JPH06501702A - 腫瘍壊死因子のリポソーム処方物の製造及び特性化 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 腫瘍壊死因子のリポソーム処方物の製造及び特性化本発明は、腫瘍壊死因子（Ｔ ＮＦ）の化学的に修正された形態及び腫瘍の成長の阻害におけるその用途に関す る。本発明はＴＮＦの新規形態を与えるので、本発明はまた、上記の修正された ＴＮＦ形態物を製造する方法にも関する。ＴＮＦは抗腫瘍細胞活性を示す能力を 有しているので、本発明はまた、腫瘍の成長を阻害し、ヒトのＴＮＦ反応性のガ ンを治療する方法を提供する。

腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）は、広範囲の生物学的メカニズム、免疫病理学、免疫調 整におけるその役割、及び潜在的抗新生物形成剤としての役割が証明されたので 、近年の興味の焦点となっている２０゜ここ数年において、そのｃＤＮＡのクロ ーニングの後に２１−１４　、Ｘ−線結晶学及び変化した主要な配列による変異 体の開発及び特性化を含む多用な研究が開始されている！＠−１゜ＴＮＦ分子の 特定の分子修飾を含む研究は、ＴＮＦ中の特定の種類のアミノ酸側鎖の重要な機 能的役割に関する従来の証拠が乏しいにも関わらず、進められている。

それにもかかわらず、正に荷電されたアルギニル２′及びリシル２ｓ残基は、活 性及び／または３次元構造に重要な影響を与えることが示されまたは推量されて いる。例えば、ｒＨｕＴＮＦのＮ末端領域における保存または非保存の置換基と してのアルギニル残基の導入は、インビトロで腫瘍細胞毒性に好ましい影響を与 え、動物モデル中の毒性を減じることが示されている！＄−！＊。さらに、リシ ル残基は、ｒＨｕＴＮＦ三景体中のその他のアミノ酸側鎖との分子内及び分子間 相互作用に関与していることが提案されている２５゜ ｒ　Ｈｕ　Ｔ　Ｎ　Ｆは、１７ｋＤのサブユニットのホモトリマーてあり、その 各々がＮ末端バリン及び６のリシル残基を含む：これらのリシル残基のうち２つ がサブユニ・ノド内またはサブユニット間の相互作用に関わることが知られてい る２５゜ＴＮＦは、インビトロでいくつかの腫瘍細胞系に対して細胞毒性であり 、インビボで特定の腫瘍の壊死を生じさせるために有効であると特徴付けられて いる１２３２゜この現象は、前世紀の終わりに、医師がガン患者の腫瘍が自発的 に少し緩解していることに気付いた時に、最初に文献に記載された。

しかしながら、ＴＮＦは敗血症ショックの開始に関わる重大な因子であることも 示されている＋２゜さらに、ＴＮＦは、カヘクチン、即ち、カヘキシー即ち慢性 病に関連する身体の憔悴状態に関連する血清由来因子と同じである１３３３゜し かしながら、このＴＮＦの腫瘍細胞毒活性は、研究音速に腫瘍細胞溶解活性を最 大に保有しながら用量−限定副作用を減少させたＴＮＦ調製物を開発させ続けて いる。

例えば、ＴＮＦは、世界中の機関でフェーズＩ／フェーズＩＩの臨床試験におけ る初期評価の対照となっている３４−３７゜しかしながら、それ以上の開発の主 な障害は、血管内皮に与える直接の影響によるものと考えられる上記の用量−限 定低血圧にある３１−４１゜このサイトカインを腫瘍の微小環境中により良く局 在化させ、通常の組織への全身的接近を減少させるための戦略は、インビボの有 用な薬学的製剤の潜在的使用に大きな進歩を与えるであろう。

リポソームは、非毒性薬物担体としての初期の臨床評価を受けている。これらは 、疎水性薬物のための担体として特に適していると考えられる。同時に、リポソ ームは、薬物を、肺及び肝臓のような網内皮糸細胞に富む器官へ直接的に、及び ＲＥＳ媒介の往来を介して腫瘍床へ間接的に、目標とさせることができる。後者 は、腫瘍内投与が最も効果的な経路であることを示唆する報告もあるように、Ｔ ＮＦの使用における特に有効な戦略であり得る。

しかしながら、天然ＴＮＦは、従来の研究１・６′において報告されているよう に、リポソームに対して低い被包化及び会合効率を示す。例えば、本発明者らの 研究室ては、ＴＮＦの被包化効率は、天然ＴＮＦ及びアシル化ＴＮＦては低かっ た。特に、天然ＴＮＦは、ＰＧの予備生成されたＭＬＶ／コレステロールにわず か３．９％の効率で、またホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルグリ セロール（ＰＧ）　、ホスファチジルセリン（ＰＳ）及びコレステロール（Ｃｈ ｏｌ）の混合物のＭＬとわずか２．０〜１１．４％の効率でリポソームにと結合 した。

この低い親和性は、主にＴＮＦの比較的低い疎水性によるものであると理論付け られる。

リボツームー会合されたＴＮＦのより効率の高い方法は、ガン及びその他の症状 の臨床管理における治療手段としてのこの薬剤の用途において、顕著な医学的価 値かあり、ＴＮＦか使用される使用の範囲を多いに拡張する。

この薬剤により潜在的な恕化を受ける症状のためにＴＮＦの受容を制限された人 は、ＴＮＦの低血圧傾向及びその他の毒性副作用か減少され及び／または除去さ れる場合には、それらに対して利用可能となったＴＮＦを摂取することかでき得 る。ＴＮＦのリポソームへの結合のためのより効果的な方法は、ＴＮＦの毒性副 作用を減少するための潜在的解決を与える。

本発明は、本明細書において親油性ＴＮＦ調製物と称されるＴＮＦの独特のリポ ソーム処方物の特性の調製物及び特性化に関する。本発明者らは、単核細胞／大 食細胞は、ＴＮＦの膜形態物を使用して腫瘍細胞を優先的に死滅させる能力を有 しているという仮説を設けてきた４２−４６゜しかしながら、低血圧及び全身性 シヨツクのようなＴＮＦの全身投与に関連する宿主特性は、それがなければヒト における治療剤として有用なペプチドであるその可能な使用を制限している。

出願人は、ＴＮＦに関連する宿主特性を著しく減少及び／または除去することが できる方法を本明細書中に開示する。それは、脂肪酸を含有させるＴＮＦ分子の 特定の修正及びこれらの修正ＴＮＦとリポソームとの有利で効率の良い会合によ り達成される。本発明のリポソームは、小車−ラメラ小胞体（ＳＵＶ）または多 重ラメラ小胞体（ＭＬＶｓ）のいずれかとして本明細書中で特性化される。

本発明によれば、腫瘍壊死因子のアミノ残基が修正された、実質的に完全に保有 された細胞溶解活性を有する修正ＴＮＦ分子か開示されている。特に詳しく言う と、ＴＮＦ三量体当り５未満のアミノ残基において修正されたＴＮＦは、細胞溶 解生物活性を保有することに成功しながら調製されている。さらに特に詳しく言 うと、本発明者らの実験室中に集められたデータは、脂肪酸を含むように約１〜 ３のアミノ残基において修正されたＴＮＦは、天然ＴＮＦ細胞溶解活性がほとん ど完全に保有されていることが開示されている。

本発明によって修正されることがてきるＴＮＦ分子のアミノ残基は、ＴＮＦ分子 のＮ末端アミノ基またはリシンアミノ残基を含む。これらのアミノ残基は、活性 となり、ＴＮＦ構造への脂肪酸等のその他の化学基の付加を促進させる。脂肪酸 の修正ＴＮＦへの付加は、ＴＮＦの疎水性を高め、それにより、ＴＮＦのリポソ ームへの効率良く高安定性の会合を促進する。

クレームされた修正ＴＮＦ調製物の好適実施例において、腫瘍壊死因子の参照修 正アミノ残基は、分子リシンアミノ残基またはＮ末端アミノ残基である。選択さ れたアミノ残基がリシン基（即ち、リシル残基）である場合には、リシル側鎖は 、腫瘍壊死因子分子への脂肪酸の付加部位として機能する。上記のアミノ残基が 修正されたＴＮＦ調製物のこれらの特に最も好ましい実施例において、脂肪酸− 修正ＴＮＦ複合体は、親油性ＴＮＦ調製物からなる。これらの親油性ＴＮＦ調製 物の生活性は、本発明者らにより、天然ＴＮＦの未修正体と比較して実質的に完 全な細胞溶解活性を保有していることによって示される。

本発明者らは本明細書中において、表面と会合したまたはリポソーム内に被包さ れた親油性の修正ＴＮＦ分子の調製のための新規で高安定性の方法論を開示する 。これらの会合において、ＴＮＦ調製物は、リポソーム親油性ＴＮＦからなる。

修正親油生ＴＮＦのリポソームへの会合（即ち、表面及び被包化）は、驚くほど の高効率で生じることが示されており、ＴＮＦ分子における脂肪酸の結合に関し ては、少な（とも５０％の効率でリポソームの表面で起こることが示される。さ らに、高結合効率は、リポソーム調製物かインビボで高度に安定であることも示 唆する。リポソーム−ＴＮＦに関して記載する際に本明細書中において使用され る「安定性」は、ＴＮＦ−リポソームかインヒポでＴＮＦをシステム中に放出す ること（即ち、レンター無しのＴＮＦ）の減少または減少された傾向を称する。

本発明のより特に画定された観点において、リポソームはＳＵＶまたはＭＬＶか らなることかできる。本発明の上記ＳＵＶは、０．０２から０．０５μｍの直径 を有していることが最も好ましい。より好ましくは、本発明のリポソーム及びＳ ＵＶは、中性脂質からなり、特に好ましくは、これらの中性脂質は、例を挙げる とＤＰＰＳまたはＤＳＰＣを包含する。中性脂質からなるＳＵＶ　（ＤＰＰＳま たはＤＳＰＣ）は、減少されたＲＥＳ−ＭＬＶｓと比較したインビボの媒介され た解除率の特徴を有利に与える。本発明者らは、修正ＴＮＦ分子は、有利にリポ ソーム（即ち、ＳＵＶまたはＭＬＶ）の表面と会合するか、またはリポソーム（ ＭＬＶ）内に被包されて、高安定性の複合体をインビボで生成することができる と考える。本発明者らは、これらの処方物がインビトロで高安定性の複合体を生 成することを以前に示している。

クレームされた本発明の特に好ましい実施例において、ＴＮＦは、組換えヒトＴ ＮＦ　（ｒＨｕＴＮＦ）からなる。

本発明のこれらの特に好ましい実施例は、修正されたアミノ残基を有するｒＨｕ ＴＮＦ調製物からなる。この実施例の特に好ましい寒天において、ｌのＴＮＦ三 量体当り５未満のアミノ残基が修正される。より好ましくは、１のＴＮＦ三量体 当り約１〜３のアミノ残基が細胞溶解活性を実質的に完全に保有しながら修正さ れる。上記のアミノ残基は、脂肪酸、特に好ましくは長鎖脂肪酸を含むように修 正されることが最も好ましい。本明細書中で使用される「長鎖脂肪酸」は、全部 含めて８〜１４の炭素原子を含む炭素鎖長の脂肪酸を称する。上記のｒＨｕＴＮ Ｆ調製物は、リポソーム、特にリポソームの表面と、実質的に１００％の結合効 率で会合することかできる。

上記のｒＨｕＴＮＦ調製物は、同様に、天然ＴＮＦ細胞溶解生物活性の実質的に 完全な補足によって特性化される。

本発明は、５０％〜１００％のリポソーム−ＴＮＦ結合効率を与えるリポソーム 親油性ＴＮＦを調製する方法をも提供する。対照的に、天然ＴＮＦまたはアシル 化ＴＮＦは、非常に低い効率で結合することが判明した。

種々の結合効率程度を有するものであっても、脂肪酸をタンパク質と会合するた めの当業者に知られたいずれの種類の化学的方法をも使用して、本発明のＴＮＦ 脂質付加物を調製することができる。しかしながら、リポソーム親油性ＴＮＦを 調製する最も好適な方法は、一定量のＴＮＦと、十分量の脂肪酸のＮ−ヒドロキ シスクシンイミドエステルとを、一定量の親油性ＴＮＦ調製物を生成するために 十分な時間反応させ；高効率で親油性ＴＮＦ分子を結合することができる一定容 量のリポソームを処方しニ一定容量のそのリポソームを、十分量の親油性ＴＮＦ 調製物と、親油性ＴＮＦがリポソームと結合するために十分な時間インキュベー トし、それによりリポソーム親油性ＴＮＦの処方物を与える工程を含む。

クレームされた方法において使用される特定のＴＮＦは、組換えヒトＴＮＦ　（ ｒＨｕＴＮＦ）からなることが特に好ましい。より好ましくは、上記方法は、全 部で８〜１４の炭素原子の炭素長を有する脂肪酸を使用する。

約８炭素長の脂肪酸鎖長は、最も好ましい。１４またはそれ以上の炭素原子の炭 素鎖を存する脂肪酸は、回収率が低く（即ち、タンパク質不溶解）、ＴＮＦの生 物（細胞溶解）活性の大きな損失をもたらす。

親油性ＴＮＦ調製物を提供するために、ＴＮＦは、上記脂肪酸のＮ−ヒドロキシ スクシンイミドエステルと、約２６°Ｃて約３時間反応する。クレームされた方 法のより特定した観点において、リポソーム親油性ＴＮＦ調製物は、リポソーム 調製物の１モルあたり約０．５モルＴＮＦの比率からなる。リポソーム調製物１ モルに対する約０．５モルＴＮＦより高いモル比率は、上記及びクレームされた リポソーム親油性ＴＮＦ調製物を有利に与えることができる。

クレームされた本発明のその他の好ましい実施例において、ＴＮＦの薬理学的に 許容され得る調製物が開示されている。このＴＮＦの薬理学的に許容され得る調 製物は、リポソームと会合した修正ＴＮＦ分子からなると特に定義される。この 調製物の１の観点により、ＴＮＦは、リポソーム表面と会合される。この表面− 会合は、ＴＮＦ構造のアミノ残基における脂肪酸の包含を介して促進される。Ｔ ＮＦ分子の反応性アミノ基は、これらの脂肪酸のための付加部位を提供する。

より詳しく言うと、本明細書中に開示された薬理学的に許容され得る調製物のリ ポソームは、約０．０２〜０．０５μｍの直径を有するＳＵＶであると定義され る。５ＵＶ−ＴＮＦ調製物は、腫瘍塊の比較的低い食細胞浸潤がある患者の治療 に対して特に適している。通常の経路を介する５ＵＶ−ＴＮＦの往来（内皮細胞 及びその先）は、ＴＮＦを標的腫瘍組織へ伝達することを管理することができる 。または、ＭＬＶ−ＴＮＦ調製物を使用することもてき、食細胞に高度に浸潤さ れた腫瘍を有する患者の治療にも適している。Ｍ　Ｌ　Ｖ　−Ｔ　Ｎ　Ｆ調製物 は、食細胞に容易に捕捉されることができ、それは、次いで、リポソーム−親油 性ＴＮＦを腫瘍組織へ運ぶ。いずれかの調製物により、全身的毒性の減少は、修 正され高度に疎水性のＴＮＦのリポソームへの高効率の会合、それによる、投与 される調製物及び投与物中の非すポソーム結合ＴＮＦＯ量の減少により得られる ことができる。

この調製物のＴＮＦは、アミノ残基において修正され、参照された脂肪酸を含む 。より詳しく言うと、ｌのＴＮＦ三量対量対当未満のアミノ残基が修正される。

より好適には、１のＴＮＦ三量対量対当１〜３のアミノ残基は、上記の薬理学的 に許容され得るＴＮＦ調製物において修正される。

ＴＮＦの上記の薬理学的に許容され得る調製物の調製において使用される脂肪酸 は、８〜１４の炭素の炭素鎖長を有するものであると特に示される。例えば、脂 肪酸は、カプリル酸、カプリン酸、ラウリル酸またはミリスチン酸の他、８〜１ ４の炭素の炭素鎖長を有する脂肪酸の修正体及び変異体である。クレームされた 薬理学的に許容され得る調製物の特に好ましい実施例において、ＴＮＦと会合し た特定の脂肪酸はカプリル酸である。この特定の実施例において、ＴＮＦ分子の 約３のアミノ残基は、修正されたＴＮＦアミノ残基における上記のカプリル酸付 加を含む。

さらに他の重要な実施例において、本発明は、患者の腫瘍を治療する方法を提供 する。この方法は、ＴＮＦ受容腫瘍を有する患者を同定し；腫瘍阻害用量のリポ ソーム親油性修正ＴＮＦ調製物を患者に投与し：患者の症状に改善が見られるま で、患者を腫瘍阻害用量のリポソーム親油性修正ＴＮＦで毎日治療することを含 む。この方法は、自発的な腫瘍の緩解及び崩壊を促進し、ＴＮＦ反応性の患者に おける腫瘍の成長を遅延させ及び／または停止するという仮説が設けられる。

