JPH0632639B2 - Ｄｎａ配列を即時に蛍光検出する方法 - Google Patents
Ｄｎａ配列を即時に蛍光検出する方法Info
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- JPH0632639B2 JPH0632639B2 JP3506001A JP50600191A JPH0632639B2 JP H0632639 B2 JPH0632639 B2 JP H0632639B2 JP 3506001 A JP3506001 A JP 3506001A JP 50600191 A JP50600191 A JP 50600191A JP H0632639 B2 JPH0632639 B2 JP H0632639B2
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
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- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 発明の背景 発明の分野 本発明は蛍光を用いるＤＮＡ配列の即時検出に関する。
背景の情報 Saiki等［Science 230,1350-1354(1985)］により開発さ
れたポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）はＤＮＡの小さな特
定の断片を迅速に増幅する方法を提供した。ＰＣＲ法は
ゲノムレベルでのＤＮＡ配列の分析を非常に簡単にし
た。
れたポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）はＤＮＡの小さな特
定の断片を迅速に増幅する方法を提供した。ＰＣＲ法は
ゲノムレベルでのＤＮＡ配列の分析を非常に簡単にし
た。
ＤＮＡ断片の検出または同定は２段階の操作を含む。第
１段階は注意深く選択されたプライマーを用いるＰＣＲ
増幅反応である。第２段階は所望のＤＮＡ断片が増幅さ
れたか否かを識別する。
１段階は注意深く選択されたプライマーを用いるＰＣＲ
増幅反応である。第２段階は所望のＤＮＡ断片が増幅さ
れたか否かを識別する。
本発明の以前には、第２段階はＰＣＲ増幅されたＤＮＡ
断片を正確に確認するために放射標識ＤＮＡプローブを
使用する必要があった。放射標識ＤＮＡプローブの使用
に関連する種々の問題がある。例えば、放射性プローブ
は取扱いに危険を伴い、そして標準的プロトコルである
32Ｐでの標識の場合、該プローブは短い可使時間（せい
ぜい数週間）を有する。さらに、放射性プローブの使用
は結果の即時検出を妨げる。すなわち、オートラジオグ
ラフの露光時間のための遅延が必要となる。
断片を正確に確認するために放射標識ＤＮＡプローブを
使用する必要があった。放射標識ＤＮＡプローブの使用
に関連する種々の問題がある。例えば、放射性プローブ
は取扱いに危険を伴い、そして標準的プロトコルである
32Ｐでの標識の場合、該プローブは短い可使時間（せい
ぜい数週間）を有する。さらに、放射性プローブの使用
は結果の即時検出を妨げる。すなわち、オートラジオグ
ラフの露光時間のための遅延が必要となる。
発明の要約 従って、放射性プローブを用いずに増幅ＤＮＡ配列を検
出する方法を提供することが本発明の目的である。
出する方法を提供することが本発明の目的である。
増幅ＤＮＡ配列を即時に検出する方法を提供することが
本発明のもう一つの目的である。
本発明のもう一つの目的である。
一実施態様において、本発明は以下の段階： ｉ）ＤＮＡ配列を非対称的に増幅し、 ii）増幅ＤＮＡ配列の断片に相補的な蛍光標識プローブ
を増幅ＤＮＡにハイブリッド形成させるが、該ハイブリ
ッド形成は溶液中で行われ、 iii）ハイブリッド形成したプローブをハイブリッド形
成していないプローブと電気泳動により分離し、そして iv）電気泳動の間に、蛍光検出によりＤＮＡ：プローブ
ハイブリッドの存在または不在を検出する、 からなる蛍光ＤＮＡ：ＤＮＡハイブリッドによりＤＮＡ
配列を検出する方法に関する。
を増幅ＤＮＡにハイブリッド形成させるが、該ハイブリ
ッド形成は溶液中で行われ、 iii）ハイブリッド形成したプローブをハイブリッド形
成していないプローブと電気泳動により分離し、そして iv）電気泳動の間に、蛍光検出によりＤＮＡ：プローブ
ハイブリッドの存在または不在を検出する、 からなる蛍光ＤＮＡ：ＤＮＡハイブリッドによりＤＮＡ
配列を検出する方法に関する。
別の実施態様において、本発明は以下の段階： ｉ）病原体に特有のＤＮＡ配列を非対称的に増幅し、 ii）増幅ＤＮＡ配列の断片に相補的な蛍光標識プローブ
を増幅ＤＮＡ配列にハイブリッド形成させるが、該ハイ
ブリッド形成は溶液中で行われ、 iii）ハイブリッド形成したプローブをハイブリッド形
成していないプローブと電気泳動により分離し、そして iv）電気泳動の間に、蛍光標識の検出によりＤＮＡ：プ
ローブハイブリッドの存在または不在を検出する、 からなる病原体に対して試料をスクリーニングする方法
に関する。
を増幅ＤＮＡ配列にハイブリッド形成させるが、該ハイ
ブリッド形成は溶液中で行われ、 iii）ハイブリッド形成したプローブをハイブリッド形
成していないプローブと電気泳動により分離し、そして iv）電気泳動の間に、蛍光標識の検出によりＤＮＡ：プ
ローブハイブリッドの存在または不在を検出する、 からなる病原体に対して試料をスクリーニングする方法
