JPH06502186A - 抗ウイルス剤として有用なミシェルアミン、組成物および治療方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 抗ウィルス剤として有用なミンエルアミン、組成物および治療方法 本発明は、抗ウィルス活性を呈する化合物、この化合物を植物から単離する方法 、およびこの化合物の使用法に関する。更に具体的には、本発明は、新規化合物 の単離および同定、および同化合物を含有する組成物に関する。本発明の化合物 は、ＡＩＤＳ　（後天性免疫不全症候群）の原因とされているヒト免疫不全ウィ ルス（ＨＩ　Ｖ）の細胞変成効果の阻害のような、優れた薬理学的、毒性学的お よび抗ウイルス特性を示す。

関連技術の説明 ＡＺＴは、現在ＡＩＤＳの治療に広く用いられている、唯一市販されている既知 の臨床上の薬剤である。ＡＺＴは、抗ウイルス療法に極めて有用ではあるが、毒 性があり治療指数が不十分で治療には適さないため、その使用は限定されている 。従って、ＨＩＶに対し効果的な抗ウイルス治療を行うため、単独使用またはＡ ＺＴおよび他の薬剤と併用する新規な種類の抗ウィルス剤が緊急に必要とされて いる。ＨＩ　Ｖ−１＠びにＨｆＶ−２に抗ウィルス活性を示す新規な薬剤を得る ことも非常に重要である。

本発明は、実質的に純粋な形態の、式：を有する化合物（以下、「ミンエルアミ ン」と呼ぶ）、または薬理学的に許容可能なその塩に関する。

本発明は、下記式を有するミシエルアミンの誘導体、または薬理学的に許容可能 なその塩にも関する。

ｃ式中、ＲおよびＲ６は同一であるかまたは異なるものであり、それぞれＣ−Ｃ アルキル、Ｒ１１ＣＯ−ま１１　１ま たはＲ５ｏ２−（但し、ＲはＣ１〜Ｃ６アルキルまたはアリール）であり、 Ｒ、Ｒ、Ｒ、Ｒ、ＲおよびＲ９は、同一であるかまたは異なるものであり、それ ぞれＣ，〜Ｃ６ア、ＩＩ／　＋　／ｌ／、Ｒ”Ｃｏ−＊たはＲ１１Ｓｏ　−（但 Ｌ、Ｒ１１ハ前記に定義した通りである）であり、 ＲおよびＲはＣ２〜Ｃ６アルキル、 アリール）であり、 １’　、３’　、７’　、４および７位の環上のＨは／１０ゲン、ニトロ、アミ ノ、ヒドロキシル、チオールまたはシアノ基で置換することができる〕 本発明は、＾ｎｃｉｓｔｒｏｃｌａｄｕｓ　ａｂｂｒｅｖｉａｔｕｓから第１図 のミンエルアミンを単離する方法にも関し、その方法は（ａ）　乾燥した植物材 料を有機溶媒で抽出して粗製抽出物を得、 （ｂ）　前記の粗製抽出物を酸−塩基に分配して粗製有機塩基画分を得、 （ｅ）　前記の粗製有機塩基画分を遠心分配クロマトグラフィに付し、 （ｄ）　アミノ結合相ＨＰＬＣカラムで前記のミシエルアミンを単離する工程を 含んで成るもの、である。

本発明のもう一つの、態様は、ミシエルアミンＡまたはＢのいずれかをミシエル アミンＡ、ＢおよびＣの混合物へ相互変換する方法であって・ （ａ）　ミシェルアミンＡまたはＢのいずれかを有Ｆａ溶媒に溶解し、 （ｂ）　前記のミシエルアミンＡまたはＢを塩基と反応ことがら成る方法に関す る。

本発明のもう一つの聾ｔ、Ｔは、抗ウイルス組成物であって、少なくとｉ、１種 類のミシエルアミンＡ、ＢまたはＣの有効量と、薬理的に許容し得る担体とを含 んで成る、組成物に関する。

本発明のもう一つの態様は、前記ミシエルアミン誘導体の少なくとも１種類の化 合物の抗ウィルス剤としての有効量と、薬理的に許容し得る担体とを含んで成る 、抗ウイルス組成物に関する。

抗ウイルス性組成物のいずれも、ＡＺＴおよび／または他の既知の抗ウィルス剤 を抗ウィルス剤としての有効量含有することかできる。

本発明は、ウィルス感染症の治療法であって、治療を必要とする患者にミンエル アミンＡＳＢまたはＣの少なくとも１種類の化合物の抗ウィルス剤としての有効 量を投与することを含んでなる治療法、およびウィルス感染症の治療法であって 、治療を必要とする患者にミンエルアミンＡ、ＢまたはＣ誘導体の少なくとも１ 種類の抗ウィルス剤としての有効量を投与することを含んでなる治療法にも関す る。

本発明の方法は、また、ＡＺＴおよび／または他の既知の抗ウィルス剤の抗ウィ ルス剤としての有効量を、ミシエルアミンＡ、ＢまたはＣの少なくとも１種類と 同時投与することを含んでなるものである。

本明細誉に記載の化合物は、これまで文献に報告かなく、また如何なる起源から のこの化合物の単離法も記載されていζい。またこの化合物に関する如何なる抗 ウィルス活性または他の生物活性についても報告はなく、この化合物の調製法お よび医薬としての使用についても全く報告されていない。

本発明の応用可能な範囲は、下記の詳細な説明および図面から明らかになるであ ろう。しかしながら、本発明の詳細な説明および具体例は、本発明の好ましい態 様を示しているのみであり、本発明の精神および範囲内の様々な変更および修正 はこの詳細な説明から当業者に明らかになることから、これらは単なる例示とし て挙げられるものであることを理解すべきである。

図面の簡単な説明 本発明を、添付の図面で更に例示する。

第１図は、ミンエルアミンＡ、ＢおよびＣの構造を示す。環の位置番号はミンエ ルアミンＡのみに示しているが、ミンエルアミンＢおよびＣについても同じであ る。

第２（ｉｌＡ−Ｄは、ミンエルアミンＡ（遊離塩基）の抗ＨＩＶ−１活性を示し ている。第２Ａ図、第２Ｂ図およびｆｆ１２ｃ図は、未感染のＣＥ　Ｌｉ　−Ｓ 　Ｓ細胞（０）およびＨＩＶ−１に感染したＣＥＭ−５ＳＪ胞（・）を６日間培 養した後にａｔ＋＋定したミンエルアミンＡの濃度の効果を示し、第２Ａ図はＢ ＣＥＣＦ分析法によって評価した生育可能なＣＥ　ｌｖｌ　−Ｓ　Ｓ細胞の相対 数を表わし、第２Ｂ図はそれぞれの培養物の相対的なり　Ｎ　Ａ含；を表わし、 第２Ｃ図はＸＴ丁分析法によって評ぽしｒ二生育可能なＣＥｋｉ　−Ｓ　Ｓ細胞 の相対数を表わす。第２Ｄ図は、感染性ウィルスまたはウィルス複製の指数に対 するミシエルアミンＡの濃度の効果を示し、ここでの表示はウィルス逆転写酵素 活性（ム）、ウィルスコアータンパク質ｐ　２４（７）生産（◆）およびシンシ チウム形成単位（麿）である。

第２Ａ図、第２Ｂ図および第２Ｃ図において、データーの点は未感染の、薬剤で 処理していない対照値の百分率として表わされる。第２Ｄ図では、データーの点 は感染させた、薬剤で処理していない対照値の百分率として表わされる。

第３Ａ−Ｄ図は、ミンニルアミンＡ（ＨＢｒ塩）の抗ＨＩＶ−１活性を示す。第 ３Ａ図、第３Ｂ図および第３Ｃ図は、未感染のＣＥＭ−５Ｓ細胞（○）およびＨ ＩＶ−１に感染したＣＥＭ−５Ｓ細胞（・）を６日間培養した後に測定したミシ エルアミンＡの濃度の効果を示し、第３Ａ図はＢＣＥＣＦ分析法によって評価し た生育可能なＣＥＭ−５ＢＭ胞のＦ目対数を表わし、第３Ｂ図はそれぞれの培養 物の相対的なりＮＡ含量を表わし、第３Ｃ図はＸＴＴ分析法によって評価した生 育可能なＣＥ　Ｍ　−ＳＳ４［Ｉ胞の岨対数を表わす。第３Ｄ図は、感染性ウィ ルスまたはウィルス複製の指数に対するミッチェルアミンＡ（ＨＢｒ塩）の情交 の範囲の効果を示し、二こでの表示はウィルス逆転写酵素ｒ工性（ム）、ウィル スコアータフバクＷ　ｐ　２４の生産（◆）δよびンンシチウム形成１１位（■ ）である。第３Ａ図、第３Ｂ図および第３Ｃ図において、データーの点は未感染 の、薬剤で処理していない対照値の百分率として表わされる。第３Ｄ図では、デ ーグーの点は感染させた、薬剤で処理していない対照値の百分率として表わされ る。

第４Ａ−Ｄ図は、ミンエルアミンＢ（遊離塩基）の抗ＨＩＶ−１活性を示す。第 ４Ａ図、第４Ｂ図３よび第４Ｃ図は、未感染のＣＥ　Ｍ　−Ｓ　Ｓ細胞（０）お よびＨＩＶ−１に感染したＣＥＭ−５Ｓ細胞（・）を６日間培養した後に測定し たミン二ルアミンＢの濃度の効果を示し、第４Ａ図はＢＣＥＣＦＣＥＣ−よって 評価した生育可能なＣＥＭ−５Ｓ細胞の相対数を表わし、第４Ｂ図はそれぞれの 培養物の相対的なりＮＡ含量を表わし、第４Ｃ図はＸＴＴ分析法によって評制し た生育可能なＣＥＭ　−Ｓ　Ｓ細胞の相対数を表わす。第４Ｄ図は、感染性ウィ ルスまたはウィルス複製の指数に対するミシエルアミンＡ（ＨＢｒ塩）の濃度の 効果を示し、ここでの表示はウィルス逆転写酵素活性（ム）、ウィルスコアータ ンパク質１）　２４の生産（◆）およびンンシチウム形成単位（■）である。第 ４Ａ図、第４８図および第４Ｃ図において、データーの点は未感染の、薬剤で処 理していない対照値の百分率として表わされる。第４Ｄ図では、デーグーの点は 感染させた、薬剤で処理していない対照値の百分率として表わされる。

第５Ａ−Ｄ図は、ミシエルアミンＢ（ＨＢｒ塩）の抗ＨＩＶ−１活性を示す。第 ５Ａ図、第５Ｂ図および第５Ｃ図は、未ｇ染のＣＥＭ−ＳＳＭ胞（Ｑ）およびＨ ＩＶ−１に感染したＣ　Ｅ　Ｍ　−Ｓ　Ｓ細胞（・）を６日間培養した後に測定 したミンエルアミンＡの濃度の効果を示し、第５Ａ図はＢＣＥＣＦＣＥＣ−よっ て評価した生育可能なＣＥＭ−５５細胞の相対数を表わし、第５Ｂ図はそれぞれ の培養物の相対的なりＮＡ含量を表わし、第５Ｃ図はＸＴＴ分析法によって評価 した生育可能なＣＥＭ−ＳＳ細胞の）ｆｌ対数を表わす。第５Ｄ図は、感染性ウ ィルスまたはウィルス複製の指数に対するミシエルアミンＢ（ＨＢｒ塩）の濃度 の効果を示し、ここでの表示はウィルス逆転写酵素活性（ム）、ウィルスコアー タンパク質ｐ２４の生産（◆）およびンンシチウム形成単位（■）である。第５ Ａ図、第５ＢＩｆｆｌおよびＭ２Ｃ図において、デーグーの点は未感染の、薬剤 で処理していない対照値の百分率として表わされる。第５Ｄ図では、データーの 点は感染させた、薬剤で処理していない対照値の百分率として表わされる。

