JPH06500856A - カード上での微量分析 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、特に悪用の薬のような物質のための、素早くしかも現場持ち運びが現 在では、種々の悪用の薬に関連した良く知られた問題と、「薬に対する戦争」に 関連した国際的な政策とにより、流体サンプル中で悪用の薬を、単純に、素早く 、しかも比較的安価に、さらに正確に検出する要請が増大している。たとえば悪 用の薬、ホルモン等々のような種々の化学物および生体種を試験するために最近 用いられている方法およびキットは、比較的高価であったり、かさばったり、持 ち運び設置が不可であったりするなどのことをしばしば含むという事実の問題が ある。それ故に、その試験は、制御された環境下で実行されなければならない。

これら現行のシステムは、このようにしばしば、色の変化を計測するための高価 で精密な装置を必要とし、その分析の全体のコストを増大させ、試験を行う試験 所の職員の熟練を必要としている。同時に、たくさんの試験は、単純な色の変化 指示を存するが、試験ストリップに対して適用しなければならない、いくつかの 溶液を必要とする。これらの溶液は、また、試験のコストを増大させ、特殊な貯 蔵条件を必要とし、まちがいの可能性を増大させると共に、熟線化された職員を 従事させることになる。これらの試験機は、動き易いようにされておらず、その ために、運ぶことができず、しかも、たとえば試験所の職員または法律強制事務 宮などのような試験を行う個々人によって、容易かつ安全に実施できるものでは ない。したがって、単純で安価で、高移動性を持ちながら、疑義となる化学物の 存在の指示を、素早くしかも信頼性良く正確に提供できるシステムを開発するこ とが強く望まれている。

複数層の乾燥フィルムを用い、イーストマンコダック社により市販されている酵 素分析システムが、タリフ。ケミ、（ｃｌｉｎ、ｃｈｅｌＩＬ）２４／８．１３ ３５−１３４２　（１９７Ｂ）の文献において、カルマ等（Ｃｕｒｍｅ　ｅｔ　 ａｌ）によって開示しである。このシステムは、上方展着あるいは計測層、バイ ンダーと計測層下のすべての要求される試薬（緩衝材、酵素、染料、前駆物質） 、および酵素含有層下の透明支持とを有する。しかしながら、コダックのシステ ムは、免疫検出を実現できず、酵素含有層内でのサンプルの移動速度を制御する ためのメンブレン膜状の層を有していない。コダックのシステムの計測層は、酵 素の過負荷の可能性を減少させるが、サンプルがいったん酵素含有層へ届いた場 合にサンプルが移動する速度を効果的に制御するための膜を使用することはでき ない。このため、コダックのシステムの感度は、不完全な酵素反応によって、低 下させられるであろう。また、この適度な速度制御の欠如は、免疫検出のために コダックのシステムを効率的に使用することを妨げている。

グリーナー等は、「クリニカル　ケミストリー（Ｃ１ｉｎｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉ ｓｔｒｙ）　Ｊ、第３５巻、第９号（１９８９）の「多層蛍光免疫分析技術」の 中で、多層蛍光免疫分析を開示している。この免疫分析では、多層構造を用い、 上部から下部に向けて、展着層、潜在的にタンパク質を妨げるようにろ過するた めの上部コート層、アガロース（寒刀マトリックス内での抗体−指示体−ハブテ ンの共役系の信号層、およびポリエステルフィルムベースとを含んでいる。この 観察された蛍光性は、サンプル中に存在する分析された物質の濃度に反比例する 。また、蛍光性が測定されなければならないので、この免疫分析は、装置設備を 必要とする。

発明の概要 したがって、本発明の目的は、高移動性を持ち、素早く、信頼でき、しかも正確 に、疑義となる化学物の存在の指示を行い、疑義となる化学物の濃度に比例して 正の信号を提供することができるものを提供することである。

