JPH06321880A - 抗体−薬物複合体 - Google Patents

抗体−薬物複合体

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JPH06321880A
JPH06321880A JP6057065A JP5706594A JPH06321880A JP H06321880 A JPH06321880 A JP H06321880A JP 6057065 A JP6057065 A JP 6057065A JP 5706594 A JP5706594 A JP 5706594A JP H06321880 A JPH06321880 A JP H06321880A
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drug
antibody
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reaction
antibodies
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JP6057065A
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Russell Lavern Barton
ラッセル・レイバーン・バートン
Deborah L Guttman-Carlisle
デボラ・レイン・ガットマン−カーライル
Gary A Koppel
ゲイリー・アレン・コッペル
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Eli Lilly and Co
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Abstract

(57)【要約】 【目的】 新規な抗体-薬物複合体を提供する。 【構成】 式(Ｉ)： 【化１】 ［Ｒ1はＣ1〜Ｃ4アルキルを表す。Ｒ2は反応に利用でき
るアミノ、ヒドロキシまたはチオール官能性を有する１
価の薬物誘導体を表す。ｍは１から１０までの整数を表
す。Ａｂは薬物の送達が望まれる細胞、組織または病原
体に関連する抗原を認識する抗体またはその抗原認識性
断片を表す。］で示される生理学的に許容される薬物複
合体とその製造に使用する中間体を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】本発明は新しい免疫複合体、その製造中間
体、医薬組成物および使用法に関する。本発明は有機化
学、薬化学および免疫学の分野に属し、医薬的に活性な
化合物の大投与量を望ましくない細胞、組織および哺乳
動物の病原体に誘導するための運搬体である免疫複合体
を提供する。
【０００２】近年、薬化学者たちは疾患を治療するため
のより特異的で強力な薬剤を開発するべく研究を重ねて
きた。癌や細胞の特異的な異常性の発生によって作用す
る他の疾患の場合、有用な薬物のほとんどは異常細胞を
殺すことによって機能する細胞毒性型のものであった。
このような薬物は極めて強力であり、その受容者にとっ
ては有害な場合や、さらには生命を脅かす場合すらあ
る。薬物を宿主内の特定の細胞、組織または病原体に指
向させようとする試みのなかで、上述のような薬物(と
りわけ高度に細胞毒性のある薬物)を全身性の投与では
なく冒されている領域または病原体に直接誘導するため
の機構を開発しようとする努力がなされてきた。しかし
抗体-薬物複合体で医療的用途のために認可されている
ものはない。本発明は、哺乳動物における細胞／組織／
病原体特異的薬物送達に有用な新規免疫複合体とその中
間体を提供することによって、免疫複合体技術の範囲を
拡張するものである。
【０００３】本発明の免疫複合体は、抗体(好ましくは
誘導剤として作用するモノクローナル抗体)、治療を必
要としている細胞、組織または宿主に対して活性を有す
る医薬的に活性な化合物、および上記抗体を上記医薬的
に活性な化合物に結合または連結するための有機化合物
(リンカー)からなる。これらの免疫複合体を製造するた
めの中間体をも提供する。
【０００４】本発明は、式(Ｉ)：
【化４】 ［Ｒ1はＣ1〜Ｃ4アルキルを表す。Ｒ2は反応に利用でき
るアミノ、ヒドロキシまたはチオール官能性を有する１
価の薬物誘導体を表す。ｍは１から１０までの整数を表
す。Ａｂは薬物の送達が望まれる細胞、組織または病原
体に関連する抗原を認識する抗体またはその抗原認識性
断片を表す。］で示される生理学的に許容される薬物複
合体を提供する。
【０００５】また本発明は、式(ＩＩ)：
【化５】 ［Ｒ1はＣ1〜Ｃ4アルキルを表す。Ｒ4はカルボキシ保護
基を表す。Ｒ5はＨ2、＝Ｃ(ＯＨ)2、＝ＣＨＯＲ6または
＝ＣＨＳＲ6を表す。Ｒ6はＣ1〜Ｃ4アルキルを表す。］
で示される中間体をも提供する。
【０００６】さらに本発明は、式(ＩＩＩ)：
【化６】 ［Ｒ1はＣ1〜Ｃ4アルキルを表す。Ｒ2は反応に利用でき
るアミノ、ヒドロキシまたはチオール官能性を有する１
価の薬物誘導体を表す。Ｒ7はＨ、カルボキシ保護基、
カルボキシ活性化基またはカルボキシ基の塩を完成させ
る部分を表す。］で示される中間体をも提供する。
【０００７】さらに本発明は、本発明の免疫複合体と非
経口投与できる媒質からなる医薬組成物をも提供する。
さらに、医薬的に活性な化合物(薬物)による治療を必要
とする患者に本発明の免疫複合体を非経口投与すること
からなる治療法をも提供する。
【０００８】本明細書では一貫してすべての温度を摂氏
温度で表す。百分率、濃度などの表現はすべて特にこと
わらない限り重量単位である。薬物複合体の投与量と濃
度に関する記載はすべて複合体中に含有される薬物の量
または濃度に換算されている。
【０００９】上記の式で用いた一般的な化学用語と特殊
な化学用語は有機化学、とりわけアミノ酸化学における
通常の意味を有する。例えば「Ｃ1〜Ｃ4アルキル」とい
う用語は１〜４炭素原子からなる直線状または分枝状の
脂肪族鎖を意味し、メチル、エチル、プロピル、イソプ
ロピル、ｎ-ブチル、イソブチル、ｓｅｃ-ブチルおよび
ｔｅｒｔ-ブチルを包含する。
【００１０】Ｒ4とＲ7のカルボキシ保護基(Ｒ7がＨでも
活性化基でもない場合)とは、一般に最終的な医薬複合
体には認められないが、合成過程のある期間、保護しな
ければ化学的操作の過程で反応してしまうかもしれない
基を保護するために意図的に導入され、その後の合成段
階で除去される基を意味する。このような保護基を保持
する化合物は主として化学中間体として重要であるの
で、それらの正確な構造は決定的な問題ではない。例え
ばProtective Groups in Organic Chemistry(Plenum Pr
ess,ロンドンおよびニューヨーク,1973)、Green,T.W.ら
編,Protective Groups in Organic Synthesis(Wiley,ニ
ューヨーク,1981)、Schroederら編,The Peptides,第1巻
(Academic Press,ロンドンおよびニューヨーク,1965)な
どを含むいつかの標準的な書物に数多くの反応が記述さ
れている。好ましいＲ4およびＲ7カルボキシ保護基には
Ｃ1〜Ｃ4アルキル、置換されていてもよいフェニルおよ
び置換されていてもよいベンジルが含まれる。「置換さ
れていてもよいフェニル」という用語は、ハロ(ブロ
モ、クロロ、フルオロおよびヨード)、ニトロ、Ｃ1〜Ｃ
4アルキルおよびＣ1〜Ｃ4アルコキシから選択される１
または２置換基を有してもよい置換フェニル残基または
非置換フェニル残基を意味する。「置換されていてもよ
いベンジル」という用語は、ハロ、ニトロ、Ｃ1〜Ｃ4ア
ルキルおよびＣ1〜Ｃ4アルコキシから選択される１また
は２置換基を有してもよい置換べンジル環または非置換