第６Ａ図および第６Ｂ図は、ミシエルアミンＡ（遊離塩基およびＨＢｒ塩）の抗 Ｈｒｖ−２活性を示す。第６Ａ図は、未感染ノｈＩＴ　−２細胞（０）　お、、 及びＨＩＶ−１に感染したＰＶｘ　Ｔ　−２細胞（・）を６日間培養した後にＸ ＴＴ分析方法を用いて測定したミンエルアミンＡ（遊離塩基）の濃度の効果を示 す。白ヌキの棒グラフは、対応する上澄液の逆転写酵素活性を示す。第６Ｂ図は 、未感を用いてＪｌ定したミシエルアミンＡ（ＨＢｒ塩）の濃度の効果を示す。

白ヌキの棒グラフは、対応する逆転写酵素活性を示す。これらのグラフにおいて 、総てのデータ一点はそれぞれの対照物の百分率としてグラフに表わし第７Ａ図 および第７Ｂ図は、ミシェルアミンＢ（遊離塩基およびＨＢｒ塩）の抗ＨＩＶ− ２活性を示す。第７Ａ図は、未感染のＭＴ−２細胞（○）およびＨＩＶ−１に感 染したｔｖｘ　Ｔ　−２細胞（・）を６日間培養した後にＸ丁Ｔ分析方法を用い て測定したミシエルアミンＢ（遊離塩基）の濃度の所定Ｕ１囲の効果を示す。白 ヌキの棒グラフは、対応する上澄液の逆転写酵素活性を示す。第７Ｂ図は、未感 染の〜ＩＴ−２細胞（０）およびＨＩＶ−１に感染したＭ　Ｔ　−２ｍ胞（・） を６日間培養した後にＸＴＴ分析方法を用いて測定したミシエルアミンＢｌ：Ｈ Ｂｒ塩）の濃度の所定範囲の効果を示す。白ヌキの棒グラフは、対応する上澄液 の逆転写酵素活性を示す。これらのグラフにおいて、総てのデーターへはそれぞ れの対照物の百分率としてグラフに表わしている。

好ましいき様の詳細を説明 薬学上許容可能な塩の例には、ＨＢ　ｒ、ＥＣ１，シュウ酸、クエン酸、酒石′ Ｍ塩などがある。

０１〜Ｃ６アルキルとは、直鎖または分岐鎖状のｃ１〜Ｃ６アルキル基を意味す る。例としては、メチル、エチル、ｎ−プロピル、１ｓｏ−プロピル、ｎ−ブチ ル、１ｓｏ−ブチル、第ニーブチル、第三−ブチル、ｎ−ペンチル、１ｓｏ−ペ ンチルおよびｎ−ヘキシルが挙げられるが、これらに限定されない。

アリールとは、芳香族炭化水素から誘導される有機残基を意味する。アリール基 の例は、フェニルである。

脂肪族とは、開いた炭化水素鎖から誘導される有機残基を意味する。脂肪族基の 例には、アルカン、アルケンおよびアルキンがある。本発明に用いることができ る脂肪族基の具体例には、直鎖または分岐鎖状のＣエルＣ６アルキルが挙げられ るが、これに限定されない。

治療を行うことができるウィルス感染症の例には、Ｃ型？；　ヨＵ　Ｄ型レトロ ウィルス、ＨＴＬＶ−１、ＨＴＬＶ−２、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ネコ白血病 ウィルス、サル免疫不全症ウィルス、ネコ白血病ウィルス、ウシ白血病ウィルス 、ウマ感染症、貧血ウィルス、ラウス肉妊ウィルスなどのようなトリ肉腫ウィル ス、Ａ型、Ｂ型、非Ａ／非Ｂ型肝炎、１および２型ヘルペスウイルス、サイトメ ガロウィルス、インフルエンザウィルス、アルボウィルス、水痘ウィルス、麻疹 、流行性耳下腺炎および風疹ウィルスが挙げられるが、これらに限定されない。

抽出物を得たＡｎｃｆｓｔｒｏｃｌａｄｕｓ　ａｂｂｒｅｖｉａｔｕｓ　（Ａｉ ｒｙＳｈａｖ）は、Ａｎｃｉｓｔｒｏｃｌａｄａｃｅａｅ科の植物の約２０種の うちの一つである。この植物の詳細な説明は、「顕花植物およびシダ類の辞典Ｊ 　（Ｗ目ｉｓ、）、Ｃ，：　５ｈａｖ、　Ａ、に、　（監＊）　、Ｃａｍｂｒｉ ｄｇｅ　ＩＪｎｉｖｅｒｓＩｔｙ　Ｐｒｅｓｓ、ケンブリッジ、英国、１９７３ 年、６１頁）に見出だすことができる。この属の植物は、主としてアジア、マレ インアおよび西アフリカに見られる。本研究の植物材料は、ミズーリ州植物園（ Ｍｉｓｓｏｕｒｉ　Ｂｏｔａｎｉｃａｌ　Ｇａｒｄｅｎ）がカメルーン、南西部 　（Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔ　Ｐｒｏｖｉｎｃｅ）、　Ｋｏｒｕｐ　Ｎａｔｉｏｎａ ｌ　Ｐａｒｋ　で１９８７年３月２５日に収集した。この植物は、南緯５．０３ ’東経８．８３°の地点の海抜６０ｍで採取した。

Ａｎｃｆｓｔｒｏｃｌａｄｕｓ属の植物の抽出物からのミシエルアミンのＲ１離 様々な方法を用いてミシエルアミンを単離することができる。これらの方法の中 には、抽出、溶媒−溶媒分配、遠心分配クロマトグラフィ、ゲル浸透クロマトグ ラフィおよび各種の結合相を有するＨＰＬＣがある。これらの化合物の単離は、 ＵＶ、ＴＬＣおよび抗ＨＩＶバイオアッセイによって観察する二とができる。

Ａｎｃｆｓｔｒｏｃｌａｄｕｓ　ａｂｂｒｅｖｉａｔｕｓからのミシエルアミン の全般的０１離手法 この手法は、葉、幹および小枝から成る風乾した植物材料約１／２ｋｇの開始量 を収容する規模のものである。

植物材料をまず粉砕し、１：１のＭ　ｅ　ＯＨ：　ＣＨ２Ｃ１２て抽出した後、 メタノールで二回目の抽出を行う。これらの最初の有機抽出物は、典型的には全 体として元の粗製抽出物のｌ１ｉｆｌの約８〜１０％になる。次いで、この二回 目の抽出物を５％水性ＨＣＩに溶解し、ＣＨＣｌ　３で抽出する。次いで、水性 層を濃ＮＨ４ＯＨで塩基性にしてｐＨ１０〜１１とした後、４：１ ＣＨＣＩ　：ＭｅＯＨで抽出し、次に１＋ＩＭｅＯＨ＋ＣＨＣｌ３で抽出して、 溶媒を除去した後に塩基性抽出物を総量で約０．５〜１．０ｇ得る。次に、この 抽出物を５：５：３　（ＣＨＣＩ　：ＭｅＯＨ：０．５％水性ＨＢ　ｒ）の二相 性溶媒系の下相に溶解し、下降方式で操作する５ａｎｋｉ　ＣＰＣ上に置く。流 出液を、２７０ｎｍで監視する。降下方式で出てくる最後のピークには、ミシエ ルアミンＡおよびＢと微量のＣのＨＢｒ塩が含まれている。溶媒を除去したとこ ろ、この混合物は、典型的には全量で約２００〜３００ｍｇである。この混合物 を、アミノ結合相ＨＰＬＣにより（４３ニア）［ＣＨＣｌ　：ＭｅＯＨＯ，０７ ５％（ＮＨ４）２００３］を溶媒として用いて更に分離する。この一般的処理法 を用いると、粗製の有機抽出物からのミシエルアミンの全収率は、ミンエルアミ ンＡについては約０．　５〜２９６てあり、ミンニルアミンＢ（二ついては２〜 １０９６である。ミンエルアミンＣは、同様の処理法によって微量に単離される 。

実施例１ 乾燥したＡｎｃｌｓｔｒｏｃｌａｄｕｓ　ａｂｂｒｅｖｌａｔｕｓ　（４４９ｇ 　）を１／１ｌｅｙ　ミルで粉砕し、Ｋ１ｌ１ａｘパーコレーター中で１〜１Ｍ ｅＯＨ−ＣＨ２Ｃｔ２で抽出した。粉砕した材料を、この溶媒に一晩浸漬した。

溶媒を濾去して、減圧で蒸発させたところ、粗製を製油出物３６．６２ｇを得た 。

この抽出物の一部（２，１０７ｇ）を５％水性ＨＣＩ３３０ｍｌに＠濁／溶解し 、ＣＨＣｌ　３１００　ｍ　Ｉずつで４回抽出した。抽出物を纏めて、溶媒を減 圧で除去したところ、抽出物０．６５７ｇを得た。−吹拭ｆ（ＩＶアッセイをＶ ｅｌｓｌｏｖ、　０．　ら、Ｊ、　Ｎａｔｌ、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎ５ｔ、、　 ８１゜５５７−５８６．１９８９に記載の処理法にしたがって行ったところ、こ の物質は不活性であった。

残っている水性層を２ａＮＨ４０Ｈで処理し、溶液のｐＨを１０と１１の間にし た。塩基性の水性相を、４：１のＣＨＣｌ　：ＭｅＯＨＩＱＯｍｌずつで５回抽 出した。この抽出物を返めて、溶媒を減圧で除去したところ、抽出物Ｏ６３１９ ５ｇを得た。抗ＨＩＶアッセイを、前記のｌ／ｃｌｓｌｏｖらの文献に記載の処 理法にしたがって行ったところ、この物質は活性であった。

残っている水性層を更に１　：　Ｉ　Ｍ　ｅ　ＯＨ：　ＣＨＣｌ　３１００ｍｌ ずつで３回抽出した。抽出物を纏めて、溶媒を減圧で除去したところ、抽出物０ ．２５３４ｇを得て、これを同じアッセイ（Ｖｅｌｓｌｏｖ　、同上）にしたが って試験したところ、この物質は活性であった。

