JPH06501610A - Ｂｃｒ−ａｂｌ遺伝子発現のリボザイム阻害 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 １１、ｂｃｒ−ａｂ＋融合ｍＲＮＡを開裂するのに有効なりボザイム遺伝子を発 現する真核細胞。

１２、前記の細胞が大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）４［Ｂ胞である請求項９に記載の真 核細胞。

１３、図７に示したプラスミドｐｈβ−リボザイム。

明　細　書 ＢＣＲ−ＡＢＬ遺伝子発現のりボザイム阻害艦盟の立社 本発明は、ｂｃｒ−ａｂ１遺伝子発現のりボザイム阻害およびｂｃｒ−ａｂｌ遺 伝子を有する白血病細胞の増殖を阻止するこのようなりボザイム阻害の使用、ｂ ｃｒ−ａｂｌｉ１台ｍＲＮＡに対して向けられたりボザイム遺伝子がトランスフ ェクトされており且つ多量のりポザイム含有遺伝子を得ることができる大腸菌（ Ｅ、ｃｏｌｔ）に関する。

本発明は、更に、ＰｈＩＴ慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）または急性リンパ芽球性 白血病（ＡＬＬ）患者の骨髄からの白血病細胞の浄化および患者の造血システム を再構成するための浄化された骨髄の使用に間する。

魚明五貿量 慢性−ｉ＃髄髄内白血病ＣＭＬ）は、多能性幹細胞の悪性の形質転換に起因し且 つ白血病全体の約１５〜２０％に相当する。フィラデルフィア染色体（Ｐｈ’） は染色体９および２２間の相互転座の結果として生じ、９５％を越えるＣＭＬ患 者において検出しうる。この転座の結果として、細胞性ａｂｌ（ｃ　ａｂｌ）遺 伝子の染色体９〜染色体２２上の通常の位置からのその転座が生じる（バートラ ム（Ｂａｒｔｒａｍ）、Ｃ，Ｒ，ら、Ｎａｔｕｒｅ　３０６：２７７〜２８０（ １９８３）；ハイスターカンプ（Ｈｅｉｓｔｅｒｋａｍｐ）、Ｎ、ら、Ｎａｔｕ ｒｅ　３０６：２３９〜２４２（１９８３））、正常なプロトオンコジーンｃ− ａｂｌは、チロシンキナーゼ活性を有するｐ１４５タンパク質をコードする２３ ０ｋｂを上回り且つ１２個のエキソンを含む、この正常なｐ１４５タンパク質の 機能は知られていない、染色体９上の切断点は、エキソン２〜１１までを融合遺 伝子の内在部分として残すｃ−ａｂｌ遠伝子の５′末端の大型の２００ｋｂの領 域内に見出される（ベルナーズ（Ｂｅｒｎａｒｄｓ）、Ａ、ら、Ｍ　ｏ　ｌ　。

（Ｋｕｒｚｒｏｃｋ）、Ｒ，、Ｎ、Ｅｎ　、Ｊ、Ｍｅｄ、３１９：９９０　（１ ９８８））、これに対して、染色体２２上のバンドｑ１１の切断点は、１４０ｋ ｂおよび２３個のエキソンから成る遺伝子上にある切断点クララスター領域すな わちｂｃｒと称され（グＯッフェン（Ｇｒｏｆｆｅｎ）、Ｊ、ら、Ｃｅ１ｌ　ユ 旦：９３〜９９（１９８４））、現在はｂｃｒ遺伝子と称する限定された５、８ ｋｂのＤＮＡセグメント内に見出される。ｂｃｒはｂｃｒ遺伝子のエキソンＸＩ ＩＩ−ＸＶＩＩＩに対応する６個のエキソンから成る。正常なりｃｒ遺伝子の機 能は知られていないが、ｐ１６０ｂｃｒタンパク質は特性決定された（スタム（ Ｓｔａｍ）、に、ら、Ｍｏ１．Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、７：１９５う（１９８７） ）、最近の研究では、γ−グルタミルトランスフエラーセ遺伝子をｂｃｒ遺伝子 内に位！決定したか、この観察の意義はまた確認されていない、ｂｃｒ中の切断 点部位は変化するが、この領域の関与は転座の一貫したおよび必要なＦ！！様で あると考えられる。ｃ−ａｂｌのｂｃｒ遺伝子への転位の結果として、ｂｃｒ− ａｂＩと称する異常融合遺伝子を生じ、これはｂｃｒエキソン３および４の間か またはｂｃｒエキソン２および３の間にそしてエキソン２にも見出される。融合 遺伝子から得られたｍＲＮＡ転写物は、８．５ｋｂであり（ｂｃｒエキソン３が 含まれるか否かに応じて−／−１０９塩基）、そして増大したチロシンキナーゼ 活性を有するｐ２１０タンパク質に關訳される。