に関する。
さらに別の実施態様において、本発明は以下の段階： ｉ）その存在または不在が決定される種々の病原体の各
々に特有のＤＮＡ配列を非対称的に増幅し、 ii）病原体の増幅ＤＮＡ配列の断片に相補的な、検出さ
れる各病原体に対する蛍光標識プローブを増幅ＤＮＡに
ハイブリッド形成させるが、該ハイブリッド形成は溶液
中で行われ、 iii）電気泳動により試料を分離し、そして iv）蛍光標識の検出による各病原体に対するＤＮＡ：プ
ローブハイブリッドの存在または不在をレーザースキャ
ナー画像形成装置により電気泳動の間に検出する、 からなる種々の病原体の存在に対して試料を同時にスク
リーニングする方法に関する。
々に特有のＤＮＡ配列を非対称的に増幅し、 ii）病原体の増幅ＤＮＡ配列の断片に相補的な、検出さ
れる各病原体に対する蛍光標識プローブを増幅ＤＮＡに
ハイブリッド形成させるが、該ハイブリッド形成は溶液
中で行われ、 iii）電気泳動により試料を分離し、そして iv）蛍光標識の検出による各病原体に対するＤＮＡ：プ
ローブハイブリッドの存在または不在をレーザースキャ
ナー画像形成装置により電気泳動の間に検出する、 からなる種々の病原体の存在に対して試料を同時にスク
リーニングする方法に関する。
本発明の種々のその他の目的および利点は本発明の図面
および以下の記載から明らかになるであろう。
および以下の記載から明らかになるであろう。
図面の簡単な説明 図１，２および３は、本発明方法で得られた典型的結果
を示す３操作(3 runs)からのコンピュータスクリンのモ
ンタージュを示している。多様な試料と処理が用いられ
た。特記すべきは矢印のまたは指定のバンドである。こ
れらは検知されていたＨＩＶ陽性配列をしめしている。
を示す３操作(3 runs)からのコンピュータスクリンのモ
ンタージュを示している。多様な試料と処理が用いられ
た。特記すべきは矢印のまたは指定のバンドである。こ
れらは検知されていたＨＩＶ陽性配列をしめしている。
発明の詳細な説明 本発明は蛍光を用いるリアルタイムのＤＮＡ：ＤＮＡハ
イブリッドによるＤＮＡ配列の検知方法に関する。
イブリッドによるＤＮＡ配列の検知方法に関する。
本発明方法においては、特定のＤＮＡ配列が増幅され、
増幅された配列の存在または不在が蛍光でリアルタイム
に検知される。ＤＮＡは増幅される前に精製されてもよ
い。ＤＮＡ配列は、ギレンステン（Gyllensten）らによ
り「ＰＡＮＳ(USA),85,7652-7656(1985)」に記載されて
いるような慣用ＰＣＲ技術により非対象的に増幅され
る。対象的増幅は等しい数の＋および−ＤＮＡ鎖を産生
することになる。非対象増幅では等しい数の＋および−
ＤＮＡ鎖は造られない。非対象増幅は、一対のプライマ
ーの一方を過剰に、通常１０：１ないし１００：１、好
ましくは５０：１の割合で用いることにより達成され
る。採用すべき割合は検知される配列に依存するが、当
分野の通常の知識を有する者により容易に決定される。
両方の単一鎖の増幅が起きている間、豊富なプライマー
からより多くのプライマー化されたＤＮＡ鎖が産生す
る。
増幅された配列の存在または不在が蛍光でリアルタイム
に検知される。ＤＮＡは増幅される前に精製されてもよ
い。ＤＮＡ配列は、ギレンステン（Gyllensten）らによ
り「ＰＡＮＳ(USA),85,7652-7656(1985)」に記載されて
いるような慣用ＰＣＲ技術により非対象的に増幅され
る。対象的増幅は等しい数の＋および−ＤＮＡ鎖を産生
することになる。非対象増幅では等しい数の＋および−
ＤＮＡ鎖は造られない。非対象増幅は、一対のプライマ
ーの一方を過剰に、通常１０：１ないし１００：１、好
ましくは５０：１の割合で用いることにより達成され
る。採用すべき割合は検知される配列に依存するが、当
分野の通常の知識を有する者により容易に決定される。
両方の単一鎖の増幅が起きている間、豊富なプライマー
からより多くのプライマー化されたＤＮＡ鎖が産生す
る。
蛍光の検知は放射活性の検知よりも感受性が低いので、
非対象増幅は必要である。従って相補的鎖(complementa
ry strand)とＤＮＡ配列用の標識プローブとの間に自然
と起こる競争(competion)は低減されなければならな
い。検知される配列をコード化している一つのＤＮＡの
過剰産生は、必要としていた競争低減をもたらし、蛍光
でのその存在の検知を可能にする。
非対象増幅は必要である。従って相補的鎖(complementa
ry strand)とＤＮＡ配列用の標識プローブとの間に自然
と起こる競争(competion)は低減されなければならな
い。検知される配列をコード化している一つのＤＮＡの
過剰産生は、必要としていた競争低減をもたらし、蛍光
でのその存在の検知を可能にする。
増幅後、変性ＤＮＡ試料は、蛍光的に標識されたプロー
ブを伴う溶液中に混合され、そして所望ＤＮＡ配列への
プローブのハイブリッド形成が起こる。好ましくはプロ
ーブは、増幅された配列の中心領域に相補的である。プ
ローブはフルオロセインイソチオシアネートまたはテト
ラメチルロダミンのような蛍光性基で標識される〔Ｂｒ
ｕｍｂａｕｇｈ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）８
５，５６１０−５６１４（１９８８）；Ｒｕｔｈ ｅｔ
ａｌ．，ＤＮＡ ４，９３（１９８５）；Ｊａｂｌｏ
ｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ
Ｒｅｓ，１４（１５），６１１５−６１２３（１９８
６）；およびRuth,DNA3,123(1984)〕。
ブを伴う溶液中に混合され、そして所望ＤＮＡ配列への
プローブのハイブリッド形成が起こる。好ましくはプロ
ーブは、増幅された配列の中心領域に相補的である。プ
ローブはフルオロセインイソチオシアネートまたはテト
ラメチルロダミンのような蛍光性基で標識される〔Ｂｒ
ｕｍｂａｕｇｈ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）８
５，５６１０−５６１４（１９８８）；Ｒｕｔｈ ｅｔ
ａｌ．，ＤＮＡ ４，９３（１９８５）；Ｊａｂｌｏ
ｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ
Ｒｅｓ，１４（１５），６１１５−６１２３（１９８
６）；およびRuth,DNA3,123(1984)〕。
増幅されたＤＮＡおよび蛍光性プローブを含む試料は次
いで、有利にはポリアクリルアミドゲルで、電気泳動さ
れ、それは電気泳動操作中、リアルタイムで走査され
る。好ましい具体例においてはレーザースキャナー画像
形成装置が用いられる。分子のサイズおよび幾何学は分
子がゲルを通過する速度に影響を及ぼすので、標識され
たプローブと、標識されたプローブ：ＤＮＡハイブリッ
ドは、ハイブリッドされたプローブから遊離プローブ(f
ree probe)を分離させる異速度で走行し、検知装置好ま
しくはレーザースキャナー画像形成装置に、蛍光性プロ
ーブの興奮によるゲル上の分離バンドの検知を可能にす
る。
いで、有利にはポリアクリルアミドゲルで、電気泳動さ
れ、それは電気泳動操作中、リアルタイムで走査され
る。好ましい具体例においてはレーザースキャナー画像
形成装置が用いられる。分子のサイズおよび幾何学は分
子がゲルを通過する速度に影響を及ぼすので、標識され
たプローブと、標識されたプローブ：ＤＮＡハイブリッ
ドは、ハイブリッドされたプローブから遊離プローブ(f
ree probe)を分離させる異速度で走行し、検知装置好ま
しくはレーザースキャナー画像形成装置に、蛍光性プロ
ーブの興奮によるゲル上の分離バンドの検知を可能にす
る。
検知装置は輝く焦点の合った特定波長の光源、例えばレ
ーザーにより供給されるものからなり、それは、移動す
るバンドが電気泳動操作中に光源を通過させるので、プ
ローブ上の蛍光標識を興奮させ、リーダー例えば光セル
(photocell)は、移動するバンドがリーダーを通過させ
るので、興奮した蛍光性プローブから放たれた発光を検
知する。装置は更に、それ自身受信されるデータを記録
するリダーと連結したコンピュータを含んでいてもよ
い。本発明方法に使用するのに適するレーザースキャナ
ー画像形成装置には、蛍光性ＤＮＡ配列装置(fluoresce
nt DNA sequencing machine)、例えばデュポン デネモ
アス(Dupont de Nemours)社製、アプライド バイオシ
ステム(Applied Biosystems)社製のもの、また好ましく
は「ＰＡＮＳ(USA)85,5610-5614,(1988)」に記載されて
いるリ−コー社(Li-Cor,Inc.)製の配列装置が含まれる
が、限定されるものではない。
ーザーにより供給されるものからなり、それは、移動す
るバンドが電気泳動操作中に光源を通過させるので、プ
ローブ上の蛍光標識を興奮させ、リーダー例えば光セル
(photocell)は、移動するバンドがリーダーを通過させ
るので、興奮した蛍光性プローブから放たれた発光を検
知する。装置は更に、それ自身受信されるデータを記録
するリダーと連結したコンピュータを含んでいてもよ
い。本発明方法に使用するのに適するレーザースキャナ
ー画像形成装置には、蛍光性ＤＮＡ配列装置(fluoresce
nt DNA sequencing machine)、例えばデュポン デネモ
アス(Dupont de Nemours)社製、アプライド バイオシ
ステム(Applied Biosystems)社製のもの、また好ましく
は「ＰＡＮＳ(USA)85,5610-5614,(1988)」に記載されて
いるリ−コー社(Li-Cor,Inc.)製の配列装置が含まれる
が、限定されるものではない。
その相補的ＤＮＡ配列の存在下、蛍光性プローブはそれ
とハイブリッド形成し、リーダーにより検知されるプロ
ーブの移動を変化させる。移動におけるシフトは、リー
ダーを通過走行されられるプローブにとって必要な時間
の長さを変化させる。従って検知器を通過する最初の蛍
光シグナルはハイブリッド形成していないプローブであ
る。第二のシグナルは全ての試料に殆ど存在する“共通
バンド”である。第三のバンドは、もし存在するとすれ
ば、増幅したＤＮＡ：ハイブリッド形成したプローブを
表す。増幅したＤＮＡ配列の存在の検知は、オートラジ
オグラフィー露光時間が不要なので、リアルタイムであ
る。
とハイブリッド形成し、リーダーにより検知されるプロ
ーブの移動を変化させる。移動におけるシフトは、リー
ダーを通過走行されられるプローブにとって必要な時間
の長さを変化させる。従って検知器を通過する最初の蛍
光シグナルはハイブリッド形成していないプローブであ
る。第二のシグナルは全ての試料に殆ど存在する“共通
バンド”である。第三のバンドは、もし存在するとすれ
ば、増幅したＤＮＡ：ハイブリッド形成したプローブを
