローンを増や
し、これらクローンよって産生する抗体を既知の方法に
従って単離する。
し、これらクローンよって産生する抗体を既知の方法に
従って単離する。
驚いたことに、抗体DSM ACC 2007がパラフィンで処理
したｃ−kitレセプター並びにパラフィンで処理してい
ないｃ−kitレセプターに結合することが判明した。
したｃ−kitレセプター並びにパラフィンで処理してい
ないｃ−kitレセプターに結合することが判明した。
本発明の好ましい態様においては、その培養上清がパラ
フィン処理ｃ−kitレセプターとも反応するそれら抗体
を含有するそれらハイブリドーマ細胞をクローン化し、
これらクローンによって産生する抗体を既知の方法に従
って単離する。
フィン処理ｃ−kitレセプターとも反応するそれら抗体
を含有するそれらハイブリドーマ細胞をクローン化し、
これらクローンによって産生する抗体を既知の方法に従
って単離する。
ｃ−kitに対する所望の抗体を産生する不滅化細胞の検
出は、該培養上清のサンプルをパラフィン処理組織片と
インキュベートし、この組織片中に存在するｃ−kitレ
セプターに結合した抗体を検出することによって、この
好ましい態様で行う。
出は、該培養上清のサンプルをパラフィン処理組織片と
インキュベートし、この組織片中に存在するｃ−kitレ
セプターに結合した抗体を検出することによって、この
好ましい態様で行う。
驚いたことに、モノクローナル抗体DSM ACC 2009は、
幹細胞因子SCFにより誘発されたリンパ球様細胞の増殖
を共働的に刺激する。加えて、それはｃ−kitレセプタ
ーのSCF誘発リン酸化反応を刺激してｃ−kitレセプター
発現のSCF誘発減少を僅かに遅延させる。
幹細胞因子SCFにより誘発されたリンパ球様細胞の増殖
を共働的に刺激する。加えて、それはｃ−kitレセプタ
ーのSCF誘発リン酸化反応を刺激してｃ−kitレセプター
発現のSCF誘発減少を僅かに遅延させる。
従って、本発明は、更に、リンパ球様細胞のSCF誘発増
殖を刺激するヒトｃ−kitレセプターに対するモノクロ
ーナル抗体であって、哺乳動物細胞中で発現され得るｃ
−kit配列でトランスフェクションされた哺乳動物細胞
で免疫感作し、該免疫感作された動物の脾臓細胞を不滅
化し、該ｃ−kitレセプターへの得られた抗体の結合を
確認し並びにリンパ球様細胞の増殖についてのこの抗体
の作用を確認することにより所望の抗体を産生するそれ
らハイブリドーマ細胞を同定し、その培養上清がこの方
法における刺激作用を有するそれらハイブリドーマ細胞
を同定し、これらハイブリドーマ細胞をクローニング
し、そして、これらクローンによって産生する抗体を既
知の方法に従って単離することにより得ることのでき
る、モノクローナル抗体に関する。
殖を刺激するヒトｃ−kitレセプターに対するモノクロ
ーナル抗体であって、哺乳動物細胞中で発現され得るｃ
−kit配列でトランスフェクションされた哺乳動物細胞
で免疫感作し、該免疫感作された動物の脾臓細胞を不滅
化し、該ｃ−kitレセプターへの得られた抗体の結合を
確認し並びにリンパ球様細胞の増殖についてのこの抗体
の作用を確認することにより所望の抗体を産生するそれ
らハイブリドーマ細胞を同定し、その培養上清がこの方
法における刺激作用を有するそれらハイブリドーマ細胞
を同定し、これらハイブリドーマ細胞をクローニング
し、そして、これらクローンによって産生する抗体を既
知の方法に従って単離することにより得ることのでき
る、モノクローナル抗体に関する。
リンパ球様細胞のSCF誘発増殖の刺激は、普通の方法
で、好ましくは、その増殖がSCFで刺激されたリンパ球
の蛍光標識によって確認する。
で、好ましくは、その増殖がSCFで刺激されたリンパ球
の蛍光標識によって確認する。
本発明は、更に、哺乳動物細胞中で発現され得るｃ−ki
t配列でトランスフェクションされた哺乳動物細胞で免
疫感作し、そして、該免疫感作された動物の脾臓細胞を
不滅化し、それによって、ヒトｃ−kitレセプターに対
する抗体を産生するそれらハイブリドーマ細胞をクロー
ン化し、そして、これらクローンによって産生する抗体
を既知の方法に従って単離する、ヒトｃ−kitレセプタ
ーに対するモノクローナル抗体を産生する方法に関す
る。
t配列でトランスフェクションされた哺乳動物細胞で免
疫感作し、そして、該免疫感作された動物の脾臓細胞を
不滅化し、それによって、ヒトｃ−kitレセプターに対
する抗体を産生するそれらハイブリドーマ細胞をクロー
ン化し、そして、これらクローンによって産生する抗体
を既知の方法に従って単離する、ヒトｃ−kitレセプタ
ーに対するモノクローナル抗体を産生する方法に関す
る。
本発明は、また、好ましくは、ヒトｃ−kitレセプター
への成長因子の結合を阻害するヒトｃ−kitレセプター
に対するモノクローナル抗体であって、哺乳動物細胞中
で発現され得るｃ−kit配列でトランスフェクションさ
れた哺乳動物細胞で免疫感作し、該免疫感作された動物
の脾臓細胞を不滅化し、該ｃ−kitレセプターへの得ら
れた抗体の結合及び該ｃ−kitレセプターへの成長因子
の結合についてのこの抗体の作用を確認することにより