ｂｃｒ−ａｂｌ遺伝子は、明らかに染色体９か関与しない異なるに、座によって 一般的な転座が置き換えられているものまたはＰｈ１の全体の細胞遺伝徴候か存 在しないものでさえも含め、実質的に全部のＣＭＬ患者において見出される。ｐ ２１０チロシンキナーゼ遺伝子産物は、癌特異的マーカーを表わすことがある。

それは造血細胞をインビトロで形質転換することが示され、実際的にそれがＣＭ Ｌの進行において原因となる役割を有することかあるということを示唆した。ｐ ２１０タンパク質の重要な役割に関する更に別の徴候として、若干の研究者は、 ウィルスベクターを用いるマウスでのこのタンパク質の発現が、多数のこれらの 被験動物においてＣＭＬ様またはＡＬＬ様疾患の進行をもたらすことを報告した 。

ＣＭＬ患者は、安定な慢性期（ＣＰ）から加速期（ＡＰ）へ、そして最後に末期 芽球分利（ＢＣ）へと必黙約に進行する。ＣＭＬ患者の死亡率は、診断後の最初 の２年間で５〜１０％、そしてＡＰまたはＢＣへの進行の範囲に対応してその後 毎年２５％まで増加する。ＣＭＬの自然の経過は、慣用的な化学療法薬によって 、攻撃的併用療法によってまたは生物学的薬剤の革新的な使用によって実質的に 変更されたことはまだなかった。

同種の骨髄移植は、この疾患に関して唯一実証された治癒的療法である。多数の 移植センターは、０２期の間に移植された患者の無疾患生存（ＤＦＳ＞率か約５ ０〜７５％であるという優れた結果を達成した。ＡＰまたはＢＣにおいて移植さ れた患者に対するＤＦＳ率は一層低く、それぞれ約４０％および２０％である。

ＢＭＴ候補者中の少数の患者のみしか利用可能な組ｍ適合性血縁ドナーを持たな いので、代わりのＢＭ源をＢＭＴのために見出す必要がある０国民骨髄ドナー登 録（Ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｍａｒｒｏｗ　Ｄｏｎｏｒ　Ｒｅｇｉｓｔｒｙ ＩＮＭＤＲ）は、同種ＢＭＴの実施においてより多数のＣＭＬ！！者を治療する のに骨髄を用いることができる適合した無血縁関係のドナー（ＭＵＤ）源である 。

しかしながら、ＮＭＤＲによってこのようなドナーを発見する機会は、患者の人 種的背景に応じてかなり異なる。米国における少数グループの大部分は登録が不 十分であり、しなかって、これらのグループの一つからの患者が適当なドナーを 発見する公算はかなり減少する。更に、ＭＵＤ　ＢＭＴに関する合併症、特に、 移植片拒絶、苛酷な移植片対宿主疾患および可能な養生法関連毒性の発生率は、 血縁ドナー移植の場合ものよりも高い、多数の患者は、年齢または好ましくない 危険／効果比率ゆえに、このアプローチの候補者ではないことがある。

変法として、ＣＭＬ患者を、下記の原理に基づいてオートロカスＢ、ＭＴで処置 する試みが行われた。ｐｈ１陰性陰性骨細１細胞診断時にＣＭＬの患者の末梢血 液（ＰＢ）または骨髄（ＢＭ）中において集中化学療法後（ゴトー（Ｇｏｔｏ） 。

Ｔ、ら、Ｂｌｏｏｄ　ラ９ニア９３　（１９８２））、インターフェロン療法後 または半固体培養若しくは長期間液体培養における骨髄造血性前駆体の増殖後に 見出されることか時々ある。このようなＰｈ１陰性細胞は悪性であることかある が：しかしながら、これらのＰｈ１陰性細胞は、造血システムを再移植し且つオ ートロガス移植後にＣＭＬを完全に鎮静させることかできる良性の生育しうる幹 細胞であることがありうるということが立証された。たとえ治癒的でない場合に おいても、このようなアプローチはＣＰを少なくとも延長しまたは疾患の変化後 の第二のＣＰを成功させることがある。このような考察は、ＣＭＬ患者を除去し うる用量の化学療法単独で若しくは化学的放射線療法で処置後の未処置若しくは 被処２ＢＩＭまたはＰＢ＃＃Ｉ胞のオートロガス注入の効力を試験する多数の臨 床試験のための原理を提供する。　ＣＰ骨髄の４−ヒドロペルオキシシクロ−ホ スファミド（４ＨＣ）または組換え体ヒトγインターフェロンによるエクスビボ 処置（マクブレイブ（ＭｃＧＩａｖｅ）、Ｐ、ら、Ｂｌｏｏｄ　ヱ４　：　２８ １Ａ　（１９８９））に続くオートロガスＢＭＴの結果として、完全な血液学的 鎮静並びに骨髄および造血性前躯体中期からのＰｈ１の消失か生じる。