表す。増幅したＤＮＡ配列の存在の検知は、オートラジ
オグラフィー露光時間が不要なので、リアルタイムであ
る。
擬陰性の数の減少は、非対称増幅化が行われる前の追加
ＰＣＲ（booster PCR）〔Amplifications,Issue 3,(Sep
t.1989)PP.12-13,(1989)〕に先立つＤＮＡの最初の精製
により得られる。ＤＮＡは当分野で既知の技術により試
料から精製される。
ＰＣＲ（booster PCR）〔Amplifications,Issue 3,(Sep
t.1989)PP.12-13,(1989)〕に先立つＤＮＡの最初の精製
により得られる。ＤＮＡは当分野で既知の技術により試
料から精製される。
本明細書で使用される“リアルタイム（即時）”は電気
泳動操作の時間とその結果が得られる時間との間に遅れ
がないことを意味する。
泳動操作の時間とその結果が得られる時間との間に遅れ
がないことを意味する。
本発明は、例えばヘルペス、梅毒、肝炎およびＨＴＬＶ
特にＨＩＶのような病原体を早期に検知するめに使用で
きる。新生物の発達前に癌遺伝子配列を検知すること、
および遺伝病を検知することも可能である。そのような
検知方法に使用されるのに適するプローブは、当分野の
通常の知識を有する者により容易に選択され得る。使用
されるプローブは、存在または不在が検知される病原体
に依存するであろう。
特にＨＩＶのような病原体を早期に検知するめに使用で
きる。新生物の発達前に癌遺伝子配列を検知すること、
および遺伝病を検知することも可能である。そのような
検知方法に使用されるのに適するプローブは、当分野の
通常の知識を有する者により容易に選択され得る。使用
されるプローブは、存在または不在が検知される病原体
に依存するであろう。
好ましい具体例において、本発明の方法は、ＨＩＶ感染
試料と実験室で調製された非感染試料とを識別すること
ができる。本発明はまた患者から取った試料中のＨＩＶ
ＤＮＡ配列の存在を検知するのにも使用することがで
きる。
試料と実験室で調製された非感染試料とを識別すること
ができる。本発明はまた患者から取った試料中のＨＩＶ
ＤＮＡ配列の存在を検知するのにも使用することがで
きる。
一具体例において、本発明は試料、例えば血液サンプル
の、幾つかの病原体の存在についての同時スクリーニン
グに関する。同時スクリーニングは、例えば異なる病原
体に各々特異的な異なるサイズの幾つかのプローブで試
料をスクリーニングすることにより行われ得る。この場
合、試料中の各病原体の存在は、プローブサイズの差異
により独特な速度で移動するハイブリッド形成したＤＮ
Ａ：プローブの独特なバンドを結果としてもたらす。各
ハイブリッド形成したバンドは例えばレーザースキャナ
ー画像形成装置により検知することができ、またその移
動速度により他のハイブリッド形成したバンドと識別す
ることができる。
の、幾つかの病原体の存在についての同時スクリーニン
グに関する。同時スクリーニングは、例えば異なる病原
体に各々特異的な異なるサイズの幾つかのプローブで試
料をスクリーニングすることにより行われ得る。この場
合、試料中の各病原体の存在は、プローブサイズの差異
により独特な速度で移動するハイブリッド形成したＤＮ
Ａ：プローブの独特なバンドを結果としてもたらす。各
ハイブリッド形成したバンドは例えばレーザースキャナ
ー画像形成装置により検知することができ、またその移
動速度により他のハイブリッド形成したバンドと識別す
ることができる。
異なる色の蛍光性基で各々標識された幾つかのプローブ
を伴う試料のスクリーニングは、試料中の幾つかの病原
体の検知をも可能にする。この場合、レーザースキャナ
ー画像形成装置は異色蛍光性基を検知できなければなら
ない。異色の蛍光性基で標識された各ＤＮＡ：プローブ
のハイブリッド形成したバンドの存在は、ハイブリッド
形成したバンドが電気泳動培地を通じて移動するので例
えばレーザースキャナー画像形成装置により検知され、
また互いに識別され得る。
を伴う試料のスクリーニングは、試料中の幾つかの病原
体の検知をも可能にする。この場合、レーザースキャナ
ー画像形成装置は異色蛍光性基を検知できなければなら
ない。異色の蛍光性基で標識された各ＤＮＡ：プローブ
のハイブリッド形成したバンドの存在は、ハイブリッド
形成したバンドが電気泳動培地を通じて移動するので例
えばレーザースキャナー画像形成装置により検知され、
また互いに識別され得る。
本発明の好ましい具体例を示す目的で、下記の非限定的
な実施例においては、細胞中に存在するＨＩＶ ＤＮＡ
が増幅され、次いで蛍光性プローブを用いて検知され
た。しかしながら、その説明が他のＤＮＡ配列の検知に
も一般的に適用されることは理解されるべきである。
な実施例においては、細胞中に存在するＨＩＶ ＤＮＡ
が増幅され、次いで蛍光性プローブを用いて検知され
た。しかしながら、その説明が他のＤＮＡ配列の検知に
も一般的に適用されることは理解されるべきである。
実施例 細胞分解物 試料を以前記述したのと同様にして調製した（クマール
他．，AIDS Research and Human Retroviruses 5,345-3
53(1989)］．臨床試料とＨＩＶ−１と白血病ウイルス
（ＨＴＬＶ−１）で感染したヒトＴ細胞を、ＮＩＨ安全
指針の生物安全レベル３の実験室中で取り扱った。
他．，AIDS Research and Human Retroviruses 5,345-3