所望の抗体を産生するそれらハイブリドーマ細胞を同定
し、その培養上清がこの方法の阻害作用を有するそれら
ハイブリドーマ細胞を同定し、これらハイブリドーマ細
胞をクローニングし、そして、これらクローンにより産
生する抗体を既知の方法に従って単離することにより得
ることのできる、モノクローナル抗体を産生する方法に
関する。
への成長因子の結合を阻害するヒトｃ−kitレセプター
に対するモノクローナル抗体であって、哺乳動物細胞中
で発現され得るｃ−kit配列でトランスフェクションさ
れた哺乳動物細胞で免疫感作し、該免疫感作された動物
の脾臓細胞を不滅化し、該ｃ−kitレセプターへの得ら
れた抗体の結合及び該ｃ−kitレセプターへの成長因子
の結合についてのこの抗体の作用を確認することにより
所望の抗体を産生するそれらハイブリドーマ細胞を同定
し、その培養上清がこの方法の阻害作用を有するそれら
ハイブリドーマ細胞を同定し、これらハイブリドーマ細
胞をクローニングし、そして、これらクローンにより産
生する抗体を既知の方法に従って単離することにより得
ることのできる、モノクローナル抗体を産生する方法に
関する。
本発明は、特に好ましくは、SCFによるリンパ球様細胞
の増殖の刺激を阻害するヒトｃ−kitレセプターに対す
るモノクローナル抗体であって、哺乳動物細胞中で発現
され得るｃ−kit配列でトランスフェクションされた哺
乳動物細胞で免疫感作し、該免疫感作された動物の脾臓
細胞を不滅化し、該ｃ−kitレセプターへの得られた抗
体の結合を確認し並びにリンパ球様細胞の増殖について
この抗体の作用を確認することにより所望の抗体を産生
するそれらハイブリドーマ細胞を同定し、その培養上清
がこの方法における阻害作用を有するそれらハイブリド
ーマ細胞を同定し、これらハイブリドーマ細胞をクロー
ン化し、そして、これらクローンにより産生する抗体を
既知の方法に従って単離することにより得ることのでき
る、モノクローナル抗体を産生する方法に関する。
の増殖の刺激を阻害するヒトｃ−kitレセプターに対す
るモノクローナル抗体であって、哺乳動物細胞中で発現
され得るｃ−kit配列でトランスフェクションされた哺
乳動物細胞で免疫感作し、該免疫感作された動物の脾臓
細胞を不滅化し、該ｃ−kitレセプターへの得られた抗
体の結合を確認し並びにリンパ球様細胞の増殖について
この抗体の作用を確認することにより所望の抗体を産生
するそれらハイブリドーマ細胞を同定し、その培養上清
がこの方法における阻害作用を有するそれらハイブリド
ーマ細胞を同定し、これらハイブリドーマ細胞をクロー
ン化し、そして、これらクローンにより産生する抗体を
既知の方法に従って単離することにより得ることのでき
る、モノクローナル抗体を産生する方法に関する。
本発明は、更に特に好ましくは、リンパ球様細胞のSCF
誘発増殖を刺激するヒトｃ−kitレセプターに対するモ
ノクローナル抗体であって、哺乳動物細胞中で発現され
得るｃ−kit配列でトランスフェクションされた哺乳動
物細胞で免疫感作し、そして、該免疫感作された動物の
脾臓細胞を不滅化し、該ｃ−kitレセプターへの得られ
た抗体の結合を確認し並びにリンパ球様細胞の増殖につ
いてこの抗体の作用を確認することにより所望の抗体を
産生するそれらハイブリドーマ細胞を同定し、その培養
上清がこの方法における刺激作用を有するそれらハイブ
リドーマ細胞を同定し、これらハイブリドーマ細胞をク
ローニングし、そして、これらクローンにより産生する
抗体を既知の方法に従って単離することにより得ること
のできる、モノクローナル抗体を産生する方法に関す
る。
誘発増殖を刺激するヒトｃ−kitレセプターに対するモ
ノクローナル抗体であって、哺乳動物細胞中で発現され
得るｃ−kit配列でトランスフェクションされた哺乳動
物細胞で免疫感作し、そして、該免疫感作された動物の
脾臓細胞を不滅化し、該ｃ−kitレセプターへの得られ
た抗体の結合を確認し並びにリンパ球様細胞の増殖につ
いてこの抗体の作用を確認することにより所望の抗体を
産生するそれらハイブリドーマ細胞を同定し、その培養
上清がこの方法における刺激作用を有するそれらハイブ
リドーマ細胞を同定し、これらハイブリドーマ細胞をク
ローニングし、そして、これらクローンにより産生する
抗体を既知の方法に従って単離することにより得ること
のできる、モノクローナル抗体を産生する方法に関す
る。
セルラインDSM ACC 2007、DSM ACC 2008及びDSM A
CC 2009も本発明の主題である。
CC 2009も本発明の主題である。
驚いたことに、治療のために価値のある知見を提供する
本発明によれば、ｃ−kitに対するモノクローナル抗体
を使用して、造血細胞、精上皮腫並びに小細胞肺癌の領
域における腫瘍の悪性度を評価することが可能であるこ
とが判明した。
本発明によれば、ｃ−kitに対するモノクローナル抗体
を使用して、造血細胞、精上皮腫並びに小細胞肺癌の領
域における腫瘍の悪性度を評価することが可能であるこ
とが判明した。
従って、本発明は、組織検体をｃ−kitレセプターに対
する少なくとも１のモノクローナル抗体と共にインキュ
ベートし、次に、既知の方法によって結合した抗体を確