長期間の液体培養において増殖したＰｈＩ陽性ＣＭＬ患者のＢＭがらＰｈｌ骨髄 性前駆体を選択する能力は、オートロガス移植用に良性の生育しうる遵血性幹細 胞の別の採取方法を示唆する。初期の報告は、高用量の化学的放射′ａ療法およ び１０日間の増殖後の長期間液体培養から洗浄されたＢＭｍ胞の注入によって処 置されたＡＮＬＬ患者での成功しｆＳＭえ込みおよび完全な鎮静を実証しな、近 年、同様の骨髄処置の適応が、ＣＭＬ患考での植え込みおよび短期間の血液学的 鎮静をもたらしな、造血性前駆体培養技術を用いる骨髄浄化に対するこの革新的 なアプローチの結果として植え込みおよび鎮静が持続するかどうかを確認するな めに、一層長い追及および追加の患者例の蓄積が必要である。

エクスビボでの浄化のこれらの方法それぞれには潜在的な欠点がある。化学療法 薬による骨髄の処置は、正常な幹細胞並びに白血病細胞を損傷し、それによって 移植失敗の危険性が増大することがある。ＣＭＬ骨髄からＰｈ１陰性幹Ａｌｆｌ 胞を培養させる成功率は変化しうる。更に、このＰｈ１陰性細胞集団は、ＰＣＲ などの感受性検定法を用いた場合、ｂｃｒ−ａｂｌ陽性であると見出されること かある。

本発明は、この問題に対する新規の分子生物学的アプローチとしてリボザイム技 術を利用する。

リボザイムは、池のＲＮＡ配列を酵素によって開裂することができる一連のＲＮ Ａ分子である。これらの分子は２種類のドメインを有し、二価の陽イオンに依存 した機序によって標的を開裂する触媒性［ハンマーヘッド（ｈａｍｍｅｒｈｅａ ｄ）Ｊ部分と、標的配列を含むＲＮＡ分子の領域に対してリボザイムの結合の特 異性を与えるフランキングオリゴヌクレオチドである。Ｎ＝Ａ、Ｃ，ｔたはＵで あるＧ−Ｕ−Ｎのヌクレオチドのいずれの配列ら、リボザイムによって標的とさ れることかできる（ルフナー（Ｒｕｆｆｎｅｒ）、Ｅ、Ｅ。

ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２９：１０６９５〜１０７０２（１９９０）） −リボザイムは、１個の分子がそのＲＮＡ標的に結合し、それを開裂した陽に分 離し、そして第二の標的に結合することができる等、酵素のように作用する。

リボザイムは種々の遺伝子の発現を特異的に阻害する可能性を有し、そしてウィ ルス感染および発癌を制御する新規の治療的アプローチを示す、研究者はこの技 術を、インビトロでおよび動物モデルにおいて、ＨＩＶ遺伝子（チャン（Ｃｈａ ｎｇ）、Ｐ、Ｓ、ら、ｑ土ユｎ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇ　２：１〜９（１９ ９０）：サーバー（Ｓａｒｖｅｒ）、Ｎ、ら、５ｃｉｅｎｃｅ　２４ヱ：１２２ ２〜１２２５　＜１９９０））、並びにｃ−ｆｏｓ（スカンロン（Ｓｃａｎｌｏ ｎ）、に、Ｊ、ら、５ｃｉｅｎｃｅに提出、１９９０）およびＨ−ｒａｓ　（カ シヤニ・サーベト（Ｋａｓｈａｎｉ−３ａｂｅｔ）、Ｍ、ら、１９９０年公開用 に提出）発癌遺伝子の発現を阻害するのに適用することを開始した。

立型Ω撚！ ｂｃｒ−ａｂ＋融合遺伝子は、９５％を越えるＣＭＩＪ者および約３０％のＡＬ Ｌの成人において見出されるフィラデルフィア染色＃Ｐｈ’の分子対応物である ０本発明は、Ｐｈ１７白血病細胞におけるｂｃｒ−ａｂｌ遺伝子の発現を阻害す るのに有効なりボザイム技術を提供する。適当なりボザイム遺伝子を提供する。

このような遺伝子がトランスフェクトされた大腸菌は、このような遺伝子の大規 模な単離を可能にするりボザイム遺伝子を複製する。大腸菌コロニーから得られ た遺伝子から転写されなりボザイムＲＮＡはｂｃｒ−ａｂｌＲＮＡを開裂する。

ＥＭ〜２＃胞におけるｂａｒ−ａｂｌの発現は、リボザイムｍＲＮＡのリボンー ムベクター取り込みによって阻害される。

本発明の特に重要なＩＩｉ様は、ＣＭＬまたはＡＬＬ患者の骨髄からの０血Ｆ４ 細胞の浄化を伴う８次に、浄化された骨髄を用いて患者の造血システムを再構成 する。

置皿の説明 図１は、スプライス１の融合部位を示すｂｃｒ−ａｂｌ　ｍＲＮＡ配列である。

「ハンマーヘッド」触媒性ドメインを示すリボザイム配列は、融合部位に対して ちょうど５′に位置したＧＵＵコドンおよびｂｃｒ−ａｂｌ　ｍＲＮＡに相補的 なフランキングオリゴヌクレオチドを標的とする。