本発明の他の目的は、高価でかさばる装置を必要としない分析を提供することで ある。

本発明のさらにその他の目的は、非熟練者によっても、信頼性良くしかも正確に 実行できる分析を提供することである。

本発明のさらにその他の目的は、便利で単純な酵素ベースの免疫分析を通しての 分析において、疑義となる化学物の存在を決定することである。

これらおよび付加的な本発明の目的は、多層微量分析カードにより達成される。

上部層は、乾燥状態でサンプルおよび何らかの必要な緩衝系を収容するための凹 部を有する。カードの第２層は、第１屡の下方にあり、反応性種に対して（共有 結合的あるいは非共存結合的に）結合する支持膜を有し、反応性種としては、分 析されるべぎ化学物に対して特定のものであり、化学物および酵素と共に結合す る抗体、または前記緩衝系を含む層が抗体−酵素一共役系を含み、その共役系が 生体的に活性の化学物に対して特定に結合する場合には、その生体的に活性の化 学物自体と共に結合する抗体がある。第２Ｎは、また、流体がそれを通して移動 する速度を制御する制御膜を育する。第３層は、第２層の下方にあり、酵素のた めの基質が含浸された超吸収支持体を有し、さらに、たとえば還元された染料お よび過酸化水素物の原料（もし酵素がコファクターとして過酸化水素物を必要と する場合）のような何らかの指示体であって、前記吸収層内でスペクトル変化を 引き起こすように、基質上で酵素の活動にとって必要な何らかの指示体を有する 。

本発明のさらに完全な理解は、次に示す本発明の詳細な説明および添付図面を参 照することによって得られ、図中、異なる図面で同じ構造および要素には同様な 符号を付しである。

図４は本発明によるカードの概略側面図である。

図２は表１の第３図式に見られるように、置換タイプの分析に設計された試験カ ードの各要素を示す。

図３は表１の第５図式に見られるように、競争タイプの分析に設計された試験カ ードの各要素を示す。

図４は試験カードの好ましい実施例の上部図である。

図５は試験カードの好ましい実施例の底部図である。

発明の詳細な説明 分析は、重要な化学物の抗原−抗体の認知、その認知の増幅、および引き続いて 化学物の存在のスペクトル指示に利用される。その分析の重要な点は、特殊化さ れた試験カードであり、以下、カード上での微量分析あるいはＭＡＣ（Ｍ　ｉ　 ｃｒｏＡｓｓａｙ　ｏｎ　Ｃａｒｄ）と称す。好ましくは、認知されるべぎ化学 物は、たとえばコカイン、ペンタクロルフェノール（ＰＣＰ）　、エルニスディ ー（ＬＳＤ）、およびモルフイネなどのような悪用の薬として一般に知られてい るものである。

図１に示すように、本発明による好ましい一実施令の微量分析カードは、３つの セクションあるいは層のスライド１０である。第１のセクション１２は、凹部１ ４を含む疎水層１２ａを有する。試験流体１６は、各凹部内に設置さね、表面張 力により保持されている。付加的に、第１セクシヨンは、凹部内に、補助層とし て、ｐＨ緩衝層を含むフィルターのような多孔質物質も有する。第２セクシヨン ２０も、凹部内に位置し、メンブレン膜の表面に対して化学的に結合する単クロ ーン（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ、単一の親細胞を持つ）の抗体を存する。その抗体 は、予め吸収された薬−酵素の共役系を持つ。第２セクシヨン２０は、流体の流 れのタイミングを制御するために、凹部工４下に、半透過のメンブレン膜２２を 有する。そのタイミングは、試験流体が、付加的な緩衝層１８および単クローン の抗体含有表面を通して、好ましい感度のために要求される最適の時間で吸引さ れるように、設定さね、その時間は通常約２分である。第３セクシヨン２６は、 酵素のための基質が含浸された超吸収ポリマーである。その超吸収ポリマーは、 適用されるべき、より大きな液体サンプルを許容し、感度を増大させる。好まし くは、第３セクシヨン２６は、補助層として、凹部１４を囲むコントラスト用背 面層と半透過メンブレン膜２２とを有し、白色あるいは開発された着色スポット のためのその他の適切なコントラスト用背面を提供する。第３層は、付加的に、 補助層として、たとえば薄葉紙などの保護層２８を育し、保護層が超吸収層の摩 耗を防止し、試験流体１６により濡れると透明になるようになっている。