認する、造血細胞、精上皮腫及び小細胞肺癌の腫瘍の悪
性度を検出する方法にも関する。
する少なくとも１のモノクローナル抗体と共にインキュ
ベートし、次に、既知の方法によって結合した抗体を確
認する、造血細胞、精上皮腫及び小細胞肺癌の腫瘍の悪
性度を検出する方法にも関する。
好ましい態様においては、組織サンプルをｃ−kitレセ
プターに対する本発明抗体と共にインキュベートする。
この場合、IgGアイソタイプの抗体を使用するのが好ま
しい。Fab又はＦ（ab′）２断片を使用できる。
プターに対する本発明抗体と共にインキュベートする。
この場合、IgGアイソタイプの抗体を使用するのが好ま
しい。Fab又はＦ（ab′）２断片を使用できる。
ｃ−kitレセプターに対し結合した抗体を検出するため
に、該ｃ−kit抗体への結合の前後に、例えば、標識し
たマウスFCδに対する第２抗体と共にインキュベーショ
ンを行う。通常は、酵素、又は蛍光性若しくは化学発光
性染料を標識として使用する。
に、該ｃ−kit抗体への結合の前後に、例えば、標識し
たマウスFCδに対する第２抗体と共にインキュベーショ
ンを行う。通常は、酵素、又は蛍光性若しくは化学発光
性染料を標識として使用する。
造血細胞の悪性腫瘍と悪性精上皮腫はこの方法において
正のシグナルを示し、細胞系DSM ACC 2007又はDSM A
CC 2009により産生する抗体と同様にしてｃ−kitレセ
プターに結合するモノクローナル抗体を使用するとき
は、更に小細胞肺癌もこの方法において正のシグナルを
示す。
正のシグナルを示し、細胞系DSM ACC 2007又はDSM A
CC 2009により産生する抗体と同様にしてｃ−kitレセ
プターに結合するモノクローナル抗体を使用するとき
は、更に小細胞肺癌もこの方法において正のシグナルを
示す。
SCFによるリンパ球様細胞の増殖の刺激を阻害する本発
明によるヒトｃ−kitレセプターに対するモノクローナ
ル抗体の更なる用途は、骨髄性白血病治療用の治療剤を
製造するためにそれらを使用することである。
明によるヒトｃ−kitレセプターに対するモノクローナ
ル抗体の更なる用途は、骨髄性白血病治療用の治療剤を
製造するためにそれらを使用することである。
本発明によるセルラインDSM ACC 2006、DSM ACC 20
07、DSM ACC 2008及びDSM ACC 2009は、ブダペスト
条約に基づいて1991年５月23日にＤ−3300ブラウンシュ
ヴァイク、マッシェローダー（Mascheroder）の“微生
物及び細胞培養物のドイツ収集協会”に寄託した。
07、DSM ACC 2008及びDSM ACC 2009は、ブダペスト
条約に基づいて1991年５月23日にＤ−3300ブラウンシュ
ヴァイク、マッシェローダー（Mascheroder）の“微生
物及び細胞培養物のドイツ収集協会”に寄託した。
図面を参照しながら以下の実施例により本発明を説明す
る。
る。
図１は、モノクローナル抗体DDSM ACC 2009によるリ
ンパ球様細胞のSCF誘発増殖の刺激及びモノクローナル
抗体DSM ACC 2007によるリンパ球様細胞のSCF誘発増
殖の阻害を示す。各場合において、増殖している細胞の
比率は、培地（●）、100μg/mlSCF（▽）、２μg/mlの
モノクローナル抗体DSM ACC 2007（▼）又はモノクロ
ーナル抗体DSM ACC 2009（△）との37℃でのAML細胞
のインキュベーション後、並びにSCFでの刺激前の、モ
ノクローナル抗体DSM ACC 2007（□）及びDSM ACC
2009（▲）との４℃での30分間のプレインキュベーショ
ン後に示されたものである。
ンパ球様細胞のSCF誘発増殖の刺激及びモノクローナル
抗体DSM ACC 2007によるリンパ球様細胞のSCF誘発増
殖の阻害を示す。各場合において、増殖している細胞の
比率は、培地（●）、100μg/mlSCF（▽）、２μg/mlの
モノクローナル抗体DSM ACC 2007（▼）又はモノクロ
ーナル抗体DSM ACC 2009（△）との37℃でのAML細胞
のインキュベーション後、並びにSCFでの刺激前の、モ
ノクローナル抗体DSM ACC 2007（□）及びDSM ACC
2009（▲）との４℃での30分間のプレインキュベーショ
ン後に示されたものである。
実施例１ ヒトｃ−kitレセプターに対するモノクローナル抗体の
産生 ヤーデンら（EMBO Journal6巻（1987）,3341−3351）に
記載されたようにしてヒトｃ−kit遺伝子をクローン化
し、NIT−3T3細胞内で発現させる。Balb/cマウスを、ｃ
−kitを発現するこれらトランスフェクション済NIT−3T
3細胞5000,000で腹腔内に免疫感作する。この免疫感作
は約４週間の間隔で繰り返す。総免疫感作期間は６ヶ月
である。次に、麦芽凝集素で富化したｃ−kit（実施例
２を参照のこと）で該動物を更に２回免疫感作する；こ
れら免疫感作の最終の回は静脈内に行う。この最終免疫
感作の３日後に該免疫感作した動物の脾臓細胞をミエロ
ーマ細胞系P3X63−Ag8.653（ATCC CRL1580）で不滅化
する。
産生 ヤーデンら（EMBO Journal6巻（1987）,3341−3351）に