図２は、ｂｃｒ−ａｂｌリボザイム遺伝子を含むＰブルースクリプト（ｐＢｌｕ ｅｓｃｒｆｐｔ）ＫＳプラスミドベクターによってトランスフェクトされた２種 類の大腸菌コロニー＃９および＃１１が（リボザイムに相補的なｐ　３２　ｇ識 オリゴマー配列とのハイブリダイゼーションによって検出されたように）、リボ ザイム遺伝子を発現するということを実証するサザンプロットである。

リボザイム遺伝子はＨｉｎｄＩＩＩおよび５ｓｔＩエンドヌクレアーゼで切断し た。

図３は、Ｐ３２−ＵＴＰを用いてＰ３２標識ＲＮＡに転写された後、細胞不合シ ステムにおいて３７℃で３時間（図３Ａ）、−晩中〈図３Ｂ）−緒にインキュベ ートされたりボザイムおよびｐＪＷρ３（ｂｃｒ−ａｂｌスプライス１配列を有 するプラスミド）である０図３Ａにおいて、列１は、ｐＪＷｐ３からの主要転写 産物が、リボザイムおよび１０ｍＭ　Ｍｇ中すの存在下においてより小型の産物 へと部分的に開裂されることを示す０列２は、Ｍｇ中十の不存在において開裂し ないことを示す９列３および４は、Ｍ　ｇ　＋　”ｔ−含有または不含のリボザ イム不存在においてｂｃｒ−ａｂｌＲＮＡは分解しないことを示す０図３Ｂにお いて、列３のｐＪＷｐ３　ＲＮＡは、リボザイムおよびＭｇｆＴと一緒に一晩中 インキュベーション後に完全に開裂した０列１は、リボザイム不存在においてρ ＪＷＰ３ＲＮＡは分解しないことを示し、そして列２は、Ｍｇ＝＋不存在ではり ホザイムによって分解しないことを示す。

図４は、リボフエクチン不存在においては僅かに最低限度の取り込みしか示さな いＥＭ−２細胞によって効率よく取り込まれた、リボフエクチン（Ｉｉｐｏｆｅ ｃｔｉｎ）と複合体を作ったｐ　３２ｖｓｖａリボザイムである。

図５は、完全なＰ３２標識リボザイムが、リボフェクチンと複合体を作ったりボ ザイムとのインキュベーションの１８時間および４２時間後にＥＭ−２４１１１ 胞において検出されるということを実証するゲルを示す。

図６は、ＥＭ−２＃！胞からｊｆＬ離された後、逆転写酵素に続いてＰＣＲを施 されたｒＮＡから増幅されたｂｃｒ−ａｂｌ　ＤＮＡのサザンプロットである。

図７は、ｂｃｒ−ａｂｌリホザイム発現プラスミドの設計および構築を図示する 。

ゲル１ひμ１囚 ＰＣＲ技術によるｂｃｒ−ａｂｌ　ｍＲＮＡの検出の方法は、レンジ（Ｌａｎｇ ｅ）ら、Ｂ　Ｉ　ｏｏｄ　ヱ旦：　１７３５〜１７４１　（１９８９）に記載ｂ ｃｒ−ａｂｌ　ｍＲＮＡを開裂する「ハンマーヘッド」リボザイムを図１に示し たように製造した。リボザイムは、ワトンン・クリック塩基対によって標的部位 へ下記触媒性ドメインの位置を定めるための１５ヌクレオチド標的配列が隣接し た２２ヌクレオチド触媒性ＲＮＡ配列を含む、標的ＲＮＡの開裂は、指定された ＧＵＵＪ！を基の後に特異的に起こり、２’−３’環状リン酸塩および５゛ヒド ロキシルを生じる。

オリゴヌクレオチド 合成オリゴデオキシリボヌクレオチドを、アプライド・バイオシステムズ（Ａｐ ｐｌｉｅｄ　Ｂｆｏｓｙｓｔｅｍｓ）３８０Ｂ型ＤＮＡ合成機で製造しな。

二つのＢａｍＨＩｉｌｌ限部位に囲まれた２重鎖リボザイム遺伝子挿入断片を、 ２１＃ｉ類の１本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチド（オリゴ１１ライマー５’ ＣＣＡＧＡＴＣＴＧＡＡＧＧにｃｗｒＴ′ＩＩＴＧＣＴＧＡＴＧＡＧＴＣＣＧＴ （：ＡＧＧ　］’。

オリゴ２プライマー ５’ＣＣＡＧＡＴＣＴＧＧＡＴＴｒ入入ＧＣＡＧＡＧＴＴＴＣＧＴＣＣＴＣＡＣ ＧＧＡＣＴ　３’３７および３９塩基長さ、３′末端に相補的な１１塩基を育す る）から製造した。