この微量分析カードは、置換モードと、競争モードとの二つのモードの内のいず れかに形式化されるようになっている。置換モードは、分析のための試験ストラ イブの製造の容易性のために実行さね、他方、競争モードは、より高い感度が要 求される分析のために実行される。

積層化されたカード内で反応性種の配置は、そのカードが置換分析あるいは競争 分析のいずれに形式化されているかによって決定される。表１は、種々の考えら れる可能性のある配置例を示す。表１中、ＡＪＩ（第１セクシヨン）は、付加的 な緩衝層であり、ＢＭ（これも第１Ｎ）は、［！！ｌＩ部に加えられたサンプル を最初に受ける層（サンプル受は層）（シかしながら、この緩衝層が用いられろ ならば、ＡとＢ層は、一体化させて良（、または、サンプルは、好ましくは、Ｂ 層を通過する前に、Ａ層を通過させる）であり、０層（第２セクシヨン）は、表 面（たとえばメンブレン膜）に対して結合される反応性種であり、Ｄ層（これも 第２セクシタン）は、反応性種結合層を通して移動する流体の速度を制御するた めの制御メンブレン膜である。０層が存在しない場合には、Ｄ層の制御メンブレ ン膜が反応性種結合メンブレン膜である。表中、　「−」は、その層が存在しな いか、またはいずれの反応性種も含まないことを示す。

（この頁、以下、余白） 表工 反応性種の配置 図２は、置換モード用に設計されたＭＡＣの一実施例を示し、図３は競争モード 用に設計されたＭＡＣの一実施例を示す。第１層１２（第１セクシヨン）では、 凹部１４内に、疑義となる物質１１２を含むあるいは含まない流体サンプルを有 している。（図３）の実施例では、凹部には、抗体１１４−酵素１１６の共役系 １１８を有する。図２では、層２０（第２セクシヨン）は、フィルター紙あるい はその他の適切な支持メンブレン膜２２３上で移動不能化された、予め吸収され た（影を付す）疑義と成る物質１１２−酵素１１６の共役系２２２を持つ抗体１ ２０を有する。図３では、疑義となる物質１１２がフィルター紙あるいはその他 の適切な支持メンブレン膜２２３上で移動不能化しである（移動不能化された疑 義となる物質１１２に影が付しである）。層２０および２０’　は、たとえば半 透過メンブレン膜２２．２２などのように、その層を通してのサンプルの流れを 適正化するための何らかの手段を有している。層２６（図２）１層２６′（図３ ）は、酵素１１６のための基質２２８が含浸された超吸収層である。

物質と酵素との兵役系および抗体と酵素との共役系は、何れも、物質を分析する ために特定される。物質と酵素との兵役系における物質は、分析されるべき物質 と同じである。同様に、抗体と酵素との共役系における抗体は、分析されるべき 物質にとって特定のものであるべきである。酵素は物質反応を促進させる（分単 位）触媒作用を司るものであって、検出可能なスペクトル変化を発生させ、また 酵素検出システムにおいて鋭敏に反応する。この酵素は、酸化若しくは加水分解 システム（例えば、加水分解指示薬を存するアルカリ性のホスファターゼなどの ような、ブロモクレゾールスルホフタレイン　モノホスフェート（モノリン酸ｌ ）において用いられるものを採用することが好ましいが、これは、還元システム に比べて反応速度が早く、しかも、より敏感だからである。最も好ましいのは、 西洋ワサビのベルオキシターゼ若しくはアルカリ性のホスファターゼを用いるこ とである。

第１層、すなわち液体サンプルが滴下される凹部は、競争モードおよび置換モー ドの両方において、幾つかの目的を有している。この第１Ｎは、疑わしき物質（ 被検査物質）を含む液体サンプルを定位置に保持するとともに、この液体サンプ ルを他層へ案内する。第１層の付加的な目的は、サンプルを適切に緩衝させるこ とである。また、競争モードにおいて、この第１Ｎは、液体サンプルが抗体と酵 素との共役系若しくは物質と酵素との共役系をそれぞれ他層へ運ぶために、抗体 と酵素との共役系若しくは物質と酵素との共役系を含まなければならない。