記載されたようにしてヒトｃ−kit遺伝子をクローン化
し、NIT−3T3細胞内で発現させる。Balb/cマウスを、ｃ
−kitを発現するこれらトランスフェクション済NIT−3T
3細胞5000,000で腹腔内に免疫感作する。この免疫感作
は約４週間の間隔で繰り返す。総免疫感作期間は６ヶ月
である。次に、麦芽凝集素で富化したｃ−kit（実施例
２を参照のこと）で該動物を更に２回免疫感作する；こ
れら免疫感作の最終の回は静脈内に行う。この最終免疫
感作の３日後に該免疫感作した動物の脾臓細胞をミエロ
ーマ細胞系P3X63−Ag8.653（ATCC CRL1580）で不滅化
する。
該脾臓細胞のミエローマ細胞系との融合は、J.of Imm.M
eth.,39（1980）,285−308による標準方法に従って行
う。脾臓細胞：ミエローマ細胞の融合割合はこの場合1:
1である。該融合物をグレイナー（Greiner）社の24ウェ
ル培養プレート上に５×104の該マウスの腹腔浸出細胞
と共に播く。蛍光活性化セルソーター（ベクトン・ディ
ッキンソン（Becton Dickinson））を使用して融合後２
週間目に陽性の一次培養物（実施例３により確認した）
をクローン化する。これのために、該細胞を96ウェルマ
イクロタイタープレート中に個別に配置してHECS培地
（テクノマラ（Tecnomara））を供給する。次に、10％
ウシ胎児血清を含有する市販RPMI−1640培地を培養培地
として使用する。
eth.,39（1980）,285−308による標準方法に従って行
う。脾臓細胞：ミエローマ細胞の融合割合はこの場合1:
1である。該融合物をグレイナー（Greiner）社の24ウェ
ル培養プレート上に５×104の該マウスの腹腔浸出細胞
と共に播く。蛍光活性化セルソーター（ベクトン・ディ
ッキンソン（Becton Dickinson））を使用して融合後２
週間目に陽性の一次培養物（実施例３により確認した）
をクローン化する。これのために、該細胞を96ウェルマ
イクロタイタープレート中に個別に配置してHECS培地
（テクノマラ（Tecnomara））を供給する。次に、10％
ウシ胎児血清を含有する市販RPMI−1640培地を培養培地
として使用する。
モノクローナル抗体を産生するために、このようにして
得られたハイブリドーマ細胞クローンをin vivoで増や
す。これのために、プリスタン（シグマ）で前処理した
マウスに５×106のハイブリドーマ細胞を腹腔内接種す
る。10〜15日後、それぞれのマウスから腹水を２〜3ml
採取し、慣用法に従いこれからモノクローナル抗体を単
離する。収率は約5mg IgG/ml腹水である。
得られたハイブリドーマ細胞クローンをin vivoで増や
す。これのために、プリスタン（シグマ）で前処理した
マウスに５×106のハイブリドーマ細胞を腹腔内接種す
る。10〜15日後、それぞれのマウスから腹水を２〜3ml
採取し、慣用法に従いこれからモノクローナル抗体を単
離する。収率は約5mg IgG/ml腹水である。
実施例２ 麦芽凝集素アガロースによるｃ−kitレセプタータンパ
クの濃縮 ｃ−kitを発現するトランスフェクションNIT−3T3細胞
系ｃ−kitを、10％FCS及び2mmol/lのグルタミンを含有
するDMEM/F12（1:1）培地中で、ローラーフラスコ内に
集密するまで培養する。次に、20mlの細胞溶解緩衝液中
で該細胞を溶解する。該細胞溶解緩衝液は、50mmol/l
Hepes pH7.5;150mmol/l塩化ナトリウム;1.5mmol/lMgCl
2;1mmol/l EGTA;1％トリトンＸ−100;10％グリセロー
ル及び４μg/ml PMSFを含有する。該細胞溶解産物を10
0000gで１時間遠心分離し、上澄み液をHer2x緩衝液で1:
1に希釈して一夜40℃でバッチ法で麦芽凝集素アガロー
ス（シグマ）に結合させる（Her2x緩衝液:50mmol/l He
pes pH7.2;150mmol/l塩化ナトリウム;1％トリトンＸ−
100;10％グリセロール及び４μg/ml PMSF）。次に、該
麦芽凝集素アガロースを10倍容量のHer2x緩衝液で洗浄
し、最後にｃ−kitレセプタータンパクをHer2x緩衝液中
で0.3mol/l Ｎ−アセチルグルコサミンで溶離する。
クの濃縮 ｃ−kitを発現するトランスフェクションNIT−3T3細胞
系ｃ−kitを、10％FCS及び2mmol/lのグルタミンを含有
するDMEM/F12（1:1）培地中で、ローラーフラスコ内に
集密するまで培養する。次に、20mlの細胞溶解緩衝液中
で該細胞を溶解する。該細胞溶解緩衝液は、50mmol/l
Hepes pH7.5;150mmol/l塩化ナトリウム;1.5mmol/lMgCl
2;1mmol/l EGTA;1％トリトンＸ−100;10％グリセロー
ル及び４μg/ml PMSFを含有する。該細胞溶解産物を10
0000gで１時間遠心分離し、上澄み液をHer2x緩衝液で1:
1に希釈して一夜40℃でバッチ法で麦芽凝集素アガロー
ス（シグマ）に結合させる（Her2x緩衝液:50mmol/l He
pes pH7.2;150mmol/l塩化ナトリウム;1％トリトンＸ−