これらの２種類の抽出物のＮＭＲおよびＴＬＣ分析を行ったところ、いずれの試 料も同じ化合物を含んでいた。

４：ＩＣＨＣｌ　＋ＭｅＯＨ処理から得た抽出物の一部（２６４，１ｍｇ）を、 Ｍ　ｅ　ＯＨ−ＣＩ（ＣＩ　３　０　、　５％水性ＨＢｒの二相系の下相の少量 に溶解した。この試料を、下降方式で操作する１２本の分析用カートリッジを有 する５ａｎｋ［遠心分配クロマトグラフィ装置（ｃｐｃ）（４０Ｏｒｐｍ、３． ０ｍ１１分）に注入した。流出液を、Ｌｉｎｅａｒ　ｔｌＶ／Ｖｌｓ　２００モ ニターを用いて２７０ｎｍで監視した。装置を下降方式で操作しながら、８個の 画分を収集しくＡ−Ｈ）、装置の操作を逆転して上昇方式にしたときに、９個目 の画分を集めた。画分Ａ、Ｃ，ＥおよびＦは、前記の抗）（ＩＶアッセイでは不 活性であった。

画分Ｂ　（１４，４ｍｇ）　、Ｄ　（９，０ｍｇ）およびＩ（３１，８ｍｇ）は 、前記の抗ＨＩＶアッセイでは比較的小さな活性を示した。抗ＨＩＶ活性の大部 分は、画分Ｇ　（７２，７ｍｇ）およびＨ（４５，４ｍｇ）に見られｔ二。

画分Ｈ（４５，４ｍｇ）をＣＨＣｌ　３　Ｍ　ｅ　ＯＨ（４３：　７）に溶解し て、Ｒａ１ｎｉｎ　Ｄｙｎａｍａｘ　Ｎｌｌ、、カラム（２１，４ｍｍｘ２５０ ｍｍ、ガードカラムを装備）を用いたＷａｔｅｒｓ　Ｄｅｌｔａ　Ｐｒｅｐ　Ｈ ＰＬＣに注入した。試料をＣＨＣＩ　３−Ｍ　ｅ　ＯＨ／　０　、　０７５％（ ＮＨ４）２ＣＯ３（４３ニア）で１３ｍ１／分の流速で溶出し、２６０ｎｍで監 視した。６個の画分を収集し、ＨＩＶ抑制活性を試験した。画分１（保持時間− １０分、１．１ｍｇ）　、２　（保持時間−１９分、４．３ｍｇ）、４（保持時 間−２６分、４．６ｍｇ）および画分５（保持時間−３１，５分、１．０ｍｇ） は、不活性であルコとが判った。画分３はミシエルアミンＡ（保持時間−２２分 、１０ｍｇ）であり、画分６はミシエルアミンＢ（保持時間−３６分、１４．　 ４　ｍ　ｇ）であった。これらの化学的および分光特性を下記に示す。

画分Ｇを溶媒１．５ｍｇに溶解し、５００μｍずつ３回注入してカラム上に置い た。この試料からミシエルアミンＡ５．０ｍｇおよびミシエルアミン８３９．５ ｍｇを得た。不活性な未同定化合物３．０ｍｇも集めた。

前記の〜１　ｅ　ＯＨ−ＣＨＣＩ　Ｂ　（１：　１　）から単離した試料（２５ １ｍｇ）を、４：１抽出物と同様の条件下で５ａｎｋｌ　ＣＰＣ上に置いた。こ の場合に、装置を下降方式（Ａ−Ｇ）で操作しながら、７個の両分を集め、１両 分を上界方式中に収集した（Ｈ）。

両分Ａ％Ｂ％Ｃ，ＤおよびＨは抗ＨＥＶアッセイでは不活性であったが、Ｅ、Ｆ およびＧは総て活性であった。

前記と同一条件下での画分Ｅの調製用ＨＰＬＣでは、ミシェルアミンＡ０．８ｍ ｇ、ミシェルアミンＢ４４．５ｍｇおよび不活性テトラヒドロイソキノリン化合 物６．３ｍｇが得られた。両分Ｆ　（１８，８ｍｇ）では、ミシェルアミンＡ２ ．８ｍｇおよびミシエルアミンＢ８．１ｍｇと共に２Ｎ類の少量の不活性化合物 （＜２ｍｇ）が得られた。画分Ｇ　（１８，２ｍｇ）では、ミシエルアミンＡ１ ０．１ｍｇと未知の不活性物質２．１ｍｇが得られた。第三の少量化合物である ミシエルアミンＣは、ミシエルアミンＢのクロマトグラフィビーク上の肩として 一度単離された。それは、それ以後の更に迅速に処理された材料では、見られな かった。

出発材料である組成の抽出物からの活性な両分の総括的収率は、ミシエルアミン Ａ１，４％およびミシェルアミン８５．０％であった。

ミシエルアミンＡ、ＢおよびＣの化学構造前記のｌ１ｅｉｓｌｏｖ、　０．らの 文献に記載の方法によるイン・ビトロでの抗ＨＩＶスクリーニングアッセイには 、最初にＡｎｃｉｓｔｒｏｃｌａｃｌｕｓ　ａｂｂｒｅｖｉａｔｕｓのＣＨ３０ Ｈ−ＣＨ２Ｃ１２（１：１）抽出物中のＡＩＤＳ−抗ウィルス活性が開示されて いた。予備分画により、活性成分は塩基性アルカロイドであることが判った。酸 −塩基分配によって得られた粗製のアルカロイド画分を、遠心分配クロマトグラ フィ　（ＣＨＣＩ　−ＣＨ２Ｏに−０，５％ＨＢ　ｒ　／　Ｈ２０，５：　５　 ：３　）　ニ付し、下相の溶出により、４個の画分を得た。画分４は、アミノ結 合相半調製用カラム上でＨＰＬＣ［ＣＨＣｌ３−０．０７５％（Ｎころ、ミシェ ルアミンＡおよびＢと名付けられた、アトローブ異性体として関連づけられる２ 種類の活性化合物を生じた。

プラズマ・デソーブション質量スペクトル分析法（Ｃｆ　ＰＤＭＳ）により質量 スペクトル分析を行ったところ、これらの２種類の化合物は分子量が同じであっ た（ｍ／ｚ７５６）。分子式は、精密質量、迅速原子衝撃質量スペクトル分析法 によってＣ４６Ｈ４８Ｎ２０８となった。

へ〇ｃｉｓｔｒＯｃＩａｄａｃｅａｅ科は、ナフタレン−テトラヒドロイソキノ リンアルカロイドの資源として周知である［Ｂｒｉｎｇｍａｎｎ、　Ｇ、：Ｔｈ ｅ　Ｎａｐｈｔｙｌ　ｌ５ｏｑｕ（ｎｏｌｉｎｅ　Ａｌｋａｌｏｉｄｓ、　Ｉｎ 　Ｔｈｅ＾Ｉｋａｌｏｉｄｓ、２９巻、Ａ、　Ｂｒｏｓｓｌ監修、Ａｃａｄｅｍ ｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク、１９８６年、１４１〜１８４頁；Ｒｕａｎｇ ｒｕｎｇｓｊ　Ｎ、ら、Ｊ、　Ｎａｔ、　Ｐｒｏｄ、、　４８．５２９−５３４ ．１９８９および前記文献に引用されている文献］。単離した化合物の’ＲＨス ペクトルデーターおよび複雑なＮＭＲスペクトルは、これらの抗ウイルス性化合 物が既知のＡｎｃｉｓｔｒｏｃｌａｄａｃｅａｃアルカロイドに対して二量体性 であることを示していた。

ミシェルアミンＡのＮ　Ｌｉ　Ｒデーターを、３ｉ１表に示す。

第１表　ミシエルアミンＡのＮＭＲデーター炭素番号　δ（Ｈに付いた　Ｈδ　 多重度　Ｊ　（Ｈｚ）番号） １　４９．５　（１）　４．８４　Ｑ　Ｂ、５３　４５．２　（１）　３．５４ 　ｄｄｑ　１１．８．４．３．６．５４　３３．１　（２）　（ｅ）　２．８９ 　ｄｄ　１１６．４に（ａ）　２．０５６ｄ　１Ｂ、６．１１．１１４ａ　１３ ３．１　（０） ５　１２０．３　（０） ６　１５６．９　（０） ７　１０２．０　（１）　６．４０　（Ｓ）１１　１５５．４　（０） ８ａ　ｌ１３．１　（０） ］’　１１９．１　（１）　［ｉ、７５　（Ｓ）２’　１３７．ｆｉ　（０） ３’　１０８．０　（０）　８．８４　（ｓ）４’　＋５１１　（０） ４ａ’　月５．２　（０） ７’　１３４．８　（１）　７ＪＯ（ｓ）ｇ’　１２４．１　（０） ８ａ’　１３６．８　（０） ＯＭｅ　５７．１　（３）　４．１．Ｏ（ｓ）Ｍｅ−３１９，４（３）　１．１ ６４６．５Ｍｅ−１ｔｇ、４（３）　Ｌ、５７　ｑ　６．５ＨＢｒ塩の１３Ｃ（ １２５ＭＨｚ）および’Ｈ（５００ＭＨｚ）ＮＭＲスペクトルは、ｄ４−メタノ ール中で測定した。Ｈに付けた番号はＤＥＰＴ実験から決定した。

ミシニルアミンＡについての他のスペクトルデーターおよび他の特性は、下記の 通りである。

融点−２２０℃（分解）、［α］　Ｄ−−１０，５’、２６２　（４，１）、２ ８７　（３，８）、３１２　（３，８）、３３１　（３，８）、３４４　（３， ８）；ν　（ニーａｘ ミシエルアミンＢについてのＮ　Ｍ　Ｒデーターを、第２表に示す。

第２表　ミシエルアミンＢについてのＮ〜ＩＲデーター炭素番号　δ（Ｈに付い た　Ｈδ　多重度　Ｊ　（Ｈｚ）番号） １　４９．８，４９．３（１）　４．４４．４．２Ｂｑｌｌｉ、５３　４５．３ ．４５．２（１）　３．２７．３．２１ｄｄｑ１１．４．４．５．６．５４　３ ３．９．３３．１　（２）　（ｅＲ）　２．４９　ｄｄ　１７．５．４．５；　 （ａＲ）１．１！６　ｄｄ　７．５．　ＬＬ、０（ａＳ）　２．２２　ｄｄ　１ ７．５．１１．０；　（ａｓ）２．０８　ｄｄ　１７．５．４．５ ４ａ　１３３．１．１３３．０　（０）５　１２０．０．１２０．２　（０） ６　Ｌ５１１ｉ、９０．１５８．８１！　（０）？　１０２．０．１０２．１　 （１）　６．３４２Ｈ（Ｓ）８　１５５．５４．１５５．５１　（０）１１ａ　 ＬＬ３．Ｏ，Ｈ３，２（０） １’　１１９．２．　ＬＬ９．２　（１）　６．７７、６．８６　（ｓ）２’　 １３７．８０．１３７．５６　（０）３’　１０８．１２．１０８．１１　＜１ ）　Ｉｌｉ、ε４．６．８２　（ｓ＞４’　１５８゜０．１５８．１　（０）４ ａ’　１１５．２２．１１５．１７　（０）５’　１５２．２．１５３．３　（ ［”）６’　１１９．０．１１９．１　（０）？’　１３Ｂ、７．１３Ｇ、５　 （１）　７．２８．７．２４　（ｓ＞８’　１２４．１２．１２４．１０　（０ ）８ａ’　１３５．２．１３４．７　（ｅ）０）！ｅ　５７．０４．５７．０５ 　（３）　４．０［１，４，０９（ｓ）Ｍｅ−３１９４，１９，３（３）　１． ０５．１．０１　ｑ　Ｇ、５Ｍｅ−１１１４２，１８，４０（３）　１．５２． １．４’ｌ　ｑ　６．５Ｍｅ−２’　２２．１．２２．２　（３）　２．３［ｉ 、　２Ｊｌ　（ｓ）１３Ｃ（１２５ＭＨｚ）および’Ｈ（５００〜ＩＨｚ）ＮＭ Ｒスペクトルは、ｄ　−メタノール中て」１定した。１３ｃの化学ンフトはＨＢ ｒ塩として測定した。ＩＨ化学シフトは遊離塩基について測定した。　（ｅＳ、 ａＳ）および（ａＲ，ｅＲ）という名称は、５−８′環接続部における「Ｓ」お よびｒＲＪ立体化学を有するイソキノリン系でのメチレンシグナルを表わし、ｒ ａＪおよび「ｅ」は軸方向および水平方向を表わす。Ｈに付けた番号はＤＥＰＴ 実験から決定した。