より詳しく言うと、クレームされた方法に含まれるリポソーム親油性修正ＴＮＦ は、５未満の残基において修正され、脂肪酸、僕に全部で８〜１４の炭素の炭素 鎖長を有する特定の脂肪酸を含むＴＮＦ分子からなる。さらに好ましくは、１の ＴＮＦ三量体当り約１〜３のアミノ残基が修正されて脂肪酸を含む。ＴＮＦ会合 された脂肪酸は、最も好ましくは、約８の炭素の炭素鎖長を存する。

この特定の脂肪酸はカプリル酸である。リポソームは、最も好ましくはＳＵＶま たはＭＬＶ、または中性脂質からなる、ＭＬＶ及びＳＵＶの混合物である。上記 の薬理学的に許容され得る処方物における使用のための最も好適な中性脂質は、 リン脂質である。例を挙げると、リン脂質は、ＤＰＰＣまたはＤＳＰＣからなる ことかできる。

上記の調製物は、多分、利用可能な遊離ＴＮＦの量の減少による（即ち、高効率 のＴＮＦのリポソームへの結合、リポソームからのＴＮＦの放出の減少（インビ ボの高安定性））、宿主毒性が著しく減少していると考えられる。従って、いず れかの投与方法が上記方法における使用に応用可能であると考えられるが、クレ ームされた方法における最も好ましい投与方法は、全身投与である。

本明細書中において使用される語句「修正された」は、化学基のＴＮＦ分子への 付加を促進するＴＮＦ分子のＮ末端アミノ残基またはいずれかのりシン残基のい ずれかの化学修飾を包含し、これらの修正されたアミノ残基に付加することがで きる化学基は、ＴＮＦの疎水性を増加または高めるように機能する。特に詳しく 言うと、これらの化学基は脂肪酸である。

ＴＮＦを修正してこれらの化学基を含有させることは、脂肪酸をタンパク質に付 加するための当業者に周知の多数の方法により達成されることができる。例を挙 げると、この目的のために使用されることかできる方法は、脂肪酸のＮ−ヒドロ キシスクシンイミドエステルによる核置換、脂肪酸無水物の使用、脂肪酸塩化物 の使用またはカルボジイミド結合方法を使用する反応性ＴＮＦアミノ官能基の化 学的修正を包含する。最も好適で、ＴＮＦとの高結合効率を提供することに最も 成功した方法は、脂肪酸のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルによる核置換 反応である。

下記の略語は、本明細書を通して採用されている。

５ＵＶ＝小単−ラメラ小胞体 ＲＥＳ＝網内皮セブレム ＴＮＦ＝腫瘍壊死因子 ＭＬＶ＝多重ラメラ小胞体 ＤＰＰＣ＝ジパルミトイルホスファチジルコリンＤＳＰＣ＝ジステアロイルホス ファチジルコリンＤＰＰＣ−３ＵＶ−Ｃｓ−ＴＮＦ＝シバＪｖミドイルホスファ チジルコリンからなる小車−ラメラ小胞体と会合したカプリル酸により修正され たリポソーム親油性ＴＮＦ図１　ｒＨｕＴＮＦＣの５ＤＳ−ＰＡＧＥ及び天然Ｐ ＡＧＥの特性を、５ＤＳ−ＰＡＧＥ　（１２％ポリアクリルアミドゲル）及び天 然−ＰＡＧＥ　（４％〜１２％線状勾配ゲル）により分析した。

図２　ＴＮＦのアミノ残基のアセチル化の時間経過。

室温における示された時間の８０倍過剰量の活性エステルによるアセチル化反応 の後、過剰量のし一リシンを添加することにより反応を停止した。この反応混合 物を、天然−ＰＡＧＥに与えて、修正の程度を測定した。

［１３ｒＨｕＴＮＦのアセチル化の程度に与えるＣ２活性エステル／ＴＮＦのモ ル比の影響。ｒ　Ｈｕ　Ｔ　Ｎ　Ｆ　ヲ、示された比率の活性Ｃ２エステル／Ｔ ＮＦにより約２６”Ｃ（室温）において約３時間修正し、修正の程度を天然−Ｐ ＡＧＥ分析により測定した。ｒＨｕＴＮＦ調製物を、モル比の酢酸のＮ−ヒドロ キシスクシンイミドエステルと反応させた。可動性が大きいと、荷電アミノ基の アミド化に影響する。

図４−４（ａ）アセチル化ＴＮＦの平均修正アミノ基残基数に与える増加モル比 の活性Ｃ２エステル／ＴＮＦの影響。平均修正アミノ残基の数は、図３中のタン パク質バンドのそれぞれにおける放射能から算出し、活性エステル／ＴＮＦの比 率に対してプロットした。

４（ｂ）水性緩衝液中のＴＮＦの回収率（溶解性）に与えるアミノ基の修正の増 加する程度の影響。

図５　アセチル化ＴＮＦの細胞溶解活性の用量作用曲線。種々のレベルの修正ア ミノ残基によりアセチル化されたＴＮＦを、アクチノマイシンＤ−処理されたＬ −９２９細胞上のバイオアッセイに付した。混入された染料の吸光度を５４０ｎ ｍにおいて測定し、ＴＮＦ濃度に対してブロワｌ−シた。このグラフは、ｌのＴ ＮＦ三景体当り約３より多いアミノ残基（即ち、２．２アセチル化されたアミノ 残基）によるアセチル化の後のＴＮＦ分子の生物活性の減少を示している。

図６　アセチル化の程度に対するアセチル化ＴＮＦの細胞溶解活性に対する用量 作用曲線。このグラフは、約３よりも多いアミノ残基によるアセチル化の後のＴ ＮＦの細胞死滅活性の著しい減少を示している。例えば、４の修正アミノ残基を 有するアセチル化ＴＮＦにより、化合物の細胞死滅活性は約７０％であった。

図７−７（ａ）修正の程度に与えるアセチル化のために使用される活性エステル とＴＮＦのモル比及び脂肪酸の鎖長の影響。

７（ｂ）水性緩衝液中のＴＮＦの回収率（溶解性）に与える脂肪酸鎖長及び置換 の程度の影響。

図８　ＴＮＦ上の生物活性に与える置換の程度及び脂肪酸鎖長の影響。

図ｇ　＋２Ｊ−天然及びＣ２７ＮＦ　（９ａ）；及びＣ。

ＴＮＦ及びＣ，、−ＴＮＦ　（９ｂ）；（７）ＤＰＰＣ−３ＵＶに対する結合。

反応混合物を分子篩によって分離した。

ＳＵＶは空隙率に表われる。（矢印）。

図１０　ＤＰＰＣ−ＳＵＶへの結合に与えるＣ２−またはＣ３−鎖によるＴＮＦ の修正の程度の影響。

図１１　天然、Ｃ，−及びＤＰＰＣ−３ＵＶ−Ｃ，−ＴＮＦの生物活性：タンパ ク質濃度に対するＬ９２９標的による中性赤色混入のための用量作用曲線。

図１２　ＴＮＦのＣ８〜Ｃ１８アシル化。５×または１０×モル比の０８〜Ｃ１ １−活性エステルと反応したｒＨｕＴＮＦの天然ＰＡＧＥ分析。

図１３−１３　（ａ）Ｃ８（Ｘ５）−ＴＮＦ−リポソーム。天然（未修正）ＴＮ Ｆと反応したＤＰＰＣ−３ＵＶまたは５×モル比のＣ６活性エステルと反応した ＴＮＦのセファデックスＧ−２００上の分子篩。矢印は空隙率のマーカーを示し 、試料をバイオアッセイに付した（口＝Ｃ８−Ｘ５　；◆＝天然ＴＮＦ）。

１３　（ｂ）Ｃ８（ＸＩＯ）　−ＴＮＦ−リポソーム。ＩＯＸモル比のＣ８活性 エステルと反応したＴＮＦを使用したこと（口＝Ｃ８−ＸＩＯ）以外は、図１３ （ａ）と同しである。

図１４　（ａ）Ｃ２−５Ｘリポソ一ム結合。５×モル比の０２活性エステルと反 応したＴＮＦを使用すること以外は、図１３（ａ）と同じである。

１４　（ｂ）Ｃ１４−５Ｘリポソ一ム結合。５×モル比のＣ１４活性エステルと 反応したＴＮＦを使用すること以外は、図１３（ａ）と同しである。

１４（ｃ）Ｃ１４−リポソーム再ゲル濾過。

図１５　Ｌ９２９標的細胞を使用するＣ８　（Ｘ５）−ＴＮＦ−リポソーム；Ｃ ８（Ｘ５）、Ｃ８（ＸＩ　Ｏ）、Ｃ８（ＸＩＯ）、Ｃ８（１０）、リポソーム、 Ｃ８（×５）リポソーム及び天然ＴＮＦの細胞死滅活性（５４０ｎｍにおける吸 光度対タンパク質濃度（ｎｇ／ｍｌ）　）。

図１６　Ｌ９２９標的細胞を使用するＣ、、ＴＮＦ及びＣ１４ＴＮＦ−３ＵＶ（ ７）生物活性。

図１７　Ｃ，−バイオゲンーＤＳＰＣリポソームＴＮＦの細胞死滅活性。ロ＝バ イオゲン×０−リポソームム＝バイオゲン×６−リポツームー二バイオゲンＸＯ −リポソーム△＝バイオゲン×６−リポソーム。

出願人は、細胞溶解活性か保持された修正ＴＮＦ分子を調製した。これらの修正 ＴＮＦ分子は、脂肪酸側鎖によるＴＮＦアミノ基の選択的置換による疎水性の増 加を示すことかできる。

脂肪酸側鎖は、種々の方法によりアミノ残基においてＴＮＦと会合されることか できる。例えば、脂肪酸のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルによる核置換 反応、または脂肪酸無水物方法の使用、または脂肪酸塩化物方法の使用、または カルボジイミド結合方法の使用を採用して、脂肪酸のＴＮＦアミノ残基への付加 を促進させることができる。脂肪酸をＴＮＦ分子のアミノ残基へ付加または会合 することは、選ばれた脂肪酸のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルの使用に より達成される。

約８〜１４の炭素分子の長さの範囲の炭素鎖を有する脂肪酸のＮ−ヒドロキシス クシンイミドエステルは、ｒＨｕＴＮＦと反応して、天然ＴＮＦと比較して実質 的に完全に保育された生物（細胞溶解）活性を有する親油性ＴＮＦを生成するこ とに成功した。Ｃ８〜Ｃ１４の酸のエステルによる修正は、正に荷電されたアミ ノ基の消費により測定されたように、生じていた。しかしながら、奇妙にも、よ り長い鎖長（Ｃ１１、Ｃ１，）のエステルは、アミド結合を介するこれらの鎖の 導入能力に非常に劣っていた。

生物アッセイは、活性（即ち、細胞溶解活性）の保存は導入された脂肪酸績の数 及び脂肪酸の鎖長の両者に依存していることを示した。生物活性（即ち、腫瘍細 胞細胞溶解作用）は、ｌのＴＮＦ三量体当り〜１−２．５のカプリン酸（Ｃ８） により修正されたＴＮＦ調製物中で最も保存されていた（〉５０％）。

クレームされたＴＮＦ調製物は、驚くほど及び予想外に高められた効率でリポソ ーム表面と結合することが判明した。例えば、〜５０％の高められた結合効率は 、前生成されたＤＰＰＣ−３ＵＶの表面と記載された親油性ＴＮＦにより示され る。リポソームへの結合は、１の三量体当り約３．５カプリン酸（Ｃ８）残基ま たはｌの三量体当り約１．５残基のミリスチン酸（Ｃ１，）により修正されたＴ ＮＦに対しては、より高い効率であった（８０〜９０％）。ＤＰＰＣ−３ＵＶ− Ｃ，−ＴＮＦの生物活性は、非−リポソームＣ，−ＴＮＦのそれと同等であるこ とが判明した。従って、本発明は、実質的に完全に保有された生物活性を有する クレームされた生物学的に活性なリポソーム−親油性ＴＮＦ組成物を高効率で調 製する方法を提供する。

脂肪鎖の数及び長さの両者に関して、疎水性脂肪酸側鎖の化学導入に対するｒＨ ｕＴＮＦの生物活性の著しい可能性は、本発明の修正されたＴＮＦ体の開発にお いて意外で重要な問題であった。アミノ官能基は、ＴＮＦの生物活性に要求され 、はんの限られた程度の修正のみかよく耐性化されている。アシル化による高め られた疎水性を存するタンパク質はその他の高分子と相互に関係することができ る能力を保有している：例えば、リソチームはＣ３〜Ｃ１４の脂肪酸績とモノア シル化されることかでき、そのため、ＰＳ／ＤＰＰＳ小胞体に親和性を示し、結 合されたタンパク質キナーゼＣにより有効にリン酸化されることができる。対照 的に、低レベル（三量体当り１〜２残基）であっても、特に長鎖の脂肪酸による ＴＮＦのアシル化（１６またはそれ以上の炭素長）は、細胞溶解活性の著しい不 安定をもたらすことが本発明者によって、本明細書中に示されている（図８）。

本明細書中で使用される語句「長鎖脂肪酸」は、含めて、８〜１４の炭素の炭素 鎖長を有する脂肪酸と定義される。

これらの結果をもたらすことができる考えられるメカニズムは、今のところ知ら れていない。それらの外部表面上に修正されたＴＮＦを与えるリポソームの特異 の処方物の特定の観点は、インビトロの殺腫瘍反応において示される活性化単核 細胞／大食細胞によりインビボで採用される伝達モードによく似ていることが本 発明者らによって仮定される４２−４＠。しかしながら、修正されたＴＮＦは、 リポソーム内に被包されるのと同様にリポソームと会合すると考えられる。表面 −会合されたまたは被包された親油性ＴＮＦは、本発明の優れたインビボの伝達 システムを提供することができる。クレームされたＴＮＦ調製物は、高められた 薬理学的な受容性を存する（例えば、減少された優れた宿主毒性を有する）優れ たＴＮＦ冶療冶金剤供すると考えられる。

本発明者らは、親ＴＮＦを出発物質として、生物学的に活性なリポソーム会合さ れた、修正ＴＮＦ処方物を高効率で調製することか可能であることを示している 。ＳＵＶまたはＭ　Ｌ　ＶとのＴＮＦ会合の上記修正体は、ＴＮＦに関連する毒 性副作用か減少及び／または除去されることかできる改良薬物伝達システムを提 供する。

特に詳しく言うと、上記の化学修飾に焦点か集中したＴＮＦ分子のアミノ残基は 、ＴＮＦアミノ酸配列配列はＴＮＦのＮ末端部位を占めるいずれかのアミノ酸の 塩基性アミノ酸リシン（Ｌｙｓ）残基を含む。その天然形態物において、ＴＮＦ は、そのＮ末端におけるバリンアミノ酸残基によって占められる。しかしながら 、Ｎ末端がバリンアミノ酸以外によって占められるＴＮＦの突然変異体は、クレ ームされた修正ＴＮＦの調製物に焦点が集中したそれらのＴＮＦ分子部位の間に 含まれる。修正ＴＮＦアミノ残基部位は次いて、ＴＮＦ分子の疎水性を高める化 学基を含むことかできる。化学基は、全てを含めて８〜１４炭素の炭素鎖長を有 する脂肪酸からなることが特に好ましい。

当業者に周知のいずれの種類の化学的方法を使用しても、ＴＮＦ分子の焦点が集 中したアミノ残基における開始反応部位を与えることかできる。ＴＮＦにおける 修正アミノ酸残基の調製方法に対して、本発明者らが考える特に好ましい化学的 方法は、脂肪酸のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを使用する核攻撃を介 する方法である。この方法は、修正ＴＮＦかＴＮＦの修正アミノ残基における脂 肪酸の付加を含む、クレームされた修正ＴＮＦを生成することに本発明者らによ って採用され成功している。

本発明のＴＮＦ体の最も好適な具体例において、組換えヒトＴＮＦペプチド（ｒ ＨｕＴＮＦ）は、ＴＮＦ三量体当り５未満の細胞溶解性が保有されたアミノ残基 により、アミノ残基において修正され、脂肪酸を含む。さらに好ましくは、ＴＮ Ｆ、特にｒＨｕＴＮＦは、Ｃ３、ＣＩＱまたはＣＩ４のアルキル鎖の約１〜３の 残基（モル１モル）において修正される。ＴＮＦの脂肪酸修正体は次いて、リポ ソーム、特にＳＵＶまたはＭＬＶと定義されるものと会合される。