100;10％グリセロール及び４μg/ml PMSF）。次に、該
麦芽凝集素アガロースを10倍容量のHer2x緩衝液で洗浄
し、最後にｃ−kitレセプタータンパクをHer2x緩衝液中
で0.3mol/l Ｎ−アセチルグルコサミンで溶離する。
実施例３ 産生した抗体の特異性の確認 ハイブリドーマ細胞の培養上清中の抗体の特異性を確認
するために酵素結合免疫吸着検定法（ELISA）を使用す
る。
するために酵素結合免疫吸着検定法（ELISA）を使用す
る。
これのために、96ウェルマイクロタイタープレート（ヌ
ンク（Nunc））を100μlc−kit抗原（実施例２に従って
単離する；炭酸緩衝液中５μl/ml、ベーリンガーマンハ
イム、カタログ No.726559）で被覆し、100μｌ培養上
清（（ダルベッコ（Dulbecco）とボート（Vogt）,J.Ex
p.Med.99（1954）,167−182に従って）PBSで1:25に希釈
する）と共に２時間室温でインキュベートし、3x350μl
PBS/0.05％ツィーン20で洗浄する。その後、それをPOD
標識ヒツジ抗マウスIgG（10mU;ベーリンガーマンハイ
ム、カタログ No.1317377）と共に15分間室温でインキ
ュベートし、3x350μlPBS/0.05％ツィーン20で洗浄し
て、3.25mmol/l過ホウ酸ナトリウム（ベーリンガーマン
ハイム、カタログ No.1204 530）を含有する40mmol/lク
エン酸緩衝液（pH4.4）中、100μｌ ABTS （1mg/ml、
ベーリンガーマンハイム、カタログ No.756407）で試験
反応を開始する。室温で20分間インキュベーションした
後、光度計で405nmにおける吸収を確認する。
ンク（Nunc））を100μlc−kit抗原（実施例２に従って
単離する；炭酸緩衝液中５μl/ml、ベーリンガーマンハ
イム、カタログ No.726559）で被覆し、100μｌ培養上
清（（ダルベッコ（Dulbecco）とボート（Vogt）,J.Ex
p.Med.99（1954）,167−182に従って）PBSで1:25に希釈
する）と共に２時間室温でインキュベートし、3x350μl
PBS/0.05％ツィーン20で洗浄する。その後、それをPOD
標識ヒツジ抗マウスIgG（10mU;ベーリンガーマンハイ
ム、カタログ No.1317377）と共に15分間室温でインキ
ュベートし、3x350μlPBS/0.05％ツィーン20で洗浄し
て、3.25mmol/l過ホウ酸ナトリウム（ベーリンガーマン
ハイム、カタログ No.1204 530）を含有する40mmol/lク
エン酸緩衝液（pH4.4）中、100μｌ ABTS （1mg/ml、
ベーリンガーマンハイム、カタログ No.756407）で試験
反応を開始する。室温で20分間インキュベーションした
後、光度計で405nmにおける吸収を確認する。
実施例４ 産生した抗体の、リンパ球様細胞のSCF誘発増殖及び成
長因子の結合における作用の確認 密度勾配遠心（“リンパ球分離媒体（Lymphozyten−Tre
nnmedium）”ベーリンガーマンハイム社、カタログ No.
295 949）によってリンパ球を単離し、完全RPMI1640（1
0％ウシ胎児血清、2mmol/lグルタミン、１％ビタミン溶
液（ベーリンガーマンハイム社、カタログ No.210 30
7）、100IU/mlペニシリン及び100μg/mlストレプトマイ
シン）中、１×106細胞/mlの細胞力価に調節する。この
細胞懸濁液100μｌを10μｌの組み換えヒトSCF（アムゲ
ン・ソウザンド・オークスUSA;最終濃度100ng/ml）及び
２μg/mlの被験モノクローナル抗体と一緒に平行実験に
おいて37℃で30分間インキュベートする。更に行った２
つの平行実験において、まず、２μg/mlの被験モノクロ
ーナル抗体とのプレインキュベーションを４℃で30分間
行い、次に100ng/mlSCFを添加する。次に、被験モノク
ローナル抗体に結合したそれら細胞をヒツジからのFITC
結合抗マウスイムノグロブリン（ベーリンガーマンハイ
ム社、カタログ No.821 462）による蛍光標識によって
染色し、そしてこれら細胞のDNAを0.05mg/mlヨウ化プロ
ピジウム（シグマ）と0.1％クエン酸ナトリウムの低張
性溶液で該細胞を処理することによって染色し、FACS
IVセルソーター（ベクトン・ディッキンソン）で核標識
を検査する。励起を488nmで行ってFITC標識細胞を530nm
で測定し、ヨウ化プロピジウムで標識した核を610nmで
測定する。増殖している細胞のパーセンテージは、Ｓ相
並びにG2相及びＭ相にあるヨウ化プロピジウムで標識さ
れた細胞の比率の合計（％Ｓ＋％G2/M）によって得られ
る。図１は、リンパ球様細胞のSCF誘発増殖についての
モノクローナル抗体DSM ACC 2009の刺激作用並びにリ
ンパ球様細胞のSCF誘発増殖についてのモノクローナル
抗体DSM ACC 2007の阻害作用を示す。
長因子の結合における作用の確認 密度勾配遠心（“リンパ球分離媒体（Lymphozyten−Tre
nnmedium）”ベーリンガーマンハイム社、カタログ No.