ミシェルアミンＢについての他のスペクトルデーターおよび他の特性は、下記の 通りである。融点−２３０℃（分解）：［α］　Ｄ−−１４，８°、Ｃα］　３ ８５−−２３．４’　（ｃ−０，７４，ＭｅＯＨ）：十 ＦＡＢ−ＭＳ　：ｍ／ｚ７５７．　３５０　（＆ｆＨ。

Ｃ４６Ｈ４゜Ｎ　２０　ｇに対する計算値７５７．３４８７）；ＵＶおよびＪＲ は、ミンエルアミンＡについて：２録しｔ二値と同じであった。

ミンエルアミンＡの１３Ｃ−Ｎ〜ＩＲスペクトルにおいて、共鳴か２３個しかな いことは、２＠３のナフタレン−イノ千ノリン成分か専制であることを示してい た。テトラヒドロイソキノリンサブユニットの構造および相対的立体化学は、Ｉ Ｈ，、−ＩＨカップリング定数分析および示差ｎＯｅ分析から容易に認める二と かできた。Ｈ−３プロトンは、分析の要として働いた（環の番号付けの図式は、 前記のＢｒｉｎｇｍａｎｎの文献と同し図式で行った）。環上の疑ｖ軸方向位置 は、Ｈ−４プロトンに対するカブプリン’ｙ’から明らかであり（１１，８，４ ，３Ｈｚ）　、Ｃ−１に結合したメチル基に対するｎｏｅ応答が中程度ないし強 いことから２個の間に１．３−二軸性の関係が成り立つことから、Ｃ−１および Ｃ−３に結合したメチル基の間にトランスの関係が成立した。ナフタレン系の１ 個の環のＭｉ戊は、介在メチル基および側鎖のメトキシルを用いて、ＨＭＱＣ， ＨＭＢＣ及びメタ位のプロトンの対としての示差ｎｏｅ実験によって確立した。

残りの環は、プロトンか１個たけと、１個のヒドロキシル基であり、２個の他の アリール系に連結している。Ｈ〜ＩＢＣ及びＨｋＩＱｃデーターは、プロトンと ヒドロキシル置換基の１゜３関係を示していた。その環の完全な置換およびナフ タレン／テトラヒドロイソキノリンの接続の相対的立体化学および立体配座は、 示差ｎｏｅデーターから確定した。

テトラヒドロイソキノリノ系のベンジル性メチレンプロトン（Ｃ−４）はそれぞ れ、異なるナフタレンプロトンに対してｎｏｅ関係を示した。Ｈ−７′に対する Ｈ−４ｅおよびＨ−１′にｌｌす’５Ｈ−４２０したがって、テトラヒドロイソ キノリンは、Ｃ−５からＣ−８′への結合によってナフタレンに連結していた。

それ故、ナフタレンは、Ｃ−６′で接続していなければならなかった。

対照的に、ミシエルアミンＢの１３Ｃ−Ｎ〜ＩＲスペクトルは４６個のシグナル を存していた。同系列のＮＭＲ実験では、ミノエルアミンＡで見られたのと同じ 大まかな構造か得られた。これら２種類の化合物の間の相違は、環の接続の相対 的な立体配置であった。ミシニルアミンＢては、Ｃ−４のメチレンプロトンは、 ４本の別個な共０１として現れ、それぞれ、照射時に芳香族プロトンシグナルの ｎｏｅが増大した。一方の組みては、この関係は１と同しであり、Ｈ−４ｅとＨ −７′およびＨ−４ａとＨ−１′であった。この関係は分子の他の半分では逆に なり、Ｈ−４ｅとＨ−１′およびＨ−４ａとＨ−７′　となった。前記と同様に 、テトラヒドロイソキノリン系のプロトンの割り当ては、カップリング定数とｎ ｏｅから明確に行った。

ミシエルアミンＣ（第１図）という慣用名を与えている第三のアトローブ異性体 も、微量であるか見られた。

ミシエルアミンＣについてのＮ　Ｍ　Ｒデーターを、第３図に示す。

合　第３図　ミンエルアミンＣについてのＮ　Ｍ　Ｒデータート じ の化学シフトは、ｉｐ１ＭＦ基について３１１足した。

ミシエルアミンＣは、分子の両方の部位のＣ−５／Ｃ−８′結合に関してミシェ ルアミンＡとは逆の配置であると思われた。可変温度Ｎ　Ｍ　Ｒ実験では、自発 的な相互転換の証拠を示すことができなかった。

分子モデルでの＃′ｉｇから、ミシエルアミンのｃ−５／Ｃ−８′結合の回りの 回転の障害は８１ＫＪ／モルとなったが、これとは対照的に、Ｃ−６’　／Ｃ− ６’結合の回りの回転の障害の計算値（５１ＫＪ／そル）は、この障害を通過し て回転させることができる利用可能な熱エネルギーの範囲内にあった［５ｔｉｌ ｌ、　ｖ、Ｃ，、Ｍａｃｒｏｍｏｄｅｌ。

Ｖ２．５１ｅ学科、コロンビア大学、ニューヨークコ。

ミシエルアミンは、幾つかの点で独特な分子である。

これらの化合物は、発見されているこの種類の内で最初の二量体性アルカロイド である。既知の「単量体性」アルカロイドには、２個の環系の開のＣ−５／Ｃ− ８’　ａ合がない。更に、それらはこの種類の化合物の中で最も極性が高い化合 物であり、既知の化合物のいずれよりも単量体性単位当たりの遊離フェノールの 含量が高い。第１図に示されている提案の絶対立体化学は、先行文献に基づいて いるＣＢｒ１ｒ＋ｇＩＩｌａｎｎ、　Ｇ、、同上文献ｊ０実施例２　ミシエルア ミンのＨＢｒ塩の調製ミシエルアミンＢをＭ　ｅ　ＯＨに溶解したものを、９Ｎ ＩＨＢｒ　（２，２モル等量）を滴下して処理した。添加を終えた後、溶媒を蒸 発させたところ、ＨＢｒ塩を得た。

ミンエルアミンの他の塩も、同様にして調製した。実施例３　ミンエルアミンの 相互転換の方法ミシ二／レアミンＡ　Ｏ；ｇ液（１ｍ　］　Ｍ　ｅ　ＯＨ−ｄ　 ４中１ｍｇ）に、０　、　５　Ｍ　Ｎ　ａ　ＯＤ　／　Ｄ　ッＯを０．５ｍｌ加 えた。　Ｈ−Ｎ〜ＩＲ分析の結果、ミンエルアミンＡは、７０間でミシェルアミ ンＡ、ＢおよびＣの混合物（約３３１）に徐々１こ転換した。同様に、ミンンニ ルアミンＢを同一条件下で同り混合物に転換した。

ＨＰＬＣ分析により、これらの結果を確認した。

標準的な有機化学的方法を用いて、抗ウィルス活性を発現するミシニルアミンの 誘導体を調製する目的で多数のミシニルアミンの構造上の修飾物を作成すること かできる。特定の反応物の化学量論的量によっては、ミシエルアミンはそれぞれ の位置の一つ、幾つがまたは総ての位置で置換することができる。例えば、ミシ エルアミンＡ、ＢまたはＣの一つを所定量の は総ての位置で置換することができる。同様に、ミシニルアミンＡＳＢまたはＣ の一つを所定量のベンゼンスルホニルクロリドと反応させると、ＲおよびＲ６の 一方または両方がベンゼンスルホニル誘導体を形成することができる。

これらの例には、下記のものが挙げられるが、それらに限定されるものではない 。

１、ミンエルアミンにおける６個のフェノール性ヒドロキシル位の１個以上での エステル、スルホネートエステルおよびエーテル誘導体の調製。

エステルまたはスルホネートエステルを調製するには、ミンニルアミンＡまたは Ｂを、無水ピリジンまたはトリエチルアミン中で酸ハロゲン化物（ＲＣＯＸまた はＲ５０２Ｘ、但し、Ｘ−Ｃｌ、Ｂｒまたは１であり、ＲはＣ工〜Ｃ６脂肪族ま たは芳香族基である）と反応させる。

あるいは、ミンエルアミンＡまたはＢを、トリエチルアミン中−ｒｅ（Ｒｃｏ　 Ｈｌｔ：はＲ３０３Ｈ−但し、Ｒは脂肪族または芳香族基である）およびジシク ロへキシルカルボジイミドと反応させて、エステルまたはスルホネートエステル を調製する。

エーテルを調製するには、ミシエルアミンＡまたはＢを無水炭酸カリウムを含む 無水アセトン中でハロゲン化アルキル（ＲＸ、但し、Ｘ＝ＣＩ、ＢｒまたはＩで あり、Ｒは０１〜０６脂肪族または芳香族基である）と反応さ例としては、 ２、　Ｃ−４’のメチルエーテル基の除去によるフェノール性ヒドロキシル官能 基の提供および／またはその残基のエステル、スルホ早−トまたは他のエーテル への転換 メチルエーテルを開裂してフェノール性ヒドロキシルへ転換スるため、ミシエル アミンＡまたはＢをＣＨＣ１中でＢ　Ｂ　ｒ　３または ＢＸ　・（ＣＨ３）２５（但し、Ｘ−Ｆ、ＣＩまたはＢｒである）と反応させる 。生成するフェノールは、前記と同様の方法（１に記載の方法）でエステル、ス ルホネートエステルまたはエーテルに転換することができる。

例えば、 “０−デメチルシミシェルアミンＢ゛ ３、ミシエルアミンの一方または両方のアミン部位におけるアミドまたはスルホ ンアミド誘導体の調製アミドまたはスルホンアミド誘導体を調製するため、前記 と同じ処理法（１に記載の方法）を適用する。いずれの場合（１または３）にも 、適当な官能基保護法（選択された基の保４Ｊ！／脱保護）を適用する。

４、　第二アミン官能基の第三アミンまたはテトラアルキル第四アンモニウム塩 への転換 第三アミンまたはテトラアルキルアンモニウム塩を調製するため、ミシエルアミ ンＡまたはＢを無水の非プロトン性溶媒中でハロゲン化アルキル（ＲＸ、　但し 、Ｘ−Ｃｌ、ＢｒまたはＩであり、Ｒは０１〜Ｃ６脂肪族基である）１または２ 当量と反応させる。