ベンジル環を意味する。「Ｃ1〜Ｃ4アルコキシ」という
用語は酸素橋を介して結合しているＣ1〜Ｃ4アルキル基
を表し、例えばメトキシ、エトキシ、ｎ-プロポキシ、
イソプロポキシなどである。非置換ベンジルと置換ベン
ジルはとりわけ好ましいカルボキシ保護基である。
【００１１】「カルボキシ活性化基」という用語は、有
機合成化学で用いられる基であって、カルボキシ基の反
応性を増大させるものを意味する。そのような基は有機
合成の分野ではよく知られており、カルボキシ基の単結
合酸素と結合しているものとしては、例えばベンゼンス
ルホニルオキシ、メタンスルホニルオキシ、トルエンス
ルホニルオキシ、フタルイミジルオキシ、スクシンイミ
ジルオキシ、クロロ、ベンゾトリアゾリルオキシ、ブロ
モ、アジドなどの基が含まれる。好ましいカルボキシ活
性化基にはベンゾトリアゾリルオキシとフタルイミジル
オキシが含まれ、スクシンイミジルオキシはとりわけ好
ましい。
【００１２】本発明の免疫複合体は、抗体、ある種の化
学物質である薬物および抗体と薬物を連結する有機化学
基から構成される。本発明はそのような免疫複合体の製
造に有用なβ-アラニン誘導体中間体をも提供する。
【００１３】抗体 本発明の薬物複合体の機能が薬物の生物学的効力と抗体
の抗原選択性によって決定されることは理解されるであ
ろう。患者の利益のために特定の薬物を送達するべき細
胞、組織または病原体に関連する抗原を認識するであろ
う抗体を選択する。例えば薬物が抗新生物剤であるとす
れば、腫瘍細胞に関連する抗原を認識する抗体を選択す
るであろう。
【００１４】抗新生物剤に加えて、心血管疾患の治療に
使用されるような他の抗増殖剤を選択して、それを部位
特異的抗体に連結してもよい。例えば血管形成術の後に
しばしば再発狭窄症が起こることは充分に立証されてい
る。アテローム性動脈硬化斑を除去した領域に抗増殖性
薬物を部位特異的に送達することは再閉塞を遅延または
防止するうえで有用であろう。
【００１５】同様に抗細菌剤や抗ウイルス剤をそれぞれ
細菌またはウイルスを認識する抗体に連結することもで
きよう。
【００１６】使用する薬物の特徴によって、ある場合に
は細胞によって内部化される抗体を選択することが好ま
しいであろうし、また表面抗原を認識することによって
細胞表面に留まる抗体やその抗原結合性断片を使用する
ことが好ましいこともあろう。
【００１７】抗体の供給源は本発明にとっては決定的な
問題ではない。ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥおよび
ＩｇＤを含む免疫グロブリンのどのクラスまたはサブク
ラスから選択してもよい。同様に、薬物の効果が有用で
ある細胞を抗体が標的にする限り、起源の種も決定的な
問題ではない。
【００１８】当該技術分野の現状としてモノクローナル
抗体とその断片がしばしば薬物複合体に使用されてお
り、本発明においてもそれらの使用が好ましい。しかし
ポリクローナル抗体とそれらの断片を除外するわけでは
ない。
【００１９】組換え技術によって新しい種類の抗原結合
性分子を製造することができる。例えばHodgson,Bio/Te
chnology,9:421-25(1991)を参照のこと。より具体的に
は、モノクローナル抗体のエピトープ特異性を維持して
いる遺伝子的に操作された抗体が当該技術分野で現在知
られており、これらは免疫原性の低い分子を与える。本
発明はそのような遺伝子的に操作された抗体も包含す
る。さらにキメラ抗体が米国特許第４８１６５６７号(C
abilly)に記述されており、この特許は参考文献として
本明細書の一部を構成する。
【００２０】遺伝子的に操作された抗体を生産するため
のさらなる方法は米国特許第４８１６３９７号(Boss)に
記述されており、この特許も参考文献として本明細書の
一部を構成する。１９８７年９月３０日に公開された欧
州特許公開０ ２３９ ４００に教示されているように、
米国特許第４８１６３９７号の方法はさらに洗練された
ものになっている。欧州特許公開０ ２３９ ４００(Win
ter)の教示は、本発明の免疫複合体の成分として使用す
るモノクローナル抗体の遺伝子的な操作にとって好まし
い形式である。Winterの技術にはヒト抗体の相補的決定
領域(ＣＤＲ)をネズミモノクローナル抗体のＣＤＲで置
換し、それによってヒト抗体の特異性をＣＤＲ領域の供
給源であるネズミ抗体の特異性に変換することが伴う。
このＣＤＲ技術は最小限度のネズミ配列を含有し、それ
ゆえに免疫原性が低い分子を提供する。
【００２１】一本鎖抗体技術も遺伝子的に操作された抗
体の一変種であり、当該技術分野ではよく知られてい
る。Bird,R.E.ら,Science,242:423-426(1988)を参照の
こと。一本鎖抗体技術には重鎖と軽鎖の結合領域をポリ
ペプチド配列で結合させることによって、それが由来す
る抗体の結合特性を有する一本鎖ポリペプチドを作成す
ることが伴う。
【００２２】上述の遺伝子操作法は親抗体の結合特性を
保持しつつ免疫原性形式を低下させるような分子を作成
するための数多くの手段を当業者に提供する。したがっ
て遺伝子的に操作された抗体を得て、それを本発明で使
用することができる。
【００２３】抗体の起源と性質は、それが処置すべき細
胞、組織または病原体を目標にし、それ自体が患者にと
って毒性でない限り、決定的な問題ではない。抗体と複
合体を評価する方法に関する議論を以下に便宜上記載す
る。
【００２４】第１に、抗体は妥当な量の抗体の生産を可
能するに足るほど安定な修飾された微生物またはハイブ
リドーマによって生産されるべきである。抗体そのもの
は精製しやすいものであるべきで、具体的には妥当な濃
度での化学的操作を可能にするに足るほど水溶性である
べきだ。
【００２５】次に、候補抗体を用いて製造される複合体
を抗原結合能について評価する。抗原結合活性の何らか
の減少を決定することの容易さを当業者は理解するであ
ろう。競争的放射線免疫検定法(ＲＩＡ)とフローサイト
メトリー(flow cytometry)は、元の抗体と比較して複合
体の結合能が減少しているかどうかを決定するために最
も便利な手段のうちの２つである。遊離の抗体の結合能
からのわずかな減少は予期されるものであり、許容でき
る。次に、複合体のインビトロ効力(例えば抗癌剤の場
合には細胞毒性)を抗原陽性細胞に対して決定するため
の試験をする。効果的な複合体は、細胞に高濃度の薬物
を運搬するというその能力ゆえに、同じ検定法で遊離の
薬物よりもいくらか低い効力をもち得る。次に、最初の
２つの試験で許容された複合体を、JohnsonおよびLaguz
za,Cancer Res.,47:3118-22(1987)によって教示されて
いるヌードマウスヒト腫瘍異種移植モデルで評価する。
例えば遊離の薬物、遊離の薬物と遊離の抗体の混合物、
非誘導化免疫グロブリンとの複合体に対してヌードマウ
スで候補複合体を試験すべきである。複合体は一般に改
善された効力または安全性を示すべきである。投与量範
囲の研究は異種移植モデルで行うべきである。
【００２６】異種移植モデルで強力である複合体を、ヒ
トに認められるものと類似する様式の興味ある抗原を発
現させることがわかっている動物内での試験に付す。そ
のような試験で複合体が抗原に対して有意な程度の結合
をもたらし、異種移植モデルにおいて医療的であると予
想される投与量で充分に毒性を含まないとすれば、その
候補複合体は医療的な潜在能力を有するとみなすことが
できる。
【００２７】正しく選択された抗体の断片が無傷の抗体
と同じ効果を有することは理解されるであろう。タンパ
ク質加水分解酵素であるパパインとペプシンが免疫グロ
ブリンを切断してそれぞれ２価または１価の断片にする
という用途を持っていることを当業者は認識するであろ
う。したがって本発明の実施において、処置すべき細胞