ＳＵＶは最も好ましくは、中性脂質の約４５００分子を含む。より好ましくは、 この中性脂質は、リン脂質である。例を挙げると、ＳＵＶ及びＭＬＶのリン脂質 は、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）またはジステアロイルホ スファチジルコリン（ＤＳＰＣ）であることができる。ＤＰＰＣからなるＳＵＶ は、本発明における使用のために特に好ましい。

しかしながら、リポソーム、及び本発明において記載されたＳＵＶは、クレーム された本発明の高められた結合効率で、ＴＮＦの上記記載の修正体と会合するこ とかできる種々の脂質、特に中性脂質からなることができる。

この点に関して、その他のＳＵＶ及びＭＬＶ処方物（即ち、種々の脂質）及び少 なくとも約５０％の結合効率の増加を示す高すポソームーＴＮＦ比率は、本明細 書中に開示されクレームされた調製物の範囲内に含まれる。

ＴＮＦの三量体の構造を仮定すると２５．４７　、ｓ　ｔｙ　ｖ−脂質−ＴＮＦ 処方物は、５ＵＶＩモル当り平均約０．５モルのＴＮＦを有している。しかしな がら、リポソーム調製物の１モル当り、より高いモル比のＴＮＦを採用して、親 油性ＴＮＦのリポソームへの実質的に１００％の結合効率を達成することができ る。

本発明者らの処方物のような５ＵＶ−ＴＮＦまたはＭＬＶ−ＴＮＦ調製物は、Ｔ ＮＦの腫瘍への伝達を高めるために適している。５ＵＶ−ＴＮＦ調製物は、ＲＥ Ｓによる迅速な捕捉を回避し、外側リポソーム表面上にＴＮＦ毒素の方向表示を 提供する。また、ＭＬＶ−ＴＮＦ処方物は、ＲＥＳ−媒介の往来がＴＮＦの腫瘍 への高められた伝達を促進する場合は、好ましい。

開示されたＴＮＦ調製物の薬物動力学的特徴を、デプスら６により以前に開示さ れた天然ＴＮＦ−ＭＬＶ調製物のそれと比較することは重要である。薬物動力学 モデルは、薬物−担体処方物を使用し、それにより従来記載されたＴＮＦ調製物 のＴＮＦ関連の宿主毒性を潜在的に減少する低全身薬物濃度を仮定するために本 発明者により採用されている。

リポソーム会合された親油性ＴＮＦ処方物の本発明者らの研究は、インビトロで 潜在的腫瘍細胞毒性を示している。これらの観察は、遊離ＴＮＦと比較したこれ らの調製物によりインビボの細胞損傷を減少すること及び肝臓及び肺のより優れ た標的活性を提供するものである。

ｒＨｕＴＮＦは、バイオゲンコーポレーション（マサチューセッツ州ケンブリッ ジ）から入手した。脂肪酸、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、ジシクロへキシル カルボジイミド、酢酸のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル及びジメチルス ルホキシド（ＤＭＳＯ）はシグマケミカルカンパニー（ミズーリ州セントルイス ）から購入した。ｌ０ＤＯ−ＧＥＮはピエスケミカルカンパニー（イリノイ州ロ ックフォード）から入手した。ＰＤ−１０はファルマシアＬＫＢバイオテクノロ ジーインコーポレイテッドにュージャージー州ビスケータウェイ）から入手した 。無担体のＮａ”’Ｉはアマ−ジャムコーポレーション（イリノイ州アーリント ンハイツ）から購入した。Ｌ−９２９細胞は、アメリカンタイプカルチャーコレ クション（メリーランド州ロックビル）から入手した。

方法 リシルε−アミノ基は、通常疎水性の環境下にあり、化学的修飾に対して補正が 可能であるので、本発明者らは、その生物活性の表現におけるｒＨｕＴＮＦ中の 化学的反応性アミノ官能基の役割の評価を行った。

本明細書中に示されるデータは、ｒ　Ｈｕ　Ｔ　Ｎ　Ｆ中のアミノ官能基かその 生物活性の表現にとって重要であることを示している。低レベルの修正のみか（ モノマー当り５未満の残基）、生物活性の実質的に完全な保有に対して耐性を有 する。

Ｎ末端バリンは、Ｘ線結晶学により非常に可動性が良いことか知られており２５ 、そのため、親水性の環境下になければならない。同様に、６つのリシル残基の 内、２つか、反応性のキャンディデートとして４つのアミノ残基を放出するサブ ユニット内及びサブユニット間のイオン性相互作用に関与していると考えられる 。化学的に反応性のアミノ官能γは、酢酸のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエス テルにより修正されることが最も好ましい。

アミノ基のアミドへの修正及びそれに伴う電荷の損失は、天然ＰＡＧＥによりモ ニターした。

ｒＨｕＴＮＦが増加するモル比において活性エステルと反応する場合は、三量体 当り１２までのアミノ基を修正することができる。アセチル化ｒＨｕＴＮＦの生 物活性が測定された場合には、修正の程度と生物活性の損失の間（ワ忙力な相互 作用が認められた。三量体当り１〜３のアミノ基は、生物活性かほとんと完全に 保有（〜８０−９５％）されたままで修正されることができる：活性は最も高い レベルの修正（三量体当り１２アミノ残基）において完全に分解された。これら の結果は、第２世代ＴＮＦ変異体の開発におけるｒＨｕＴＮＦのアミノ基の重要 な機能及びそれらの修正を含む戦略上の顕著な制約を示す。

アシル化反応か１５てはなく１２の残基においてプラト−に達するように見える という事実は、モノマーあたり１の追加のアミノ基は反応しないことを示唆して いる。

例えば、これか、三量体の４分の１の構造におけるリシル残基の１の非接近性に よるのか、または低すぎるｐＫを有するアミノ基の低反応性によるのかは、本明 細書中に提案された研究を採用する当業者によって決定されることができる。

下記の実施例１〜９は、本発明の好適具体例及び有用性を説明するために開示さ れるのであって、本明細書に添付の請求の範囲において特に断らない限り本発明 の範囲を限定することを意図するものではない。

実施例１−ＴＮＦの放射性ヨー素化 実施例２−アシル化されたＴＮＦの調製実施例３−脂質小単一ラメラ小胞体（Ｓ ＵＶ）の調製実施例４−アシル化されたＴＮＦの小車−ラメラ小胞体への結合 実施例５−アミノ残基修正されたＴＮＦのインビトロの細胞溶解活性 実施例６−親油性の修正されたＴＮＦのインビトロの細胞溶解活性 実施例７−リポソーム−親油性ＴＮＦのインビトロの細胞溶解活性 予言的実施例８−ヒトへの使用のための薬学的に許容され得るＴＮＦ調製物の前 臨床開発の提案予言的実施例９−ヒトにおけるリポソーム−親油性ＴＮＦのイン ビボの使用の提案 実施例Ｉ ＴＮＦの放射性ヨー素化 精製されたｒＨｕＴＮＦを、下記のようにしてヨードゲン方法を使用してＩ２５ Ｉにより標識した：ＩＭリン酸カリウム緩衝液４０μｍ中のｒ　ＨｕＴＮＦ　１ ０　μｇ　、　ｐＨ７，０を、ｌ０ＤＯ−ＧＥＮ　（１０μｇ）の製造直後の股 上に層上に置き、無担体のＮａ　”Ｊ　１ｍＣ１の存在下で、４℃において１０ 分間インキュベートした。この反応混合物を、０．１％のゼラチンを含むリン酸 塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）により、０．５　［＋１１の容量とし、未反応のヨー素 を、０．１％のゼラチンを含むＰＢＳにより平衡化したセファデックスのＧ−２ ５ＰＤＩＯのカラム上のゲル濾過により除去した。このカラムを、同じ緩衝液２ ｍｌにより洗浄し、流出容量を廃棄した。放射性ヨー素化されたＴＮＦを、次の 緩衝液１．２ｍｌにより溶離した。９５％より多い１２５Ｉを下記により測定さ れたタンパク質中に導入した：　（１）全放射能のトリクロロ酢酸の沈殿、及び （２）１７ｋＤａにおけるＴＮＦの単一バンドが放射性標識として検出された５ ＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動。生成物の特異的放射能は、〜５５μＣｉ／μｇ　 ＴＮＦであった。

実施例２ アセチル化されたＴＮＦの調製 本実施例は、アミノ酸残基の利用可能性の研究及び細胞溶解性活性ＴＮＦの研究 のためにアセチル化ＴＮＦが製造される方法を開示するために提供される。保持 された細胞溶解活性により耐性化された最適数のアミノ残基の修正を得て、本発 明者らは、種々の鎖長の脂肪酸を含むアミノ残基修正されたＴＮＦを製造した。

ａ、アミノ酸残基の利用可能性及びアセチル化ＴＮＦ研究の細胞溶解性の研究の ためのアセチル化ＴＮＦの製造 アセチル化ＴＮＦを、ｒＨｕ及び酢酸のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル を使用して製造した。反応媒体は、１００μｌの最終容積中に、０．１Ｍ重炭酸 ナトリウム、種々の濃度の酢酸のヒドロキシスクシンイミドエステル、冷ｒＨｕ ＴＮＦ２０　μｇ及び”Ｊ−ｒＨｕＴＮＦ５Ｘ１０’ｃｐｍを含んでいた。ＤＭ ＳＯＩＯ，ｃｚｌ中に溶解された種々の濃度の活性エステ□ルを添加することに より、この反応を開始した。やさしく撹拌しながら、約２６°Ｃ（室温）で示さ れた時間（最も好ましくは約３時間）インキュベートした後、過剰量のし一リシ ンを添加することによりこの反応を停止した。次いで、この反応混合物をＰＢＳ により予め平衡化されたセファデックスＧ−２５カラム（０，７ｘ　５　ｃｍ） に充填し、残存する活性エステル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド及びＤＭＳｏ を除去した。アシル化されたＴＮＦを、同じ緩衝液による溶離によって分画し、 放射性の画分をアシル化されたＴＮＦの調製物として使用した。

これらの研究において使用されるｒＨｕＴＮＦは、５ＤＳ−ＰＡＧＥ　（１２％ ）において単一のバンドを示し、一方、天然のＰＡＧＥにおいて２つの主要なバ ンドと１つの小さなバンドを示す（ＩＩＪＩ）。いくつかの異なる起源から得ら れたｒＨｕＴＮＦ調製物はまた、天然のＰＡＧＥにおいて類似のパターンを示す （データは示していない）。下記のフローチャートは、ＴＮＦのＣ２−アシル化 のための方法の概要を示す： ＴＮＦのＣ２−アシル化 ＴＮＦ９０μｌ　（２０μｇ冷＋５　ｘ　１０５ｃｐｍ）ＤＭＳｏ中のＣ２−０ ｓｕ　ｌ　Ｏμ！↓ 室温で３時間攪拌 ↓ Ｌ−リシン１５μｌを添加 ↓ エッペンドルフの管中に充填　→　計測計測　１０μｉ　ｔｏμｌ　残り ↓ ５ＤＳ−ＰＡＧＥ　計測　計測　計測 ↓ 放射能写真　バイオ７フｔ’イ　５ＤＳ−ＰＡＧＥ　天然ＰＡＧＥ↓ 計測 ｂ、修正された残基の定量 ＴＮＦ修正の程度を、天然ＰＡＧＥ上の修正されたタンパク質の可動性を測定す ることにより決定した。アシル化反応混合物２０μＩを、４９６〜１２％の線状 勾配ポリアクリルアミドゲルのレーンに与え、ｐＨ８，２９、天然ＰＡＧＥに付 した。銀染色の後、各タンパク質のハントをゲルからそれぞれ切断し、放射能を ガンマ計測器を使用して測定した。各調製物の修正された残基の測定された平均 を、これらのタンパク質のバンド中の計測から算出した。図５に示されるように 、１２のＣ２基により修正されたＴＮＦ形懸形態事実上全ての生物学的活性を失 った。

実施例３−脂質の調製−小単一ラメラ小胞体（ＳＵＶ）この研究の目的は、リポ ソーム、特に、ＲＥＳによる捕獲を排除するために十分小さな直径を存するリポ ソームの製造のための方法を示すことにある。これらの小リポソームは、小単一 ラメラ小胞体と呼ばれ、頭字語ＳＵＶと称される。この研究の特定のＳＵＶは、 約０８０２〜０．０５μｍの直径を有していた。

脂質−小単一ラメラ小胞体（ＳＵＶ）の製造り記の小さな小胞体寸法を与えるこ とができるいずれかの天然脂質は、本明細書中に記載されたＴＮＦの処方物の製 造において使用されることができるか、これらの脂質は、天然の脂質を含むこと か特に好ましく、さらにリン脂質を含むことか好ましい。飽和及び不飽和の両リ ン脂質は、上記のリポソームの製造の目的のために有用であると考えられる。リ ン脂質の中で、最も特に好ましいものは、ＤＰＰＣ及びＤＳＰＣを含む。

下記の研究において、小単一ラメラ小胞体（ＳＵＶ）は、’Ｊ　ン脂質ＤＰＰＣ から製造された。ＤＰＰＣｌＯｍｇを最初に小容量のクロロホルム中に溶解し、 溶媒をガラス試験管中で真空下で乾燥した。ＰＢＳ　１ｍｌ　（ｐＨ７，４）を 添加した後、乾燥されたＤＰＰＣを、５０’Ｃて３０分間繰り返し渦巻き回転に より混合することによって、水和した。得られた懸濁液を、プローブ型の超音波 処理装置（ヒートシステム：ニューヨーク州ファーミングデール）を使用して、 ５０°Ｃにおいて３０分間超音波処理し、次いで１５００Ｘｇで１０分間遠心分 離し、チタン粒子を除去した。

ＴＮＦのＤＰＰＣ−小胞体への結合は、実施例４に記載のゲル濾過により測定さ れた。

実施例４−アシル化ＴＮＦの小単一ラメラ小胞体（ＳＵＶ）への結合 下記の実施例は、リポソーム、特に小単一ラメラ小胞体（ＳＵＶ）として記載さ れた小リポソームの表面への修正された腫瘍壊死因子分子の増加された結合効率 を示すためのものである。

本実施例は、ＴＮＦのアシル化体がリポソーム表面に結合親和性を有しているか 否かを測定するためにも行われた。本研究は、出願人によって開発されたリポソ ーム−会合されたＴＮＦ体を提供する高効率の方法を示すものである。高レベル の結合効率は、修正されたＴＮＦのＳＵＶへの会合及び修正されたＴＮＦの〜Ｉ ＬＶによる被包化のために与えられる。

これらのｍｌ究において、本発明者らは、実質的に１００９６の結合効率を有す るリポソーム会合されたーアシル化さｔ］たＴＮＦ伝達システムを開発すること に成功した。

これらの結果は、従来のＴＮＦ伝達システムよりも著しく高められたことを示し ている。さらに、増加した結合効率は、はんの２〜１１％のＭＬＶ被包効率がＴ ＮＦの未修正体に関して報告されている従来の方法に対する著しい向上を示して いる。本明細書において使用される場合は、語句「未修正の」は、そのＮ末端ア ミノ残基またはリシンアミノ残基が、ＴＮＦ分子の疎水性を増加させるような化 学基の付加を包含するかまたは促進するように化学的に変化されていないＴＮＦ 分子であると定義される。より詳しく言うと、ＴＮＦ分子の疎水性を増加させる 化学基は、例を挙げると、脂肪酸を包含する。

これらの研究のために、実施例２に記載され製造された種々の長さのアルキル側 鎖へ共有結合した修正ＴＮＦのＳＵＶ処方物を採用した。

上記記載のＳＵＶ会合された修正ＴＮＦ分子の最も好ましい例は、ＴＮＦ三量体 当りカプリル（Ｃ８）脂肪酸鎖約１〜２．５残基により修正されたＴＮＦ分子で ある。

この特定の修正ＴＮＦ分子は、ＤＰＰＣリン脂質またはＤＳＰＣリン脂質からな る予備形成されたＳＵＶと接触した。この実施例の結果は、天然ＴＮＦは会合の 傾向かほとんとないが、脂質−修正されたＴＮＦに対しては高程度（５０〜９５ ％）の会合か観察されたことを示唆している。この観察は、ＴＮＦの脂質置換の 程度及びＳＵＶからなる脂質の鎖長と相関関係があった。

本研究において、天然ＴＮＦ及びアシル化ＴＮＦの両ＴＮＦは、低い効率でリポ ソームに結合した（図９、く５％結合効率）。これらの研究はまた、ＤＰＰＣ及 びＤＳＰＣ−３ＵＶ−脂質−ＴＮＦ処方物が温度安定特性を有していることを示 した。これらの安定性は、室温において類似しているが、３７°Ｃまでの温度の 上昇は、空隙率からＤＰＰＣ−Ｃｓ　−ＴＮＦの不安定を示した。ＳＵＶにおけ るＤＰＰＣの相転移温度は〜３７°Ｃであり、それは不安定性の原因となり得る 。対照的に、ＤＳＰＣ−Ｃ，−ＴＮＦは、この温度においてそのままであり：Ｓ ＵＶ中のＤＳＰＣの相転移温度は、〜５５℃である。