53(1989)］．臨床試料とＨＩＶ−１と白血病ウイルス
（ＨＴＬＶ−１）で感染したヒトＴ細胞を、ＮＩＨ安全
指針の生物安全レベル３の実験室中で取り扱った。
Ｔリンパ球細胞系Ｈ９は、ある種の実験では陰性対照と
して使用した。大部分の臨床試料は、ヘパリン処理した
血液試料から単離した、末梢血液単核細胞であった。そ
の細胞を、生きたまま調速(controlled-rate)冷凍器で
冷凍し、−７０℃で保存した。ＰＣＲ解析のためのＤＮ
Ａ基質は、細胞をリン酸塩緩衝液（ＰＢＳ），ｐＨ７．
５中で３回洗浄し、次いで所望の濃度で蒸留水中に懸濁
することにより調製した。ＰＣＲ反応のためには、細胞
を１ｍ１当り１−５×１０６で細胞を懸濁した。細胞を
分解し、そしてウイルスは９５℃で２０分間加熱するこ
とにより不活性化した。分解物を−２０℃で貯蔵した。
して使用した。大部分の臨床試料は、ヘパリン処理した
血液試料から単離した、末梢血液単核細胞であった。そ
の細胞を、生きたまま調速(controlled-rate)冷凍器で
冷凍し、−７０℃で保存した。ＰＣＲ解析のためのＤＮ
Ａ基質は、細胞をリン酸塩緩衝液（ＰＢＳ），ｐＨ７．
５中で３回洗浄し、次いで所望の濃度で蒸留水中に懸濁
することにより調製した。ＰＣＲ反応のためには、細胞
を１ｍ１当り１−５×１０６で細胞を懸濁した。細胞を
分解し、そしてウイルスは９５℃で２０分間加熱するこ
とにより不活性化した。分解物を−２０℃で貯蔵した。
ＤＮＡ精製とＰＣＲ増幅 ＤＮＡ配列の存在または非存在の検出のためには、ＤＮ
Ａの精製は必要ではないが、非対称的増幅に先立つＰＣ
Ｒ増幅は、偽陽性の数を減少させることができる。精製
だけでも、偽陽性の数における若干の減少を招く。
Ａの精製は必要ではないが、非対称的増幅に先立つＰＣ
Ｒ増幅は、偽陽性の数を減少させることができる。精製
だけでも、偽陽性の数における若干の減少を招く。
ＤＮＡを以前に記述したようにフェノール抽出に次ぐエ
タノール沈澱により精製した［マニアチス他，１９８
２．分子クローニング：実験室操作法、コールド・スプ
リング・ハーバー・ラボラトリ，ニューヨーク(Molecul
ar Cloning： A Laboratory Manual,Cold Spring Harbo
r Laboratory,NY)。
タノール沈澱により精製した［マニアチス他，１９８
２．分子クローニング：実験室操作法、コールド・スプ
リング・ハーバー・ラボラトリ，ニューヨーク(Molecul
ar Cloning： A Laboratory Manual,Cold Spring Harbo
r Laboratory,NY)。
ＰＣＲ増幅は生成物の特異性を高めるために実施した
［増幅，Issue 3,pp.12-13,9月，1989年］。増幅するＨ
ＩＶ配列の期待量について１０７倍モル過剰のプライマ
ーを使用して精製したＤＮＡを増幅した。その過剰のプ
ライマーを使用して１５−２０周期実施した。
［増幅，Issue 3,pp.12-13,9月，1989年］。増幅するＨ
ＩＶ配列の期待量について１０７倍モル過剰のプライマ
ーを使用して精製したＤＮＡを増幅した。その過剰のプ
ライマーを使用して１５−２０周期実施した。
ＰＣＲ ＰＣＲは、実質的には以前記述したようにして実施した
［サイキ他，Science 239,487-491(1988)およびサイキ
他，Science 230,1350-1354(1985)および米国特許第4,6
83,202号および第4,683,195号］。市販の試薬キットを
使用した（パーキン・エルマー−セタス）。増幅は、３
０μ１細胞分解物（５×１０５個までの細胞）と２μ１
（５単位）のＴａｑＤＮＡポリメラーゼを含有する全容
積２００μ１で実施した。全てのプライマーをゲル精製
し、１００μｇ／ｍｌで蒸留水中で懸濁した。非対称の
増幅は、プライマー対の５０：１比を使用して実施し、
より多いプライマーからプライムした鎖の過剰をもたら
した。試料を９４℃で１分間変性し、２分間にわたり５
２℃でアニールし、各々の周期の間３分間にわたり７２
℃で重合した。合計３５回のＰＣＲは、ＤＮＡ温度周期
化機(thermal DNA cycler machine)で実施した（パーキ
ン・エルマー−セタス）。増幅した試料を−２０℃で貯
蔵した。
［サイキ他，Science 239,487-491(1988)およびサイキ
他，Science 230,1350-1354(1985)および米国特許第4,6
83,202号および第4,683,195号］。市販の試薬キットを
使用した（パーキン・エルマー−セタス）。増幅は、３
０μ１細胞分解物（５×１０５個までの細胞）と２μ１
（５単位）のＴａｑＤＮＡポリメラーゼを含有する全容
積２００μ１で実施した。全てのプライマーをゲル精製
し、１００μｇ／ｍｌで蒸留水中で懸濁した。非対称の
増幅は、プライマー対の５０：１比を使用して実施し、
より多いプライマーからプライムした鎖の過剰をもたら
した。試料を９４℃で１分間変性し、２分間にわたり５
２℃でアニールし、各々の周期の間３分間にわたり７２
℃で重合した。合計３５回のＰＣＲは、ＤＮＡ温度周期
化機(thermal DNA cycler machine)で実施した（パーキ
ン・エルマー−セタス）。増幅した試料を−２０℃で貯
蔵した。
プローブ−シフト検定 増幅したＨＩＶ配列の存在は、精確に増幅した配列の中
央部に合うオリゴヌクレオチドとのハイブリッド形成に
より非両義的に同定された。ＨＩＶ配列は、液体ハイブ