295 949）によってリンパ球を単離し、完全RPMI1640（1
0％ウシ胎児血清、2mmol/lグルタミン、１％ビタミン溶
液（ベーリンガーマンハイム社、カタログ No.210 30
7）、100IU/mlペニシリン及び100μg/mlストレプトマイ
シン）中、１×106細胞/mlの細胞力価に調節する。この
細胞懸濁液100μｌを10μｌの組み換えヒトSCF（アムゲ
ン・ソウザンド・オークスUSA;最終濃度100ng/ml）及び
２μg/mlの被験モノクローナル抗体と一緒に平行実験に
おいて37℃で30分間インキュベートする。更に行った２
つの平行実験において、まず、２μg/mlの被験モノクロ
ーナル抗体とのプレインキュベーションを４℃で30分間
行い、次に100ng/mlSCFを添加する。次に、被験モノク
ローナル抗体に結合したそれら細胞をヒツジからのFITC
結合抗マウスイムノグロブリン（ベーリンガーマンハイ
ム社、カタログ No.821 462）による蛍光標識によって
染色し、そしてこれら細胞のDNAを0.05mg/mlヨウ化プロ
ピジウム（シグマ）と0.1％クエン酸ナトリウムの低張
性溶液で該細胞を処理することによって染色し、FACS
IVセルソーター（ベクトン・ディッキンソン）で核標識
を検査する。励起を488nmで行ってFITC標識細胞を530nm
で測定し、ヨウ化プロピジウムで標識した核を610nmで
測定する。増殖している細胞のパーセンテージは、Ｓ相
並びにG2相及びＭ相にあるヨウ化プロピジウムで標識さ
れた細胞の比率の合計（％Ｓ＋％G2/M）によって得られ
る。図１は、リンパ球様細胞のSCF誘発増殖についての
モノクローナル抗体DSM ACC 2009の刺激作用並びにリ
ンパ球様細胞のSCF誘発増殖についてのモノクローナル
抗体DSM ACC 2007の阻害作用を示す。
更に、モノクローナル抗体DSM ACC 2007は、ｃ−kit
レセプターへのSCFの結合の阻害を起こす。この作用を
検出するために、上記のようにして単離したリンパ球を
0.01％NaN3及び２μg/mlのモノクローナル抗体DSM ACC
2007を含有するPBS中で、氷上で30分間インキュベー
トする。次に、125ng/mlのビオチニル化SCFを添加して
該細胞をストレプトアビジン−フィコエリトリン（ダイ
アノバ）で染色する、FACS IVセルソーター（ベクトン
・ディッキンソン）中で、488nmの励起波長及び570nmの
測定波長で評価する。モノクローナル抗体DSM ACC 20
07と共にインキュベートしなかったコントロール試料と
比較して、モノクローナル抗体DSM ACC 2007によるリ
ンパ球へのSCF結合の阻害は98％である。
レセプターへのSCFの結合の阻害を起こす。この作用を
検出するために、上記のようにして単離したリンパ球を
0.01％NaN3及び２μg/mlのモノクローナル抗体DSM ACC
2007を含有するPBS中で、氷上で30分間インキュベー
トする。次に、125ng/mlのビオチニル化SCFを添加して
該細胞をストレプトアビジン−フィコエリトリン（ダイ
アノバ）で染色する、FACS IVセルソーター（ベクトン
・ディッキンソン）中で、488nmの励起波長及び570nmの
測定波長で評価する。モノクローナル抗体DSM ACC 20
07と共にインキュベートしなかったコントロール試料と
比較して、モノクローナル抗体DSM ACC 2007によるリ
ンパ球へのSCF結合の阻害は98％である。
培地（完全RPMI1640） 440ml RPMI1640（ベーリンガーマンハイムBM 209 94
5） 50ml ウシ胎児血清（FCS）（BM 210 471） 5ml グルタミン溶液、200mmol/l（BM 210 277） 5ml ビタミン溶液（１％）（BM 210 307） 1ml ペニシリン（50000 IU）及びストレプトマイシ
ン（50mg） 実施例５ ｃ−kitに対する抗体のエピトープ重複の確認 ある抗体のモノクローナル抗体DSM ACC 2007とのエピ
トープ重複を検出するために、競合酵素免疫測定を行
う。これのために、実施例２に従って濃縮したｃ−kit
レセプタータンパクを、まず、Ｄ−ビオチニル−ε−ア
ミドカプロン酸−Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドエステ
ル（ベーリンガーマンハイム、カタログ No.1008960）
で製造業者の説明書に従ってビオチニル化する。300ng
のこのビオチニル化抗原を、室温で１時間インキュベー
トすることにより、100μlPBS中でストレプトアビジン
被覆マイクロタイタープレート（EP−A 0 344 578に従
って作る）に結合させる。PBS/0.05％ツィーン20で４回
洗浄した後、それをペルオキシダーゼ（最終濃度250mU/
ml）で標識したモノクローナル抗体DSM ACC 2007及び
評価すべき抗体と共に室温で90分間同時にインキュベー
トする。再度、PBS/0.05％ツィーン20で４回洗浄した
後、それを酵素−基質溶液ABTS と共に渦ホウ酸ナトリ
ウム含有緩衝液中で室温にて30分間インキュベートし、
次に、結合したPOD標識モノクローナル抗体DSM ACC 2
007の量の測定値として405nmの吸収を測定する。この値
をモノクローナル抗体DSM ACC 2007を単独でインキュ
ベートしたときに得られた吸収と比較した。モノクロー
ナル抗体DSM ACC 2007酵素複合体（250mU/ml）につい
て、105倍過剰の評価すべき抗体で少なくとも50％の競
合が検出できる場合、エピトープ重複が存在する。
5） 50ml ウシ胎児血清（FCS）（BM 210 471） 5ml グルタミン溶液、200mmol/l（BM 210 277） 5ml ビタミン溶液（１％）（BM 210 307） 1ml ペニシリン（50000 IU）及びストレプトマイシ
ン（50mg） 実施例５ ｃ−kitに対する抗体のエピトープ重複の確認 ある抗体のモノクローナル抗体DSM ACC 2007とのエピ
トープ重複を検出するために、競合酵素免疫測定を行
う。これのために、実施例２に従って濃縮したｃ−kit