好ましくは、第１層は、表面張力によってサンプルを定位置に保持するとともに 、ｐＨ緩衝機能を備え、さらに、もしＭＡＣ（微量分析カード）が競争モードに ある場合には特定の抗体と酵素との共役系若しくは物質と酵素との共役系を含む 。最も好ましいのは、第１図に示すように、第１層１２を２つの分離した層から 構成することである。この場合、一方の層は、サンプル用の凹部１４を有する疎 水層１２ａである。また、他方の層は、ｐＨ緩衝機能を備えるとともに、競争モ ードにあってはサンプルに溶解する抗体と酵素との共役系若しくは物質と酵素と の共役系を含む層１８である。この層１８は、フィルタ紙あるいはその他、吸収 性の基質から形成されている。

第２層２０は、ＭＡＣ（微量分析カード）が第２図に示す置換モードである場合 には、予め物質と酵素との共役系とともに配置される固定化抗体を含む。この層 は、疑わしき物質がサンプル中に存在すると、置換反応が生じるところである。

もし、液体サンプルに疑わしき物質が含まれていると、その物質は抗体から物質 と酵素との共役系に置換される。したがって、疑わしき物質が多（存在すればす る程、物質と酵素との共役系はより遊離さね、識別されるべく次の層に向かって 通過する。また、この層は２つの他の目的を有している。一つ目の目的は、サン プルが反応するに十分な時間をもつために当該層を通過するサンプルの流れを調 節することであり、二つ目の目的は、血液細胞などのように後で生じる色反応を 妨害する不純物を濾過することである。

第３図に示すＭＡＣ，すなわち、競争モードにおけるＭＡＣでは、第２Ｍ２０′ は固定化された疑わしき物質１１２を含んでいる。もし、液体サンプルが疑わし き物質１１２を含んでいる場合には、その物質１１２は、第１Ｈにおける抗体と 酵素との共役系１１８と結合する。どの遊離抗体も、この層２０′における固定 化物質１１２との結合には役立たず、物質と抗体と酵素との共攪慄ａ　ｏ　ｏは 、１１１１ｔＪされるべく通過してＮ２Ｇ′に至る。サンプル中に疑わしき物質 が存在ずればする程、抗体の位置はより拘束さね、その結果、物質と抗体と酵素 との共役系はより遊離して層２６′　に至ることになる。

使用される抗体に要求されることは、抗体が特定的に疑わしき物質を拘束し得る ことである。抗体の好ましい親和力は、分析の類型に依存するであろう。置換モ ードにおける好ましい親和力としては、約１０１乃至約１０＠であり、約１０１ が最も好ましい。また、競争モードにおける好ましい親和力としては、約１０１ 乃至約１ｏ１１であり、約１０１０が最も好ましい。低分子量の化学薬品、特に 麻薬に対する抗体は、高価でしかも低品質であることが少な（ないため、複クロ ーンの抗体より単クローンの抗体を採用することが最も好ましい。

第２層２０．　２０’　は、競争／置換反応が生じる場所であり、また、サンプ ルの流れを調節する機能を司る。一般的には、第２層２０．　２０’　は２つの 補助層から構成されている。第１の補助層は固定化された反応種を有する層２０ ａ（第２９）２０ａ’　（第３図）であり、第２の補助層２２（第２図）２２’ （第３図）は、液体の流れを調節し得る半透過膜である。反応種（抗体／疑わし き化学薬品、疑わしき物質／酵素、抗体または疑わしき物質）は、好ましくは支 持膜２２３上に固定されている。この固定は、液体が膜を自由に通過し得るよう に、共有結合若しくは非共有結合による非晶質膜への固定である。このような膜 としては、例えばセルロース、ニトロセルロース、セルロースとニトロセルロー スとの酢酸エステル、ポリカーボネート、ポリスルホンなどを挙げることができ る。好ましくは、反応種は、反応種の溶液を膜を通過させて引き抜き、膜を乾燥 させることにより固定される。最も好ましくは、真空施工が用いられる。半透過 膜は、支持膜とともに、適切な反応が生じるように液体の流れ率を調節する全て の膜が適用される。好ましくは、この相互作用に要する時間は約１乃至５分の間 であり、２分が最も好ましい。その結果、細孔サイズおよび支持膜と半透過膜の 領域（表面積）が変化して適切な相互反応の時間を達成することができる。細孔 サイズと膜の表面積が小さければ小さい程、相互反応時間が長くなり、検出の感 度が高まる。また、支持膜の細孔サイズによっては、半透過膜を省略することも できる。