リッド形成−ゲル遅延検定［クマール他，Oncogene 3,6
47-651(1988)］により検定した。１０μ１のＤＮＡ試料
を、蛍光で標識したプローブの６μ１と混合し、０．７
５Ｍ ＮａＣｌを含有する２５μ１の最終反応容積にす
る。使用した一つのプローブは２０塩基の長さであり、
２か所のチミジン部位で２個の蛍光基で２重に標識して
ある。他の一つのプローブは、３２塩基の長さであり、
内部チミジン部位で２個の蛍光基を持つ。増幅した領域
と両方のプローブは、ＨＩＶのＧＡＧ遺伝子の領域から
のものである。
央部に合うオリゴヌクレオチドとのハイブリッド形成に
より非両義的に同定された。ＨＩＶ配列は、液体ハイブ
リッド形成−ゲル遅延検定［クマール他，Oncogene 3,6
47-651(1988)］により検定した。１０μ１のＤＮＡ試料
を、蛍光で標識したプローブの６μ１と混合し、０．７
５Ｍ ＮａＣｌを含有する２５μ１の最終反応容積にす
る。使用した一つのプローブは２０塩基の長さであり、
２か所のチミジン部位で２個の蛍光基で２重に標識して
ある。他の一つのプローブは、３２塩基の長さであり、
内部チミジン部位で２個の蛍光基を持つ。増幅した領域
と両方のプローブは、ＨＩＶのＧＡＧ遺伝子の領域から
のものである。
反応は、パラフィンで覆って、ＤＮＡを変性するため
に、１０分間に９７℃で加熱し、次いでＤＮＡ熱周期化
機（thermal DNA cycler）（パーキン・エルマー−セタ
ス）でハイブリッド形成のために７９℃の最適アニーリ
ング温度に急速に冷却した。ハイブリッド形成を２時間
にわたり行い、氷上冷却して終了した。次いで各々の試
料を６％の非変性アクリルアミドゲルの井戸（well）に
入れ、電気泳動した。
に、１０分間に９７℃で加熱し、次いでＤＮＡ熱周期化
機（thermal DNA cycler）（パーキン・エルマー−セタ
ス）でハイブリッド形成のために７９℃の最適アニーリ
ング温度に急速に冷却した。ハイブリッド形成を２時間
にわたり行い、氷上冷却して終了した。次いで各々の試
料を６％の非変性アクリルアミドゲルの井戸（well）に
入れ、電気泳動した。
蛍光検出 電気泳動装置を、リ−コル社（Li-Cor,Inc.）製の配列
解析・レーザ走査−像装置(seqencing laser scanner-i
maging device)を使用して実働時間内に走査した。検出
器を最初に通る蛍光シグナルは、ハイブリッド形成され
ていないプローブであった。第２番目のシグナルは、殆
ど全ての試料に存在する「共通帯」であった。第３番目
の帯またはシグナルは、もし存在するならば、興味のあ
る増幅したＤＮＡ区分を表していた。
解析・レーザ走査−像装置(seqencing laser scanner-i
maging device)を使用して実働時間内に走査した。検出
器を最初に通る蛍光シグナルは、ハイブリッド形成され
ていないプローブであった。第２番目のシグナルは、殆
ど全ての試料に存在する「共通帯」であった。第３番目
の帯またはシグナルは、もし存在するならば、興味のあ
る増幅したＤＮＡ区分を表していた。
＊＊＊＊ 上で引用した全ての参考文献の全内容は、ここでは参照
により包含される。
により包含される。
ここに記述した実施例と実施態様は説明の目的だけのも
のであることそしてそれらを照合してのいろいろの変形
と変化は当業者には示唆されておりそして本願の精神と
範囲と請求の範囲内に含まれることは明瞭である。
のであることそしてそれらを照合してのいろいろの変形
と変化は当業者には示唆されておりそして本願の精神と
範囲と請求の範囲内に含まれることは明瞭である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 クマー，ラメシュ アメリカ合衆国，ニュージャージー 08534，ペニントン，ヤード ロード 60
Claims (10)
- 【請求項１】以下の段階： ｉ）ＤＮＡ配列を非対称的に増幅し、 ii）増幅ＤＮＡの断片に相補的な蛍光標識プローブを増
幅ＤＮＡにハイブリッド形成させるが、該ハイブリッド
形成は溶液中で行われ、 iii）ハイブリッド形成したプローブをハイブリッド形
成していないプローブと電気泳動により分離し、そして iv）電気泳動の間に、蛍光検出によりＤＮＡ：プローブ
ハイブリッドの存在または不在を検出する、 からなる蛍光ＤＮＡ：ＤＮＡハイブリッドによりＤＮＡ
配列を検出する方法。 - 【請求項２】段階ｉ）の前に、以下の段階： ｉ）試料からのＤＮＡを精製し、そして ii）過剰な約１０７倍モルのプライマーの存在下でＤＮ
Ａ配列を増幅する、 をさらに含む請求項１記載の方法。 - 【請求項３】ＤＮＡ：プローブハイブリッドがレーザー
スキャナー−画像形成装置で検出される請求項１記載の
方法。 - 【請求項４】プローブがフルオレセインで標識される請
求項１記載の方法。 - 【請求項５】以下の段階： ｉ）病原体に特有のＤＮＡ配列を非対称的に増幅し、 ii）増幅ＤＮＡの断片に相補的な蛍光標識プローブを増
幅ＤＮＡ配列にハイブリッド形成させるが、該ハイブリ
ッド形成は溶液中で行われ、 iii）ハイブリッド形成したプローブをハイブリッド形
成していないプローブと電気泳動により分離し、そして iv）電気泳動の間に、蛍光標識の検出によりＤＮＡ：プ
ローブハイブリッドの存在または不在を検出する、 からなる病原体に対して試料をスクリーニングする方
法。 - 【請求項６】病原体がＨＩＶである請求項５記載の方