さらに、ＴＮＦを使用する下記の細胞溶解アッセイにおいて示されるように、脂 質−ＴＮＦがＤＰＰＣ−３ＵＶ中に存在する場合に、生物学的活性は保持される かまたは遊離脂質−ＴＮＦと比較するとわずかに増加さえした（図１３）。対照 的に、生物学的活性が減少するのにつれて、ＤＳＰＣ−３ＵＶは、脂質−ＴＮＦ の不十分な担体となるようである（図１７）。この理由は不明であるが、ＴＮＦ −レセプター−リガンド衝突頻度のＳＵＶを媒介する減少、またはＤＳＰＣ−Ｓ ＵＶの相対的剛性に帰することかできるレセプター−リガンド相互作用のその他 の不安を包含するいくつかの要素が原因であると考えられる。

これらのデータはまた、ＤＰＰＣ調製物が、Ｃ５ＴＮＦと３７°Ｃで可逆的会合 を示す一方で、ＤＳＰＣ調製物はこれらの同し条件下で著しく及び高度に安定で あることを示している。しかしながら、上記のリン脂質のいずれかにより製造さ れたＴＮＦ及びＳＵＶ処方物の両者は、インビトロで細胞溶解活性を示した。こ れらのデータは、出願人による安定で細胞学的に活性なリポソーム−ＴＮＦ処方 物の高効率の調製物を示している。

ＤＰＰＣ−小胞体への結合 ＤＰＰＣ−小胞体へのアシル化されたＴＮＦの親和性を、　１２６１−天然、　 ”’Ｉ−Ｃｔ　−１”Ｊ−Ｃｓ　−及び”’Ｉ−Ｃ，４−ＴＮＦのＤＰＰＣ−３ ＵＶへの結合により測定し、セファデックスＧ−２００カラムクロマトグラフイ ーを使用する分配により定量した。より詳しく言うと、　＋２５１−天然または １２５Ｉ−アシル化されたＴＮＦ（５μｇ、５　ｘ　１０’ｃｐｍ）　（”’Ｉ Ｃｓ　ＴＮＦ、”ＪＣＩ４　ＴＮＦ等）をそれぞれ、ＤＰＰＣ−小胞体５００μ ｇと混合し、２０℃で１５分間インキュベートした。このインキュヘーション混 合物を、ＰＢＳにより予め平衡化されたセファデックスＧ−２００カラム（ｌｘ 　１５　ｃｍ）に充填し、小胞体−結合の及び未結合のタンパク質を、同じ緩衝 液による溶離により分画した。各画分（タンパク質０．５　ｍｌ）中の放射能を ガンマ計測により測定した。

”５）−ＴＮＦを、実施例１の方法により製造した。

アシル化ＴＮＦのリポソームへの結合において採用された方法を、下記チャート 中にまとめて示すニアシル化ＴＮＦのＤＰＰＣ−リポソームへの結合ＰＢＳ中の ＤＰＰＣ−８ＵＶ５０　ｏμｇアシル化ＴＮＦ　５　μｇ　（５ｘ　ｌ　Ｏ’　 ｃｐｍ）↓ 室温で１５分間インキュベート ↓ 予めＰＢＳにより平衡化されたセファデックス０２００カラム（７，０ｍｌ）へ 充填 ↓ ０．５ｍ１部分を採集 ↓ 計測 未結合タンハク質由来（７）”’Ｉ−ＴＮＦ−ＤＰＰＣ小胞体複合体の典型的な グラフを図９に示す。Ｄ　Ｐ　Ｐ　Ｃ／Ｊ％胞体またはタンパク質−ＤＰＰＣ− 小胞体複合体は、矢印で示されるように、空隙率に溶離された。

図９ａに示されるように、ｕｓｌ−天然ＴＮＦのＤＰＰＣ−小胞体への結合は、 無視できるほとである。三量体当り２つの脂肪酸基を含むように修正されたＣ２ −ＴＮＦは、図９Ａに示されるように小胞体へわずかに結合した。同じ修正レベ ルを有するＣ、−ＴＮＦに関しては、添加されたタンパク質の８５％より多くが 、小胞体へ結合したことか判明した（図９ｂ）。

図１Ｏは、Ｃ２−及びＣ＊　Ｔ　Ｎ　ＦのＤＰＰＣ−３ＵＶへの結合に与える修 正された残基の数の影響を示している。ＴＮＦの０２−アセチル化は、三量体当 り６残基か修正されている場合てもＴＮＦのＤＰＰＣ−小胞体への結合に検出可 能な増加をもたらさない。対照的に、修正された残基の数が増加するにつれて、 Ｃ，−ＴＮＦの結合が著しく増加し、修正された残基の数が三量体当り３．５残 基を越える場合には、添加されたＴＮＦの８０％より多くか小胞体に結合した。

実施例５一種々の脂肪酸を含むまたは含まない残基修正されたＴＮＦのインビト ロの細胞溶解活性下記のインビトロのアッセイは、（１）ＴＮＦ生物学的活性の 表現におけるｒＨｕＴＮＦの化学的反応性アミノ官能基の役割を評価しく実施例 ５）、低レベルのＴＮＦ分子アミノ残基修正（三量体当り１〜３残基）が生物学 的活性を著しく失うことなく行われ得ることを確立するデータを得て、（２）長 鎖脂肪酸（Ｃ８〜Ｃｌ８）を存する低レベルのアミノ残基アシル化されたＴＮＦ の親油性体の生物学的活性を評価する（実施例６）ために、行った。

下記の実施例５及び６はまた、特に抗ガン性の薬理学的に許容され得る調製物と してヒトに使用するための、インビボの抗腫瘍形成剤としての本発明の応用可能 性を確立するために行われる。

（ａ）異なるレベルの修正されたアミノ残基を有するＴＮＦの製造 異なるレベルの修正されたアミノ残基を有するアシル化ＴＮＦを実施例２のパー ト（ａ）に概略を示した方法に従って製造した。本研究において採用される特定 のアミノ残基修正されたアシル化ＴＮＦ体は下記のものを包含する： １〜２アミノ残基か修正されたＴＮＦ ３〜５アミノ残基が修正されたＴＮＦ 図２は、タンパク質に対して酢酸のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを８ ０倍モル過剰量使用するＴＮＦのアミノ残基のアセチル化の時間経過を示す。遊 離アミノ残基の数の減少のために、修正反応の進行につれて天然ＰＡＧＥ上のＴ ＮＦの可動性は増加した。ＴＮＦの電気泳動の微小不均一性はまたアシル化によ り増加することが観察された。修正は迅速に起こり、５分後にほぼ完全になり、 １０分以内にプラトーに達した。１０分後には、６日後であっても反応が明白に 起こらなかった。

図３及び４は、３時間の反応の後のＴＮＦのアセチル化の程度に与える活性−エ ステル／ＴＮＦのモル比の増加の影響を示す。修正の程度は、これらの成分活性 エステルとＴＮＦのモル比に非常に依存する：これは比率の増加につれて線状に 増加し、最高の活性エステル／ＴＮＦ比を採用することにより三員対当り１２の アミノ残基が修正された時にプラトーに達した。

修正された残基の定量 修正の程度は、実施例２に記載されたように天然ＰＡＧＥ上の修正されたタンパ ク質の可動性を測定することにより決定した。簡単に言うと、アシル化反応混合 物２０μｌを、４％〜１２％の線状勾配ポリアクリルアミドゲル、ｐＨ８，２９ のレーンに与えて、次いで天然ＰＡＧＥに付した。銀染色の後、各タンパク質バ ンドをゲルからそれぞれ切断し、放射能をγ計測により測定した。各調製物の修 正された残基の加重値を与えられた平均は、これらのタンパク質バンド中の計測 数から算出した（図４（ｂ））。

（ｂ）ＴＮＦの細胞溶解活性の表現におけるＴＮＦのアミノ基の影響 細胞溶解活性の表現に与えるＴＮＦのアミノ基の影響を測定するために、異なる レベルの修正された残基を有するアセチル化ＴＮＦを、アクチノマイシンＤ−処 理されたＬ−９２９細胞上の生物学的アッセイに付した。

細胞溶解活性は、既に文献に記載された方法により測定した”ｏＬ９２９細胞を 、０．３３　ｃｍ”ウェル中のＤＭＥ／Ｆ　ｌ　２培地１５０μｍ当り＋５Ｘ１ ０３としてブレート上に置いた。パートａ由来の種々のアミノ残基修正されたＴ ＮＦ調製物を一晩インキユベートした後、アクチノマイシンＤを含む培地５０μ ｌを添加して、最終薬物濃度ｌμｇ／ｍｌを得た。本明細書に記載された方法（ 実施例２）から得られたアセチル化ＴＮＦの試料を、それらの標的上で直ちに滴 定し、インキュベーションを一晩続けた。

１８〜２４時間後、中性の赤色溶液５０μｌを添加し、残存する生存可能な標的 に、６０分間染料を混入させた。

未混入の染料をＰＢＳにより一度洗浄することにより除去した。

混入された染料を、酸性化されたエタノールにより可溶化し、各ウェルのＡ１４ ゜を、多重チャンネルの走査装置を使用して測定した。各試料のＬ　Ｄ　ｓ。を Ａ、４゜の滴定曲線から得て、ＴＮＦ投与量及び相対的細胞溶解活性（％）を、 前記試料のＬ　Ｄ　ｇ　ｏと天然ＴＮＦのそれとを比較することにより算出した 。

図５は、細胞毒活性の用量作用曲線を示す。天然ＴＮＦと比較したアセチル化Ｔ ＮＦ試料の相対的細胞毒活性は、ＬＤｉｏ値から算出され、修正された残基の数 に対してプロットした（図６）。

結果： ９０％より多い細胞毒活性か、ＴＮＦ三景三量つき１〜２のアミノ残基を修正し た場合に保持された。しかしながら、三量体当り３〜５の残基のレベルまでＴＮ Ｆを置換することは、３０％〜７０％の活性の損失を生じさせた。最大の修正（ 三量体当り〜１２アミノ残基）は、９５％より多い活性の損失をもたらした。

この実験から得られた結果は、ＴＮＦの生物学的活性の損失は、ＴＮＦのリシン アミノ基の修正の程度に密接に平行の関係にあることを示している。これらの研 究において、ＴＮＦ三量体当り５未満のリシンアミノ残基において修正されたＴ ＮＦ分子が細胞溶解活性を保持していたことが確立された。より詳しく言うと、 ＴＮＦ三量体について１〜３のリシンアミノ残基が修正されたＴＮＦ調製物が最 も高い程度の細胞溶解活性を保持していることが確立された。

実施例６−脂肪酸修正されたＴＮＦのインビトロの細胞溶解活性 本実施例は、脂肪酸鎖、（修正されたアミノ残基において）特に長鎖の脂肪酸、 を含むようにさらに修正されたアミノ残基修正されたＴＮＦが細胞溶解性生物学 的活性を保持しているか否かを測定するために行われた。語句「長鎖脂肪酸」は 、８〜１４の炭素の炭素鎖長を育する脂肪酸であると定義される。

低レベル（三量体当り５未満の残基、より好ましくは約１〜３の残基）のアミノ 修正は、実施例５において得られたＴＮＦ中でよく耐性化されているという発見 は、本発明者らに、ヒトの治療におけるこの薬剤の可能な用途のための応用の範 囲を拡張する機会を与えた。例えば、ｒＨｕ　Ｉ　１−２において、リシルまた はシスティン修正を介するポリエチレングリコール付加物の導入は、生物学的活 性を保持し、分子のインビボの半減期を増加させることが示されている＋４−＋ ７゜本明細書中に開示されたＴＮＦの化学的修正は、この分子の免疫原性を好都 合に減することと考えられている１８１９゜従って、出願人か特に定義するＴＮ Ｆの化学修飾の戦略は、従来のインヒポの試験において確証されたＴＮＦの使用 の毒性用量限界を克服するために有用である３４−３７゜親油性ＴＮＦの製造 本実施例において、本発明者らは、長鎖脂肪酸（Ｃ。

〜Ｃ＋−）によるＴＮＦのアミノ酸を低レベルにアシル化し、親油性のＴＮＦを 合成し、これらの処方物のインビトロの細胞溶解活性を試験した。アシル化され たＴＮＦ−リポソーム親油性ＴＮＦを、実験２において記載した方法と実質的に 同じ方法により本研究のために製造した。

ＴＮＦ分子上の反応性アミノ残基の修正は、当業者には周知の種々の方法により 実施されることができる。例えば、脂肪酸側鎖の導入を促進するためのＴＮＦの 修正は、（１）アミン基を脂肪酸のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを使 用してｌのアミドに修正すること；または（２）脂肪酸無水物方法の使用による 二または（３）脂肪酸塩化物方法の使用による：または（４）水溶性カルボジイ ミド方法の使用によるを包含する。

脂肪酸無水物及び塩化物は、商業的に入手可能であるか、または容易に合成する ことができる。これらはタンパク質と直接反応し、アミノ官能基により攻撃され 、それにより、アミン結合を介して脂肪酸ａｍを導入する。

カルボジイミドは、最初に遊離脂肪酸と反応して、カルボキシル官能基を活性化 し：この活性化されたカルボキシル官能基かタンパク質アミノ官能基による攻撃 を受けやすい。しかしながら、ＴＮＦアミノ残基を修正して、脂肪酸側鎖のＴＮ Ｆへの導入を促進するために使用され、る最も好適な方法は、脂肪酸のＮ−ヒド ロキシスクシンイミドエステルの使用による。より詳しく言うと、アシル化され たＴＮＦは、ｒＨｕＴＮＦ及び脂肪酸のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル を使用して製造された。

このエステルは、ラピデットらの方法により製造された４１゜この反応培地は、 最終容量１００μｌ中に、０．１Ｍ重炭酸ナトリウム、種々の濃度の特定の脂肪 酸の活性エステル、冷ｒＨｕＴＮＦ２０μｇ及びＩ　”　Ｓ　Ｉｒ　Ｈｕ７ＮＦ ２Ｘ１０’ｃｐｍを含有していた。この反応は、ＤＭＳ０１０μｌ中に溶解され た種々の濃度の活性エステルを添加することにより開始した。２６°Ｃ（室温） で約３時間やさしく撹拌しながらインキュベーションした後、反応混合物を、Ｐ ＢＳにより予め平衡化したセファデックスＧ−２５カラム（０，７〜５　ｃｍ） に充填して、残存エステル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド及びＤＭＳＯを除去 した。アシル化ＴＮＦを同じ緩衝液による溶離により分画し、放射性画分をアン ル化ＴＮＦ調製物として使用した。修正された残基の定量は、実施例２に記載の 方法と実質的に同じ方法により行った。各調製物の修正された残基の加重値を与 えられた平均を、得られたタンパク質バンド中の計測数から算出した。

図７は、各活性化されたエステルによるＴＮＦアミノ残基のアシル化の程度に与 える脂肪酸側鎖の影響を示す。

この場合において、ＴＮＦは、限定された量（５及び１０倍のモル過剰量）の各 脂肪酸の活性エステルを使用して修正され、低レベルの修正が得られた。

修正の程度は、脂肪酸鎖長がこれを越えて増加するのに従って減少したが、長さ がＣ８〜Ｃ１４の脂肪酸により概ね等しい程度の修正が行われた（三量体当り約 １〜２の残基）。著しいＴＮＦ分子の脂肪酸修正は、Ｃ１１に関して認められな かった。従って、０２〜ＣＩ４の脂肪酸鎖長を有するアシル化されたＴＮＦを、 次の一連の実験において使用した。特に、脂肪酸修正されたＴＮＦの試験された 種類は、下記のリスト中に示されるＴＮＦを含んＣ−８＝　Ｃ，−ＴＮＦ Ｃ−１ｏ＝　Ｃ＋。−ＴＮＦ ＣＩ２”　Ｃ＋□−ＴＮＦ Ｃ−１４＝　Ｃ１，−ＴＮＦ 親油性ＴＮＦの細胞溶解性活性 本研究における使用のために、ＴＮＦ細胞溶解活性を、既に文献に記載された方 法により測定した４１゜簡単に言うと、Ｌ９２９細胞を、０．３３　ｃｍ’ウェ ル中のＤＭＦ／Ｆ１２培地１５０μｍ当り１５ＸｌＯ’としてプレートに置いた 。−晩インキユヘーシタンした後、アクチノマイシンＤ自存培地５０μｌを添加 して、最終薬物濃度１μｇ／ｍｌを得た。天然またはアシル化されたＴＮＦまた はそれらのリポソーム処方物の試料を、これらの標的上ですぐに滴定し、インキ ュベーションを一晩続けた。