あるいは、ミンエルアミンＡまたはＢをアルデヒドと反応させ、得られる生成物 をＮ　ａ　Ｂ　Ｈ４で還元する。

例えば、 １ミシエルアミンＢジメチルアンモニウムヨーダイト２５、　アリール系上の１ 個以上の水素置換基（Ｃ−７゜Ｃ−１’　、Ｃ−３’　、Ｃ−７’　）のハロゲ ン、ニトロ、アミノ、ヒドロキシル、チオールまたはシアノ基の置換臭素置換し た誘導体を調製するため、ミシエルアミンまたはＢＡＨＯ中でＢｒ　と反応させ る。ミシニルアミンＡまたはＢをＨＮ　Ｏ３／　ＨＯＡ　ｃで処理して、ニトロ 置換した（−Ｎｏっ）誘導体で処理する。次に、このニトロ誘導体を還元して、 アミノ誘導体にすることができる。このアミノ誘導体は、判知で且つ実施されて いるジアゾニウム置換反応を介するクロロ、ヨード、シアノ、チオールおよびヒ ドロキシル置換の８発物質である。

例えば、 ＯＡ　Ｉ ｕＣＮ −〉“シアノミシェルアミンＡ２ 一＝−＋”ヒドロキシミシエルアミンＡ″実施例５　ミンエルアミンの抗ウイル ス活性９６大のマイクロタイタープレートの個々のウェルについての一連の相関 した分析法を行い、抗ウィルス活性を明らかにした。Ｗｅｉｎｓｌｏｖ、　Ｏ， ら、Ｊ、　Ｎａｔｌ、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎ５ｔ、、　８１：　５７７−５８６ ．１９８９に記載の処理法を採用し、並びにＲｉｎｋ、　Ｔ、Ｊ、ら、Ｊ、　Ｃ ｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、、　９５：　１８９−１９６．　１９Ｈにｇ２載のフルオレ でインプローブである２１　、　７　／　−ヒ゛スカルボキシエチル−３（６） −カルボキシフルオレセインアでトモ／メチルエステル（ＢＣＥＣＦ）を用いる 方法を採用する二とによって、未感染およびウィルス感染細胞中での化合物の存 在下および非存在下にお１ブる細胞生存度の測定を行ったところ、下記の通りで あった。ＢＣＥＣＦは、非螢光性分子であって、容易に生長力のある細胞に入り 、そこで細胞性エステラーゼによって加水分解されて螢光性分子となる。総細胞 ＤＮＡ含量は染ｆ４２−ジアミジノーフェニルインドール（ＤＡＰＩ）で測定し たか、この染ｔ４は月ｃＣａｆｆｒｅｙ、Ｔ、Ａ　ら、Ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ　Ｃｅ １ｆ、　Ｄｅｖｅｌｏｐ、　Ｂｉｏｌ、、　２４：　２４７−２５２．　ｔｑｇ ｇに記載の処理法にしたがってクロマチンのＡ　−Ｔ特異的部位に挿入されると 螢光を発する。これらの染料は、粒子濃度螢光イムノアッセイ法（ＰＣＦＩＡ） 、具体的にはＢａｘｔｅｒ）１ｅａｌｔｈｃａｒｅ　Ｃｏｐｐｏｒａｔｉｏｎ　 （７ンデライン、イリノイ州）から発売されている５ｃｒｅｅｎ　Ｍａｃ旧ｎｅ Ｃ商品名）と組合せて用いられる。この５ｃｒｅｅｎ　Ｍａｃｈｉｎｅは、試薬 および／または緩衝液をフィルターを底部に備えた９６大プレートに添加した後 、流体を吸引してセルロースアセテートフィルター上に螢光染色した細胞をｔ； 縮することかできる半自動螢光プレートリーダーである。螢光はニビ螢先（ｅｐ ｉｆｌｕｏｒｃｓｃｃｎｃｃ）によッて検出する。

前記の分析と同時に、ｐ２４抗原生産、逆転写酵素および感染性ビリτンの合成 の確認分析を行った。我々の処理？！：および結果についてのこれらおよび他の 詳細について、下記に更に、詳細に説明する。

Ｈｎ　ＩＩ？およびウィルス　抗ウイルス性分ｔｌｉに用いたしトリンバ球漂的 細胞ライン、ＣＥ　Ｍ　−Ｓ　ＳおよびＮＩＴ　−２を、フェノールレッドなし の、５％ウシ胎児血清（Ｆ　Ｂ　５）（Ｇｉｂｃｏ）　、２ｍＭ　Ｌ−グルタミ ン及び５０　ｕ　ｇ　／　ｍ　ｌのゲンタマイシ：／　（Ｇｊｂｃｏ）を補足し たＲＰＭ１１６４０培地（Ｃｉｂｃｏ、　Ｇｒａｎｄ　ｌ５ｌａｎｄ、ニューヨ ーク）（完全培地）中に保持した。対数増殖しているＣＥＭ−５ＳおよびＭＴ　 −２細胞を、完全培地中にベレット状にし、完全培地に２．０ＸＩＯ５個／ｌｌ １ｌの濃度に再懸濁した。ＨＩＶ−１の検討には、）ＩＩＶのＨａｉｔｉａｎ変 種ＨＴＬＶ−Ｉ　１　また。ＨＩＶ−２の検討には、ＮＩＨ−ＤＺ株（２，８Ｘ ）　１０５ンンチウム形成単位／ａ１）を用いた。凍結したウィルス保存溶液を 使用直前に融解し、完全培地に再懸濁１ｂｓｔｉｔｕｔｅ　Ｓ　Ｄｉｖｉｓｉｏ ｎ　ｏ（’　Ｃａｎｃｅｒ　Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ。

ＤｅｖｅｌｏｐＨ１ｅｎｔａｌ　Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ　ＰｒｏｇｒａＩｌ ｌ。

ｔｈｅ　Ｄｒｕｇ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ　ａｎｄ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　Ｂｒａ ｎｃｈより入手した。ビスカルボキシエチル−３（６）−カルボキシ−フルオレ セインアセトキシメチルエステル（ＢＣＥＣＦ）は、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｐｒ ｏｂｅ　Ｉｎｃ、　（ＣＢｅｎｅ、オレゴン州）から購入し、使用直前にＤ〜Ｉ ＳＯ中に溶解した（ＩＢ／　１）。

２μｇ／ａｌの使用溶液を、Ｄυｌ　ｂｃｃｃｏ　’　ｓリン酸緩衝食塩液（Ｐ 　Ｂ　Ｓ　）　（Ｇｉｂｃｏ）で調製した。４′、６−ジアミノノー２フエール インドール（ＤＡＰりはＳｉｇａ＋ａ　Ｃｈｅａ＋１ｃａｌ　Ｃｏ、　（セント ・ルイス、ミズーリー州）から購入した。

ＤＡＰ　Ｉの保存溶液は、蒸溜水中で超音波処理により１００μｇ／ｍｌて調製 し、０．４５μｍフィルターを通過させ、−２０℃で保存した。ＤＡＰ　Ｉの使 用溶液は、０、５９６ｎｏｎｉｄｅｎｔＰ−４０（ＮＰ−４０）　（Ｓｉｇｍａ ）　を含むＰＢＳ中で１０μｇ／ｍｌに調製した。ＸＴＴは、無血／ｉｌｆＲＰ Ｍ１１６４０中でｌｏｎｇ／ｍｌの濃度に調製した。フエナノンメトスルフエ− ト（ＰＭＳ）　（Ｓｉｇｌｌａ）は、ＰＢＳ中で０．１５３ｍｇ／ＩＩｌに調製 し、−２０℃で保存した。

使用直前に、ＸＴＴを３７℃で溶解し、Ｐ　Ｍ　Ｓを加えて、２０μＮ１のｉ終 濃度とした。

具体的な抗−ＨＩＶ評価のためのプロトコール　抗−ＨＩＶ評価のための純粋な 化合物の適量を１００％ジメチルスルホキシド（Ｄ　Ｍ　Ｓ　Ｏ）に溶解した後 、完全培地で希釈して、所望な初期濃度（および最終Ｄ　Ｍ　Ｓ　Ｏ含量が１％ を超過しないように）とした。次いで、ミンニルアミンＡ、ＢおよびＣの総ての 連続希釈、試薬添加及びプレート間の移動を、自動Ｂｉｏａ＋ｃｋ　１０υＯＷ ｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ（Ｂｅｅにｌｌ１ａｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ　、　Ｐ ａ１ｏ　Ａｌｔｏ　、カリフォルニア州）を用いて行った。それぞれの化合物を 最初に完全培地でｆ？ｉＲし、９６ウエルのマイクロタイタープレート（希釈プ レート）のＩｌｉ〜ｌミルカラムた。Ｂｉｏｍｅｋを用いてそれぞれ−ＯＷ剤を ８連続希釈し、それぞれの希釈物１００μｍずつを試験プレートに移した。未感 染ＣＥＭ−ＳＳまたはＭＴ−２細胞を、完全培地５０μｌ中１×１０４個の密度 で培養した。次いで、希釈したＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２ウイルスを、５０μ ｌの容量の適当なウェルに加え、０．６の感染の多重度とした。適当な甥胞、ウ ィルスおよび薬剤コントロールを用いて、それぞれのウェルにおける最終容積を ２００μｍとなるようにした。未感染の未処理の細胞コントロールおよび未処理 のウィルスに感染した細胞コントロールを、９６ウエルの試験プレートの両側に 置き、薬剤ブランクをプレートの上部および下部に置いた。試験化合物を受けた 細胞は、４個のウィルスに感染したウェルおよび２個の未感染ウニ／しとされた 。プレートを、３７℃で５％ＣＯ２を含む雰囲気中で６日間インキュベーション 行った。次いて、無細胞上澄液の一部をＢｉｏｉｅｋを用いてそれぞれのウェル から取り出し、逆転写酵素活性、Ｉ）２４抗原生産および感染性ピリオンの合成 について分析した（下記も参照されたい）。０．００２％（重量／容りフルオリ コン対照粒子（５９０／　６２０　ｎ　ｍ）　（Ｂａｘｔｅｒ　）Ｉｅａｌｔｈ ｃａｒｅ　Ｃｏｒｐ、）２５μＩを、螢光分析の内部標準として用いる試験プレ ートのそれぞれのウェルに加えた。Ｂｉｏｓｅにを用いて試験プレートのそれぞ れのウェルの内容物を均一に分散させ、２個の新しいマイクロタイタープレート のそれぞれに５０μＩすっ移した。次に、これらのプレートを用いて、ＢＣＥＣ Ｆを用いる細胞生長力またはＤＡＰＩを用いる総ＤＮＡ含量をｎ１足した。

塩ＸＴＴの可溶性の着色したホルマザンへの代謝による還元を、元の試験プレー トそれぞれのウェルにＸＴＴ／ＰＭＳ溶液５０μｌを加え、３７℃で４時間イン キュベーションすることによって行った。インキュベーションの後、プレートを 接着性プレートシーラー（Ｄｙ１ａｔｅｃｈ、アレキサンドリア、バージニア州 ）で被覆し、振ミし、Ｖ−ｍａｘ光度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｅｖｉｃｅｓ 、　ＩｎｃＳＭｅｎｌｎ。