ニトロセルロースを用いた置換モードにおいて、２分の透過時間を得るために、 膜の直径が３／１６インチ、４０μｍの試験溶液を与えると、時間と感度の両方 に対する最適な実施は、細孔サイズが０．４５μｍとなる。ポリカーボネートお よびポリスルホンの膜を用いたときの３／１６インチの孔径に対する概略の透過 時間を表■および表■に示している。

表■−ポリカーボネート 細孔サイズ（μｍ）　時間（秒） ０．０１５　■（不透過） 表■−ポリスルホン 細孔サイズ（μｍ）　時間（秒） ０．１　７８ ０．２　６５ 第３層２６（第２図）、２６’（第３図）、すなわち酵素１１６の基質をしみ込 ませる超吸収層は、酵素の量、つまり液体サンプル中の疑わしき物質１１２の濃 度に応じた検出スペクトル変化（基質上の酵素の反応からの変化）を生じさせる 。表示体からの信号が直接に出力されるため、逆に疑わしき物質の濃度に応じる よりむしろ、本発明では流布層が不要であり、その結果説明が容易である。好ま しくは、第３層２６．　２６’は、２つの補助層、つまり、酵素１１６の基質を しみ込ませる超吸収層と、吸取紙２４のように全てのスペクトル変化の同定に適 した白色その他のコントラスト用背面を提供するコントラスト用背面層とから構 成される。また、最も好ましくは、第３Ｊ１２８．２６′　は、［２８（例えば ティッシュペーパなどからなる）を有し、使用時における摩耗や損傷から超吸収 ポリマーを保護するために、濡れたときに透明であったり濡れると透明になった りする。

超吸収ポリマーは、承認された種類の材料である。しばしば、超吸収ポリマーは 、ポリアクリル酸の塩あるいは澱粉の主材上でグラフトされたアクリル酸の何れ かで形成される。超吸収ポリマーは、水中において自重の２０００倍の重量を吸 収することができる（好ましくは、吸収容積が少なくとも２００ｍＬの蒸留水／ １００ｃｍ”）。水和されると、超吸収ポリマーは実質的に透明な（通常は、無 色で透明）ゲルとなる。

超吸収ポリマーは、多量の液体サンプルの試験を可能にするだけでなく、検出感 度を向上させることもできる。好ましくは、ポリマーは即座に吸収し、小さなス ポットを生じさせ、外観を均一化する。例えば、グレイン・プロダクト・コーポ レイション製のし４１３紙（ｉｇ／ｃｍ”、吸収体積が２２５ｍＬの蒸留水／１ ０Ｑｃｍ２である超吸収ポリマー）は、吸取紙、超吸収ポリマー、ティッシュベ ーパを含む３層構造の紙であり、これを用いてもよい。他に適切な紙としては、 上記Ｌｉ２Ｓ紙と類似の構造であるグレイン・プロダクト・コーポレイション製 のＬ４１５紙（１，３ｇ／ｃｍ”、吸収体積が４２５ｍＬの蒸留水／ｃｍ”であ る超吸収ポリマー）である。このような商業的に有用な紙は単に模範的なもので ある。このような特定された商業的な材料には、決して限定される意味ではない 。さらに適切な超吸収材料に付いては、本件出願人の米国出願である「超吸収材 料を用いた酵素の分析Ｊ　（１９９０年８月２７日出噸に開示されており、全体 の具体例が該出願に示されている。