１８〜２４時間後、中性の赤色溶液５０μｌを添加し、残存する生存能力のある 標的か６０分間染料を混入することを可能にした。未混入の染料をＰＢＳにより 一度洗浄することによって除去した。

混入された染料を、酸性化されたエタノールにより可溶化し、各ウェルのＡ５４ ゜を、多重チャンネルの走査装置を使用して測定した。各試料のＬ　Ｄ　ｓ。を Ａｌ１゜及びＴＮＦ容量の滴定曲線から得て、相対細胞溶解活性（％）を、試料 のＬＤ、。を天然のＴＮＦと比較することによって算出した。

図８は、アシル化ＴＮＦの細胞溶解活性に対する脂肪酸鎖長及び修正された残基 の数の並置を示す。アセチル化ＴＮＦ（Ｃ２）の場合、三量体当り１〜３の残基 のレベルての修正は、細胞溶解活性においてわずかな減少（１０〜３０％）を生 しさせた。一方、より長い鎖の脂肪酸による同しレベルの修正は、活性に著しい 損失をもたらした。三量体当り１〜２．５のカプリル酸（Ｃ８）鎖により結合さ れたＴＮＦは、この細胞活性を５０％保持していた。即ち、クレームされた修正 されたＴＮＦ調製物の最も好適な具体例において、ＴＮＦ分子は、１〜３のアミ ノ残基において修正され、８炭素の炭素鎖長を有する脂肪酸を含む。一般的に、 この研究は、細胞溶解活性の損失の程度は、修正されたアミノ残基の数の増加及 び採用された脂肪酸の鎖長の増加の両者と並行である。

実施例７−リポソーム−親油性ＴＮＦのインビトロの細胞溶解活性 本実験は、リポソームと会合して製造されたＴＮＦのアシル化体かインビトロで 細胞溶解活性を保持したか否かを決定するために行われた。また、本研究は、潜 在的抗ガン治療剤としてのヒトへの使用のためのアシル化されたリポソーム−会 合されたＴＮＦ体のインビボの採用の応用可能性を確立するために行われた。

リポソーム−会合されたアシル化ＴＮＦの細胞溶解活性を測定するために、ＤＰ ＰＣ−小胞体に結合されたＣ３−ＴＮＦ（実施例４の方法により製造された）を 最初にゲル濾過により精製し、未結合のタンパク質を除去し、次いて、空隙率の 複合体の細胞溶解活性を試験した。

結果： 図５は、天然、Ｃ８−及びＤＰＰＣ−３ＵＶ−Ｃ１−ＴＮＦ　（リポソーム親油 性ＴＮＦ）の細胞溶解活性の用量作用曲線を示す。Ｃ，−ＴＮＦは、わずかに減 少した細胞溶解活性を示すが（天然ＴＮＦの〜６０％）、他の点では、この用量 作用曲線の形状は、天然ＴＮＦのそれと全く類似していた。ＤＰＰＣ−ＳＵＶＣ Ｉ　−ＴＮＦは、遊離Ｃ，−ＴＮＦとほとんど同じＬＤ、。を示した。しかしな がら、用量作用曲線の特徴は、Ｃ，−ＴＮＦとわずかに異なり、低タンパク質濃 度範囲において比較的強い活性を示した。

予言的実施例８−ヒト腫瘍に使用される薬学的に許容され得るＴＮＦ調製物の提 案された前臨床開発抗ガン剤としてフェーズＩ／フェーズｌ　ｌ　２４−２？の 臨床試験において世界的に評価されたｒＨＵＴＮＦは、用量管理によっても、著 しい毒性、主に低血圧を引起こす期待外れの効力が示されている。

今日までのフェーズＩ試験は、低血圧及び血小板減少を包含する用量−限定毒性 においてさえも、部分的な反応が殆ど認められず、一過性であることが、残念に も示している３７゜これらの初期の臨床効果と同時に、インビトロ及び動物実験 からＴＮＦの複合的生理学に関して多くのことが学ばれている。事実、それは「 腫瘍壊死因子」以上である；例えば、それは、カへクチン０、力ヘキシーの活性 剤と同じであり、エンドトキシン誘発の傷害の心身に有害な影響の多（を生じさ せる２１．　ｆｉｏ、　５＋、さらに、イヌモデル１及び臨床において観察され る低血圧の細胞の基準は、内皮細胞（ＥＣ）の生理学の不安定性である。しかし ながら、ＴＮＦが、インビボで特定の移植可能な腫瘍の出血性壊死を生じさせる ことができ、インビトロで腫瘍細胞毒を管理することができるという知識は、多 くの研究者に、ＴＮＦのしばしば致死的である副作用を減少する方法を探索する ことを刺激している。

本発明者らの研究は、より良い治療学的指標を有する、第２世代のＴＮＦの設計 と、薬物標的システムの応用を包含する、治療学的利益を増加し、毒性を最小限 にする新しい戦略を開発することにつながる。この提案された研究の目的は、イ ンビトロでモデルシステム中の効率がより高（毒性がより低く、また安定なリポ ソーム調製物として効率良く処方されることができるＴＮＦ変異体を開発するこ とにある。

クレームされた処方物の前臨床評価のためのこの予言的実施例の特定のねらいは 、下記を包含する：ａ、第２世代のＴＮＦの開発 １、天然の成熟ＴＮＦの部位特異的突然変異生成２、塩基性ペプチドによるアミ ノ末端の延長す、ＴＮＦの親油性付加物の開発、下記を介する第１の目的から得 られる天然成熟タンパク質または変異体：１、リシルまたはＮ末端アミノ基の脂 肪酸側鎖の活性化エステルによる化学的アシル化； ２、この配列のＴＮＦｃＤＮＡへの融合から得られる変異体ｃＤＮＡによりコー ドされたＮ末端ペプチドシグナルの認識による細胞媒介ミリスチル化：３、トラ ンスメンブランドメインをコードするアミノ末端延長による変異体ＴＮＦｃＤＮ Ａの構成。

Ｃ３目的す由来の親油性ＴＮＦ付加物のリポソーム処方物の製造。ＳＵＶ及びＭ ＬＶの両処方物は、会合の効率及び安定性に与える脂質組成物及び電荷の影響に 関して評価される。

ｄ、遊離及びリポソームＴＮＦ及び第２世代のＴＮＦ処方物のインビトロの特性 化： １、効率 ｉ、特異的活性 ｉｉ、可能な標的のスペクトル ２、毒性 ｉ、低血圧−内皮細胞モデル ｉｉ、カヘキシー リボタンパク質リパーゼ／脂肪分解モデルａ、第２世代ＴＮＦ 本発明者らは、分子のＮ末端アミノ残基またはリシンアミノ残基におけるＴＮＦ 分子の修正がリポソームとのＴＮＦの会合を促進することを提案する。ＴＮＦの Ｎ末端領域の増加した塩基度は、低い毒性でＴＮＦ抗腫瘍活性を高めることがで きる。増加した塩基度を有する生成されたＴＮＦ変異体は、親ＴＮＦよりも高い 細胞毒性を表現している２＠−１゜本出願において、本発明者らは、これに含ま れる提案された全身的方法において、特にリポソームとのこれらの修正されたＴ ＮＦ分子の結合による、抗腫瘍活性及び毒性に与えるＴＮＦのＮ末端領域におけ る塩基度の影響の研究を提案している。この研究の目的は、部位特異的突然変異 生成技術によるＮ末端領域における変異体による第２世代のＴＮＦを生成するこ とにある。これらの特定の修正されたＴＮＦ分子は、リポソームと好都合に結合 して、クレームされた薬理学的に許容され得る調製物を与えることができる。

実験 ａ、１．ＴＮＦの部位特異的突然変異生成予め決定された領域においてランダム 変異体を生成する一般的方法は、十分に確立されている５２゜本発明者らは、塩 基度を増加し細胞毒性を高めるＴＮＦのＮ末端１１アミノ酸をコードする領域に おける一連の変異体を生成するこの技術の使用を提案している。簡単に言うと、 ＴＮＦｃＤＮＡを含むスーパーコイル化されたプラスミドＤＮＡを単離し、成熟 ＴＮＦの最初のＩＩＮ末端アミノ酸残基に対応する１本鎖のオリゴヌクレオチド とインキュベートする。ｒｅｃＡタンパク質及びＡＴＰの存在下で、１本鎖のフ ラグメントがプラスミド環状ＤＮＡ上の相補配列と一対になり、Ｄ−ループを生 成する。Ｄ−ループ領域（成熟ＴＮＦ中の最初の１１アミノ酸残基をコードする ）は、１本鎖−特異的エンドヌクレアーゼＳＩによる処理によりニックされるこ とができる。このように、緩和された環状ＤＮＡ分子は、Ｎ末端の１１アミノ酸 残基をコードする領域内のどこかにニックを存する。

エキソヌクレアーゼＩＩによる次の処理及び重硫酸ナトリウムによる突然変異生 成により、この領域内の一群の点変異を生成して、ＤＮＡ配列決定により確認す ることができる。

本発明者らが特に好ましいと考える代替的な特定の手法は、この領域内の非塩基 性アミノ酸を塩基性のアミノ酸ＡｒｇまたはＬｙｓに転化することである。最初 のＩＩのアミノ酸残基 の中て、３つ（２，６，１１）が、塩基性アミノ酸をコードする。本発明者らは 、オリゴヌクレオチド部位特異的突然変異生成を使用して、各非塩基性アミノ酸 残基をＡｒｇまたはＬｙｓに変更することを提案する。いずれかの単一突然変異 生成が細胞毒性を増加することが判明したら、Ｎ末端領域中の塩基度が細胞毒性 を著しく高める場合には、２つの非塩基性アミノ酸残基を塩基性アミノ酸残基に 転化する二重突然変異変異体を生成することができる。細胞毒性を高めることは 、目的ｄ、において概要を述べた方法により評価されることが提案されている。

Ａｒｇではなく　Ｌｙｓによる置換は、上記の修正されたＴＮＦにおいて好まし い。Ｌｙｓは、少なくとも２つの理由から特に好ましい：１）これはアシル化の ための標的を提供する（目的ｂ）；及び２）Ｌｙｓ突然変異体は、高められたＤ ＮＡ結合による細菌中で表現されたＡｒｇ突然変異体により出合う単離の問題を 回避することができる。

本発明者らは、提案された方法（例えば、ＬｙｓまたはＡｒｇによる置換）によ る塩基度の増加が生物学的活性（細胞溶解）の増加を与えるプラトーを仮定して いる。

このプラトーは、上記の方法を使用して本研究において測定されることができる 。

ａ、２．塩基性ペプチドによるアミノ末端の延長の調製テトラペプチドＡｒｇ− １ｉｅ−Ａｒｇ−ＭｅｔがＴＮＦのＮ末端に結合されたときに、得られた突然変 異体（ｒＴＮＦ−３ＣＷ２と称される）は、天然ＴＮＦよりも広く著しく高い細 胞毒性を、腫瘍細胞にインビトロ及びインビボの両方において示す２ト！８゜Ｎ 末端領域中の塩基性ペプチドによるＴＮＦの延長の方法は、高く広い細胞毒性と 低い毒性副作用を有する第２世代のＴＮＦを製造するための潜在的に有用な方法 を提供する。この研究の目的は、高められた細胞毒性を存するＮ末端領域におけ る延長された塩基性ペプチドによる塩基性の増加によりその他の第２世代のＴＮ Ｆを生成することにある。

上記の目的を達成するために、テトラペプチドＬｙｓ−１１ｅ−Ｌｙｓ−Ｍｅｔ をＴＮＦのＮ末端に添加することが提案される。

Ｌｙｓ−１１ｅ−Ｌｙｓ−Ｍｅｔのテトラペプチドは、脂肪酸側鎖の活性化され たエステルによる化学的アシル化のためのより良い受容部位を提供することがで きる。上記に記載のテトラペプチドに加えて、アミノ酸残基の多くのその他の異 なる組み合わせを使用して塩基性のペプチドを生成することかできると理解され るへきである。しかしながら、これらか前ペプチド内の成熟ペプチドの配列の側 部に位置するその他のシステムにおいてタンパク質の加水分解のための潜在的標 的部位であるから、一対の塩基性残基（Ａｒｇ−Ａｒｇ　、　Ｌｙｓ−Ｌｙｓ　 、　Ａｒｇ−Ｌｙｓ　、　Ｌｙｓ−Ａｒｇ）は、選択されるテトラペプチドにお いて回避されなければならない。

しかしながら、これらの配列は、ＴＮＦリーダー配列中には存在せず、少なくと も完全なプロホルモンが膜内て表現されるまで分割されない４４゜しかしながら 、小ペプチドの塩基性を最大にするために、本発明者らは、Ａｒｇ及びＬｙｓ残 基の数を実質的に増加し、酸性アミノ酸残基、Ａｓｐ及びＧｌｕの使用を減少さ せることを提案している。より詳しく言うと、全ての２のアミノ酸残基中のＡｒ ｇまたはＬｙｓを含むペプチドは、上記のテトラペプチドにおいて好ましい。

増加した塩基性が、ＴＮＦの高められた細胞毒性の主な理由である場合には、本 発明者らは、このペプチドがまた細胞毒性を高めることを仮定する。Ｎ末端領域 における増加された塩基性が細胞毒性を高める主な理由であるという概念を試験 するための簡単な方法を与えることの他に、Ｌｙｓ−［１ｅ−Ｌｙｓ−Ｍｅｔテ トラペプチドは、リポソームＴＮＦ　（目的Ｃ，）の開発に有用である脂肪酸側 鎖の活性化されたエステル（目的す、）による化学的アシル化のだめのより優れ た受容部位を提供することもできる。

Ｎ末端領域中の塩基性をさらに増加するために、ＡｒｇまたはＬｙｓ残基を有す る長いペプチドをＮ末端領域に添加することができることか提案される。すでに 説明したように、塩基性ペプチドを生成するためのアミノ酸残基の多くの異なる 組み合わせかある。小ペプチド中の残基の塩基度を最大にするために、Ａｓｐ及 びＧｌｙのような酸性アミノ酸残基における場合と同様に、一対の塩基性アミノ 残基（例えば、Ａｒｇ及びＬｙｓ　）は回避されることが提案される。全ての２ つのアミノ酸残基においてＡｒｇまたはＬｙｓを含むペプチドは、特に好ましい 。例えば、Ａｒｇ−１１ｅ−Ａｒｇ−ＭｅｔまたはＬｙｓ−ｌｉｅ−Ｌｙｓ−Ｍ ｅｔに対応するオリゴヌクレオチドは、単一ユニットとして使用されることがで きる。オリゴヌクレオチドがＴＮＦをコードするｃＤＮＡに連結されている場合 は、１のモノマーが１のテトラペプチドを生成し、同様に二量体がオクタペプチ ドを生成する。このようにして、Ｎ末端領域においてＡｒｇ及び／またはＬｙｓ に富む４．８または１２の延長されたアミノ酸残基を有する一群の組換えＴＮＦ を生成することができる。

テトラペプチドＡｒｇ−１１ｅ−Ａｒｇ−Ｍｅ　ｔの添加はＴＮＦの細胞毒性を 増加させることが示されているが、ペプチドがＴＮＦのＮ末端にどのくらい長く 延長されるかについては明白でない。長ペプチド（例えば、特に１２またはそれ 以上のアミノ酸）の添加は、ＴＮＦ及びその受容体の相互作用にステアリン酸の 立体障害を与えるかまたは機能性ＴＮＦの三量体を生成をもたらし得る。しかし ながら、テトラペプチドの添加から得られた有望な結果は、ＴＮＦのＮ末端領域 における塩基性アミノ酸残基の延長をさらに促進する。

ｂ、ＴＮＦの親油性付加物の開発 ＴＮＦの親油性付加物は、多くの種々の化学的及び生化学的方法に従って製造さ れることができる。本発明者らは、本明細書において、これらのＴＮＦの親油性 付加物を提供する少なくとも３つのこれらの方法を提供する：　（１）脂肪酸に よる化学的アシル化；　（２）インシテウでのミリスチル化及び（３）インビト ロでのトランスメンブラン配列によるＴＮＦのアミノ末端のタギング。

ｂ、１．脂肪酸による化学的アシル化 本研究の目的はセクションＡにおいて開示されたように十分進歩している。これ らの研究において示されている困難の１つは、化学的アシル化により負う生物活 性の実質的損失を軽視することである。この損失は、明らかに、アミノ官能基の 損失により直接に、及び増加する疎水性の置換基の導入の両者により生じる。こ の実験の目的は、生物活性の損失を克服するための戦略を開発することにある。