に関連する抗原を認識する抗体の断片(とりわけＦ(ａ
ｂ')2断片)はまさに無傷の抗体と同じく有用であり得
る。Ｆａｂ断片も有用である。
【００２８】リンカー基が抗体と反応してそれに結合す
る機構は式(ＩＩＩ)で示されるリンカー内のＲ7基(ここ
にＲ7はカルボキシ活性化基である)に依存する。Ｒ7基
の連結機構については複合体の合成に関する章で後に詳
細に説明する。
【００２９】式(Ｉ)は１から１０個までのリンカー-薬
物部分(誘導体化薬物)が抗体の各分子に結合しているこ
とを示している。当然のことながら、抗体１分子あたり
のそのような部分の数は平均数である。なぜならあるバ
ッチの複合体は必然的にある範囲の抗体に対する誘導体
化薬物の比を有する分子を含有するからである。当然の
ことながら、各抗体分子に数分子の薬物を結合させる場
合に、高価な抗体が最も効率よく使用される。しかし過
剰分子数の誘導体化薬物の結合は通常、抗原を認識し、
それに結合するという抗体の能力に対して有害な影響を
与えるので、ｍの値については妥協点を見つける必要が
ある。
【００３０】一般にｍに関する好ましい平均値は３から
６までである。複合比は、薬物、リンカー、ペプチド結
合などを検出するべく選択された波長で免疫複合体の吸
光度を測定した後、その吸光度データと様々な成分の吸
光係数から１抗体あたりの平均薬物量を導き出すことに
よって容易に決定される。
【００３１】本発明で使用するための抗体は免疫学者に
は多数利用可能であり、さらに有用な抗体は関連する雑
誌のあらゆる出版物に開示されている。本発明の実施に
応用することができる抗体を総括的に列挙することは不
可能であるし、そのような必要は全くない。免疫学者や
一般的な化学者はAmerican Type Culture Collection(A
TCC)(米国メリーランド州ロックビル)のカタログやLins
cott's Directory ofImmunological and Biological Re
agents(米国94941カリフォルニア,ミル・バレイ,グレン
ドライブ40のLinscott's Directoryが出版している)な
どの供給源から抗体を選択することが充分に可能であ
る。したがって実際上どのような決定因子であっても
(例えば腫瘍、細菌、カビ、ウイルス、マイコプラズマ
または組織適合性抗原や、病原体表面抗原、毒素、酵
素、アレルゲン、生理学的に重要な細胞および組織に関
連する他の種類の抗原など)、それに対する抗体を選択
することは当業者にとって単純な問題である。
【００３２】本発明の最も好ましい使用は、具体的には
偏平癌腫細胞、腺癌細胞、小細胞癌腫細胞、グリオーマ
(glyoma)細胞、黒色腫細胞、腎細胞癌腫細胞、遷移細胞
癌腫細胞、肉腫細胞、腫瘍脈管構造を支持する細胞、白
血病やリンパ腫などのリンパ様腫瘍の細胞を含む癌細胞
に細胞毒性剤を送達する際に使用することである。この
ような細胞のすべてを標的にするのに適当な抗体が利用
可能であり、その供給源はLinscottに見つけることがで
きる。別法として、従来の方法によってこのような抗体
を製造するために必要なハイブリドーマをＡＴＣＣや他
の細胞系収集物から入手することができる。
【００３３】現在知られている抗体のうちのいくつかは
本発明の抗癌的側面での使用に関してとりわけ興味深
い。好ましい特定の抗体は例えばＶＸ００７Ｂ、ＣＣ８
３、ＣＣ４９およびＤ６１２である。
【００３４】もう１つの興味深い抗体はＫＳ１／４であ
り、これはVarkiら,Cancer Research,44:681-86(1984)
が最初に開示したものである。モノクローナル抗体ＫＳ
１／４の異なる領域のコード配列を含むいくつかのプラ
スミドが現在寄託されており、米国イリノイ州ペオリア
のＡＴＣＣから入手することができる。これらのプラス
ミドを用いることによって、当業者は腺癌細胞上に高密
度で認められる細胞表面抗原に結合するキメラ抗体を組
換え法によって製造することができる。そのような抗体
の構築については米国特許第４９７５３６９号に詳細に
議論されている。下記のプラスミドはＫＳ１／４に関係
している。
【００３５】プラスミドｐＧＫＣ２３１０：軽鎖のコー
ド配列、軽鎖に伴うシグナルペプチド、５'および３'非
翻訳領域；大腸菌Ｋ１２ ＭＭ２９４／ｐＧＫＣ２３１
０(ＮＲＲＬ Ｂ-１８３５６)から単離される。プラスミ
ドｐＧ２Ａ５２：重鎖のコード配列、重鎖に伴うシグナ
ルペプチドのコード配列、５'および３'非翻訳領域；大
腸菌Ｋ１２ ＭＭ２９４／ｐＧ２Ａ５２(ＮＲＲＬ Ｂ-１
８３５７)から単離される。プラスミドＣＨＫＣ２-６：
軽鎖可変領域のコード配列、軽鎖に伴うシグナルペプチ
ドのコード配列、ヒトＩｇＧの軽鎖定常領域をコード化
する配列；大腸菌Ｋ１２ ＤＨ５／ＣＨＫＣ２００６(Ｎ
ＲＲＬ Ｂ-１８３５８)から単離される。プラスミドＣ
ＨＫＣ２-１８；誘導体軽鎖可変領域のコード配列、軽
鎖に伴うシグナルペプチドのコード配列、ヒトＩｇＧの
軽鎖定常領域をコード化する配列；大腸菌Ｋ１２ ＤＨ
５／ＣＨＫＣ２-１８(ＮＲＲＬ Ｂ-１８３５９)から単
離される。プラスミドＣＨ２Ａ５：重鎖可変領域のコー
ド配列、重鎖に伴うシグナルペプチドのコード配列、ヒ
トＩｇＧ１の重鎖定常領域をコード化する配列；大腸菌
Ｋ１２ ＭＭ２９４／ＣＨ２Ａ５(ＮＲＲＬ Ｂ-１８３６
０)から単離される。プラスミドＣＨ２Ａ５ＩＧ２：重
鎖可変領域のコード配列、重鎖に伴うシグナルペプチド
のコード配列、ヒトＩｇＧ２の重鎖定常領域をコード化
する配列；大腸菌Ｋ１２ ＤＨ５／ＣＨ２Ａ５ＩＧ２(Ｎ
ＲＲＬ Ｂ-１８３６１)から単離される。プラスミドＣ
Ｈ２Ａ５ＩＧ３：重鎖可変領域のコード配列、重鎖に伴
うシグナルペプチドのコード配列、ヒトＩｇＧ３の重鎖
定常領域をコード化する配列；大腸菌Ｋ１２ ＤＨ５／
ＣＨ２Ａ５ＩＧ３(ＮＲＲＬ Ｂ-１８３６２)から単離さ
れる。プラスミドＣＨ２Ａ５ＩＧ４：重鎖可変領域のコ
ード配列、重鎖に伴うシグナルペプチドのコード配列、
ヒトＩｇＧ４の重鎖定常領域をコード化する配列；大腸
菌Ｋ１２ ＤＨ５／ＣＨ２ＡＩＧ４(ＮＲＲＬ Ｂ-１８３
６３)から単離される。
【００３６】ＡＴＣＣのハイブリドーマＨＢ２１によっ
て生産される抗体５Ｅ９Ｃ１１は多くの腫瘍が発現させ
るトランスフェリン受容体を認識する。Ｂ７２.３と命
名された抗体はNational Cancer Instituteから入手可
能であり、乳癌と結腸癌の両方によって発現される抗原
を認識する。
【００３７】非腫瘍抗原に対する反応性を持つ興味深い
２つの抗体はＯＫＴ３とＯＫＴ４である。これらの抗体
はそれぞれ末梢Ｔ細胞とヒトＴヘルパー細胞に結合す
る。
【００３８】様々な医療用途に有用な抗体のさらなる供
給源には例えば下記のものが含まれる。免疫調節と腫瘍
療法に有用な抗ヒトリンパ球および単核細胞抗体はＡＴ
ＣＣの培養物ＨＢ２、ＨＢ４４、ＨＢ７８およびＨＢ１
３６によって生産される。腫瘍療法に有用な抗トランス
フェリン受容体抗体はＡＴＣＣの培養物ＨＢ８４によっ
て生産される。ＡＴＣＣの培養物ＨＢ８０５９は結腸直
腸癌腫モノシアロガングリオシドに対する抗体を生産
し、培養物Ｂ８１３６は免疫調節とＴ細胞白血病療法に
有用な成熟したヒトＴ細胞表面抗原に対する抗体を生産
する。
【００３９】さらにＡＴＣＣのハイブリドーマＨＢ９６
２０はＣＥＭ２３１.６.７と呼ばれる便利な抗癌胎児性
抗原を生産するであろう。
【００４０】J.Schlomらは腫瘍関連抗原に対して親和性
を有するいくつかの興味深い抗体を開示している。具体
的には、彼のグループによる下記の文献と特許は重要で
ある：Cancer Research,50:1291-98(1990)、Cancer Res
earch,45:5769-80(1985)、International J.Cancer,43:
598-607(1989)、米国特許第４５２２９１８号、米国特
許第４６１２２８２号、欧州特許公開０,３９４,２７
７、欧州特許公開０,２２５,７０９。Schlomらのグルー
プによって教示される抗体であって、本発明との関連で
機能的な抗体には下記の名称を持つものが含まれる：Ｄ
６１２、ＣＯＬ-１〜ＣＯＬ１５、ＣＣ-１、ＣＣ-８、
ＣＣ-９、ＣＣ-１１、ＣＣ-１４、ＣＣ-１５、ＣＣ-２
０、ＣＣ-２６、ＣＣ-２９、ＣＣ-３０、ＣＣ-４１、Ｃ
Ｃ-４６、ＣＣ-４８、ＣＣ-４９、ＣＣ-５２、ＣＣ-５
５、ＣＣ-５７、ＣＣ-６０、ＣＣ-６３、ＣＣ-６６、Ｃ
Ｃ-７２、ＣＣ-７４、ＣＣ-７８、ＣＣ１-８３、ＣＣ-
８７、ＣＣ-９０、ＣＣ-９２。
【００４１】免疫学者や薬物誘導の分野をよく知ってい
る者は、この分野において一般的に知られている刊行物
や上述の例と説明を手助けにして、あらゆる適当な薬物
をその薬物によって処置されるべきあらゆる所望の細胞
に誘導するための抗体を容易に選択することができる。
【００４２】モノクローナル抗体を生産する方法と精製
する方法も免疫学の分野の当業者にはよく知られてい
る。ハイブリドーマを培養し、腹水を生産し、抗体を精
製する方法の総説についてはMishell,B.ら編,Select Me
thods in Cellular Immunology(W.H.Freeman and Compa
ny,ニューヨーク,1980)を参照のこと。
【００４３】薬物 上述のβ-アラニン由来のリンカーを用いて１価の薬物
誘導体(以下薬物と記載する)と抗体を連結する方法が本
発明の要旨であることと、薬物と抗体がどちらも本発明
を制限しないことは理解されるであろう。したがって本
発明のリンカーは、あらゆる治療的または予防的用途の
薬物に応用する場合、β-アラニン誘導体が結合し得る
化学官能性を保持することという薬物に関する必要性
と、薬物が利益をもたらす細胞を標的にすることという
抗体に関する必要性のみによって制限されるものであ
り、有益に使用される。本発明によって提供されるメチ
リデン連結機構は、薬物が反応に利用できるアミノ、ヒ
ドロキシまたはチオール官能性を有することを必要とす
る。さらに、薬物は反応に利用できる官能性とリンカー
の反応が薬物の活性を破壊しないというような性質のも
のでなくてはならない。
【００４４】したがって本発明のリンカーは、例えば抗
細菌剤、抗ウイルス剤、抗カビ剤、抗癌剤、抗マイコプ
ラズマ剤などを含む実質上あらゆる種類の薬物に関して
使用することができる。そのように構築された薬物複合
体は対応する薬物が効果的であるような用途に有効であ
り、そのような薬物療法に応答するであろう細胞、組織
または病原体に薬物を輸送するという抗体に固有の能力
ゆえに、より優れた効力を有する。
【００４５】薬物と薬物複合化に付すことができる他の
化合物は米国特許第５０１０１７６号と第４６７１９５
８号に開示されており、これらの特許の薬物に関する開
示は参考文献として本明細書の一部を構成する。
【００４６】上述のように薬物は、その薬物上の反応に
利用できるアミノ、ヒドロキシまたはチオール官能性を
介してリンカーと反応する。薬物の反応に利用できる官
能性は元来その薬物の一部であってもよいし、誘導体化
薬物を形成させる目的で導入してもよい。「反応に利用
できるアミノ官能性」という用語は、ヒドラジド、ヒド
ラジン、カルバメートなどの一部であるアミノ基と炭素
-水素構造に単に結合しているアミノ基を包含する。ア
ミノ基は、その基がβ-アラニン誘導体構造との反応を
防止するような立体的障害を生み出さないという条件の
もとで、第３の小さい置換基を有してもよい。そのよう
な基は例えば直鎖または分枝鎖のアルキル基などであり
得る。
【００４７】同様に、「反応に利用できるヒドロキシ官
能性」および「反応に利用できるチオール官能性」とい
う用語はそれぞれ単純なアルコールおよびカルボン酸と
チオ酸を包含する。
【００４８】反応に利用できる官能性と何らかの治療的
または予防的効力を有するあらゆる化学種の薬物を使用
することが本発明に包含されるのであるが、反応に利用
できるアミノ官能性を有する薬物を使用することが好ま
しい。またそのアミノ基がヒドラジンまたはヒドラジド
部分の一部である薬物を使用することはより好ましい。
【００４９】本発明での使用に関して最も好ましい有効
性のある薬物の種類は細胞毒性剤の種類、とりわけ癌療
法に使用されるものである。そのような薬物には概して
アルキル化剤、抗増殖剤、チュービュリン結合剤などが
含まれる。好ましい種類の細胞毒性剤には例えばダウノ
マイシン族の薬物、ビンカ薬物、ミトマイシン類、ブレ
オマイシン類、細胞毒性ヌクレオシド、プテリジン族の
薬物およびポドフィロトキシン類が含まれる。これらの
種類のなかでとりわけ有用なものにはドクソルビシン、
ダウノルビシン、アミノプテリン、メトトレキセート、
ロメトレキソール、メトプテリン、ジクロロメトトレキ
セート、ミトマイシンＣ、ポルフィロマイシン、５-フ
ルオロウラシル、６-メルカプトプリン、シトシンアラ
ビノシド、ポドフィロトキシン、エトポシド、メルファ
ラン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ロイロシジ
ン、ビンデシン、ロイロシンまたはそれらの誘導体など
が含まれる。これらのなかではビンブラスチンとその誘
導体、とりわけデスアセチルビンブラスチンとその誘導
体、ドクソルビシンとその誘導体がとりわけ好ましい薬
物である。デスアセチルビンブラスチンヒドラジドとド
クソルビシンをこれ以降、それぞれＤＡＶＬＢ-ＮＨＮ
Ｈ2およびＤＯＸ-ＮＨ2と記載する。
【００５０】当業者が概説した好ましい化合物に化学修
飾を施してそれらの反応をより便利にし得ることは理解
されるであろう。また好ましい免疫複合体が好ましい薬
物から製造されることも理解されるであろう。
【００５１】中間体 本発明の中間体であるβ-アラニン誘導体(式(ＩＩ)およ
び(ＩＩＩ))は抗体および薬物と反応させる中間体であ
り、したがって抗体と薬物を結合させるリンカーの前駆
体である。したがって好ましいβ-アラニン誘導体中間
体は本発明の好ましい免疫複合体にそれらの構造を付与
する。この中間体はβ-アラニンに由来し、既知の方法
か、もしくは有機化学の当業者が容易に発想する方法に
従って製造される。
【００５２】中間体β-アラニン誘導体の合成 本発明の中間体であるβ-アラニン誘導体は、容易に入
手できる試薬を用いて、有機化学の当業者が知っている
方法によって製造される。
【００５３】本発明の新規中間体を製造するための第１
の段階では、式(ＩＶ)で示される保護されたβ-アラニ
ン化合物を式(Ｖ)で示されるジケテンと不活性溶媒か、
溶媒の混合物中で、Ｎ-メチルモルホリンなどの塩基の
存在下で反応させる。式(Ｖ)で示される化合物のＲ8置
換基(Ｃ1〜Ｃ3アルキル)の長さが式(Ｉ)、(ＩＩ)および
(ＩＩＩ)で示される化合物におけるＲ1置換基の長さを
決定することは理解されるであろう。式(ＩＩａ)で示さ
れる化合物が生成するこの反応は当該技術分野で既知の
反応であり、これを次の反応式(１)に記載する。
【化７】 ［Ｒ1はＣ1〜Ｃ4アルキルを表す。Ｒ4aはカルボキシ保
護基を表す。Ｒ5aはＨ2を表す。Ｒ8はＨまたはＣ1〜Ｃ3
アルキルを表す。］
【００５４】好適な溶媒は反応条件下で不活性なままで
あるか、実質上不活性なままであるあらゆる極性溶媒ま
たは溶媒の混合物である。好ましくは塩化メチレンとジ
メチルホルムアミド(ＤＭＦ)を含有する溶媒の混合物を
この反応に使用する。これらの好ましい溶媒の好ましい
比率はそれぞれ５：１である。反応物と試薬の量、使用
する温度、この反応を達成するのに必要な時間の長さは
当該技術分野では既知であり、有機化学者には明らかで
ある(例えば実施例１を参照のこと)。
【００５５】本発明の化合物を合成する際の第２の段階