基質については、基質と酵素の両者が、乾燥しているときは安定しており、濡れ たときは反応できる限りは、スペクトル変化を生じさせる酵素と協働する全ての 基質が用いられる。スペクトル変化は、蛍光、化学発光、または可視でなければ ならない。可視色変化は、器械を使用しないことが望ましい。また、全てのスペ クトル変化の強度は分析すべき物質の濃度に応じていることが好ましい。好まし くは、還元染料の前駆物質は基質として用いられる。この反応は、酵素 無色種　−−−積分一→　有色種 この反応は、複数の酵素による触媒作用であり、このうちの一つが西洋わさびの ベロキシダーゼであることが好ましい。過酸化水素源は、安定で、しかも（凝縮 する液体過酸化水素としての）検出試薬を破壊しないことが必要とされるため、 過酸化水素の液体形状は基質（還元染料の前駆物質）の中に取り込まれなければ ならない。好ましくは、過酸化ナトリウムまたは過ホウ酸ナトリウムが用いられ 、最も好ましくは過ホウ酸ナトリウムが用いられる。

色彩発生システムで用いられる還元染料の前駆物質は、空気中で安定で高感度で あり、空気中で安定した強度色彩か提供される。還元染料の前駆物質の形として は、４−クロロ−１−ナフトール；０−フェニレンジアミン；３−アミノ−９− エチルカーバゾール、２．２’　−アジノージ（３−エチルベンズチアゾローネ ）、ハンカーイエーテス（Ｈａｎｋｅｒ−Ｙａｔｅｓ）の試薬、３−メチル−２ ペンゾチアジンナン　ヒドラゾン　塩酸基（ＭＢＴＨ）＋３−ジメチルアミノベ ンゼンカルボン酸（ＤＭＡＢ）；４−アミノアンチピレン＋フェノール；３，３ ′　−ジアミノベンジジンおよびその誘導体、例えば３．　３’　、５．　５’ 　−テトラメチルベンジジン、０−ジアニシジン、ジカルボキシジンなどを例示 できる。好ましくは、この染料の前駆物質は、４−クロロ−１−ナフトールとＮ 、　Ｎ−ジエチルフェニレンジアミン、Ｎ、Ｎ−ジメチルフェニレンジアミン； またはＭＢＴＨおよびＤＭＡＢの結合体である。最も好ましくは、４−クロロ− １−ナフトールまたは３−メチル１−２ベンゾチアジンノン十Ｎ、　Ｎ−ジメチ ルアミノベンゼン酸が用いられる。このような染料の前駆物質や使用される酵素 の安定性を高めるために、ＭＡＣ（微量分析カード）を気密なコンテナなどに保 管しておくことが好ましい。

上述したＭＡＣ（微量分析カード）は、免疫分析（例えば、自分自身あるいはハ ブテンと結合して抗体生産を引き出す全ての物質）に適したあらゆる物質の分析 のために構成さね、そして、水媒体において抗体を特定的に拘束する。例えば、 本発明に係るＭＡＣ（微量分析カード）は、プロゲステロン（妊娠試験）、特別 なタンパク質（ＡＩＤＳウィルスのタンパク質皮膜のような病理学１示される毒 素その他のタンパク質）、または、多糖類（バクテリア細胞の壁面要素）の分析 に用いられる。

第１層は単一のサンプルを保持するために構成されているため、カード４００は 第４図および第５＠に示されるように構成さね、幾つかの凹部１４が第４１に設 けられ、それぞれの凹部はサンプルを保持するとともに独立して物質を試験する 。第４図および第５図に示す実施例ではカード４００はコカインを分析するため に構成さね、サンプル中にコカインが存在すると指示体が青色に変化する。カー ド４００は他の物質に対しても構成することができ、指示体も他のものを採用で きることは勿論である。好ましくは、−の凹部１４が負制御４０２（無色のまま である必要がある、すなわち、スペクトル特性を変化させることができない）の ためのものであり、他の一つの凹部１４が正制御４０４（青色に変色する、つま り、スペクトル特性を変化させる必要がある）のためのものであり、他の一つの 凹部１４が不知のサンプル４０６のためのものである。凹部の色彩はカードの背 面から読み出される。

本発明に係るカードの使用は、きわめて簡便であり、如何なる試薬も試験サンプ ルに付加する必要がなく、しかも、全てのタイミングはＭＡＣの構成によって調 節されている。分析は少量の疑わしきサンプルにいくらかの緩衝溶液を混合し、 この試験溶液を疑わしき物質の有無を表示するように構成されたＭＡＣの凹部に それぞれ滴下することにより実施される。