ヘキサン酸基（Ｃ６）により置換されたＴＮＦは、カプリル酸（Ｃ８）により修 正されたＴＮＦよりも生物活性を同等またはそれ以上に保持することができると 仮定される一方で、本発明者らは、この目的の実験における仮説を試験すること を企図している。しかしながら、疎水性の増加は活性の損失をもたらすことが一 般的に観察されている。ＣＩ　−ＴＮＦが完全に活性か否かを測定したら、本発 明者らは、目的Ｃにおいて記載したように　Ｃ１による調製物をそのリポソーム 結合能力について特性化するであろう。

重要な論点は、ＴＮＦの最も反応性の高いアミノ間官能基の特性である。本発明 者らは、ｌ）天然ＴＮＦ。

２）適度に（１〜３残基）アセチル化されたＴＮＦまたは３）完全に（〜１２残 基）アセチル化されたＴＮＦのいずれかのＮ末端アミノ酸測定によりこれを処理 するであろう。Ｎ末端バリンが最も反応性が高い場合には、調製物２及び３が、 アセチル化の正確な程度及び誘発された異成分に応じて、弱いシグナルを与える かまたはシグナルを与えないはずである。リシル残基が好ましい最初の標的であ る場合には、調製物１及び２は同等であり、３は弱められたシグナルを与えるは ずである。３が通常のＮ末端バリンシグナルを与える場合には、モノマーあたり わずか４つのリシル残基がこのような条件下で反応することを示唆している。重 要な結論は、今日までに特性化された５ＵＶ−ＣＩ−ＴＮＦ調製物は、前ＴＮＦ がエフェクター細胞膜上て表示された方法では、ＴＮＦ分子を表示しないという ことである。

本発明者らが天然ＴＮＦのために採用し成功した解決方法は、目的ａ、において 開発された第２世代のＴＮＦに拡大される。例えば、塩基性置換基（Ａｒｇまた はＬｙｓ）または延長を、好ましい生物学的特性を与えるフレキシブルなアミノ 末端中またはアミノ末端へ導入するときには、新規なリシル側鎖または新規アミ ノ末端をアシル化する機会か生じる。この解決方法は、レセプター結合としての このような研究によるより不自然でないＴＮＦ変異体の領域での脂質への結合を 可能にすることができるので、成功すると仮定される。

上記に記載の解決方法は、天然ＴＮＦによる本実験に基づいて、実施可能性が高 い。ＴＮＦ変異体の選択の優先度は′、その開発の容易性、遊離体としての生物 学的性質及び新規アシル化部位の演鐸的処理を包含するいくつかの要素を基準と する。

ｂ、２．インシトゥのミリスチル化 エフェクター細胞膜中の前−ＴＮＦのベクター表示は、成熟タンパク質がそのア ミノ末端を介して〜２０のアミノ酸セグメントに、次いでそれによって〜２５残 基のトランスメンブランドメインに結合するようになっている。

最もアシル化が可能なアミノ基の定義（目的す、１）はまたなされておらず、Ｎ 末端バリンを含み得るが、いくらかの異成分は、残基の部位及び数の両者に関し て確実である。プレカーサーに関して見出された方法と類似の方法で、リポソー ム中／上の成熟タンパク質を表示するために、Ｎ末端における脂質の特異的導入 が望ましい。この実験の目的は、その末端においてミリスチル化シグナルをコー ドするＴＮＦｃＤＮＡにヌクレオチド配列を導入することを介して行うことであ る。ＴＮＦにおいてこの領域は顕著な構造上の制約により結合されるようである ので３４．５５、本発明者らは、ｐ２１Ｒａｓ中に見られるパリミチル化のよう なＣ末端付近の不安を回避した５４゜ミリスチル化シグナルをプロト腫瘍遺伝子 生成物ｐ２ＩＲａｓに導入するための一般的戦略はバスらにより記載されている ５６゜本発明者らは、ＴＮＦ構造物の製造におけるこの一般的戦略の修正を提案 する。第１の構造物は、Ｒａ５Ｖ”のアミノ末端配列の最初の１１のアミノ酸を コードするｃＤＮＡを、１５７アミノ酸成熟ＴＮＦタンパク質をコードするもの に結合することによって得られる。ＮＩＨ／３Ｔ３細胞は、トランスフェクショ ンのための適当な標的であり、従って本発明者らは、成熟ｃＤＮＡ並びに全長の 親画−ＴＮＦｃＤＮＡの両者を表現するために使用されている同じ方法を採用す る。参照用の成熟ｃＤＮＡにおいて、トランスメンブランドメイン及びトランス メンブラン領域を成熟タンパク質に接合するドメインがトランケートされる。共 トランスフェクションの成功は、与えられたＧ４１８に対する耐性と、出願人の 実験室において入手可能な０Ｐ−標識されたＴＮＦプローブによるサザンプロッ トにより証明される。

タンパク質の表現は、上清中において、バイオアッセイ、ＥＬＩＳＡ及び免疫沈 殿／ウェスタンプロットによリモニターされ、〜１８．５　ｋＤの生成物が予想 される。しかしながら、所望の期待される局在化は、膜内であるので、本発明者 らは亜細胞性の局在化及び推定リポタンパク質の往来の特性化の用意をする。タ ンパク質を２Ｈ−ロイシンまたはｌ５ｓ−システィンにより標識しくメチオニン は成熟ＴＮＦから存在しない）、ミリスチル化された付加物を３〜ミリスチン酸 による代謝標識により検出する：粗膜−含有画分を低浸透圧分解−超遠心分離に よりシトツルから分離される。シトツル中で合成されたが、本発明者らは、ミリ スチル化タンパク質は膜と迅速に会合すると仮定している。タンパク質が実際に 膜−会合されたら、その方向は前−ＴＮＦとは反対または同じであることができ る。これは、下記に概要を示すいくつかの解決方法（ｉ＝ｉｖ）により測定され る。

ｉ、タンパク質の加水分解 融合性の放射能標識された３Ｔ３トランスフエクタントをＤＰＢＳにより洗浄し 、次いで３７゛Ｃで種々の長さの時間のトリプシン処理に付し、細胞生存能力を 維持していることを予め測定する。この上清及び膜画分を免疫沈殿／ウェスタン プロットにより分析し、膜−局在化したミリスチル化ＴＮＦからのタンパク質の 分割を評価する。これが生じている場合には、ペレット化可能な抽出物は、タン パク質または脂質を介して標識されることができる高速に可動するバンドを示す はずである：上清はタンパク質の加水分解フラグメントを示すてあろう。

ｉｌ、細胞表面ＲＩＡ ３Ｔ３トランスフエクタントは、生長して集合し、パラホルムアルデヒドによる 化学的固定化に付される４２４３．４＃０第一のラビット抗ヒ１−ＴＮＦ抗血清 を、固定化された単分子層上で種々の希釈度においてインキュベートし：負の対 照は前免疫血清である。　１′Ｉ−タンパク質Ａを添加して、結合された第１抗 体を検出し、上記の負の対照及び正の対照、管腔内の成熟ＴＮＦにより通常の前 −ＴＮＦを表現する我々の３Ｔ３トランスフエクタントと比較される。

ｉｉｉ、細胞表面放射性ヨー素化 ３Ｔ３トランスフエクタントを、ｌ０ＤＯ−ＧＥＮ方法による細胞表面放射性ヨ ー素化に付す。放射性標識された細胞溶解物の膜画分を免疫沈殿化／ウェスタン プロットに付す。ミリスチル化されたＴＮＦが、細胞質に方向を合わせているな らば、顕著なシグナルが存在することが仮定される。しかしながら、それが管腔 に方向を合わせているならば、〜１８．５　ｋＤにおけるバンドが明らかである 。親画ＴＮＦｃＤＮＡを表現するトランスフエクタントは、正の対照であり、２ ６ｋＤにおいて放射性ヨー素化されたバンドを示す。

ｉＶ、蛍光活性化された細胞選別機（ＦＡＣ３）を使用する細胞表面タンパク質 の検出 集密的３Ｔ３トランスフエクタントをＰＢＳにより洗浄し、０．１　ｍＭＥ　Ｄ 　Ｔ　Ａ、ｐＨ８により再懸濁した。ＰＢＳ中においてさらに洗浄した後、この 細胞をＴＮＦに対する第１モノクローナルＡｂとともにインキュベートし、次い て、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）−接合されたラヒット抗マ ウス抗体とともに３０分間インキュベートする。正の蛍光の百分率を、ＥＰＩＣ ８、プロフィルｌ蛍光活性化されたフローサイトメーターを使用して測定した。

このミリスチル化されたＴＮＦ構造物の全体的な構造は、トランスメンプラン前 −ＴＮＦの顕著な特徴に反映する。後者において、成熟タンパク質は、そのアミ ノ末端を介して、〜２０アミノ酸ドメインを有する推定の疎水性固定手段に結合 されている；本発明者らの構造物において、成熟タンパク質は、約１１の残基の 配列を介して脂質基に同様に結合されることができる。しかしながら、リーダー 配列の類似の延長を包含するこの関係に非常に似ているその他の構造物を想定す ることができる。

バスら■の研究において、Ｒａ５Ｖ（５９残基）の１１残基セグメントまたは全 アミノ末端を使用した。興味深いことに、いずれかの構造物が、成熟ｐ２１Ｒａ ｓ遺伝子生成物にミリスチル化シグナルを与え、それが膜の結合を可能にした： しかしながら、前者のみが形質転換活性を有し、後者は有していなかった。これ らの結果は、タンパク質の不安定な構造または膜−会合された標的により変化し た相互作用によるものであると考えられる。

商業的生産： 細菌は同じシグナルを認識しないので、この戦略により製造されたミリスチル化 −ＴＮＦ付加物は非細菌（哺乳動物または酵母）抽出システムに特に適している ことと考えられる。代替的に、本発明と関連して使用されることかできる適当な 翻訳後の修正によるＴＮＦ変異体の製造方法が、昆虫細胞中のバキュロウィルス 表現システムである。この表現システムは、細菌表現システムが不可能な、機能 性後翻訳修正によるタンパク質の大規模の表現のために首尾良（使用されること ができる。このようなメンプラン結合されたタンパク質の単離方法は究極的には 、目的Ｃ１で要求されるように、リポソーム結合のリポソームを不安定にする洗 剤のような、汚染薬剤及び不純物を含まない環境下でこれらの付加物を単離しな げればならない。

ｂ、３．インシトウのトランスメンプラン配列によるアミノ末端のテーリング この研究の原理は、目的す、２のそれと非常に似ている：単核細胞／大食細胞− 表面上で見られるものと類似の方法で成熟ＴＮＦの親油性体を与えることである 。このセクションにおいて、脂質膜に対する親和性は、残基−４６〜−２１から 推定される前−ＴＮＦのトランスメンブランドメインに対応するアミノ酸配列に よってＴＮＦに与えられる。このドメインは〜２０のアミノ酸セグメントを介し て成熟タンパク質に結合されるので、またこのリンカ−は−１、＋１における分 割のわきの少なくともｌのタンパク質分解に付されるので、本発明者らは本発明 において提案される構造物中の可能な部位を除去することが最も好ましい。最も 好ましい構造物は、成熟タンパク質をそのアミノ末端を介して、脂質膜中での安 定な表示のために必要な最小の長さを有するアミノ酸の疎水性鎖に結合する。

最初の戦略は、本発明者らの経験及びｐＭＴｐＴＮＦＯＬＩと呼ばれる前−ＴＮ Ｆの変異対の開発によって導かれる。０Ｌ１ｃＤＮＡは、（１）成熟タンパク質 の通常の配列が保有されている、（２）推定トランスメンブランドメイン（−４ ６〜−２１）の約半分（残基−３２〜−２１）が除去されている、及び完全な天 然結合配列（−２０〜−１）が４つの新規の残基１１ｅ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌ ｕにより置換され、それにより知られた（−１、＋１）及び推定の分割部位を除 去するＴＮＦ変異体をコードするように一部設計された。ＮＩＨ／３Ｔ３０Ｌ１ トランスフエクタントの特性化は、（１）サザンプロットによって、〜９０ｂｐ の除去に相当するトランケートされたｃＤＮＡが明白であり、（２）これらのト ランスフエクタントは大食細胞様のエフェクター細胞として作用することができ 、共培養物中のＬ９２９細胞を溶解する、及び（３）これらのトランスフエクタ ントはそれらの上清中でＴＮＦ様活性を示すことを示す。

Ｃ２目的す、により生成された親油性ＴＮＦのリポソーム生成 この目的において使用される戦略に影響を与えるいくつかの教義がある。例えば 、単核細胞／大食細胞は接触−依存方法により腫瘍細胞を殺すＴＮＦの膜−形態 を採用することが知られている４ト４３、Ｓ＄。ＴＮＦの潜在的膜−形態が、こ の受容体に結合したトランスメンブランの前−ＴＮＦ若しくは成熟ＴＮＦである か、または両者であるかは不明である。いくつかの研究が前者のメカニズムを支 持している４４・４″・４０゜この議論はまだ解決されていないが、これらのエ フェクター細胞がそれらの殺腫瘍機能において、非常に高い用量のＴＮＦよりも はるかに能力があることには疑いがない。本発明者らは、リポソーム表面に結合 したＴＮＦの提示は、膜−結合したＴＮＦの挙動を特性化するための適当なモデ ルであると考える。

さらに、高効率でＴＮＦ−リポソーム調製物を処方する能力は、さらなる前臨床 評価及びそのような薬物担持複合体の将来の臨床応用のために必須である。デブ ズらトロにより既に報告された研究は、被包されたまたは表示された（会合され た）天然ｒＨｕＴＮＦであるＭＬＶ調製物を採用した。これらの調製物は非常に 低い効率を有するように構成された；例えば、天然ＴＮＦはわずか３．９％の効 率を有する前生成されたＭＬＶと会合した。

さらに、この及びその他のＭＬＶ−ＴＮＦ調製物の安定性。インビボの環境をま ねる生理温度または血清接触のようなインビトロの操作に対するＴＮＦの調製物 は報告されていなかった。しかしながら、毒性の減少並びに肺及び肝臓の優れた 標的化６は、さらにこれらのＴＮＦの形態物の開発を奨励する。

このセクションにおける本発明者らの優先性は、リポソームＴＮＦの処方の高効 率性の必要性及びリポソーム表面上にＴＮＦを示す要求によって口述されるであ ろう。

本発明者の目的は、親油性の武器を、成熟ＴＮＦまたは第２世代のＴＮＦへ（目 的ａ及びｂ）選択的に導入することと方向付けることによって、処方物の効率を 高めることにある。加えて、ＭＬＳよりもＲＥＳによる捕獲をより回避すること ができ、腫瘍細胞との衝突かより可能な担体としてのＳＵＶの使用は、初期の焦 点となる。しかしながら、ある場合において、促進されたリポソーム−ＴＮＦの ＲＥＳ媒介の取込みが望まれ、そのためＭＬＶ処方物がこれらの研究の一部とし て開発されることができる。

本発明者らの最初の実験は、目的す、１．に従って生成された親油性ＴＮＦ及び ＤＰＰＣのＳＵＶを採用している。これらの処方物は、室温において高効率で製 造され、分子篩による測定により結合相互作用を保持しながら、何日間に渡って ＤＰＢＳ中の保存に対して安定であった。

ＭＬＶ中のＤＰＰＣは、〜４１″Ｃの相転移温度を有しているが、ＳＵＶ中にお いて、高曲率の膜安定効果によって、〜３７°Ｃに低下する。５ＵＶ−Ｃ，−Ｔ ＮＦが、ＤＰＢＳ中の３７°Ｃにおける再クロマトグラフィーに付される場合に は、著しい結合損失が認められた。

上記の戦略に影響を与える主要な教義は、リポソームはＴＮＦを単核細胞／大食 細胞エフェクター細胞に類似した方向性の膜−環境中の標的に与えるというもの であるが、本発明者らは、インビボの実際のメカニズムは、代替的に、リポソー ム−捕獲されたＴＮＦは伝達の有効なモードとなり得ると考える。ＭＬＶにおけ る被包効率に与えるＴＮＦの増加した親油性の影響は、従って、本発明者らの研 究の一部として調査されることができる。

デブズ及び共働者らは、天然ＴＮＦは、その脂質組成物によって、２．０〜１１ ．４％の範囲の効率でＭＬＶ中に被包されることができることを報告している５ ゜これらの低効率は、脂質対タンパク質の大比率の単一の反応条件に対して測定 されている。本発明者らは、これよりも非常に高い効率でリポソーム（ＭＬＶＳ または５ＵＶ）により被包化または会合されることができることを提案する。さ らに、本調製物自体の実際のタンパク質対脂質比は重要である。本発明者らは、 結合条件を代えて、タンパク質／脂質比率を増加し、被包されたタンパク質の量 がプラトーになったときに測定することを提案する。目的す、により提案された 特定のＴＮＦの選択は、目的ｄ。