は、好ましくは式(ＩＩａ)で示される化合物を適当なト
リアルキルオルトホルメート(トリエチルオルトホルメ
ートなど)と、ルイス酸(塩化亜鉛など)およびアルコー
ル補集剤(酢酸無水物など)の存在下で反応させて式(Ｉ
Ｉｂ)で示されるアルコキシメチリデン誘導体を形成さ
せることを必要とする。この反応は１００〜２００℃の
高温で行われ、数時間で完了する。下記の反応式(２)に
この好ましい反応を記載する。別法として、当該技術分
野で公知の方法を用いることによってＲ5をアルキルチ
オメチリデンとしてもよい。
【化８】 ［Ｒ1、Ｒ4aおよびＲ5aは上に定義した通りである。Ｒ
5bは＝Ｃ(ＯＨ)2、＝ＣＨＯＲ6または＝ＣＨＳＲ6を表
す。Ｒ6はＣ1〜Ｃ4アルキルを表す。］
【００５６】本発明の各反応では、並外れて過剰な量の
出発物質は必要でない。通常の有機化学の場合と同様
に、比較的安価な反応物を適度に過剰に用いることによ
って、より高価な反応物が完全に消費されることを確実
にすることが望ましい。この規則は典型的に高価で製造
と精製が困難な抗体との反応の場合にはとりわけ的を得
ている。しかし一般に成分のコストと装置の処理量を念
頭においてその工程の経済性を最大化する目的で過剰量
の反応物を使用することができる。したがってただ単に
反応を起こさせるためにのみ過剰量の反応物を使用する
必要はない。
【００５７】本発明の中間体を製造する際に使用する方
法の第３の段階では、式(ＩＩｂ)で示される化合物を適
当な溶媒の存在下で触媒的に水素化して式(ＩＩｃ)で示
される化合物を形成させる。このよく知られている反応
ではＲ4aカルボキシル保護基を除去してその酸を形成さ
せることが目的であり、１,４-シクロヘキサジエンが好
ましい還元剤である。好適な水素化触媒には貴金属およ
び酸化物、例えば炭素や酸化カルシウムなどの支持体上
の酸化ロジウム、パラジウムおよび白金などが含まれ
る。しかしパラジウム／炭素が好ましい。この反応の溶
媒はこの反応の間に不活性のままである溶媒または溶媒
の混合物である。典型的にはメタノール、１-プロパノ
ール、２-プロパノール、とりわけエタノールなどのア
ルコールが好適な溶媒である。遊離の酸に加えて、Ｒ4a
カルボン酸をさらにその塩型に誘導体化してもよい。こ
のカルボン酸の生理学的に許容される塩を形成する能力
がある部分で塩を形成させる。アルカリ金属とハロゲン
化水素塩はとりわけ好適である。したがってナトリウム
塩、カリウム塩およびリチウム塩は、塩化水素塩、臭化
水素塩、フッ化水素塩と共に本発明の実施にとりわけ有
用である。しかし薬化学で許容される他の塩も有用であ
る。例えばトリエチルアミン、トリエタノールアミン、
エチルジメチルアミンなどは、テトラアルキルアンモニ
ウム塩、(ベンジルまたはフェニル)トルアルキルアンモ
ニウム塩などを含む４級アンモニウム塩と同様に有用で
ある。アンモニウム塩のなかではテトラブチルアンモニ
ウム、ベンジルトリメチルアンモニウムおよびテトラメ
チルアンモニウムが代表的で好ましい塩である。薬化学
者はしばしばカルボン酸の塩を使用するが、本発明の塩
(Ｒ4bが塩形成部分を表すもの)は生理学的に許容される
塩を形成するいずれの塩基を使って製造してもよい。本
法のこの側面を反応式(３)に記載する。
【化９】 ［Ｒ1とＲ6は上に定義した通りである。Ｒ5bは＝Ｃ(Ｏ
Ｈ)2、＝ＣＨＯＲ6または＝ＣＨＳＲ6を表す。Ｒ4はＨ
またはカルボン酸の塩を完成させる部分を表す。］
【００５８】式(ＩＩ)で示される化合物についてとりわ
け好ましい置換基は次の通りである。
【表１】 化合物 Ｒ1 Ｒ4 Ｒ5 ＩＩａ メチル ベンジル −Ｈ2 ＩＩｂ メチル ベンジル エチルオキシメチリデン ＩＩｃ メチル Ｈ エチルオキシメチリデン
【００５９】式(ＩＩａ)、(ＩＩｂ)および(ＩＩｃ)で示
される化合物はそれぞれ新規化合物であって、本発明の
免疫複合体の製造にとって有用であり、これらは集合的
に本明細書における式(ＩＩ)で示される化合物に包含さ
れる。
【００６０】中間体と薬物を用いる反応 式(ＩＩｃ)で示される中間体を、Ｒ5b置換基のアルキル
チール、アルコールまたはアルコキシ基が切断されて、
残りのメチリデニル基が薬物の反応に利用できるアミ
ノ、ヒドロキシまたはチオール官能基と反応するような
条件下で薬物と反応させる。一般にこの反応は約−３０
℃から約５０℃までの温度で不活性有機溶媒か、そのよ
うな有機溶媒の水性混合物中で、通常は温和な塩基(重
炭酸アルカリ金属、炭酸アルカリ金属、水酸化アルカリ
金属など)の存在下で行われる。一般にこの反応は定量
的であり、並外れて過剰な量の反応物を必要としない。
この反応は式(ＩＩＩａ)で示される誘導体化薬物化合物
を与える。
【化１０】 ［Ｒ1はＣ1〜Ｃ4アルキルを表す。Ｒ2は反応に利用でき
るアミノ、ヒドロキシまたはチオール官能性を有する１
価の薬物誘導体を表す。Ｒ7aはＨまたはカルボン酸の塩
を完成させる部分を表すか、もしくは後に還元されて酸
かカルボン酸の塩を完成させる部分を形成するカルボキ
シ保護基を表す。］ 通常はかなりの注意をはらって誘導体化薬物を精製する
ことが重要であるから、生成物の単離には高圧下でのク
ロマトグラフィーか他の高性能の手法を必要とするであ
ろう。誘導体化薬物は後に抗体と反応させて免疫複合体
の製造を完了させるので、誘導体化薬物に付随する反応
性不純物は抗体上の反応性部位を消費し得る。
【００６１】反応式(３)の式(ＩＩｂ)で示される化合物
からカルボキシ保護基を除去することは、β-アラニン
誘導体中間体を薬物と反応させる前か後に行うことがで
きる。薬物上で保護基を使用する必要がある場合に、上
述の保護基を除去する場合と同じ条件下でそれらの基を
除去することは十分に可能である。したがってまず薬物
を式(ＩＩｂ)で示される化合物と反応させて、薬物とβ
-アラニン由来の中間体の両方を脱保護するか、もしく
は式(ＩＩｂ)で示される化合物をまず脱保護して、式
(ＩＩｃ)で示される化合物を薬物と反応させることによ
って式(ＩＩＩａ)で示される化合物を形成させることが
できる。
【００６２】カルボキシ活性化基 誘導体化した薬物を所望の抗体と反応させる準備とし
て、式(ＩＩＩａ)のカルボン酸または塩部分をまず活性
化する。カルボン酸(式(ＩＩＩａ)で示される化合物の
Ｒ7aがＨまたはその塩部分を表す場合)を活性化する方
法は当該技術分野でよく知られており、一般にカルボジ
イミドなどの従来のエステル化剤(とりわけジシクロヘ
キシルカルボジイミド)とＮ-ヒドロキシスクシンイミド
などの活性化基を用いることによって達成される。この
反応によって式(ＩＩＩｂ)で示される化合物が生成す
る。
【化１１】 ［Ｒ1とＲ2は上述の通りである。Ｒ7bはカルボキシ活性
化基を表す。］
【００６３】式(ＩＩＩａ)で示される化合物についてと
りわけ好ましいＲ1とＲ7はそれぞれメチルと水素であ
り、式(ＩＩＩｂ)で示される化合物についてとりわけ好
ましいＲ1とＲ7bはそれぞれメチルとＮ-ヒドロキシスク
シンイミドである。活性化基との反応は、例えばジオキ
サン、テトラヒドロフラン、塩素化炭化水素などの不活
性有機溶媒中か、その混合物中で行われる。これらの反
応は一般に約０℃から約５０℃までの範囲の穏やかな温
度で行うことができる。式(ＩＩＩａ)と(ＩＩＩｂ)で示
される化合物はそれぞれ新規化合物であって、本発明の
免疫複合体の製造にとって有用であり、これらは集合的
に本明細書における式(ＩＩＩ)で示される化合物に包含
される。
【００６４】免疫複合体の合成 誘導体化薬物(式(ＩＩＩ))を上述のように作成したら、
複合体を製造する最終段階としてそれを抗体と反応させ
る。誘導体化した薬物を抗体と反応させる条件を選択す
る際の第１の課題は抗体の安定性を維持するということ
である。この反応は抗体を傷つけない組成の水性媒質中