以上、本発明を説明したが、以下においては本発明をさらに具体化する。ただし 、以下述べる詳細な具体例は本発明の要旨を限定する意味で開示するものではな い。

具体的実施例 コカインに対する抗体とＰＣＰ　（ペンタクロルフェノール）はウサギの血清を 用いて作製した。コカインの抗体を、親和カラムクロマトグラフィによって純化 し、ＭＡＣ分析に使用するために必要な品質にした。ウサギに注入するためのコ カイン共役系の製法の概略は以下の通りである。

浄書（内容に変更なし） コカイン 浄書（内容に変更なし） 誘導コカインの分子は、ジアゾ結合を通じての担体タンノくり質として、牛科の 抗血清のタンパク質（ＢＳＡ）に、以下のようにして付加された。

コカインＢＳＡ共役系は、非反応なｐ−アミノコカインに移すために３回分解さ れて殺菌濾過された。注入はウサギに行わわ、抗体が成長したのちウサギからの 採血がおこなわれた。血漿はリン酸塩綴衝剤によって５０％薄めらね、親和力が 純粋化された。親和カラムはアラフィーゲル１０（活性固体担体）とｐ−アミノ コカインから調合され九拘束抗体は、０．ＯＩＭのＨＣＩによる溶出によって移 さね、０．１Ｍのアンモニウムカーボネートに対して分解さね、凍結乾燥された 。

コカインと酵素との共役系の製法の概略は以下の通りである。

ＨＲＰ＋ＮａｌＯｘ　−−−→ＨＲＰを含むアルデヒド＋ｐ−アミノコカインＮ 　ａ　Ｂ　Ｈｓ　ＣＮ 積分−−−−→ｐ−アミノコカインと西洋わさびのベロキシダーゼとの共役系こ の共役系は、ポリアクリルアミドゲル上のゲル等電子焦点により分解された。

酵素の検出は、基質を成長ゲルに供給するとともに形成される色彩帯を観察する ことによりなされる。

コカインへの抗体の種々の調製品は、ＭＡＣに構成したときに、様々な応答を引 き起こす。例えば、い（つかの調製品は全（完全なブランクー−数時間後でも何 の色も表れなかった。他の抗体調製品は着色されたブランクを与えた。薬品を含 んだ溶液が暗色であっても、そのブランクは数分後には同じ強度となった。良い ａ［製品は、酸（０，１Ｍ）を用いて親和カラムからコカインとともに抗体を溶 出させることにより得られた。酸の溶離液がＭＡＣの調製に用いられた。このよ うな手順で、中程度から高親和抗体のみがカラムに結合し、コカインは低親和抗 体に移った。酸は残りの高親和抗体に移った。低親和抗体は、まだ薬品と酵素と の共役系に拘束されているが、これは容易に解放し、高ブランクを生じる。

上述した技術的見地に基づけば、本発明について多くの改変が可能であることは 言うまでもない。したがって、添付した請求の範囲を逸脱しない限り、本発明は 以上述べられた以外の手法で実施されてもよい。

浄書（内容に変更なし） ＦＥ、２ 補正書の翻訳文の提出書（特許法第１８４条の８）平成５年３月８日

Claims (21)