法。 - 【請求項７】試料が血液である請求項５記載の方法。
- 【請求項８】以下の段階： ｉ）その存在または不在が決定される種々の病原体の各
々に特有のＤＮＡ配列を非対称的に増幅し、 ii）蛍光標識プローブを増幅ＤＮＡに溶液中でハイブリ
ッド形成させ、 iii）電気泳動により試料を分離し、そして iv）蛍光標識の検出による各病原体に対するＤＮＡ：プ
ローブハイブリッドの存在または不在をレーザースキャ
ナー画像形成装置により電気泳動の間に検出する、 からなる種々の病原体の存在に対して試料を同時にスク
リーニングする方法。 - 【請求項９】各プローブが異なる着色蛍光基で標識さ
れ、そしてそれによりレーザースキャナー画像形成装置
で識別可能である請求項８記載の方法。 - 【請求項１０】各プローブが異なる大きさであり、そし
てそれによりレーザースキャナー画像形成装置で識別可
能である請求項８記載の方法。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US48457390A | 1990-02-26 | 1990-02-26 | |
| US484,573 | 1990-02-26 | ||
| PCT/US1991/001176 WO1991013174A1 (en) | 1990-02-26 | 1991-02-21 | A method for the fluorescent detection of a dna sequence in real time |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05503215A JPH05503215A (ja) | 1993-06-03 |
| JPH0632639B2 true JPH0632639B2 (ja) | 1994-05-02 |
Family
ID=23924709
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3506001A Expired - Lifetime JPH0632639B2 (ja) | 1990-02-26 | 1991-02-21 | Ｄｎａ配列を即時に蛍光検出する方法 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
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| EP (1) | EP0516753A4 (ja) |
| JP (1) | JPH0632639B2 (ja) |
| AU (1) | AU638568B2 (ja) |
| CA (1) | CA2076853A1 (ja) |
| WO (1) | WO1991013174A1 (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU656965B2 (en) * | 1991-04-11 | 1995-02-23 | Dade Behring Inc. | Detection of DNA/RNA by fluorescence polarization |
| EP0582256A3 (en) * | 1992-08-06 | 1997-09-17 | Hitachi Ltd | Polynucleotide detecting method and apparatus |
| JP4185185B2 (ja) * | 1997-05-08 | 2008-11-26 | 征夫 軽部 | 部分二重鎖ｄｎａを利用したｄｎａの検出方法 |
| AU730491B2 (en) | 1997-05-16 | 2001-03-08 | Exact Sciences Corporation | Electrophoretic analysis of molecules using immobilized probes |
| DE19808534A1 (de) * | 1998-02-28 | 1999-09-02 | Roche Diagnostics Gmbh | Verfahren zum Nachweis hochkonzentrierter Nukleinsäuren |
| US6391544B1 (en) * | 1998-05-15 | 2002-05-21 | Abbott Laboratories | Method for using unequal primer concentrations for generating nucleic acid amplification products |
| WO2003040397A2 (en) * | 2001-10-25 | 2003-05-15 | Gorilla Genomics, Inc. | Asymmetric pcr with nuclease-free polymerase or nuclease-resistant molecular beacons |
| DE10253966B4 (de) * | 2002-11-19 | 2005-03-24 | Clondiag Chip Technologies Gmbh | Microarray-basiertes Verfahren zur Amplifikation und Detektion von Nukleinsäuren in einem kontinuierlichen Prozess |