のこれらの変異体の前スクリーニングの結果に照して追加的に評価されることが できる。この研究において生成されたリポソーム−ＴＮＦのさらなる開発の優先 性は、今度は、処方物の効率及び安定性の因子により影響を受け得る。

ｄ、効力及び毒性モデルにおけるＴＮＦのインビトロの評価 この研究は、前述の３つの研究と完全に統合されることができる。例えば、目的 ａ、において製造された第２世代のＴＮＦをスクリーニングすることができる。

最も確実な有効性及び毒性特性を有するこれらの第２世代のＴＮＦは、目的す、 の開発のための最高の優先性を受けるものである。目的す、由来の親油性変異体 をスクリーニングしたら、次に最も確実で実施可能なキャンディデートを目的Ｃ ９のリポソーム処方物として製造することができる。これらは、次はそれらの効 力及び毒性について本明細書中に記載の方法により評価されることができる。

これらの調製物の効力は、標準アクチノマイシンＤ−処理されたＬ９２９細胞バ イオアッセイにより特異的活性によって一部評価されることができる。加えて、 通常の成熟ＴＮＦに耐性を有するものを包含する腫瘍細胞標的のパネルを採用す るアッセイ中において表現される活性を測定することができる。

これらの調製物はさらに、低血圧及びカヘキシーのインビトロモデルにおいて評 価されることができる。前者の副作用はフェーズ■／フェーズＩＩの臨床試験に おいて今日までに認められた用量−限定毒性である。この現象の分子的な根拠は 、近年一生懸命研究されているが、下記のインビボモデルは、インビトロでの記 載された最も顕著な特徴を具体化することを提案することができる。

そρ他のサイドキン、例えばＩＦＮ−ガンマと関連したＴＮＦは、内皮細胞中の 内生的−酸化窒素シンセターゼ経路を活性化する。−酸化窒素は内皮由来の弛緩 要素と同等であり３”−４０、形態学的及び機能的変化をもたらす。

これらの最も適当なものは、究極的には肺浮腫及び低血圧をもたらす隣接する内 皮細胞間の接合の不安定である。

本発明者らの目的は、インビトロで強い殺腫瘍効果を奏することができ、内皮細 胞毒性モデル中での最小の効果を有するリポソーム処方物を開発することにある 。これらの特徴が構造的に分離され得る場合はそれはやはり測定される必要があ る；しかし、カミジョ及びその共働者は細胞毒受容結合及び分化誘導活性は相関 関係になく、従って彼らが開発した一連のＴＮＦ変異体中の分離可能な特徴であ ることを示している！１０ 最後に、ＴＮＦ及び力へクチンは同じであるので、本発明者らは、３Ｔ３−Ｌｌ 脂肪細胞中のリポソーム処方物を、そのリポタンパク買上の阻害効果及び脂肪分 解における刺激効果について評価することができる。リポタンパク質の溶解物及 び脂肪分解活性の調査のための実験モデルは、フィールディングら１及びカワカ ミら・Ｏらにより開示されており、それらの文献はこの目的のために本明細書中 に特に採り入れられている。

ｄ、１．効力 本発明者らは目的す、１．から生成されたそれらの付加物及び目的Ｃ８から生成 されたそれらのリポソーム処方物に関して最近行っているのと同様に、上記実験 から得られたＴＮＦ調製物を最初に、標準のアクチノマイシンＤ−処理されたＬ −９２９標的細胞パイオア・ソセイにおいてその特異的活性を評価する。成熟タ ンパク質は、ＴＮＦ変異体、？ＮＦ″８ＡＭ２よりもこのアッセイにおいて能力 が劣っている；これは、その代り、高熱に関して通常のＴＮＦ−耐性ハツカネズ ミＥＭＴ−６乳房腺ガン細胞を使用するその他のアッセイでのその相対的能力と 相関関係があることが判明している。

インビトロの細胞毒効力はまた、親ＴＮＦとはその感受性が異なる誓歯動物とヒ トの通常の及び腫瘍の細胞のパネルを使用して評価される６！。本発明者らは、 重要な肺、結腸及び乳腫瘍を代表する特定のそれらのヒト細胞系を評価すること を提案する。１例を挙げると、これらの細胞系は、Ａ−５４９肺及びＬＳ１７４ Ｔ及びＷＩＤｒ結腸系を包含する１゜本発明者らは、次いで、これにＭＣＦ−７ 乳系２０及び結腸系Ｃｏ１ｏ２０５及びＣａＣｏ−２を加えることができる。そ れらの通常のＴＮＦ−耐性表現型は、ＴＮＦとともにＣ４５−またはＣａｒｂｏ −プラチナによる処理及び／または急性高熱により相乗的に可逆化されることが できる。

ｄ、２．毒性 ｄ、２．ｉ、低血圧−内皮細胞モデル 低血圧をもたらすＴＮＦ−媒介効果のためのこのモデルは最初に内皮細胞実験モ デルを採用する。キルホルン４１の文献は、特に内皮細胞モデルによる低血圧の 測定の一般的観点を提供する目的で本明細書中に参考文献とし１　て採り入れら れている。内皮細胞は、ＡＴＣＣから入手可能な系統であるウシ大動脈から得ら れることができる。

本発明者らは、この細胞系を、ＴＮＦまたは第２世代のＴＮＦ、またはそれらの 親油性修正物、または、その代り、それらのリポソーム処方物及び感受性用量の 組換え・　ＩＦＮ−ガンマとともにインキュベートすることを提案する。測定さ れるべき１つの特別の終点は、−酸化窒素シンセターゼ経路の活性化から蓄積さ れた亜硝酸塩であり得る。用量作用曲線は、各試験調製物に対して確立される。

最も好ましい結果は、親ＴＮＦと比較した試験ＴＮＦの塊当りの亜硝酸塩の生成 を低下するこれらの曲線内のシフトである。我々の団体の外科学助教授であるマ ークロー博士と協力して最近確立されたヒト肝臓内皮細胞系を含むその他の内皮 細胞モデルも試験される。

ｄ、２．ｉｉ、カヘキシーモデル 本発明者らは、カワカミらｌｏ及びツマら！７の方法を採用する。ＴＮＦ調製物 かりボタンバク質リパーゼの抑制及び脂肪分解の刺激に与える影響を、３Ｔ３− Ｌ！／含脂肪細胞において評価する。ツマ及びその共働者は、インビトロのこれ らの２つのアッセイから、ＴＮＦ−３ＡＭ２が、親ＴＮＦまたは２つのその他の ＴＮＦ変異体、Ｓ　ＡＭ＄及びＳ　ＡＭ４のいずれかよりも低いカヘキシー活性 を存していることを予言した２７゜興味深いことに、これらの４つのＴＮＦの急 性毒性がマウス中で測定された場合に、ＴＮＦ−８ＡＭ２は最も毒性が低かった ；しかしながら、親ＴＮＦは２つのその他のＴＮＦよりも毒性が高かった。

まとめると、上記にアウトラインを示した実験は、得られたインビトロの腫瘍毒 性の結果からクレームされた調製物の効力の基準を提供することが提案される。

最も確実であることが判明した第２世代のＴＮＦ　（即ち、特に親ＴＮＦに耐性 を有する腫瘍細胞系に対して、最も高度に活性であり、内皮細胞アッセイにおい て活性が低い）は、ヒト腫瘍の治療薬としての用途が提案される（予言的実施例 ９）。

予言的実施例９−提案されたヒト中のリポソーム−親油性ＴＮＦのインビボの用 途 この予言的実施例は、本明細書中に開示されたリポソーム−親油性腫瘍壊死因子 調製物がそれによってヒトにおいて使用され得るプロトコールを示すために提供 され、特に、インビボで、すでに存在する腫瘍の崩壊を実施するとともに、腫瘍 成長速度を減少し及び／または停止させるために提供される。

修正されたＴＮＦ−３ＵＶ及び修正されたＴＮＦ−ＭＬＶの両者の処方物が、抗 腫瘍及び抗ガン効果を与えると考えられる。修正されたＴＮＦ−ＳＵＶまたは修 正されたＴＮＦ−ＭＬＶの選択は、治療されるべき患者の特定の症状及び治療さ れる腫瘍の性質を研究する必要がある。例えば、腫瘍がすでに食細胞によって高 度に浸潤されている場合には、修正されたＴＮＦ−ＭＬＶ調製物は、有利に使用 されてＴＮＦを食細胞に富む組織に伝達する。

ＴＮＦを腫瘍に伝達する効果的な方法を提供することが期待されている。代替的 に、修正されたＴＮＦ−３ＵＶ調製物は、食細胞によって高度に浸潤された腫瘍 を持たない患者の治療には最も好ましく、有利に使用される。

これらの好ましいメカニズムは、分子の種々の組織等への身体の通常の生理学的 往来を利用している。

修正されたＴＮＦ　（増加した疎水性を有する）の増加した結合効率は、投与さ れたＴＮＦの比較的少量のみが循環において遊離で未結合の形態で存在すること を確実にするので、修正されたＴＮＦ−ＭＬＶ調製物は、インビボでＴＮＦに関 連する毒性副作用を減少すると仮定される。既に開示したように、本明細書中に 記載されたＴＮＦの修正物は、修正されたＴＮＦ分子の実質的に全てが、リポソ ームがＳＵＶであろうとＭＬＶであろうと、リポソームと会合するようにＴＮＦ 分子を作用させる。

本明細書中においてクレームされた小車−ラメラ小胞体（ＳＵＶ）として特に記 載されている、修正された腫瘍壊死因子調製物中で使用されるリポソームの減少 された寸法は、ＲＥＳによる捕獲をより良く回避することができる。この利点は 本発明者によって仮定され、この調製物を全身投与した時にリポソーム−腫瘍細 胞の衝突の機会を増加する。これにより、より大きなＭＬＶ調製物を使用して既 に報告された制限を克服することかてきるてあろう６゜ さらに、その外部表面上に腫瘍壊死因子を表示する小車−ラメラリポソームの開 示された処方物はさらに、インビトロで既に認められた殺腫瘍反応において活性 化された単核細胞／大食細胞により天然に採用された伝達の方法をまねるという 利点を提供する。しかしながら、ＭＬＶ中に被包された修正ＴＮＦは、上記の治 療的利点を与えることに有効であり、その腫瘍がすてに食細胞により大いに浸潤 された患者の治療において好ましい。例えば、修正されたＴＮＦ−ＭＬＶは好都 合に、腫瘍組織床に搬送される。

本ＴＮＦ−処方物の提案された治療学的用途によれば、親油性リポソームＴＮＦ 剤は、ＴＮＦ−反応性腫瘍を持つ患者に全身投与することが最も好ましい。例え ば腫瘍のサイズの減少により示される患者の症状の改善が検出されるまで、定期 的用量のリポソーム親油性ＴＮＦ調製物を、患者に連続的に投与する。ＴＮＦ調 製物のより正確な用量及びより詳しく明確にされた使用される治療計画を確立す るために、臨床試験及び動物実験は続けられるへきである。また、腫瘍の治療に おける臨床器具及び抗ガン剤としてリポソームＴＮＦを導入することは、開示し た戦略を使用して開始されることかできる。

文献 下記の文献は特に、本出願を通して示される特定の目的に対して直接関係のある 部分において、参考文献として本明細書中に採り入れられている。

１、Ｄａｃｋｅｒ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８７）、　Ｊ、　Ｉｘｍｕｎｏｌ、、 　１３＆（３）＝９５７−６２゜２、Ｅｓｐｅｖｉｋ　ａｔ　ａｘ、　（１９８ ７）、　ｘｘｍｕｎｏｘｏｇｙ、　６１：４４３　＋８＋］、ＢａＪｃｏｕｃｈ ａ　ａｔ　ａｌ、　（１９８８）、　Ｊ、　Ｉｘｍｕｎｏｌ、、　１４０：１１ ４２−７−４、　Ｋｒｉｅｇｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ、（１９８８１，Ｃａ１ｌ、５ ３：４５−５３゜５、　Ｄ＠ｂｓ　ａｔ　ａｌ、（１９８９）、Ｊ、ＩｒＭｎ１ ｎｏ１．、　４１３：ｕり２−７゜６、Ｄ＠ｂｓ　ａｔ　ａｌ、　（１９９０１ ，Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、、　５０：３７５−８０−７、　Ｕｔｓｕｍｉ　ａｔ 　ａｌ、（１９８８）、ＦＥＥＥ；　Ｌａｔｔｅｒｓ、２３Ｅ１（１）：１コー ６゜８、Ｕｔｓｕｍｉ　ａｅ　ａｌ、　（１９９０１，Ａｇｒｉｃ−Ｅｉｏ、Ｃ ｈｅｗ−、５４（１）：２５−９、Ａｎｄｏ　ｅｔ　ａｌ、　（１９９０）、　 ＦＥＥＥ；　Ｌｅｔｔｅｒｓ、　２ａＯ（ｌ、２）＝２ｘ６−２０゜ｘＯ，Ｔｅ ｒａｄａ　（１９８８）、　Ｃａ１ｌ　５ｔｒｕｃｔｕｒｅ　ａｎｄ　Ｆｕｎｃ ｔｉｏｎ、　１３：３５９−７１゜ ＩＬ　ｌｆＰ工　Ａｃｅ　Ｎｏ：８９−３１１１２０／４コ　（ＥＰ８９　コ０ ２７１２）　−−Ｓｈａｒｗｉｎ。

Ｓ、Ａ＋（１９８８１ １２、ｏｌｄ　（１９ｓｓ）ｓｃｉｅｎｃｅ、２３０：６３０−６３２゜１：Ｉ 　０１ｉｆｆ　ａｔ　ａｌ、　（１９８７）、　Ｃａ１−１．５０＝５５５−５ ６３゜１４、Ｚｉｗｅｒｍａｎ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８９）、　Ｃａｎｃｅｒ 　Ｒｅ５−、４９：６５２１−６５２Ｂ。

１５、Ｋｎａｕｆ　ｅｅ　ａｌ−（１９８８１，Ｊ、　Ｂ１１１．　Ｃｈｅｎ、 、　２６３：１５０６４−１６、　Ｋａｔｒｅ　ｅｔ　ａｌ、（Ｌ９８〕ｌ、Ｐ ｒ０Ｃ，Ｎａｔｌ、ＡＣａｄ、５Ｃ１−ＵＳＡ。

＆４：１４８７−１４９１゜ １フ、　Ｇｏｏｄｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、（１９９０）、Ｂｉｏｔａｃｈｎｏｌｏ ｑ５ｒ、ｌＪ：３４コーコ５６゜１Ｂ、Ｄａｖｉｓ　ｅｔ　ａＪ、　（１９８０ ）、　Ｉｎ：　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ　Ｐｏｌｙｍｅｒｓ、　ｐ。

４４１、ＡＣａｄｅｆｆｌｉＣｐｒｅｓｓ、ＮｅＷ　ＹＯｒ）Ｌ１９、Ｋａｔｒ ｅ、　Ｎ、Ｖ、（１９９０）、　Ｊ、　ＩｍｍｕｎｏＬ、　：Ｌ４４：２０９− ２１３−２０、　Ｏｌｄ　（１９９０１、Ｉｎ：　Ｔｕｍｏｒ　Ｎｅｃｒｏｓｉ ｓ　Ｆａｃｔｏｒ：　！；ｔｒｕｃｔｕｒｅ。

Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ　ｏｆ　Ａｃｔｉｏｎ、　Ｒｏｌｅ　ｉｎ　Ｄｉｓｅａｓｅ 　ａｎｄ　Ｔｈｅｒａｐｙ、　ｐ。

１　（Ｋａｒｇａｒ、Ｂａ５ｅｌｌ。

２Ｌ　Ｆｒａｎｓｅｎ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８５）　、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａ ｃ１ｄ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ。

１：４４１７−４４２９゜ ２２−　Ｐ＊ｎｎ１ｃａ　ａｔ　ａｌ、　（１９８５）、　Ｐｒｏｃ、　Ｍａｔ ｅ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、、　Ｕ！；Ａ。

Ｂ２：６０６０−６０６４゜ ２３、Ｋｕｌｌ　ａｔ　ａｈ　（１９８４）、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ−Ａｃａ ｄ、　５ｃｉ−、１７ｓＡ。

８：Ｌニア９３２−７９３６＋ ２４、工ｔａｈ　ａｔ　ａｌ、（１９８６）、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈａｘｒ、、　 ９９：９−１５−２５、Ｅｃｋ　ａｔ　ａｘ、（１９８８）、　、ｙ、　Ｂｉｏ ｌ、　ｃｈｅｍ−、２６３：Ｌ２１ｎ６−１２ＳＬ９゜２６、５ｏｒｎａ　ａｔ 　ａｌ、（１９１７ン、Ｂｉｏｃｈａｘ、Ｅｉｏｐｈｙｓ、Ｒａｓ、Ｃｏｍｎｕ ｎ、。