【特許請求の範囲】
1. １．液体サンプル中の疑義物質を分析するためのカードであって、液体サンプル を収容するための少なくとも一つの凹部が内部に形成してある疎水補助層を有す る第１層と、 前記凹部の周囲内で少なくとも部分的に延び、前記第１層の下方に位置し、支持 体表面を有すると共に、通過する液体の速度を適正化するための手段を有する第 ２層と、 前記凹部の周囲内で少なくとも部分的に延び、前記液体の速度を適正化する手段 の下に位置し、前記凹部中に収容された液体サンプル中の疑義となる物質の濃度 に直接比例して信号を生成する指示体が含浸された超吸収体を有する第３層とを 有するカード。
2. ２．前記支持体表面が、メンブレン膜の表面である請求項１のカード。
3. ３．前記物質に対して特定される抗体−酵素の共役系または、前記物質と酵素と の共役系をさらに有し、前記物質に対して特定される抗体−酵素の共役系または 、前記物質−酵素の共役系が、前記第１層または第２層内にあり、前記指示体前 記酵素のための基質出ある請求項１のカード。
4. ４．前記カードが、競争分析のために形式化されている請求項３のカード。
5. ５．前記カードが、置換分析のために形式化されている請求項３のカード。
6. ６．前記支持体表面が、予め上に吸収された物質を持つ前記抗体−酵素の共役系 、非共役系の状態の前記物質、予め上に吸収された前記物質に対して特定の抗体 を持つ物質−酵素の共役系、あるいは共有結合によって非共役状態の前記抗体に 対して結合されている請求項３のカード。
7. ７．前記支持体表面が、予め上に吸収された物質を持つ前記抗体−酵素の共役系 、非共役状態の前記物質、予め上に吸収された物質に対して特定の抗体を持つ物 質−酵素の共役系、あるいは非共有結合によって非共役状態の前記抗体に対して 結合されている請求項３のカード。
8. ８．液体サンプル中の疑義物質を分析するためのカードであって、前記物質に対 して特定の抗体−酵素の共役系あるいは前記物質と酵素との共役系と、 液体サンプルを収容するための少なくとも一つの凹部が内部に形成してある疎水 補助層を有する第１層と、 前記凹部の周囲内で少なくとも部分的に延び、前記第１層の下方に位置し、予め 上に吸収された前記物質を持つ抗体−酵素の共役系と、非共役状態の前記物質と 、予め上に吸収された前記物質に対して特定の抗体を持つ物質−酵素の共役系と 、非共役状態の前記抗体とから構成されるグループのうちの一つの構成要素に対 して化学的に結合されることにより直接装着された支持表面を有し、さらに、流 体の通過を適正化するための手段をも有する第２層と、前記凹部の周囲内で少な くとも部分的に延び、前記液体の速度を適正化する手段の下に位置し、前記酵素 のための基質が含浸してある超吸収支持体を有する第３層であって、前記酵素と 前記基質とが、前記基質上での前記酵素の動作によう、前記凹部内に収容された 液体サンプル内で疑義となる前記物質の濃度に直接比例する量の検出可能なスペ クトル変化を引き起こすように、選択される第３層とを有するカード。
9. ９．前記支持体表面がメンプレン膜の表面である請求項８のカード。
10. １０．前記抗体が、単クローンの抗体である請求項８のカード。
11. １１．前記支持体表面が、抗体−酵素の共役系に対して直接結合されて、抗体の 上に予め吸収された前記物質を有している請求項８のカード。
12. １２．前記物質が、前記支持体表面に対して直接結合され、前記第１層が前記抗 体−酵素の共役系を有する請求項８のカード。
13. １３．流体の流れ速度を適正化するための手段が、半透過メンプレン膜である請 求項８のカード。
14. １４．前記酵素のための物質が還元された染料前駆物質である請求項８のカード 。
15. １５．前記酵素が西洋わさびペルオキシダーゼである請求項１４のカード。
16. １６．前記超吸収層が過酸化水素の原料を有する請求項１５のカード。
17. １７．前記過酸化水素の原料が、過酸化ナトリウムあるいは過ホウ酸化ナトリウ ムである請求項１６のカード。
18. １８．前記還元化された染料が、４−クロロ−１−ナフト−ルと、Ｎ，Ｎ−ジエ チルフェニレンジアミン；Ｎ，Ｎ−ジメチルフェニレンジアミン；または３−メ チル−２ベンゾチアゾリナンヒドラゾン塩酸基と、ジメチルアミノベンゼンカル ボン酸の組合せである請求項１４のカード。
19. １９．少なくとも一つの正の制御セルと、少なくとも一つの負の制御セルとをさ らに有する請求項８のカード。
20. ２０．前記酵素がアルカリ性ホスホダーゼである請求項８のカード。
21. ２１．前記指示体がブロムクレゾールスルホフタレインモノリン酸塩である請求 項８のカード。