リボザイムｃＤＮＡ合成およびプラスミドに　するサブクローン２本鎖リボザイ ムｃ　Ｄ　Ｎ　Ａを合成するために、前記に記載した２種類のオリゴを用いて、 Ｔａｑ　ＤＮＡポリメラーゼを用いるインビトロでの重合（ＰＣＲ）反応を行っ た。続いて、リボザイム配列のＰＣＲ生成物は、ｐブルースクリプト（ｐＢＬＵ ＥｓｃＲＩＰＴ）ＩＩ　ＫＳベクターのＢａｍＨＩ部位にクローン化される（ス トラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ラホヤ　ＣＡ）、挿入断片の合成、重 合および挿入方向の信頼度は、クローン化されたりホザイムＰＣＲ生成物のジデ オキシ配列決定法によって検査された（ＵＳＢ配列２．０キツト、クリープラン ド、ＯＨ）。

プラスミド　型からのりボザイムＲＮＡのインビトロでの−Ｔ７プロモーターを 用いるＰブルースクリプト−ＫＳ（〒）プラスミドからのＲＮＡの転写を、ロワ リー（１，ｏｗａｒｙｌら、ｒＲＮＡの構造および力学（Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　 ａｎｄ　Ｄｙｎａｍｉｃｓ　ｏｆ　ＲＮＡ）Ｊ、６９頁、ブレナム・プレス（Ｐ ｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ）−ニューヨーク（１９８６）から応用された粂件下で 行った。簡単には、５倍過剰の適当な制限エンドヌクレアーゼを用いて、転写さ れる配列の下流で直線状になる部分二重らせん合成りボザイムＤＮＡＭ型のＴ７ 　ＲＮＡボリメラーセ転写によってＲＮＡを合成した。転写反応混合物は、０． ０５μｇ／μＩ濃度のプラスミドＤ　Ｎ　Ａ鋳型、Ｔ７　ＲＮＡポリメラーゼ０ ５単位／μｌ；４０ｍＭトリスーＨＣＬ　ｐＨ７，９；２０１：並びに５０μｍ 容量中１単位のＲＮアーセ阻害剤を含む０反応は３７℃において、放射性標識Ｒ ＮＡに対しては１時間および非放射性標識ＲＮＡに対しては３時間行った。転写 反応は７Ｍ尿素を含むアクリルアミドゲルを用いることによって分別された。生 成物をオートラジオグラフィーまたは紫外線増動法によって位置決めし、０．２ ５Ｍ酢酸アンモニウム／１０ｍＭトリスＨＣＩ、ｐＨ７，９／１ｍＭ　ＥＤＴＡ 中で溶離した後、エタノール沈殿によってＪａした０図２を参照されたい。

ｂｃｒ−ａｂｌスプライスｌＲＮＡの　・ｐＪＷｐ３グラスミドは、ｂａｒ−ａ ｂｌスズライス１ｃＤＮＡを含む、このクローンはオーウェン・ウィツト（Ｏｗ ｅｎ　Ｗｉｔｔｌ博士、カリフォルニア大字分子生物学研究室（Ｍｏｌｅｃｕｌ ａｒ　ＢｉｏｌｏｇｙＩｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｃａ １ｉｆｏｒｎｉａ）、ロサンゼルス、カリフォルニア９００２４によって提供さ れた。このｃ　Ｄ　Ｎ　Ａは、ｂｃｒ−ａｂ＋リボザイム遺伝子に関して前記に 記載したように、ｐブルースクリプト−ＫＳ　（＋）プラスミドベクターに取り 込まれサブクローン化され、そしてＲＮＡに転写された。

ｂｃｒ−ａｂｌ　ｍＲＮＡのりボザイム　裂の細　゛図３Ａおよび３Ｂに示した ように、Ｐ３２．、リボザイムおよびｂａｒ−ａｂＩ　ＲＮＡ分子を、ノザンプ ロットを用いる細胞不合検定においてインキュベートして反応生成物を実証した 。リボザイム二基質比率の滴定、Ｍｇｔ−１−ｆｉ度並びにこの反応に対する温 度および時間条件の決定を行った。

陽イオン性リポソームを用いるＲＮＡトランスフェクションは、培養された真核 細胞に遺伝情報を導入する方法として認められたものである。マローン（Ｍａｌ ｏＨｅ）、Ｒ，Ｗ、ら、ＰＮＡＳ　８６：６０７７〜６０８１（１９８９）を参 照されたい、リポソームはＤＮＡまたはＲＮＡと自発的に相互作用して、ＤＮＡ またはＲＮＡに完全に閉じ込められた脂質−ＤＮＡまたは脂質−ＲＡＮ複合体を 形成し、そしてこの複合体と細胞膜との融合の結果としてＤＮＡまたはＲＮＡの 有効な取り込みが生じる。

ＥＭ−２Ａ［Ｂ　のＲＮＡ　トランスフェクション芽球分利のＣＭＬ患者から由 来したものであり且つｂｃｒ−ａｂ＋融合遺伝子（スプライス１）を含むＥＭ− ２細胞系（キーティング（Ｋｅａｔｉ　ｎｇ）、Ａ。