Ｐａｒｋ　、カリフォルニア州）を用いて４５０ｎｍの試験波長で光学濃度を測 定した。

ＢＣＥＣＦ分析　細胞生長力はまたＢＣＥＣＦを用いてｎ１足した。新たに調製 したＢＣＥＣＦ溶液（２５μｌ）をそれぞれのマイクロタイタープレートのそれ ぞれのウェルに加え、プレートを３７℃で３０分間インキュベーションした。次 いで、パラホルムアルデヒドの２％溶液２５μｌそれぞれのウェルに加え、更に ３０分間インキュベーションして、ウィルスを不活性化した。それぞれのウェル の内容物を混合した後、７５μｌずっをフィルターを底部に備えた９６ウエルの プレート（ＢａｘｔｅｒＩｌｃａｌｔｈｃａｒｃ　Ｃｏｒｐ、）　Ｉこｔ多した 。プレートを下二己のプロトコールを行うようにプログラムを組ンだ５ｃｒｅｅ ｎ　Ｍａｃｈｉｎｅに入れた　（ｌｌｅａ支持マトリック又としてＰＢＳ中に３ ．２ｏｍポリスチレンビーズ（Ｂａｘｔｅｒ　ＨｅａｌｔｈｃａｒｑＣｏｒｐ− ）　０．　２５％帽１／容量）懸濁液２０μｍを加え、（２）１５ｍｍＨｇの真 空圧を用いて１，５分間液相を濾去し、（３）それぞれのウェル中の細胞−ビー ズケーキを２０ｍｍＨｇの真空圧を用いて１分間洗浄し、（４）それぞれのウェ ルの螢光を読む（シグナルチャンネル＝４８５　ｎ　ｍで励起、５３５ｎｍて発 光、および対照チャンネル−５４９ｎｍで励起、６２０ｎｍで発光）。

ＤＡＰ　＋分析　それぞれのウェルの総ＤＮＡ含量を、ＭｃＣａｒｒｒｅｙによ って記載された方法［ＭｃＣａｆｆｒｅｙ、　Ｔ、Ａ。

ら、　Ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ　Ｃｅ１１．　Ｄｅｖｅｌｏｐ、Ｂｉｏｌ、、２４：　 ２４７−２５２゜１９８８］の下記のような変法によって測定した。それぞれの ウェルの内容物を、２％バラホルムアルデヒド溶液２５μｍを加え、プレートを ３７℃で３０分間インキュベーションすることによって固定した。ＤＡＰＩ／Ｎ Ｐ−４０溶液２５μｌをそれぞれのウェルに加え、２時間インキュベーションし た。それぞれのウェルの内容物を混合し、７５μｌずつをフィルターを底部に礒 えた９６ウニルのプレート（１３ａｘｔｅｒ　ｌ１ｅａｌｔｈｃａｒｅ　Ｃｏｒ ｐ、）に移した。

ＤＡＰ　Ｉプレートを５ｃｒｅｅｎ　Ｍａｃｈｉｎｅに入れ、４００ｎｍの励起 および４５０ｎｍの発光のシグナルチャンネルの組を用いて前記のＢＣＥＣＦプ レートと同しプロトコールによって処理した。

ｐ２４抗原捕捉分ｔＥ　（Ｃｏｕｌｔｅｒ　ｌｉｍｕｎｏｌｏｇｙ　、旧ａｌｅ ａｈ　。

フロリダ州）を用いて、測定した。試験プレートからの上ａ液を１０％トライト ンＸ−１００で１・１００に希釈し、用いるまで一２０℃で凍結保存した。トラ イトンＸで処理したＫ　ｆ４２００μｌずつをネズミ単りローン性抗−）（ＩＶ −１１）２４抗原を予めコーティングしたマイクロタイターウェル１こ力０えた 。プレートをシールし、３７℃で１時間インキュベーションした。プレートを、 自動Ｄｅｎｌｅｙ　Ｗｅｌｌｗａｓｈ　４　（Ｃｏｕｌｔｅｒ　ｌａｖｕｎｏｌ ｏｇｙ）プレート洗浄装置を用いて洗浄した。プレートを洗浄して、吸取り紙で 乾爆した後、ビオチン化したヒト単りローン性抗−ＨＩＶ−１ｐ２４　２００μ Ｉ８適当なウェルに加え、プレートを３７℃で１時間再インキュベーションした 。

更に洗浄した後、ストレプトアビジン−西洋ワサビベルオキシダーゼ溶液２００ μｍを加え、プレートを３７℃で３０分間インキユヘーシランした。テトラメチ ルベンゼン溶液をそれぞれのウェルに加え、室温で３０分間インキ二へ一／ヨン した。インキュベーションの後、酸性停止試薬をそれぞれのウェルに加え、Ｖｍ ａｘ光度’；ｔ　（Ｍｏｌｃｃｕｌａｒ　Ｄｅｖｊｃｅｓ）を用いて３０分以内 に吸光文を４５ｆ）ｒ＋ｍで；んた。ｌ）　２４の７ｏ度を、既知のｐ　２４の １’１１２　度の１４曲課と比較することによって測定した。

／ンンテウム分＋ｒ７　＼ａｒａ！こよって報告されたシンンチウムｎｔｌＴ　 ：％Ｂ１．−＋　ら、〜ｉｄｓ　Ｒｅｓ、　Ｈｕｍ、　Ｒｅｔｒｏｖｉｒυｓｅ ｓ　。

３：　２８３−３０２．１９８７　］を用いて、感染性ウィルスの定量を行った 。試験プレートからの上澄液を、多段希釈のＣＥ’ｖ１−５ＳＳ細胞層で検討し て、２〜４日で計数可能なンンチウムを得た（５０〜２００／ウエル）。

逆転写酵素分析　上澄液を３０μｌずつ、５０ｍＭトリスｐＨ７，８，０，１５ ｍｇ／ｍｌジチオトレイトール（ＤＴＴ）および０．１％トライトンＸ−１００ を含むウィルス破砕援衝液３０μｍに加えた。溶菌したウィルス１０μｍの試料 を、ＩＭ　トリス、ｐＨ７，８’２μｍ、３Ｍ　ＭＣＩＩμ＋、３ｍｇ／ｍＩＤ Ｔ丁５μｍ、０．１Ｍ酢酸マグ早シウム５．ｃｚｌ、Ｐｏ１ｙ（＋−Ａ）−ｐ　 （ｄＴ）　１ｏ（２単位／　ｍ　１　）　（Ｐｈａｒｖａｃｊａ　。

Ｐ：５ｃａｔａｖａｙ、ニ二−ジャージー州）１０μｍ、蒸溜水６゜５μｍ、１ ０％トライトンＸ−１００ ０，５μ】および［３Ｈ］　ｄＴＴＰ　（１６，５６Ｃｉ／ミリモル）　（Ａｍ ｅｒｓｈａｎ　Ｃｏｒｐ、　、　ＡｒｌｉＡｒｌｌｎ　Ｈｅｉｇｈｔｓ　、イリ ノイ州）１０μ１８含む混合物３０μｌに加えた。試料を３７℃で３０分間イン キュベーションし、ＤＥ８１イオン交換紙上に集め、１５分間吸収させた。

試事４バッドを最初に５９ｏ　Ｎ　ａ　、ＨＰ　Ｏ４で６回洗浄した後、蒸溜水 で２回６ｔｌＴＩシた。バットを乾燥し、液体レンチレー／ヨンカウンターで月 数しｒ二。試料は３回計数し分析終了へと司１″泡数の直線性　”ｊｌ数増殖し ているＣ　Ｅ　ｋｌ−５Ｓ細胞を集め、洗浄し、様々な細胞濃度で９６ウエルの マイクロタイターウェル中で培養した。細胞を接種した後、細胞を前記のプロト コールにしたがってＸＴＴ、ＢＣＥＣＦまたはＤＡＰ　Ｉで処理した。ＢＣＥＣ ＦおよびＤＡＰ　Ｉを用いる螢光分析では、広範囲の細胞濃度に亙って優れた直 線性が認められた。いずれの分析法でも、再現性の高い結果が、１０００個／分 析を下回る細胞数で得られた。比色ＸＴＴ分析法でも良好な直線性が見られたが 、最大検出限界は５，０００〜１０，０００個／分析であった。

ミシエルアミンの抗ウィルス活性　第２図および第３図に、それぞれｉｌ離塩基 またはＨＢｒ塩としてのミシエルアミンＡの抗ウィルス活性を示す。第４図およ び第５図に、それぞれ遊離塩基またはＨＢｒ塩としてのミシエルアミンＢの抗ウ ィルス活性を示す。これらの化合物は極めて類似した活性曲線を示した。

第２Ａ図および第２Ｃ図、第３Ａ図および第３Ｃ図、第４Ａ図および第４Ｃ図、 第５Ａ図および第５ＣＣは、生長力のあるヒトＣＥＭ−５Ｓリンパ芽球様細胞の 標的細胞であって、未感染（０）またはＨＩＶ−１ウイルスに感染したもの（・ ）で、Ｆｉ離塩基またはＨＢｒ塩の形態のミシエルアミンの所定範囲の濃度を導 入した後６日間培養ウェル中に止どまっていたものの相対数を表わしている。結 果は、適当な未感染の、薬剤処理されていないコントロールの百分率として表わ されている。約２０〜２００μＭの間のミシエルアミン濃度では、ＢＣＥＣＦお よびＸＴＴ生長力分析は、標的細胞がウィルスの殺生効果からほぼ完全に保護さ れることを示している。約１００μＭを下回る薬剤濃度では標的細胞に対するミ シエルアミンの直接的細胞毒性はほとんどまたは全くない。

ＤＮＡ分析の結果（第２Ｂ、３Ｂ、４Ｂおよび５Ｂ図）は、生長力分析の結果と 一致しており、すなわちミシエルアミンの抗ウィルス活性を更に示しており、Ｄ ＮＡＩＩ定は、予想した通り、含まれる細胞数と対応していた。

第２Ｄ、３Ｄ、４Ｄおよび５Ｄ図では、Ｉ（ＩＶ−１に感染し、遊離塩基または ＨＢｒ塩の形態のミシェルアミンを各種濃度導入してから６日後に分析したヒト ＣＥ　Ｍ　−Ｓ　Ｓリンパ芽球様細胞の標的細胞の培養におけるウィルス複製の 指標を表わす。結果は、適当なＨＩＶに感染し、薬剤処理されていないコントロ ールの百分率として表わされている。本質的に完全な細胞保護を与える同し範囲 内のミシエルアミン濃度では（上記参照）、ウィルス複製の指標である１）２４ ウイルスコアー抗原の産生（ム）およびウィルス性逆転写酵素活性（■）が劇的 にほぼ完全に抑制され、感染性ウィルスの裂失を示すＳＦＵも同様に完全に抑制 された。

イン・ビトロでの前記の様な細胞保護効果は、ヒトでの抗ウィルス活性を予測さ せるものとして知られている。

例えば、ＡＺＴも同様に、まずは培養されたヒトリンパ芽球様細胞の細胞ライン でのＡＩＤＳウィルスに対するイン・ビトロでの細胞保護効果に基づき、ヒト患 者での評価を行うために選択されたものである［Ｙａｒｃｈｏａｎ、　Ｒ。