１４Ｂ：６２９−６３５＋ ２７、ＳＯｍａ　ａｔ　ａｌ、（１９８８）、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｒａ５ｐ、 　Ｍｏｄ、、７：５８７−７９５゜２８、Ｇａｔａｎａｇａ　ａｔ　ａｌ、（１ ９８９）、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｒａ５ｐ、　Ｎｏｄ、、　ＪＩ：２７８−２８ ６゜ ２９、Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ　ａＣａ１．　（１９８５）、　Ｊ、　Ｍａｔｅ、　 （”ａｒｚｃｅｒ　Ｉｎ５ｔ、。

コＯ，Ｃｒａａｓａｙ　ａｔ　ａＪ＋　（１９８７）、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｍｓ、 、４７：１４５４４９゜コＬ　Ｋａｍｉｊｏ　ａｔ　ａｌ、（１９８９）、Ｅｉ ｏｃｈｅｘｎ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ。

Ｃｏｍｘｒｕｎ、、ＭＯ＝８２０−８２７゜コ２．　Ｃａｒｓｗ＠Ｌ１　ａｔ　 ａｌ、（１９７５）、Ｐｒｏｃ−５ａｔｅ、Ａｃａｄ、ｓｃｉ、ＵＳＡ。

７２：３６６６−３６７０゜ ココ−Ｂａａｕｔｌａｒ　ａｔ　ａｌ、（１９８６）、Ｎａｔｕｒｅ、３２０： ５８４−５８９゜コ４．　Ｏｓ仁ｔｑｅｎ　ａｔ　ａｌ−（１９８７）、Ｉｎ： 　Ｉｍｐｏｒｔａｎｔ　Ａｄｖａｎｃｅｓ　ｉｎＯｎｃｏｌｏｇｙ、　Ｐｈ１ｌ ａｄｅｌｐｈｉａ、　Ｊ−Ｂ、　Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ　Ｃｏ、、　１０５−３ ５、　Ｂ１１ｃｋ　ａｔ：　ａｌ、（１９８７）、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、、４ ７：２９８６−２９８９゜３６−　Ｋｌａｕｓｎａｒ　Ａ、（１９ｓ７）、　Ｅ ｉｏｔａｃｈｎｏｌｏｇｙ、　５：３３５−３＜１＋コア、　Ｔａｇｕｃｈｉ、 ？、（ｌり８６）、Ｊｐｎ、Ｊ、Ｃａｎｃｅｒ　Ｃｈａｍｏｔｈｔｓｒ、。

１３；コ４９１−コ４９８＋ ３８、Ｋ１１ｂｏｕｒｎ　ａｔ　ａｌ、（１９９０）、　Ｐｒｏｃ−Ｎａｔｌ、 　Ａｃａｄ、　！；ｃｉ、、１Ｊ５Ａ。

８７：３６２９−３６３２゜ ：１９．　Ｐａｌｍｅｒ　ａｔ　ａｌ−（１９８８）、Ｎａｔｕｒｅ、３３３： ６６４−６６６゜４０、　工ｑｎａｒｒｏ　ａｔ　ａｌ、（工９８７Ｊ、Ｐｒｏ ｃ−Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ−Ｓｃｉ、、（ＪＳＡ。

Ｂ４：９２６５−９２６９゜ ４１　Ｋ１１ｂｏｕｒｎ　ｅｔ　ａｌ＋　（１９９０）、Ｊ、Ｐｌａｔｌ、Ｃａ ｎｃｅｒ　Ｉｎ５ｔ、。

Ｂ２：１１２−７７６− ４２、ＫＬｏｓｔｅｒｇａａｒｄ　ｅｔ　ａｌ、（１９９０１，Ｊ、　Ｌａｕｋ ｏｃｙｔｅ　Ｂｉｏｌ、。

４Ｂ：２２０−２２Ｂ− ４３、Ｄａｃｋｅｒ　ｅａｔ　ａｌ、　（１９８７１，Ｊ、　Ｉｎｕｎｕｎｏｌ 、、　１３ｇ：９５７−９６１゜４４、Ｋｒｉｅｇｌａｒ　（１９１１８）　Ｃ ａ１ｌ、　５Ｊ：４５−５３゜４５−　Ｌｕａｔｔｉｇ　ａｔ　Ｂ２−　（１９ ８９）、Ｊ、Ｉｍｎｍｏｌ、、１４３：４０コ４−４ｏコ８゜４６−　Ｅｓｐ＊ ｖｉｃｋ　ｅｅ　ａｌ−（１９８７）、　Ｉｍｒｕｎｏｌ、、　６１：４４３− ４４８゜４７、Ｊｏｎａｓ　ａｔ　ａｌ、　（１９８９）、　Ｎａｔｕｒｅ、　 ３３ａ：２２５−２２８＋４８、Ｋｌｏｓｔ＠ｒｇａａｒｄ　ａｅ　ａｌ、　（ １９５１７）、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、、　４７＝２０１４−４９、Ｌａｐｉ ｄｏｔ　ａｔ　Ｂ２−　（１９７（１，Ｊ、　Ｌｉｐｉｄ　Ｒａｓ、、　８：Ｌ ４２−１４５−５０、Ｒ＠ｍ１ｅｋ　ａｔ　ａｌ、　（１９８７］、　Ｌａｂ　 Ｉｎｖｅｓｔ、、　５６：５０３−５９０−５Ｌ　Ｔｒａｃ＠ｙ　ａｔ　ａｌ、 　（工９８６］、　５ｃｉｅｎｃｅ、　２３４：４７０−４７４゜５２、５ｈｅ ｐａｒｄ　（１９８Ｂ）、Ｊ、Ｃ１１ｎ−１ｍｍｕｎｏ１．、　８：コ３コー３ ４１゜５３、　５ｂｏｒｔｉａ　ａｔ　ａｌ、　（１９８２）、　Ｐｒｏｃ、　 Ｎａｔｌ−Ａｃａｄ、　５ｃｉ−、ＵＳＡ。

７７：５３フ５〜５３７９゜ ５４＋Ｗｉｌｌｕｍｓ＠ｎ　ａｔ　ａｌ、　（１９８４）、　Ｎａｔｕｒｅ、　 ３１０：５８３−５８５゜５５、　Ｓｏｍａ　（１９９０）、Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｅ ｘｐ、Ｒｅｄ、、１５２＝５８９−５９３゜５６、Ｂｕｓｓ　ａｅ　ａｌ、　（ １９８９）、　５ｃｉｅｎｃｅ、　２４３：１６００−４６０３゜５７、　Ｒａ ５ｈａ＊ｄ　ａｔ　ａｌ、（１９８コ）、Ｓｃｉｔａｎｃｍ、２２１：Ｌ５５− １５８−５Ｂ、Ｒｏｈ　ａｔ　ａｌ、　（１９９０）、　！；ｕｒｇａｒｙ、　 １０８：４００−４０５゜５９、Ｆｉｅｌｄｉｎｇ　ａｔ　ａｌ、　（ｘ９７７ ）、　Ａｒａｃｈ、　Ｐａｔｈｏｌ、　Ｌａｂ、　Ｒｅｄ、。

１０１：２２５−２２９゜ ６０、　Ｋａｖａｋａｍｉ　ａｔ　ａｌ、（１９８７）、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｒｎ 、、１０１：３３ニー３３８゜反応特開 レーン→１２Ｂ４５ 分−０５１０３０３６０ ＮＧ２ Ｃ２−エステルだＮＦ ０　２．５　５　１０　２０４０　８０１６０Ｃ２−エステル／ＴＮＦ 平均の修正された残基 修正された残基 修正された残基 活性エステル アシル化後の回収 修正された残基 画分番号 画分番号 タンパク質濃度 Ｃ８−１８ＴＮＦのアシル化 天然　８　１０　１２　１４　１６ Ｃ８−１８ＴＮＦのアシル化 天然　８　１０　１２　１４　１６　１８Ｃ−８（Ｘ５）−リポソーム 画分番号 画分番号 Ｃ２−Ｘ５−リポソーム結合 Ｃ１４−リポソーム再ゲル濾過 Ｃ−８（ｘ５）　−ＴＮＦ−リポソームの細胞死滅活性タンパク質濃度　（ｎｇ ／　ｍｌ） Ｃ−８（ｘ　ｌ　Ｏ）　−ＴＮＦ−リポソームの細胞死滅活性タンパク質濃度　 （ｎｇ／　ｍｌ） タンパク質濃度（ｎｇ／ｍ１） Ｃ８−パイオゲンーＤＳＰＣ−リポソームＴＮＦの細胞死滅活性タンパク質濃度 （ｎｇ／ｍｌ） 補正書の写しく翻訳文）提出書（曲ｍ１ｊ１１８４条）８　）

Claims (42)

【特許請求の範囲】
1. １．腫瘍壊死因子のアミノ残基が修正されている細胞溶解活性を有する修正され たＴＮＦ。
2. ２．腫瘍壊死因子のＮ末端アミノ基またはリシンアミノ基が修正されている請求 の範囲第１項に記載の修正されたＴＮＦ。
3. ３．腫瘍壊死因子のアミノ残基が修正されて脂肪酸を含む請求の範囲第１項また は第２項に記載の修正されたＴＮＦ。
4. ４．腫瘍壊死因子の５未満のアミノ残基が修正されて脂肪酸を含む請求の範囲第 ３項に記載の修正されたＴＮＦ。
5. ５．ＴＮＦの約１〜３のアミノ残基が修正されて脂肪酸を含む請求の範囲第４項 に記載の修正されたＴＮＦ。
6. ６．修正されたアミノ残基がリシンアミノ残基である請求の範囲第５項に記載の 修正されたＴＮＦ。
7. ７．ＴＮＦの修正されたアミノ残基が、脂肪酸を腫瘍壊死因子に結合するリシル 側鎖を含む請求の範囲第６項に記載の修正されたＴＮＦ。
8. ８．脂肪酸が、ＴＮＦをリポソームに結合して、リポソーム親油性ＴＮＦを与え る請求の範囲第５項に記載の修正されたＴＮＦ。
9. ９．ＴＮＦリシル側鎖における脂肪酸が、ＴＮＦとリポソームを少なくとも５０ ％の効率で会合することができる請求の範囲第８項に記載の修正されたＴＮＦ。
10. １０．リポソームが、小単−ラメラ小胞体または多重ラメラ小胞体である請求の 範囲第９項に記載の修正されたＴＮＦ。
11. １１．ＴＮＦが、リポソーム表面において会合されるかまたはリポソーム内に被 包される請求の範囲第８項に記載の修正されたＴＮＦ。
12. １２．リポソームが、リン脂質からなる請求の範囲第８項に記載の修正されたＴ ＮＦ。
13. １３．リン脂質が、ＤＳＰＣまたはＤＰＰＳである請求の範囲第１２項に記載の 修正されたＴＮＦ。
14. １４．５未満の修正されたアミノ残基を有するｒＨｕＴＮＦ調製物であって、前 記アミノ残基がさらに修正されて脂肪酸を含み、前記ｒＨｕＴＮＦ調製物がリポ ソームと１００％の結合効率で会合することができるｒＨｕＴＮＦ調製物。
15. １５．約１〜３の修正されたアミノ残基を有する請求の範囲第１４項に記載のｒ ＨｕＴＮＦ調製物。
16. １６．下記工程： 一定量の腫瘍壊死因子と、十分量の脂肪酸のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエス テルとを、一定容量の親油性ＴＮＦ調製物を生成するために十分な時間反応させ て；親油性ＴＮＦ分子と高効率で結合することができる一定容量のリポソームを 処方し；次いで、一定容量のリポソームを、十分量の親油性ＴＮＦ調製物ととも に、アセチル化されたＴＮＦがリポソームに結合するために十分な時間インキュ ベートし、リポソームー親油性腫瘍壊死因子の処方物を与えるを含む、５０〜１ ００％の効率でリポソーム親油性ＴＮＦを製造する方法。
17. １７．腫瘍壊死因子が、組換えヒト腫瘍壊死因子である請求の範囲第１６項に記 載の方法。
18. １８．脂肪酸が、８〜１４の炭素原子の炭素鎖長を有する脂肪酸を含む請求の範 囲第１６項に記載の方法。
19. １９．腫瘍壊死因子が、脂肪酸のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルと、約 ２６℃で約３時間反応する請求の範囲第１６項に記載の方法。
20. ２０．リポソームが、中性脂質を含む請求の範囲第１６項に記載の方法。
21. ２１．中性脂質が、リン脂質である請求の範囲第２０項に記載の方法。
22. ２２．リン脂質が、ＤＰＰＣまたはＤＳＰＣである請求の範囲第２１項に記載の 方法。
23. ２３．リポソームが、０．０２〜０．５μｍの直径を有する請求の範囲第２１項 に記載の方法。
24. ２４．リポソーム会合された腫瘍壊死因子調製物が、リポソーム調製物１モル当 り約０．５モルの腫瘍壊死因子の比率からなる請求の範囲第１６項に記載の方法 。
25. ２５．修正された腫瘍壊死因子が、リポソームの表面と会合している請求の範囲 第１６項に記載の方法。
26. ２６．リポソーム表面に結合された修正された腫瘍壊死因子分子を含む腫瘍壊死 因子の薬理学的に許容され得る調製物であって、腫瘍壊死因子が修正されて脂肪 酸を含む調製物。
27. ２７．リポソームが、約０．０２〜０．０５μｍの直径を有する小単−ラメラ小 胞体である請求の範囲第２５項に記載の腫瘍壊死因子の薬理学的に許容され得る 調製物。
28. ２８．腫瘍壊死因子分子が、修正されたアミノ残基を含む請求の範囲第２６項に 記載の腫瘍壊死因子の薬理学的に許容され得る調製物。
29. ２９．腫瘍壊死因子の５未満のアミノ残基が修正されて脂肪酸を含む請求の範囲 第２８項に記載の腫瘍壊死因子の薬理学的に許容され得る調製物。
30. ３０．腫瘍壊死因子の約１〜３のアミノ残基が修正されて脂肪酸を含む請求の範 囲第２６項に記載の腫瘍壊死因子の薬理学的に許容され得る調製物。
31. ３１．修正された腫瘍壊死因子分子が、８〜１４の炭素の炭素鎖長を有する脂肪 酸を含む請求の範囲第２６項に記載の腫瘍壊死因子の薬理学的に許容され得る調 製物。
32. ３２．脂肪酸が、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸またはミリスチン酸であ る請求の範囲第３１項に記載の腫瘍壊死因子の薬理学的に許容され得る調製物。
33. ３３．脂肪酸が、カプリル酸である請求の範囲第３１項に記載の腫瘍壊死因子の 薬理学的に許容され得る調製物。
34. ３４．下記： 腫瘍壊死因子受容腫瘍を有する患者を同定し；腫瘍−阻害投与量のリポソームー 親油性の修正された腫瘍壊死因子調製物を、 患者に投与し；次いで、 患者の症状の改善が認められるまで、腫瘍−阻害投与量のリポソームー親油性の 修正された腫瘍壊死因子により患者を毎日治療すること を含む患者の腫瘍を治療する方法。
35. ３５．リポソームー親油性の修正された腫瘍壊死因子が、５未満のアミノ残基に おいて修正された腫瘍壊死因子分子からなり、脂肪酸が、８〜１４の炭素の炭素 鎖長からなる請求の範囲第３４項に記載の方法。
36. ３６．リポソーム親油性の修正された腫瘍壊死因子が、約１〜３のアミノ残基に おいて修正された腫瘍壊死因子からなる請求の範囲第３４項に記載の方法。
37. ３７．修正された腫瘍壊死因子の１〜３のアミノ残基が、８の炭素の炭素鎖長を 有する脂肪酸を含む請求の範囲第３６項に記載の方法。
38. ３８．脂肪酸が、カプリル酸である請求の範囲第３７項に記載の方法。
39. ３９．リポソームー親油性の修正された腫瘍壊死因子が、その表面と会合した修 正された腫瘍壊死因子を有するリポソームであり、そのリポソームが小単−ラメ ラ小胞体からなる請求の範囲第３４項に記載の方法。
40. ４０．リポソームー親油性の修正された腫瘍壊死因子の投与が全身的である請求 の範囲第３４項に記載の方法。
41. ４１．リポソームー親油性の修正された腫瘍壊死因子が、Ｎ末端アミノ基または リシンアミノ基において修正された腫瘍壊死因子分子である請求の範囲第３４項 に記載の方法。
42. ４２．修正された腫瘍壊死因子分子が、脂肪酸と結合することができる請求の範 囲第４１項に記載の方法。