ら、Ｎｏｒｍａｌ　ａｎｄ　Ｎｅｏ　ｌａｓｔｉｃＨｅｍａｔｏ　ｏｉｅｓｉｓ 、５１３〜５２０頁（１９８３）、アラン・アール・リス・インコーホレーテッ ド（Ａｌａｎ　Ｒ，Ｌｉ５ｓ、Ｉｎｃ、＞、ニューヨーク）（ウィツト博士、Ｕ ＣＬＡから入手された）を、本実験室において１０％（ｖ／ｖ）ＦＣ３ｔ育ＲＰ Ｍ１１６４０中で維持した。トランスフェクション中に、ＥＭ−２ＭＡ胞をオズ ティ−ＭＥＭ　Ｉ血清減少培地（ジブコ（Ｇｉｂｃｏ）、ＭＤ＞で１回洗浄し且 つ同一の培地と一緒に１時間インキュベートする０次に、別個に稀釈した１度の りボザイムｍＲＮＡおよび等量のりボッエフチン（ＢＲＬギャザースバーグ、Ｍ Ｄ）を、最適細胞濃度、すなわち細胞うＸ１０４個／ｍ１のＥＭ−２細胞に加え 、そして湿潤した５％Ｃｏ２環境中において３７℃で５〜２４時間インキュベー トする。

リボザイムを有するプラスミドによる細　乙のトランスフェクションｂｃｒ−ａ ｂｌリポザイム　現プラスミドの設−および構築リポザイムの発現か安定して維 持されることによる効果を観察する目的用に、高４度のｂｃｒ−ａｂｌリボザイ ムを発現するＥＭ−２細胞系を開発させる。適応された発現ベクターは、カニン グ（Ｇｕｎｎｉｎｇ）ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ。

Ａｖａｃｉ、Ｓａｌ、ＵＳＡ　８４：４８３１　（１９８７）によって報告され たｐＨβ　Ａρｒ−１ｎｅｏである。このベクターは、５′非翻訳領域および介 在配列を加えたβアクチンプロモーター領域を、独特のＳａｌ　１、ＨｉｎｄＩ Ｉ■およびＢａｍＨＩ制限エンドヌクレアーゼ部位を含む類ＤＮＡポリリンカー セグメントに結合して含み、続いて、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル、アンピ シリン耐性遺伝子およびネオマイシン耐性遺伝子を含む、したがって、ｂｃｒ− ａｂ＋リボザイムｃＤＮＡの発現は強力なβ−アクチンプロモーターの制御下に ある０発現プラスミドを有する細胞はネオマイシンに対するそれらの耐性によっ て選択される。簡単には、図７によって示されたように、ｂｃｒ−ａｂｌリボザ イムｃ　Ｄ　Ｎ　Ａは、ｂｃｒ−ａｂｌリボザイムｃＤＮＡを有するｐブルース クリプトＩＩＫＳを制限酵素ＢａｍＨＩで消化し且つ精製することによって製造 される。

このリポザイムｃＤＮＡフラグメントを、ＢａｍＨＩで制限消化された発現ベク ターＰＨβＡｐｒ−１−ｎｅｏに連結させる。このようにして、ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ 挿入断片は、ヒトβ−アクチンブロモ−ターおよびＳＶ４０ポリアデニル化シグ ナル間に位置する。

ＣＭＬ４１　乙におけるｂｃｒ−ａｂｌリボザイムの一発現プラスミドｐＨｌ３ Ａｐｒ−１−ｎｅｏを用いることによってＥＭ−２ＣＭＬ細胞系をトランスフェ クトするために、リボフエクチンを製造者のプロトコル（ＢＲＬ、ガイサーズバ ーグ、ＭＤ）にしたかって用いる。細胞を、オプティ−ＭＥＮ　Ｉ血清減少培地 中において５％ＣＯ２と一緒に３７℃で２４時間インキュベートした後、１０％ ウシ胎児血清含有培地を加えた。更に４８時間後に、細胞を選択培地（１０％Ｆ Ｃ３およびＧ４１８含有オプテイ−Ｍ　Ｅ　Ｎ　）に移した。

約２′Ａ間の選択後に、個々のコロニーを集め、増殖させ、そしてポリメラーゼ 連鎖反応検定およびノザンプロット分析によってＰ３２標ｍｂｃｒ−ａｂｌリボ ザイムの発現に関してスクリーンする。

ウェスタンプロット分析による ｚ　、　ｏｂｃ　ｒ−ａｂ　Ｉタンパク　生成物の検ダウンレギュレーティング ｂｃｒ−ａｂ１遺伝子発現に対する抗ｂａｒ−ａｂｌリポザイムの作用を評価す るなめに、ｂｃｒ−ａｂ＋融合遺伝子によってコードされたｐ２　ｔ　ａ　ｂ　 （ｒ　ａ　ｂ　ｌタンパク質をウェスタンプロット分析によって検出した。リボ ザイムでトランスフェクトした細胞をＳＤ’Ｓゲル添加５ｏｔｉ中で直接溶解さ せた後、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析した。