ら、Ｌａｎｃｅｔ、　ｌ：　５７５−５８０．１９Ｈ］　。

第６母は、生長力のあるヒトリンパ芽球様細胞ＭＴ−２細胞であって、未感染（ ０）またはＨＩ￥−２ウイルスに感染したもの（・）で、Ｊ離塩基の形ｇ（第６ Ａ図）またはＨＢｒ塩の形！３（第６Ｂ図）のミシエルアミンＡを所定範囲の濃 度導入してから６日間培養ウェルに止どまっていたもののｔ相対数を表わしてい る。第７図は、生長力のあるヒトリンパ芽球様細胞〜ＩＴ−２細胞であって、未 感染（０）またはＨＩＶ−２ウイルスに感染したもの（・）で、遊離塩基の形態 （第６Ａ図）またはＨＢｒ塩の形態（第６Ｂ図）のミシニルアミンＢを所定範囲 の濃度導入してから６日間培養ウェルに止どまっていたものの相対数を表わして いる。結果は、第６図、第７図いずれにおいても、適当なコントロールの百分率 として衷されている。ミシニルアミンＡおよびＢは、遊離塩基またはＨＢｒ塩と しても、 ＨＩ　ｖ　−２にン、１して抗ウイルス効果（第６および７図）あった。典型的 に１６３０〜１００　ｑ　ＭのミシニルアミンＢの濃度では、ＭＴ−２＠胞につ いてのＨＩＶ−２の殺生効果に対してほぼ完全な保護が得られた。これとは対照 的に、２５０μＮ１程度のミシエルアミンＡの濃度では、ＨＩＶ−２に対してＭ Ｔ−２細胞は部分的にしか（２０〜４０％）保護されなかった。

前記と同様に、ミシエルアミンは少なくとも２ｉ類のＨＩＶレトロウィルスを阻 害する。当業者であれば理解可能なように、ミシエルアミンおよびその組成物は も同様に他のレトロウィルスおよび他の病原性ウィルスを阻害するであろう。

実施例６　薬学組成物 本発明の化合物は、適当な薬学上許容可能な担体または希釈剤と組合せて薬学組 成物とすることができ、それぞれの投与経路に対して通゛常の方法で、錠剤、カ プセル、粉末、顆粒、軟膏、溶液、座薬、注射液、吸入剤およびエアゾールのよ うな固形、半固形、液状またはガス状の形態の製剤に配合することができる。

これらの化合物はそれぞれ単独で使用することもまたは互いに組合せて使用する こともでき、または他の抗ウィルス剤と組合せて用いることもできる。ＨＩＶ− １および／またはＨＩＶ−２に感染した患者を治療しようとするときには、本発 明の少なくとも１種類の化合物をＡＺＴと同時投与することができる。

藁半投与形思ては、本発明の化合物は薬学上許容可能な塩の形態で用いる二とか でき、単独でまたは適当な集合体で用いることができ、他の薬学上活性な化合物 と組合せて用いることもできる。

経口用製剤の場合には、本発明の化合物は単独で用いることもまたは錠剤、粉末 、顆粒またはカプセルを作成するための適当な添加剤、例えば、ラクトース、マ ンニトール、コーンスターチまたはジャガイモ澱粉と；結晶性セルロース、セル ロース誘導体、アラビアゴム、コーンスターチまたはゼラチンのような結合剤と 、コーンスターチ、ジャガイモ澱粉またはカルボキシメチルセルロースナトリウ ムのような崩壊剤と：タルクまたはステアリン酸マグネシウムと；および所望な らば希釈剤、緩衝剤、加湿剤、防腐剤およびフレーバ剤と組合せて用いることが できる。

本発明の化合物は、水性または非水性溶媒、例えば、植物性または他の同様な油 状生成物、合成の脂肪族酸グリセリド、高級脂肪族酸のエステルまたはプロピレ ングリコール中にそれらを、および所望ならば従来の添加剤、例えば、可溶化剤 、等張剤、懸濁剤、乳化剤、安定剤および防腐剤と共に溶解、懸濁または乳化す ることによって注削用製剤に配合する二とかできる。

本発明の化合物は、吸入によって服用されるエアゾール配合物に用いることがで きる。本発明の化合物は、シールクロロシールフルオロメタン、プロパン、窒素 などのような加圧された許容可能なプロペラントに配合することができる。

更に、本発明の化合物は、乳化基剤または水溶性基剤のような各種の基剤と混合 することによって座薬にすることができる。本発明の化合物は、座薬により直腸 から投与することができる。座薬は、カカオ脂、カーボワックスおよびポリエチ レングリコールのような体温で融解し、しかも室温で固化するビヒクルを含むこ とができる。

シロップ、エリクンルおよび懸濁液のような経口または直腸投与用の単位投与形 態であって、小匙一杯または大匙一杯のそれぞれの投与単位の錠剤または座薬が 本発明の化合物を含む組成物の所定量を含むものを提供することができ、同様に 注射または静脈内投与の単位投与形態は、蒸溜水、規定食塩水または他の薬学上 許容可能な担体の溶液としてのミシエルアミン組成物を含むことができる。

本明細書に用いられる「単位投与形態」という用語は、ヒトおよび動物に対する 単一の投与量として好適な物理的に別個な単位であって、それぞれの単位が薬学 上許容可能な希釈剤、担体またはビヒクルと共同して所望な効果を生じるのに十 分な二でＸｔ算された本発明の化合物の所定量を含むものを表わす。本発明の新 規な単位投与形態についての明細は、用いられる特定の化合物および達成される 効果、および宿主中でのそれぞれの化合物に関連した薬物動態によって変化する 。

薬学上許容可能な賦形剤、例えばビヒクル、アジュバント、担体または希釈剤は 、容易に入手することができ当業者は、用いられる組成物の精確な配合物に対し て適当な投与法を容易に決定することができる。投与量での任意の必要な調整は 、感染症の性状または重篤度に容易に合わせることができ、したがって熟練した 実施者が！Ａ整することができる。

実施例７　ウィルス性感染症を治療するための本発明のな量を投与することを含 んでなる、ウィルス性感染症の治療法にも関する。抗ウィルス薬として有効な量 は、個々の患者に投与して抗ウィルス薬として有効な血液および／または組織濃 度を達成してウィルスを阻害するのに要する化合物の童として定義される。抗ウ ィルス薬として有効な血中濃度は、例えばスクリーニング分析でウィルスを阻害 するために選択することができる。このような二の一例は２０〜２００μＮ１と なり、例えば第２〜７図をり照されたい。或いは、抗ウィルス夏として有効な血 中濃度は、患者の血液中におけるウィルスのマーカー（例えば、ｐ２４）を阻害 する濃度、または特定のウィルス性感染症に対して患者を無ｆＬ挨性にする濃度 とじて定義することもできる。固定した抗ウィルス薬として有効な血中濃度は、 投与に対する好ましい終点として用いられるので、それぞれの患者に対する薬剤 投与の実際の投与量および計画は、薬物動態における個人間の差、薬剤の配置お よび代謝によって変化する。更に、化合物を予防的に使用するときまたは他の薬 剤と組合せて用いるときには、投与量は変化することがある。

このような投与量は、当業者により甚だしい困難および実験を行うことなしに容 易に決定することができる。

抗ウィルス薬として有効量の一例として、ヒトについての投与量は、約０．０１ ｍｇ／ｋｇ体重〜２００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲とすることができる。

前記の発明を明確にし且つ理解を助けるために詳細に説明してきたが、当業者で あればこの開示を読むことによって本発明の真の範囲から離反することなく形態 および詳細の様々な変更を行うことができることが理解されるであろう。

ミシエルアミン　ＡψＭ〕 ＦＩＧ、　２Ａ ミシエルアミン　ＡψＭ〕 ＦＩＧ、　２Ｂ ミシエルアミン　Ａ　ＣＩＪＭ） ＦＩＧ、　２Ｃ ミシエルアミン　ＡψＭ〕 ＦＩＧ、　２Ｄ ミシエルアミンＡ＊ＨＢｒ（１，ＩＭ〕ＦＩＧ、　３Ａ ミシエルアミンＡ鞭ＨＢｒＣ１，ＩＭ〕ＦＩＧ、　３Ｂ ミシエルアミン　Ａ俸ＨｅｒψＭ〕 ＦＩＧ、　３Ｃ ミシエルアミン　Ａ華ＨＢｒψＭ〕 口ｌた　リｎ ミシエルアミン　ＢψＭ〕 ＦＩＧ、　４Ａ ミシエルアミン　ＢψＭ〕 ミシエルアミン　ＢψＭ〕 ＦＩＧ、　４Ｇ ミシエルアミン　ＢψＭ） ＦＩＧ、　４Ｄ ミシエルアミンＢ肇ＨＢｒ（１，ＩＭ〕ＦＩＧ、　５Ａ ミシエルアミン　Ｂ牽ＨＢｒψＭ〕 ＦＩＧ、　５Ｂ ミシエルアミン　Ｂ廁ＨＢｒψＭ〕 ＦＩＧ、　５Ｇ ミシエルアミン　Ｂ◆ＨｅｒψＭ〕 【＝＝置／’！ｊ：ｎ ミシエルアミン　ＡψＭ） ＦＩＧ、　６Ａ ミシエルアミン　Ａ秦ＨｅｒψＭ〕 ミシエルアミン　ＢψＭ〕 ＦＩＧ、　７Ａ ミシエルアミン　ＢＩＨＢｒψＭ〕 ＦＩＧ、　７Ｂ 手　続　補　正　書 平成　５年　８月　２３日 ＰＣＴ／ＵＳ　９２１０２８０５ ３　補正をする者 事件との間係　特許出原人 アメリカ合衆国 発送日　平成　年　月　日 ６　補正により減少する請求項の数　７７　補正の対象 明細書及び請求の範囲並びに図面 ８　補正の内容 （１）　朔七嗜→請求の範囲を別紙の通り補正する。

（２）　明細書第２頁第４行〜第４頁第４行の［本発明は、実質的に〜で置換す ることができるコ」の記載を次の通り補正する。

「　本発明は、実質的に純粋な形態の、下記の式・ を有する化合物（以下、「ミシエルアミン」とよぶこ七がある）または薬理学上 許容されるその塩、もしくは、第１図に記載したミシエルアミンＡ１ＢまたはＣ の式を有する実質的に純粋な形態の化合物または薬理学上許容されるその塩に関 する。