で行われなければならない。特に好適な水性媒質は炭酸
イオンの濃度が約０.０５〜約０.５Ｍの範囲にある炭酸
ナトリウム緩衝液である。この反応をわずかに酸性のリ
ン酸緩衝液や生理学的リン酸緩衝化食塩水(ｐｐｂｓ)な
どの中で行うこともできる。この反応媒質は水性である
べきだが、溶媒が抗体を損傷する傾向を持たないという
条件下では反応媒質中に少量の有機溶媒があっても有害
ではない。反応媒質のｐＨは約７から約９までの範囲に
維持すべきであり、誘導体化した薬物と抗体の反応は約
４℃から約４０℃までの温度で行われなければならな
い。抗体の溶解度は大きくないので、反応媒質中の抗体
の濃度は比較的低濃度に維持すべきである。例えば抗体
の濃度は通常約５〜約２５ｍｇ／ｍｌ-水性媒質の範囲
である。
【００６５】上述のように、抗体各１モルにつき約１〜
１０モルの誘導体化薬物を結合させる。この複合比を得
るためには、通常は過剰量の式(ＩＩＩ)で示される誘導
体化薬物を使用する必要がある。抗体と活性エステルの
反応性がいくぶん変化し得るが、一般的には抗体１モル
につき約５〜約１５モルの誘導体化薬物をこの工程で使
用する。
【００６６】念のため注記するが、誘導体化薬物の薬物
部分が複数の反応性部位を有する場合、通常はこれらの
部位を保護基で遮断する必要がある。保護基の使用に関
するいくつかの側面は上述の通りであり、その他は有機
化学者一般によく知られていることである。
【００６７】この反応の生成物は新規化合物であって、
次の式(Ｉ)で示される。
【化１２】 ［Ｒ1、Ｒ2、ｍおよびＡｂは上に定義した通りであ
る。］
【００６８】最後に免疫複合体(薬物-リンカー-抗体)を
通常はクロマトグラフィー法によって単離精製する。患
者への投与に適した濃度で複合体をクロマトグラフィー
媒質から溶出させることも可能であろう。しかし通常は
クロマトグラフィーによって免疫複合体を精製し、その
溶解度が許す限りの最大濃度で都合のよい溶媒を用いて
溶出させるであろう。４０％のアセトニトリルと６０％
の生理学的リン酸緩衝化食塩水を含有する溶媒溶液が好
ましい。
【００６９】組成物と使用法 本発明の免疫複合体は、とりわけ医薬組成物(これも本
発明の１側面である)として非経口的に投与される場合
に、本発明の治療法において有用である。式(Ｉ)で示さ
れる免疫複合体と非経口的に投与できる媒質からなるそ
のような組成物は薬化学で一般的に使用される方法によ
って製剤化される。例えば本発明の免疫複合体は、血清
タンパク質(ヒト血清アルブミンなど)、緩衝物質(リン
酸塩など)、水、電解質および生理学的食塩溶液などの
生理学的に許容できる液体(担体)に良好に溶解する。非
経口投与用の製品はしばしば製剤化され、使用直前に再
構成するための固形(好ましくは凍結乾燥型)に振り分け
られる。そのような製剤は本発明の有用な組成物であ
る。凍結乾燥型組成物の製造は当該技術分野でよく知ら
れている。一般にそのような組成物は等張性を付与する
無機塩と、乾燥した調製物が再構成時に迅速に溶解する
ことを可能にする調合剤(乳糖など)の混合物からなる。
このような製剤は使用にあたって高度に精製された水で
再構成される。
【００７０】本発明の組成物における本発明の免疫複合
体の最も効果的な濃度は、複合体に用いられた薬物、薬
物と複合体の物理学的特性および組成物の最終形態によ
って決定される。このような組成物を製造する分野の当
業者は考慮すべき変数と組成物成分の最適な比率を容易
に認識するであろう。同様に、本発明の免疫複合体組成
物に関して最も効果的な投与法は疾患／感染の重篤度と
経過、患者の健康、処置に対する応答および治療する医
師の判断に依存する。したがって免疫複合体と付随する
化合物の投与量は個々の処置に合わせて滴定されるべき
である。さもなくば標準的な医学文献から薬物の比効力
とそれらの適当な投与量範囲に関する指針を得るべきで
ある。
【００７１】本発明は感受性の哺乳類細胞または組織を
処置する方法であって、そのような処置を必要とする哺
乳動物に上記式(Ｉ)で示される免疫複合体の有効量を投
与することからなる方法をも提供する。さらに本発明は
哺乳動物宿主内における病原体の成長を阻害する方法で
あって、そのような処置を必要とする哺乳動物に上記式
(Ｉ)で示される免疫複合体の有効量を投与することから
なる方法をも提供する。
【００７２】本発明の方法のもう１つの態様は、複合化
学療法で使用するために、異なる薬物もしくは異なる抗
体またはその異なる抗原認識性断片を保持する異なるい
くつかの免疫複合体の同時もしくは逐次的投与を包含す
る。例えば本発明の１態様は複合体の抗体成分の特異性
が異なるいくつかのデスアセチルビンブラスチン免疫複
合体の使用を伴い、例えばそれぞれが目標の細胞、組織
または病原体上に存在する異なる抗原もしくは同じ抗原
の異なる部位またはエピトープに特異的に結合する抗体
を有するいくつかの免疫複合体を使用する。この態様は
腫瘍の表面上の様々な抗原の量が未知であるか、もしく
は腫瘍細胞集団が抗原の発現に関して不均一であって、
その腫瘍部位にある細胞のすべてに十分量の薬物を確実
に誘導することが望まれるようないくつかの腫瘍を治療
する際にとりわけ有用であり得る。腫瘍に関して異なる
抗原またはエピトープ特異性を保持するいくつかの免疫
複合体の使用は腫瘍部位に十分な薬物を与える可能性を
増大させる。さらにこの態様は腫瘍に関して高度の特異
性を達成するためにも重要である。なぜなら正常組織が
同じ腫瘍関連抗原のすべてを保持する可能性が小さいこ
とは当該技術分野で知られているからである(例えばHel
lstrom,I.ら,J.Immunol.,127,1:157-160(1989)を参照の
こと)。
【００７３】別法として、複合体中の薬物成分のみが異
なるようないくつかの異なる免疫複合体を使用すること
もできる。例えば特定の抗体をドクソルビシンに連結し
て１つの免疫複合体を形成させ、同じ抗体をロメトレキ
ソールに連結して第２の免疫複合体を形成させることが
できる。次に両複合体を処置されるべき宿主に投与すれ
ば、それらは抗体の特異性ゆえに、処置するべく選択し
た標的細胞、組織または病原体の部位に局在化するであ
ろう。この態様は、標的が既知であるか、もしくは標的
が特定の薬物または特定の種類の薬物に対して耐性であ
ると疑われる時、処置すべき細胞、組織または病原体を
保持する宿主に免疫複合体を投与する場合に重要であり
得る。
【００７４】本明細書に記載した発明がより完全に理解
されるように、次の実施例を記載する。しかしこれらの
実施例は単なる例示であって、決して本発明の範囲を制
限するものと見なすべきではない。
【００７５】実施例１
【化１３】 撹拌機、乾燥管および温度計を装着した丸底フラスコに
ジクロロメタン５０ｍｌと乾燥ジメチルホルムアミド
(ＤＭＦ)１０ｍｌを入れ、β-アラニンベンジルエステ
ルＨＣｌ３.８ｇを加えた。溶液が形成してからＮ-メチ
ルモルホリン１.９ｇを加え、その混合物を４℃未満に
冷却した。次にジケテン１.９ｇをジクロロメタン２５
ｍｌに溶解し、得られた溶液を温度が５℃未満に維持さ
れるような速度でフラスコに滴下した。ジケテンの添加
後、反応液を１５分間撹拌し、室温に温め、再び１.５
時間撹拌した。その反応混合物を減圧下で終夜濃縮し、
橙色の粘性の残渣を得、それを酢酸エチル食塩水に溶解
した。酢酸エチル層を分離し、１０％クエン酸溶液、食
塩水、飽和炭酸ナトリウムおよび食塩水で順次洗浄し
た。得られた酢酸エチル溶液を硫酸マグネシウムで乾燥
し、減圧下で濃縮して淡橙色の液体を得た。室温で終夜
放置するとこの液体が固体化して橙色の固体４.１８ｇ
(９１％)が得られた。標記の化合物であることを確認す
るためにＮＭＲを用いた。
【００７６】実施例２
【化１４】 撹拌機、乾燥管および温度計を装着した丸底フラスコに
酢酸無水物４.７ｍｌとトリエチルオルトホルメート３.