レセプタータンパクを、まず、Ｄ−ビオチニル−ε−ア
ミドカプロン酸−Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドエステ
ル（ベーリンガーマンハイム、カタログ No.1008960）
で製造業者の説明書に従ってビオチニル化する。300ng
のこのビオチニル化抗原を、室温で１時間インキュベー
トすることにより、100μlPBS中でストレプトアビジン
被覆マイクロタイタープレート（EP−A 0 344 578に従
って作る）に結合させる。PBS/0.05％ツィーン20で４回
洗浄した後、それをペルオキシダーゼ（最終濃度250mU/
ml）で標識したモノクローナル抗体DSM ACC 2007及び
評価すべき抗体と共に室温で90分間同時にインキュベー
トする。再度、PBS/0.05％ツィーン20で４回洗浄した
後、それを酵素−基質溶液ABTS と共に渦ホウ酸ナトリ
ウム含有緩衝液中で室温にて30分間インキュベートし、
次に、結合したPOD標識モノクローナル抗体DSM ACC 2
007の量の測定値として405nmの吸収を測定する。この値
をモノクローナル抗体DSM ACC 2007を単独でインキュ
ベートしたときに得られた吸収と比較した。モノクロー
ナル抗体DSM ACC 2007酵素複合体（250mU/ml）につい
て、105倍過剰の評価すべき抗体で少なくとも50％の競
合が検出できる場合、エピトープ重複が存在する。
実施例６ 異なる組織及び腫瘍におけるｃ−kitレセプタータンパ
クの発現の確認 被験組織片をｃ−kitに対するモノクローナル抗体（DSM
ACC 2007、DSM ACC 2009又はDSM ACC 2008、い
ずれの場合も20μg/ml）と共に４℃で２時間インキュベ
ートする。洗浄工程（PBS/0.05％ツィーン20中で５分間
を３回）後、該組織片をヒツジ抗マウスIgG（100μg/m
l、ベーリンガーマンハイム、カタログ No.1092618）と
共に室温で１時間インキュベートする。結合した抗体を
ペルオキシダーゼとマウス抗ペルオキシダーゼ抗体の複
合体（250mU/ml、ベーリンガーマンハイム、カタログ N
o.1092626、室温で１時間インキュベーション）によっ
て検出する。試験反応はジアミンベンジジン（1mg/ml）
で始まり、顕微鏡で評価する。
クの発現の確認 被験組織片をｃ−kitに対するモノクローナル抗体（DSM
ACC 2007、DSM ACC 2009又はDSM ACC 2008、い
ずれの場合も20μg/ml）と共に４℃で２時間インキュベ
ートする。洗浄工程（PBS/0.05％ツィーン20中で５分間
を３回）後、該組織片をヒツジ抗マウスIgG（100μg/m
l、ベーリンガーマンハイム、カタログ No.1092618）と
共に室温で１時間インキュベートする。結合した抗体を
ペルオキシダーゼとマウス抗ペルオキシダーゼ抗体の複
合体（250mU/ml、ベーリンガーマンハイム、カタログ N
o.1092626、室温で１時間インキュベーション）によっ
て検出する。試験反応はジアミンベンジジン（1mg/ml）
で始まり、顕微鏡で評価する。
以下の表は、この方法によって確認された、細胞系DSM
ACC 2007、DSM ACC 2008及びDSM ACC 2009から
得られたモノクローナル抗体の反応性を示す。
ACC 2007、DSM ACC 2008及びDSM ACC 2009から
得られたモノクローナル抗体の反応性を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ 33/577 Ｂ // Ｃ１２Ｎ 15/02 (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） 微生物の受託番号 ＤＳＭ ＡＣＣ２００９ (72)発明者 コストカ，グンター ドイツ連邦共和国 Ｄ−8000 ミュンヘン −40 バレールシュトラーセ 74 (72)発明者 ナオヨックス，クルト ドイツ連邦共和国 Ｄ−8122 ペンツバー ク ビュッヘンシュトラーセ ３ (72)発明者 ウルリッヒ，アクセル ドイツ連邦共和国 8000 ミュンヘン−40 アダルバートシュトラーセ （番地な し) (56)参考文献 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌｕｌａ ｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｓｕｐｐ ｌｅｍｅｎｔ 15Ｆ（1991）Ｐ．89 Ｂｌｏｏｄ，77（９）（1991）Ｐ．1876 −1883 Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ, 39（２）（1991）Ｐ．210Ａ Ｂｌｏｏｄ，79（２）（1992）Ｐ．338 −346
Claims (7)
- 【請求項１】（ａ）ｃ−kitレセプターへの成長因子の
結合を阻害し、SCFによるリンパ球様細胞の増殖の刺激
を阻害し、精上皮腫および小細胞肺癌と反応するが健康
な肺組織とは反応せず、かつ、パラフィンで処理したｃ
−kitレセプターにもパラフィンで処理していないｃ−k
itレセプターにも結合することを特徴とする、細胞系DS
M ACC 2007から得ることができるか、または細胞系DS
M ACC 2007により産生される抗体によって認識される
エピトープと同じエピトープを介してヒトｃ−kitレセ
プターに結合し得るモノクローナル抗体； （ｂ）精上皮腫と反応するが小細胞肺癌および健康な肺
組織とは反応しないことを特徴とする、細胞系DSM ACC
2008から得ることができるか、または細胞系DSM ACC
2008により産生される抗体によって認識されるエピト
ープと同じエピトープを介してヒトｃ−kitレセプター
に結合し得るモノクローナル抗体；および （ｃ）リンパ球様細胞のSCF誘発増殖を刺激し、精上皮
腫および小細胞肺癌と反応するが健康な肺組織とは反応
しないことを特徴とする、細胞系DSM ACC 2009から得
ることができるか、または細胞系DSM ACC 2009により