また、本発明は、下記の式： を有するミシエルアミンの誘導体に関し、さらにとりわけ次の式を有する化合物 またはその薬理学上許容される塩に関する。

［式中、 ＲおよびＲ６は同一であるかまたは異なるものであり、それぞれＨＳＣ−ｃ６ア ルキル、Ｒ■ １１Ｃｏ−またはＲ”Ｓｏ　−（、：こで、Ｒ１１ハｃ同一であるかまたは異な るものであり、それぞれ５０２−（ここで、ＲＩＩは前記に定義した通りである ）であり、 ＲおよびＲ１（ｌは同一であるがまたは異なるものてあり、それぞれＨ１Ｃｉ〜 Ｃ６アルキル、＊　７’、：　ハＲＳ　Ｏ２−テあり、ＲはＣ１〜ｃ６アルキル またはアリール）であり、 ＋４　１５　１６ Ｒ、Ｒ、ＲおよびＲ１７は同一であるがまたは異なるものであり、それぞれ’ｓ 　ＣＨ３またはＣＨ３を表し、 １′、３′、７′、４および７位、１′′、３″、７″、４″′　および７′′ ′　位の環上のＨはハロゲン、ニトロ、アミノ、ヒト０キシル、チオールまたは シアノ基て置換することができるコ」（３）　明細書の、次に掲げる箇所に記載 のｒＡｎｃｉｓｌｒｏｃｌａｄｕｓ　ａｂｂ＋ｅｙｉａｔｕｓＪをｒＡｎｃｉｓ ＋ｒｏｃｌａｄｕｓＪと補正する。

（４）　明細書第１２頁第２２３行の ［抽出物を得たＡｎｃｉｓｌｒｏｃｌａｄｕｓ　ａｂｂｒｅｖｉａｆｕｓ（＾ｉ 〔ＹＳｈａｖ　）は、」を 「抽出物を得たのは、」と補正する。

（５）　明細書第１２頁第２２行の 「人ｎｃｉｓｊｒｏｃｌａｄｕｓ　ａ）＋ｂｒｅｖｉａｆｕｓからのｊを［Ａｎ ｃｉｓｌｒｏｃｌａｄｕｓからの」と補正する。

（６）　図面の第１図を別紙の通り補正する。

請求の範囲 １、　実質的に純粋な形態での、下記式Ｉを有する化合物または薬理学上許容さ れるその塩。

２、　下記式を有する請求の範囲第１項に記載の化合物または薬理学上許容され るその塩。

３、　実質的に純粋な形態での、下記式■を有する化合物または薬理学上許容さ れるその塩。

４、　下記式を有する請求の範囲第３項に記載の化合物または薬理学上許容され るその塩。

特表千６−５０２１８６　（２０） ［式中、 ＲおよびＲ６は同一であるかまたは異なるも同一であるかまたは異なるものであ り、それぞれ５Ｏ２−（ここで、Ｒ１１は前記に定義した通りである）であり、 Ｒ５およびＲ１１１１は同一であるがまたは異なるものであり、それぞれＨＳＣ １〜Ｃ６アルキル、−またはＲＩ３ＳＯ−であり、Ｒ１３ハｃ　−Ｃアルキルま たはアリール）であり、 １４　＋５　１６ Ｒ、Ｒ、ＲおよびＲ１７は同一であるがまたは異なるものであり、それぞれ４ｃ Ｈ３またはＣＨａを表し、 ７・・、４・・・　および７′″　位の環上のＨはハロゲン、ニトロ、アミノ、 ヒドロキシル、チオールまナーｌ＋パノアノ某で置換することができるコ５、　 下記式Ｉ： を有する化合物を、＾ｎｃｉｓｔｒｏｃｌａｄｕｓから単離する方法であって、 （ａ）　乾燥した植物材料を有機溶媒で抽出して粗製抽出物を得る工程と、 （ｂｌ　前記の粗製抽出物を酸−塩基に分配して粗製有機塩基画分を得る工程と 、 （ｃ）　前記の粗製有機塩基画分を遠心分配クロマトグラフィに付す工程と、 （ｄ）　アミノ結合相ＨＰＬＣカラムで前記のミシエルアミンを単離する工程と を含んでなる、方法。

６、　請求の範囲第５項に記載の方法であって、化合物が下記の式を有するもの またはその薬理学上許容される塩である、方法。

Ｍｅ　Ｏ）（Ｍｅ　ＯＨ 三　１ ８□・　−□・パ ℃罠双 “ダ紀ミ１□ ＭｅＯＨＯ ）（０＋Ｍｅ　Ｈ（）　ｌ Ｓ？ｃ ｒ亡ニ ア、ミシエルアミンＡまたはＢを、ミシェルアミンＡ、ＢまたはＣの混合物に相 互転換する方法であって、 （＝１　ミシエルアミンＡまたはＢのいずれかを有機溶媒に溶解し、 （ｂ）　前記のミシエルアミンＡまたはＢを塩基と反応させること を含んでなる、方法。

８、　前記の塩基が水酸化ナトリウムである、請求の範囲第７項に記載の方法。

９、　請求の範囲第１項に記載の少なくとも１種類の化合物の抗ウィルス薬とし て有効な量と、薬理学上許容可能な担体とを含んで成る、ウィルス感染患者の治 療のための医薬組成物。

１０、請求の範囲第３項に記載の少なくとも１種類の化合物の抗ウィルス薬とし て有効な量と、薬理学上許容可能な担体とを含んで成る、ウィルス感染患者の治 療のための医薬組成物。

１１、請求の範囲第１項または第４項に記載の少なくとも１種類の化合物の抗ウ ィルス薬としミシエルアミンＡ ミシエルアミン日　ミシエルアミンＣ ＦＩＧ、　１ 国際調査報告 フロントページの続き （７２）発明者　カーデリナ、ジョン　エイチ、ザ、七カント アメリカ合衆国メリーランド州、ウォーカースピル、ハイランダー、ブールバー ド、（７２）発明者　マンフレディー、カーク　ピー。

アメリカ合衆国メリーランド州、フレデリック、コランバイン、ロード、１０１ １、アパートメント、ナンバー１ビー （７２）発明者　プラント、ジョン　ダブリュ。

ニューシーラント国りライストチャーチ、５、バニスター、ブレイス、３０ （７２）発明者　パネル、ルイス　ケー。

アメリカ合衆国メリーランド州、シルバー、スプリング、カタリナ、テラス、 （７２）発明者　マクマホン、ジェームズ　ビー。

アメリカ合衆国メリーランド州、フレデリック、エルローズ、コート、５２９ （７２）発明者　グラコウスキー、ロバート　ディー。

アメリカ合衆国メリーランド州、ジャーマンタウン、スコツッパリー、テラス、 （７２）発明者　クラッグ、ゴートン　エム６アメリ力合衆国メリーランド州、 ベセスダ、エルスミア−、アベニュ、５１１７

Claims (20)

【特許請求の範囲】
1. １．実質的に純粋な形態での、式： ▲数式、化学式、表等があります▼ ▲数式、化学式、表等があります▼または▲数式、化学式、表等があります▼を 有する化合物、または薬学上許容されるその塩。
2. ２．下記式を有する化合物、または薬理上許容されるそれらの塩。 ▲数式、化学式、表等があります▼▲数式、化学式、表等があります▼ｏｒ▲数 式、化学式、表等があります▼［式中、Ｒ１およびＲ６は同一であるかまたは異 なるものであり、それぞれＣ１〜Ｃ６アルキル、Ｒ１１ＣＯ−またはＲ１１ＳＯ ２−（但し、Ｒ１１はＣ１〜Ｃ６アルキルまたはアリール）であり、 Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ７、Ｒ８およびＲ９は、同一であるかまたは異なるもので あり、それぞれＣ１〜Ｃ６アルキル、Ｒ１１ＣＯ−またはＲ１１ＳＯ２−（但し 、Ｒ１１は前記に定義した通りである）であり、 Ｒ５およびＲ１０はＣ２〜Ｃ６アルキル、▲数式、化学式、表等があります▼ま たは▲数式、化学式、表等があります▼（但し、Ｒ１２はＣ１〜Ｃ６アルキル、 Ｒ１３ＣＯ−またはＲ１３ＳＯ２−であり、Ｒ１３はＣ１〜Ｃ６アルキルまたは アリール）であり、 １′、３′、７′、４および７位の環上のＨはハロゲン、ニトロ、アミノ、ヒド ロキシル、チオールまたはシアノ基で置換することができる］
3. ３．下記式： ▲数式、化学式、表等があります▼，▲数式、化学式、表等があります▼または ▲数式、化学式、表等があります▼を有する化合物をＡｎｃｌｓｔｒｏｃｌａｄ ｕｓ　ａｂｂｒｅｖｉａｔｕｓから単離する方法であって、 （ａ）乾燥した植物材料を有機溶媒で抽出して粗製抽出物を得る工程と、 （ｂ）前記の粗製抽出物を酸−塩基に分配して粗製有機塩基画分を得る工程と、 （ｃ）前記の粗製有機塩基画分を遠心分配クロマトグラフィに付す工程と、 （ｄ）アミノ結合相ＨＰＬＣカラムで前記のミシェルアミンを単離する工程とを 含んで成る、方法。
4. ４．ミシェルアミンＡまたはＢをミシェルアミンＡ、ＢまたはＣの混合物に相互 転換する方法であって、（ａ）ミシェルアミンＡまたはＢのいずれかを有機溶媒 に溶解し、 （ｂ）前記のミシェルアミンＡまたはＢを塩基と反応させること を含んでなる、方法。
5. ５．前記の塩基が水酸化ナトリウムである、請求の範囲第４項に記載の方法。
6. ６．前記の有機溶媒がメタノールである、請求の範囲第４項に記載の方法。
7. ７．請求の範囲第１項に記載の少なくとも１種類の化合物の抗ウイルス薬として 有効な量と、薬学上許容可能な担体とを含んで成る、抗ウイルス性組成物。
8. ８．請求の範囲第２項に記載の少なくとも１種類の化合物の抗ウイルス薬として 有効な量と、薬学上許容可能な担体とを含んで成る、抗ウイルス性組成物。
9. ９．ＡＺＴまたは他の既知の抗ウイルス薬の抗ウイルス薬としての有効量を更に 含んで成る、請求の範囲第７項に記載の組成物。
10. １０．ＡＺＴまたは他の既知の抗ウイルス薬の抗ウイルス薬としての有効量を更 に含んで成る、請求の範囲第８項に記載の組成物。
11. １１．化合物の抗ウイルス薬としての有効量を投与することをを含んでなる、ウ イルス感染症の治療を行うための請求の範囲第１項に記載の化合物の使用。
12. １２．ＡＺＴの抗ウイルス薬としての有効量を投与することを更に含む、請求の 範囲第１１項に記載の方法。
13. １３．前記のウイルスがレトロウイルスである、請求の範囲第１１項に記載の方 法。
14. １４．前記のレトロウイルスがヒト免疫不全症ウイルスである、請求の範囲第１ ３項に記載の方法。
15. １５．前記のヒト免疫不全症ウイルスが、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２から成る 群から選択される、請求の範囲第１４項に記載の方法。
16. １６．化合物の抗ウイルス薬としての有効量を治療を必要とする患者に投与する ことを含んでなる、ウイルス感染症の治療を行うための請求の範囲第２項に記載 の化合物の使用。
17. １７．ＡＺＴの抗ウイルス薬としての有効量を同時に投与する、請求の範囲第１ ６項に記載の使用。
18. １８．前記のウイルスがレトロウイルスである、請求の範囲第１６項に記載の使 用。
19. １９．前記のレトロウイルスがヒト免疫不全症ウイルスである、請求の範囲第１ ８項に記載の使用。
20. ２０．前記のヒト免疫不全症ウイルスが、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２から成る 群から選択される、請求の範囲第１９項に記載の使用。