３ｍｌを入れ、実施例１の生成物２.０ｇを加えて、そ
の溶液を２時間加熱還流した。過剰の酢酸無水物とトリ
エチルオルトホルメートを減圧下で除去したところ、暗
赤色の粘性の液体が残った。この赤い粘性の液体を最少
量の酢酸エチルに溶解し、濁りが生じるまでヘキサンを
加えた。シリカゲル６０を７５％充填した１５０ｍｌ熔
融ガラスブフナーロートにこの混合物を注いだ。そのゲ
ルを２０％酢酸エチル／ヘキサン５００ｍｌ、３０％酢
酸エチル／ヘキサン５００ｍｌおよび４０％酢酸エチル
／ヘキサン５００ｍｌで溶出させ、各分画を集めた。最
後の２つの分画を合わせ、減圧下で濃縮して淡黄色のシ
ロップ状物１.２３ｇ(５１％)を得た。標記の化合物で
あることをＮＭＲで確認した。
【００７７】実施例３
【化１５】 磁気撹拌子を備えた５０ｍｌ丸底フラスコ中で無水エタ
ノール１０ｍｌに５％パラジウム／炭素触媒(Ｐｄ／Ｃ)
を懸濁した。これに無水エタノール１０ｍｌ中の実施例
２の反応生成物１.２ｇを加えた後、１,４-シクロヘキ
サジエン０.７ｍｌを添加した。その混合物を室温で３
０分間撹拌した後、６５℃に３０分間加熱した。濾過に
よってＰｄ／Ｃを除去した後、残渣を熱い酢酸エチルで
溶出させて灰白色の結晶０.２８ｇ(３２％)を濾過によ
って得た。標記の化合物であることをＮＭＲを用いて確
認した。
【００７８】実施例４
【化１６】 磁気撹拌子を備えた１０ｍｌ丸底フラスコに乾燥ＤＭＦ
０.８ｍｌを入れ、デスアセチルビンブラスチン-ヒドラ
ジド・Ｈ2ＳＯ4(ＤＡＶＬＢ-ヒドラジド・Ｈ2ＳＯ4)２
７８.０ｍｇを加えて溶解した。この溶液に実施例３の
反応生成物７３.５ｍｇを加えて溶解した。反応をＨＰ
ＬＣ(Waters Radial pak C18，流速５ｍｌ／分，６５％
ＭｅＯＨ：３５％０.１Ｍ(ｐＨ７.０)ＫＨ2ＰＯ4を用い
る)で監視した。ＨＰＬＣは標記の複合体が２０分以内
に形成することを示した。
【００７９】実施例５
【化１７】 実施例４の反応フラスコにセプタムと乾燥管を装着し、
−２０℃未満に冷却した。実施例４の溶液を含有してい
るこの反応フラスコに、乾燥ＤＭＦ３６９.０μｌに溶
解したＮ-ヒドロキシスクシンイミド９１ｍｇの溶液３
００μｌを加えた。その溶液を−２０℃で１０分間撹拌
した後、室温まで徐々に温めた。その溶液を連続的に終
夜撹拌した。翌日、減圧下で加熱(６５℃未満)してＤＭ
Ｆを除去し、得られた粘性の橙色液体を封印し、少なく
とも２日間は−４℃未満に保存した。貯蔵庫から取り出
した後、粘性の橙色液体をジクロロメタンに溶解して濾
過することによって、過剰のＮ-ヒドロキシスクシンイ
ミド結晶を選択的に除去した。エーテルを添加すること
によって溶液内に残っている生成物を沈殿させ、それを
ジクロロメタンに再溶解し、エーテルで３回再沈殿させ
た。遠心分離の後、残渣をジクロロメタンに再溶解し、
丸底フラスコに移し、減圧下で濃縮して灰白色の固体３
７０ｍｇを得た。その固体の一部をＤＭＦに溶解し、イ
ソプロピルアミンで処理し、ＨＰＬＣで分析したとこ
ろ、標記の生成物へのきれいな変換が立証された。
【００８０】実施例６
【化１８】 抗体ＶＸ００７Ｂは、本明細書の抗体の項に記した抗体
ＫＳ１／４を生産するハイブリドーマから誘導されたサ
ブクローンであるハイブリドーマによって生産される。
０.３４Ｍ ホウ酸ナトリウム中にこの抗体９.９ｍｇ(１
９.８ｍｇ／ｍｌ)を含有する溶液５００.０μｌを磁気
撹拌子を備えた３.０ｍｌバイアルに加えた。乾燥ＤＭ
Ｆ１７７μｌに実施例５の生成物２.４ｍｇが入ってい
る混合物４０.５μｌをこの溶液に加えることによって
実施例５の生成物０.５５ｍｇを添加した。この溶液を
室温で２０分間撹拌し、５分間遠心分離した。上清の
１.０ｍｌを、０.１Ｍ生理学的リン酸緩衝化食塩水(ｐ
ｐｂｓ)で平衡化したフェニルスパロースカラム(ＦＰＬ
ＣTM，ＨＲ ５／５，Pharmacia,Inc.，ニュージャージ
ー州ピスカタウェイ)に充填し、４０％のアセトニトリ
ルと６０％の０.１Ｍ ｐｐｂｓを含有する溶液で段階的
勾配によって溶出させた。貯蔵した３つの分画を集め
た。３つの貯蔵液各５００μｌをスパロース１２(１０
％アセトニトリル／ｐｐｂｓで溶出)で精製し、紫外(Ｕ
Ｖ)分光光度測定法によって分析した。ＵＶ分析は複合
体の総合回収量が４.４ｍｇであることを示した。３つ
の貯蔵物の複合比はそれぞれ抗体１モルにつき薬物(ｍ)
３.３、４.５および６.３モルであった。
【００８１】実施例６Ａ
【化１９】 抗体９.９ｍｇと実施例５の生成物０.６９ｍｇから出発
して、実施例６の方法に従った。総合的に回収された免
疫複合体の量は３.０ｍｇ(３０％)であり、３つの貯蔵
物の複合比はそれぞれ抗体１モルにつき薬物(ｍ)４.
１，４.５および７.２モルであった。
【００８２】実施例７
【化２０】 ０.１Ｍリン酸緩衝液中に抗体ＶＸ０７７Ｂ１８.９ｍｇ
を含有する溶液１.０ｍｌを磁気撹拌子を備えた３.０ｍ
ｌバイアルに加えた。乾燥ＤＭＦ８１.１μｌに実施例
５の生成物１.５９ｍｇが入っている混合物をこの溶液
にゆっくりと加えた。この溶液を室温で２時間撹拌し、
１０分間遠心分離した。上清を０.１Ｍｐｐｂｓで平衡
化した実施例６に記載のフェニルスパロースカラムに注
入し、４０％アセトニトリル／０.１Ｍ ｐｐｂｓを含有
する溶液で段階的勾配によって溶出させた。貯蔵した１
つの分画を集めた。この分画をMIllex-GVR(Millipore，
マサチューセッツ州ベドフォード)０.２２μフィルター
を通して濾過し、ＵＶ分析に付したところ、１０.４ｍ
ｇ(５５％)の総合回収量と抗体１モルあたり薬物(ｍ)
４.０モルの複合比が示された。
【００８３】実施例７Ａ
【化２１】 フェニルスパロースカラムを０.１Ｍ酢酸緩衝液で平衡
化し、０.１Ｍ酢酸緩衝液中に４０％のアセトニトリル
を含有する溶液で溶出させる点以外は実施例７の方法に
従った。貯蔵した１つの分画のうちの２ｍｌをセファデ
ックスＧ-２５ＭRカラム(Pharmacia)に注入し、集めた
貯蔵分画をＵＶ分析に付した。このＵＶ分析によって、
７.９ｍｇ(４２％)の総合回収量であることがわかり、
比率は抗体１モルあたり薬物(ｍ)４.４モルであった。
【００８４】実施例８
【化２２】 磁気撹拌子を備えた１０ｍｌ丸底フラスコに窒素雰囲気
を供給し、ＤＭＦ４ｍｌを入れ、これにドクソルビシン
２００.０ｍｇを懸濁した。この懸濁液に飽和重炭酸ナ
トリウム溶液０.７５ｍｌを加えると、暗赤色の均一な
溶液が得られた。次に実施例３の生成物９５ｍｇを加
え、その溶液を室温で放置した。反応をＨＰＬＣ(Water
s C18 Radial pakカラム，流速５ｍｌ／分，６５％Ｍｅ
ＯＨ：３５％ＮａＯＡｃ溶液(３％ｗ／ｖ)を用いる)で
監視し、３時間後に標記の化合物を同定した。その反応
混合物を４℃で終夜保存した後、室温に温め、水５０ｍ
ｌを加え、エタノール１５０ｍｌで２回洗浄した。次
に、得られた溶液を０.２Ｎ ＨＣｌでｐＨ３.０に酸性
化し、各１５０ｍｌのエタノール中に２回迅速に抽出し
た。エタノール抽出物を貯蔵し、硫酸マグネシウムで乾
燥し、減圧下で濃縮して暗赤色の固体２４２.８ｍｇ(９
７％)を得た。この物質のＨＰＬＣ分析によって標記の
誘導体化薬物であることが確認された。
【００８５】実施例９
【化２３】 磁気撹拌子を備えた１０ｍｌ丸底フラスコに乾燥窒素雰
囲気を供給し、ＤＭＦ４ｍｌを入れ、そこに実施例８の
ドクソルビシン誘導体１９４.４ｍｇを加えた。この溶
液に１-エチル-３-(３-ジメチルアミノプロピル)カルボ
ジイミド・ＨＣｌ ２５６.４ｍｇを加え、その１５分後
にＮ-ヒドロキシスクシンイミド１５３.９４ｍｇを加え
た。反応をＨＰＬＣ(上述のWaters C18 radial pakカラ
ム)で監視した。最後の反応物を添加した３時間後に反
応が完了し、標記の誘導体化薬物が同定された。この反
応混合物を窒素雰囲気下室温で終夜撹拌したが、３時間
後に反応混合物を後処理するのが最善である。後処理と
して、全反応混合物を塩化ナトリウム溶液と共に酢酸エ
チル中に抽出し、塩化ナトリウム溶液で２回、水で１回
洗浄した。得られた混合物を硫酸マグネシウムで乾燥
し、濾過し、減圧下で濃縮して赤色の残渣約２５０ｍｇ
を得た。この残渣をジクロロメチレン２０ｍｌに溶解
し、エタノール５０ｍｌを加えた。直ちに形成した生成
物の沈殿を濾過し、乾燥することによって赤色の粉末１
７４.２ｍｇ(７９％)を得た。この粉末のＨＰＬＣ分析
によって標記の誘導体化薬物であることを確認した。
【００８６】実施例１０
【化２４】 ０.１Ｍ 生理学的リン酸緩衝化食塩水(ｐｐｂｓ)中に抗
体ＣＣ８３(上述したもの)１０.０ｍｇ(１３.５ｍｇ／
ｍｌ)を含有する溶液７４１.０μｌを、磁気撹拌子を備
えた３ｍｌ丸底フラスコに加えた。乾燥ＤＭＦ１６４.