個々の成分をゲルからニトロセルロースフィルターに移しな後、標的タンパク質 を、ｐ２　ｔ　ｏ　ｌ）　Ｃｒ　””−ａ　ｂｌに対して特異的な多クローン性 抗体を用いることによって１０−ブしたくオンコジーン・サイエンス（Ｏｎｃｏ ｇｅｎｅＳｃｉｅｎｃｅ）、ＮＹ）。

ソボザイムによるＥＭ　２ＭＡ　でのｂｃｒ−ａｂｌ　の阻害ＥＭ−２＋！ＩＩ 胞から単離されたＲＮＡに逆転写酵素処理を施した後、ＰＣＨによって増幅させ た。増幅生成物のサザンプロット分析を図６に示す０列１は、増幅の主要生成物 としてスプライス１を示す陽性対照ｐＪＷｐ３である０次の列はブランクである ０列２は、ＥＭ−２細胞をリボザイムーリボフェクチン複合体と−緒に１８時間 インキュベージランした後のｂｃｒ−ａｂ　ｌＲＮＡの完全な不存在を示す０列 ３は、細胞を陰性対照のＲＮＡ−リボフエクチン複合体と一緒にインキュベート する場合の完全なりｃｒ−ａｂｌスプライス１を示す８列４は、ＥＭ−２細胞単 独からのｂｃｒ−ａｂｌである０列５は、リボザイムーリボフエクチンとのイン キュベーションの４２時間後のｂｃｒ−ａｂｌスプライス１の弱いシグナルを示 す１列６および７は、インキュベーションの４２時間後ということを除き、列３ および４と同一である０列８は、反応混合物に対して鋳型を加えないＰＣＲ検定 に対する陰性対照である。

鯉鳳Ｏ忠惣主土用 ＥＭ−２細胞の３Ｈ−チミジン取り込み、細胞数、コロニー形成および細胞表現 型に対する、ｂｃｒ−ａｂｌ遺伝子発現のりボザイムに媒介された阻害の効果を 、イムノフェノタイピングを含む標準的な技法によって決定した。ｐｈｌ＋白血 病の患者由来の新たに単離したヒト白血病細胞を同様の方式で研究した。一つの 実験結果を表１に報告する。

人工 ＥＭ　２４１胞による３Ｈ−チミジン取り込み（ｃｐｍ十／　ＳＤ）阻宣駈 １、対照細胞ａ　１３，４４１＋／−１８２８−２、「対照ＪＲＮＡ５　１３， ３１７＋／−２１７０，９％３、リボザイム’　９，００７＋／−２９１３３， ０％ａは、１％ＦＣＳ中において１８時間インキュベートし、３Ｈ−チミジンを 用いて４時間Ｉｋ露した５Ｘ１０４１１ｋｌのＥＭ−２，４１［１胞。

ｂは、ａと同一であるが、正常なヒトの末梢血液単核細胞から抽出された全ＲＮ Ａ９μｇをリボフエクチンを介してＥＭ−２細胞に加えた。

Ｃは、ａと同一であるが、ｂｃｒ−ａｂｌリボザイム９μｇをリボフエクチンを 介して細胞に加えた。

関連リボザイム 図１に具体的に示したりボザイムは、ｂｃｒエクソン３をａｂｌエクソン２に融 合させるｂｃｒ−ａｂｌスプライス１ｍＲＮＡに対して向けられる。ｐｈ十ｃＭ Ｌの若干の患者の細胞は、スプライス１、スプライス２（ａｂｌエクソン２に融 合したｂｃｒエクソン２）のいずれかまたは双方を発現することがありうる。

２種類のりボザイム、すなわちスプライス１を標的とするものおよびスプライス ２を標的とするものが、双方のスプライスを発現する白血病細胞の増殖を阻害す るのに必要とされるであろう、ＡＬＬｂｃｒ−ａｂ　１スプライスの増殖を阻害 するのには第三のりボザイムが必要とされる０本発明は、したがって、３種類の このようなりボザイム全部、２種類またはそれ以上のこのようなりボザイムの組 合わせ、およびＰｈ＋ＣＭＬまたはＡＬＬの患者からの骨髄を浄化するためのこ のようなりボザイムの単独でまたは組合わせでの使用を含む。

ａｂｌ遺伝子の５′末端に配列したｂｃｒの融合の結果としてのｃ−ａｂ１発癌 遺伝子の活性化は、重要な工程ではないとしても、Ｐｈ１〒白血病の発病におい て重要な開始工程の一つであると仮定された。特異的にｂｃｒ−ａｂｌ　ｍＲＮ Ａに向けられたりボザイムによるＰｈｌ十細胞増殖および／または分化の阻害は 、この仮説に対して強い支持根拠を与える。

臨床的には、オートロガス骨髄移植の実施において患者の骨髄を浄化するりボザ イム技術の成功した適用は、ＣＭＬの治癒の可能性に対して有意の影響を及ぼす であろう、ＢＭＴによって潜在的に治癒しつる慢性期のＣＭＬ患者の大部分には 、適当な血縁ドナーがいない、適合した無血縁関係のドナーを用いてＢＭＴを実 施する変法は、血縁ドナー移植よりもはるかに危険であると考えられ、米国の多 数の患者はこのようなドナーを発見する機会がほとんどない。