産生される抗体によって認識されるエピトープと同じエ
ピトープを介してｃ−kitレセプターに結合し得るモノ
クローナル抗体； よりなる群から選ばれる、ヒトｃ−kitレセプターに対
するモノクローナル抗体。 - 【請求項２】抗体DSM ACC 2007によって認識されるエ
ピトープと同じエピトープを介してｃ−kitレセプター
に結合できるヒトｃ−kitレセプターに対するモノクロ
ーナル抗体であって、哺乳動物細胞中で発現され得るｃ
−kit配列でトランスフェクションされた哺乳動物細胞
を用いて動物を免疫感作し、該免疫感作された動物の脾
臓細胞を不滅化し、ｃ−kitレセプターへの得られた抗
体の結合を確認し、さらにｃ−kitレセプターへの成長
因子の結合に関するこれら抗体の作用またはリンパ球様
細胞の増殖に関するこれら抗体の作用を確認することに
よって目的とする抗体を産生するハイブリドーマ細胞を
同定し、その培養上清がこの方法において阻害作用を示
しかつパラフィンで処理したｃ−kitレセプターと反応
する抗体を含有するハイブリドーマ細胞を同定し、これ
らハイブリドーマ細胞をクローン化し、そして、これら
クローンによって産生される抗体を既知の方法に従って
単離することにより得ることができる、上記のモノクロ
ーナル抗体。 - 【請求項３】リンパ球様細胞のSCF誘発増殖を刺激する
ヒトｃ−kitレセプターに対するモノクローナル抗体で
あって、哺乳動物細胞中で発現され得るｃ−kit配列で
トランスフェクションされた哺乳動物細胞を用いて動物
を免疫感作し、該免疫感作された動物の脾臓細胞を不滅
化し、ヒトｃ−kitレセプターへの得られた抗体の結合
を確認し並びにリンパ球様細胞の増殖についてのこの抗
体の作用を確認することにより目的の抗体を産生するハ
イブリドーマ細胞を同定し、このようにして同定した目
的のハイブリドーマ細胞をクローン化し、そして、これ
らクローンによって産生される抗体を既知の方法に従っ
て単離することにより得ることができる、上記のモノク
ローナル抗体。 - 【請求項４】哺乳動物細胞中で発現され得るｃ−kit配
列でトランスフェクションされた哺乳動物細胞を用いて
動物を免疫感作し、該免疫感作された動物の脾臓細胞を
不滅化し、ヒトｃ−kitレセプターへの得られた抗体の
結合を確認し、さらにｃ−kitレセプターへの成長因子
の結合に関するこれら抗体の作用またはリンパ球様細胞
の増殖に関するこれら抗体の作用を確認することによっ
て目的と抗体を産生するハイブリドーマ細胞を同定し、
その培養上清がこの方法において阻害作用を示しかつパ
ラフィンで処理したｃ−kitレセプターと反応する抗体
を含有するハイブリドーマ細胞を同定し、これらハイブ
リドーマ細胞をクローン化し、そして、これらクローン
により産生される抗体を既知の方法に従って単離するこ
とからなる、抗体DSM ACC 2007によって認識されるエ
ピトープと同じエピトープを介してｃ−kitレセプター
に結合できる、ヒトｃ−kitレセプターに対するモノク
ローナル抗体の産生方法。 - 【請求項５】哺乳動物細胞中で発現され得るｃ−kit配
列でトランスフェクションされた哺乳動物細胞を用いて
動物を免疫感作し、該免疫感作された動物の脾臓細胞を
不滅化し、ヒトｃ−kitレセプターへの得られた抗体の
結合を確認し、さらにリンパ球様細胞のSCF誘発増殖に
ついてのこの抗体の作用を確認することにより目的の抗
体を産生するハイブリドーマ細胞を同定し、この方法で
同定した目的のハイブリドーマ細胞をクローン化し、そ
して、これらクローンにより産生される抗体を既知の方
法に従って単離することからなる、リンパ球様細胞のSC
F誘発増殖を刺激するヒトｃ−kitレセプターに対するモ
ノクローナル抗体の産生方法。 - 【請求項６】（ａ）ｃ−kitレセプターへの成長因子の
結合を阻害し、SCFによるリンパ球様細胞の増殖の刺激
を阻害し、精上皮腫および小細胞肺癌と反応するが健康
な肺組織とは反応せず、かつ、パラフィンで処理したｃ
−kitレセプターにもパラフィンで処理していないｃ−k
itレセプターにも結合する、ヒトｃ−kitレセプターに
対するモノクローナル抗体を産生する細胞系DSM ACC
2007; （ｂ）精上皮腫と反応するが小細胞肺癌および健康な肺
組織とは反応しない、ヒトｃ−kitレセプターに対する
モノクローナル抗体を産生する細胞系DSM ACC 2008;
および （ｃ）リンパ球様細胞のSCF誘発増殖を刺激し、精上皮
腫および小細胞肺癌と反応するが健康な肺組織とは反応
しない、ヒトｃ−kitレセプターに対するモノクローナ
ル抗体を産生する細胞系DSM ACC 2009; よりなる群から選ばれる、ヒトｃ−kitレセプターに対
するモノクローナル抗体を産生する細胞系。 - 【請求項７】組織検体を請求項１〜３のいずれか１つに
記載された少なくとも１つのモノクローナル抗体と共に
インキュベートし、次に、結合した抗体を既知の方法に
よって検出する、造血細胞の腫瘍、精上皮腫または小細
胞肺癌を検出する方法。
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|---|---|---|---|
| DE4117090.3 | 1991-05-25 | ||
| DE4117090 | 1991-05-25 | ||
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| DE4205148.7 | 1992-02-20 | ||
| PCT/EP1992/001117 WO1992021766A1 (de) | 1991-05-25 | 1992-05-20 | Monoklonale antikörper gegen c-kit |
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|---|---|
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-
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