| AU2003300370A1 (en) * | 2002-12-23 | 2004-07-22 | Decode Genetics Ehf. | Single nucleotide polymorphism detection using nucleotide depletion genotyping |
| AU2008282780B2 (en) * | 2007-08-01 | 2014-04-17 | Dana- Farber Cancer Institute | Enrichment of a target sequence |
| JP5795341B2 (ja) | 2010-03-08 | 2015-10-14 | デイナ ファーバー キャンサー インスティチュート，インコーポレイテッド | 参照ブロック配列によるｆｕｌｌＣＯＬＤ−ＰＣＲ濃縮 |
| WO2012135664A2 (en) | 2011-03-31 | 2012-10-04 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Methods and compositions to enable multiplex cold-pcr |
| US9133490B2 (en) | 2012-05-16 | 2015-09-15 | Transgenomic, Inc. | Step-up method for COLD-PCR enrichment |
| US11371090B2 (en) | 2016-12-12 | 2022-06-28 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Compositions and methods for molecular barcoding of DNA molecules prior to mutation enrichment and/or mutation detection |
| WO2019023243A1 (en) | 2017-07-24 | 2019-01-31 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | METHODS AND COMPOSITIONS FOR SELECTING AND AMPLIFYING DNA TARGETS IN A SINGLE REACTION MIXTURE |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4683202A (en) * | 1985-03-28 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying nucleic acid sequences |
| US4855225A (en) * | 1986-02-07 | 1989-08-08 | Applied Biosystems, Inc. | Method of detecting electrophoretically separated oligonucleotides |
| SE8802573D0 (sv) * | 1988-07-08 | 1988-07-08 | Wallac Oy | Multi-label time-resolved fluorescence analysis of nucleic acid sequences using lanthanide chelates |
-
1991
- 1991-02-21 WO PCT/US1991/001176 patent/WO1991013174A1/en not_active Application Discontinuation
- 1991-02-21 JP JP3506001A patent/JPH0632639B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1991-02-21 CA CA002076853A patent/CA2076853A1/en not_active Abandoned
- 1991-02-21 AU AU74955/91A patent/AU638568B2/en not_active Ceased
- 1991-02-21 EP EP19910905999 patent/EP0516753A4/en not_active Withdrawn
-
1992
- 1992-07-27 US US07/920,013 patent/US6197499B1/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US6197499B1 (en) | 2001-03-06 |
| AU638568B2 (en) | 1993-07-01 |
| EP0516753A1 (en) | 1992-12-09 |
| JPH05503215A (ja) | 1993-06-03 |
| CA2076853A1 (en) | 1991-08-27 |
| EP0516753A4 (en) | 1994-05-18 |
| WO1991013174A1 (en) | 1991-09-05 |
| AU7495591A (en) | 1991-09-18 |
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