オートロガス　の゛ 骨髄細胞を、標準的な方法にしたがって全身麻酔下において患者の背部腸骨稜か ら採取する。全部で有核細胞４Ｘ１０８個／ｋｇ（患者の体重）を採取する。

この全部が通常の数の２倍であるので、半分の細胞は細胞の予備として保存する ことができる。必要ならば骨髄採収を増強するためにＧ−Ｃ３Ｆによって感作さ れた末梢血液幹細胞をロイコフェレシス（Ｉｅｕｋｏｐｈｅｒｅｓｉｓ）によっ て採取してもよい。

次に、新たに採取された幹細胞をｂｃｒ−ａｂｌリポザイム遺伝子を有するグラ スミドの存在下においてインビトロでインキュベートし、それをリポソームベク ターによってまたは取り込みの能率に応じて他の方法によって骨髄細胞中に導入 する。４１１１胞を滅菌ＣＯ２インキュベーター中において２〜４日間インキュ ベートし、正確な時間の長さは前臨床の実験によって決定される０次に、細胞を 回収し、洗浄し、そして患者に再注入する。

骨髄細胞のインビトロでのインキュベーションのこの期間中に患者は、分割全身 照射およびＶＰ−１６、〒／−シクロホスファミドから成る高用量化学療法の組 合わせによる骨髄除去療法を施される。浄化された骨髄細胞は、最後の化学療法 薬を投与して約４８時間後に再注入される。

浄化技術の効果を日常的な細胞遺伝分析によっておよびＰＣＨによって監視して 、残留するｐｈ’Ｔおよびｂｃｒ−ａｂｌ＋細胞をそれぞれ検出する。ＣＦＵ− ＧＭおよびＣＦＵ−ＧＥＭＭコロニーに関する標準的な骨髄培黄検定を行って、 浄化処置の特異性および安全性を評価する。

ρＪＷｐ３ ＦＩＧ、　３Ｂ φ １８瞬明　４２喰幅 国際調査報告 １１ｔＪ針鴫−一一＾−６ｇ口＠＠＠−Ｅτ／ＬＳＱＩ　１０％４１１□　４− ―＋＋ｄ’ＣＴ／ＵＳ９１１０５４４：１フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，５識別記号　庁内整理ｔｒ号Ｃｌ２Ｎ　５／１０ ／／（Ｃ１２Ｎ　１／２１ Ｃ１２Ｒ１：１９） （Ｃ１２Ｎ　５／１０ Ｃ１２Ｒ１：９１） （Ｃ１２Ｎ　９１００ Ｃ１２Ｒ１：１９） （７２）発明者　フォーマン、スティーヴン・ジエイアメリカ合衆国カリフォル ニア州９１１０８゜サン・マリノ、オーク・ノール・アベニュＩ

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. １．フィラデルフィア染色体＋慢性骨髄性白血病および急性リンパ芽球性白血病 に冒された患者の骨髄を、ｂｃｒ−ａｂｌ遺伝子の発現を阻害するのに有効なリ ボザイムで処置することを含む、該骨髄から白血病細胞を浄化する方法。
2. ２．前記のｂｃｒ−ａｂｌ遺伝子産物がｂｃｒ−ａｂｌスプライス１ｍＲＮＡで ある請求項１に記載の方法。
3. ３．前記のｂｃｒ−ａｂｌ遺伝子産物がｂｃｒ−ａｂｌスプライス２ｍＲＮＡで ある請求項１に記載の方法。
4. ４．前記のｂｃｒ−ａｂｌ遺伝子産物が、「ＡＬＬ」スプライスｍＲＮＡである 請求項１に記載の方法。
5. ５．請求項１または請求項２に記載の方法に続いて、前記の浄化された骨髄のオ ートロガス移植によって骨髄から白血病細胞をエクスビボで浄化することを含む 方法。
6. ６．白血病細胞が請求項１または請求項２の方法によって浄化された骨髄。
7. ７．ｂｃｒ−ａｂｌｍＲＮＡを開製するのに有効なリボザイムが取り込まれたＰ ｈｌ＋細胞系。
8. ８．図１に示したリボザイムが取り込まれたＥＭ−２細胞系。
9. ９．ｂｃｒ−ａｂｌ転写物を開製するのに有効なリボザイムを発現する遺伝子で トランスフェクトされた真核細胞。
10. １０．前記のリボザイムが図１に示したリボザイムである請求項６に記載の真核 細胞。
11. １１．ｂｃｒ−ａｂｌ融合ｍＲＮＡを開裂するのに有効なりボザイム遺伝子を発 現する真核細胞。
12. １２．前記の細胞が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞である請求項９に記載の真核細 胞。
13. １３．図７に示したブラスミドｐｈβ−リボザイム。