０μｌに実施例９の生成物１.５ｍｇが入っている混合
物６０.１μｌをこの溶液に加えることによって、実施
例９の生成物０.５５ｍｇを添加した。その反応混合物
を室温で１.５時間ゆっくりと撹拌し、遠心管に移し、
１０分間遠心分離した。その上清を、６２.５％の０.１
Ｍ ｐｐｂｓと３７.５％の緩衝液(これは４０％のアセ
トニトリルと６０％の０.１Ｍ ｐｐｂｓを含有する)を
含有する溶液で平衡化したフェニルスパロースカラム
(ＦＰＬＣ；ＨＲ ５／５)に注入した。貯蔵した３つの
分画を集めた。第２と第３の分画を合わせ、この貯蔵物
の２.０ｍｌを０.１Ｍ ｐｐｂｓで平衡化したセファデ
ックスＧ-２５カラムTM(ＨＲ １６／５０)に注入し、
０.１Ｍ ｐｐｂｓで溶出させた。４０％のアセトニトリ
ルと６０％の０.１Ｍｐｐｂｓを含有する溶液でこのカ
ラムを段階的勾配によって溶出させた。貯蔵した分画は
約８.０ｍｌの橙色の溶液を与え、それをMillex-GVR０.
２２μフィルターを通して濾過し、ＵＶで分析した。Ｕ
Ｖ分析によって複合体の総合回収量が７.８ｍｇ(７８
％)であることがわかり、複合比は抗体１モルにつき薬
物(ｍ)３.９モルであった。
【００８７】実施例１０Ａ
【化２５】 抗体溶液を調製する際の緩衝液と遠心分離前に反応混合
物を撹拌する時間以外は実施例１０の方法に従った。
０.１Ｍ ｐｐｂｓを用いるのではなく０.３４Ｍホウ酸
緩衝液を使用した。また反応混合物を１.５時間ではな
く２０分間撹拌した。ＵＶ分析によって複合体の総合回
収量が８.７ｍｇ(８７％)であることがわかり、複合比
は抗体１モルにつき薬物(ｍ)５.２モルであった。
【００８８】実施例１１
【化２６】 ０.１Ｍ ｐｐｂｓ中に抗体Ｄ６１２ １０ｍｇ(１５.２
ｍｇ／ｍｌ)を含有する溶液６５８.０μｌを３ｍｌの丸
底フラスコに加えた。乾燥ＤＭＦ２０４.０μｌ中に実
施例９の生成物２.１０ｍｇが入っている混合物５３.３
μｌをこの溶液に加えることによって、実施例９の生成
物０.５５ｍｇを添加した。その反応混合物を室温で２
０分間ゆっくりと撹拌し、遠心管に移し、１０分間遠心
分離した。その上清を、６２.５％の０.１Ｍ ｐｐｂｓ
と３７.５％の緩衝液(これは４０％のアセトニトリルと
６０％の０.１Ｍ ｐｐｂｓを含有する)を含有する溶液
で平衡化したフェニルスパロースカラム(ＦＰＬＣ；Ｈ
Ｒ ５／５)に注入した。４０％のアセトニトリルと６０
％の０.１Ｍ ｐｐｂｓを含有する溶液を用いてこのカラ
ムを段階的勾配で溶出させた。貯蔵した３つの分画を集
めた。第２と第３の分画を合わせ、その貯蔵物の２.０
ｍｌを０.１Ｍ ｐｐｂｓで平衡化したセファデックスＧ
-２５ＭカラムTM(ＨＲ １６／５０)に注入した。貯蔵し
た分画は約８.０ｍｌの橙色溶液を与え、それをMillex-
GV０.２２μフィルターを通して濾過し、ＵＶで分析し
た。ＵＶ分析によって、複合体の総合回収量が７.６ｍ
ｇ(７６％)であることがわかり、複合比は抗体１モルに
つき薬物(ｍ)４.１モルであった。
【００８９】実施例１１Ａ
【化２７】 抗体溶液を調製する際の緩衝液以外は実施例１１の方法
に従った。０.１Ｍ ｐｐｂｓを用いるのではなく０.３
４Ｍホウ酸緩衝液を使用した。ＵＶ分析によって複合体
の総合回収量が６.１ｍｇ(６１％)であることがわか
り、複合比は抗体１モルにつき薬物(ｍ)６.１モルであ
った。
【００９０】試験例１：マウスにおけるＵＣＬＡ／Ｐ３
腫瘍 実施例６の複合体を雌のCharles Riverヌードマウス内
のＵＣＬＡ／Ｐ３肺腺癌の異種移植物に対してインビボ
で試験した。まず１０7ＵＣＬＡ／Ｐ３腫瘍細胞を各マ
ウスの皮下に移植することからこの試験を始めた。移植
後の第２日、第５日および第７日のそれぞれに各マウス
に複合体を注射するか、もしくは複合化していない薬物
を比較基礎として注射した。複合体は実施例６の生成物
であり、薬物はデスアセチルビンブラスチン-ヒドラジ
ド・Ｈ2ＳＯ4である。薬物単独または複合体の成分とし
ての薬物の投与量は０.５〜３.０ｍｇ／ｋｇの範囲であ
った。移植によって誘発された腫瘍の大きさを可能であ
れば移植の１４日後、２１日後、２８日後に測定し、阻
害百分率を計算した。各処置群は５匹のマウスからな
る。次の表に薬物と複合体の活性を腫瘍の阻害率(％)と
して記載する。
【表２】 腫瘍の阻害率(％) 移植後の日数 薬物 薬物投与量 複合体 ３.０ｍｇ／ｋｇ １４ ９２＊ １００＊＊ ２１ ８９ １００ ２８ ６９ １００ １.０ｍｇ／ｋｇ １４ ８０ １００ ２１ ７１ １００ ２８ ６４ １００ ０.５ｍｇ／ｋｇ １４ ７９ １００ ２１ ５０ １００ ２８ ４８ １００ ＊マウスの死亡率１／５ ＊＊マウスの死亡率２／５
【００９１】試験例２：マウスにおけるＵＣＬＡ／Ｐ３
腫瘍 試験例１の手法を用いて雌のCharles Riverヌードマウ
ス内にＵＣＬＡ／Ｐ３肺腺癌を樹立した。移植の２日
後、５日後および７日後のそれぞれに複合体(実施例５
のＶＸ００７Ｂ-Ｆ(ａｂ')2-デスアセチルビンブラスチ
ン付加物)、デスアセチルビンブラスチン-ヒドラジド・
Ｈ2ＳＯ4のみ、もしくは静脈内賦形剤のみを各マウスに
注射した。薬物単独または複合体の成分としての薬物の
投与量は０.２５〜１.０ｍｇ／ｋｇの範囲であった。次
の表に複合体、薬物および対照の活性を、移植の２４日
後に測定した存在する腫瘍の平均腫瘍質量(ｍｇ)として
記載する。
【表３】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 デボラ・レイン・ガットマン−カーライル アメリカ合衆国46069インディアナ州シェ リダン、ウエスト・トゥーハンドレッドシ ックスティファースト・ストリート3175番 (72)発明者 ゲイリー・アレン・コッペル アメリカ合衆国46260インディアナ州イン ディアナポリス、サンセット・レイン7823 番

Claims (4)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 式： 【化１】 ［Ｒ1はＣ1〜Ｃ4アルキルを表す。Ｒ2は反応に利用でき
    るアミノ、ヒドロキシまたはチオール官能性を有する１
    価の薬物誘導体を表す。ｍは１から１０までの整数を表
    す。Ａｂは薬物の送達が望まれる細胞、組織または病原
    体に関連する抗原を認識する抗体またはその抗原認識性
    断片を表す。］で示される免疫複合体。
  2. 【請求項２】 式： 【化２】 ［Ｒ1はＣ1〜Ｃ4アルキルを表す。Ｒ4はカルボキシ保護
    基を表す。Ｒ5はＨ2、＝Ｃ(ＯＨ)2、＝ＣＨＯＲ6または
    ＝ＣＨＳＲ6を表す。Ｒ6はＣ1〜Ｃ4アルキルを表す。］
    で示される化合物。
  3. 【請求項３】 式： 【化３】 ［Ｒ1はＣ1〜Ｃ4アルキルを表す。Ｒ2は反応に利用でき
    るアミノ、ヒドロキシまたはチオール官能性を有する１
    価の薬物誘導体を表す。Ｒ7はＨ、カルボキシ保護基、
    カルボキシ活性化基またはカルボキシ基の塩を完成させ
    る部分を表す。］で示される化合物。
  4. 【請求項４】 請求項１の免疫複合体を活性成分とする
    医薬組成物。
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