JPH06321806A

JPH06321806A - 皮膚外用剤

Info

Publication number: JPH06321806A
Application number: JP5092440A
Authority: JP
Inventors: Kumiko Yamada; 久美子山田; Kanemoto Kitamura; 謙始北村; Taiichi Nakayama; 泰一中山; Eriko Kasahara; 永吏子笠原; Akira Ito; 明伊藤
Original assignee: Shiseido Co Ltd
Current assignee: Shiseido Co Ltd
Priority date: 1993-03-25
Filing date: 1993-03-25
Publication date: 1994-11-22

Abstract

(57)【要約】【構成】単鎖ウロキナーゼタイプ・プラスミノーゲン
・アクチベータまたはそれを含有する正常ヒト表皮角化
細胞の培養上清を配合することを特徴とする皮膚外用
剤。【効果】優れた創傷治癒効果を有する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は皮膚外用剤、特に創傷治
癒効果を有する皮膚外用剤に関する。

【０００２】

【従来の技術】皮膚が損傷を受けた場合、その修復のメ
カニズムの一つである細胞増殖を促進することは損傷治
癒にとって重要なことであり、この細胞増殖促進作用を
有する薬剤の開発が盛んに行われ、例えば、化粧水、ク
リーム、乳液、パック、頭皮用化粧料等の化粧品や、創
傷治療、消炎用軟膏等の医薬品に広く応用されている。
従来より、アラントインや柴胡等の植物から抽出される
サイコサポニン、または表皮増殖因子（エピダーマル・
グロース・ファクター）等には、皮膚の創傷治癒に効果
があることが知られており、医薬品、化粧品等に応用さ
れてきた。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、これら
は何れもその効果が充分でなく、より一層効果の高い皮
膚外用剤の開発が望まれていた。本発明は、前記従来技
術の課題に鑑みなされたものであり、その目的は優れた
表皮細胞増殖促進作用によって皮膚組織の損傷修復に顕
著な効果を発揮する皮膚外用剤を提供することにある。

【０００４】

【課題を解決するための手段】前記目的を達成するため
に本発明者らが鋭意検討した結果、無血清角化細胞増殖
培地にて培養した正常ヒト表皮角化細胞の培養上清に顕
著な表皮角化細胞増殖促進作用があることを見出し、そ
の有効成分が従来より血栓溶解剤として各種血栓症の治
療に注射剤として用いられている単鎖ウロキナーゼタイ
プ・プラスミノーゲン・アクチベータ（ウロキナーゼの
不活性型前駆物質）であることを確認した。そして、最
終的に、単鎖ウロキナーゼタイプ・プラスミノーゲン・
アクチベータおよびそれを含有する正常ヒト表皮角化細
胞の培養上清に、極めて優れた創傷治癒効果を認め、本
発明を完成するに至った。

【０００５】すなわち、本出願の請求項第１項記載の皮
膚外用剤は、単鎖ウロキナーゼタイプ・プラスミノーゲ
ン・アクチベータを含有することを特徴とする。また、
請求項第２項記載の皮膚外用剤は、単鎖ウロキナーゼタ
イプ・プラスミノーゲン・アクチベータを０．０００１
〜１００単位／ｇ含有することを特徴とする。請求項第
３項記載の皮膚外用剤は、正常ヒト表皮角化細胞を無血
清角化細胞増殖培地にて培養することによって産生した
単鎖ウロキナーゼタイプ・プラスミノーゲン・アクチベ
ータを含有する培養上清を配合することを特徴とする。
請求項第４項記載の皮膚外用剤は、請求項第３項記載の
皮膚外用剤において、正常ヒト表皮角化細胞の培養上清
が、正常ヒト表皮角化細胞が産生した単鎖ウロキナーゼ
タイプ・プラスミノーゲン・アクチベータを皮膚外用剤
に対して０．０００１〜１００単位／ｇとなるように含
有することを特徴とする。

【０００６】以下に本発明の構成を詳細に説明する。単
鎖ウロキナーゼタイプ・プラスミノーゲン・アクチベー
タは、セリンプロテアーゼの一種であるウロキナーゼの
不活性型前駆体で、分子量約５４，０００の蛋白質であ
り、ヒト表皮角化細胞の培養上清の他、腎細胞の培養上
清にも分泌されることが知られている。単鎖ウロキナー
ゼタイプ・プラスミノーゲン・アクチベータはプラスミ
ンによってその一部が切断されると活性型ウロキナーゼ
（２本鎖ウロキナーゼタイプ・プラスミノーゲン・アク
チベータ）になり、プラスミノーゲンを活性化してフィ
ブリンを溶解する。このため、ウロキナーゼタイプ・プ
ラスミノーゲン・アクチベータは、従来より、血栓溶解
剤として各種血栓性疾患の治療に注射用医薬品として用
いられているが、創傷治療や、消炎を目的とした皮膚外
用剤に用いられたことはなかった。

【０００７】最近の知見として、プラスミノーゲン・ア
クチベーターが表皮細胞の遊走を促進することが確認さ
れた（日皮会誌、１０１（１０），１１０１ー１１０
７，１９９１）が、表皮細胞の遊走自体は創傷の治癒機
転の一つであり、細胞増殖のような実質的な創傷治癒課
程への関与は明らかにされていなかった。本発明者ら
は、無血清角化細胞増殖培地にて培養した正常ヒト表皮
角化細胞の培養上清から得た単鎖ウロキナーゼタイプ・
プラスミノーゲン・アクチベータに、本来活性体である
二本鎖ウロキナーゼタイプ・プラスミノーゲン・アクチ
ベータには認められなかった角化細胞増殖促進作用があ
り、更には優れた創傷治癒効果を有することを発見し
た。そして、単鎖ウロキナーゼタイプ・プラスミノーゲ
ン・アクチベータあるいはそれを含有する正常ヒト表皮
角化細胞の培養上清が皮膚外用剤に広く適用できること
を見出したものである。

【０００８】単鎖ウロキナーゼタイプ・プラスミノーゲ
ン・アクチベータは培養ヒト表皮角化細胞から次のよう
な方法で得られる。すなわち、ヒトの皮膚から既知の手
法を用いて採取された正常ヒト表皮角化細胞をプラステ
ィックシャーレに播種後、無血清角化細胞増殖培地にて
培養し、正常ヒト表皮角化細胞が産生する単鎖ウロキナ
ーゼタイプ・プラスミノーゲン・アクチベータが高活性
に含有されている培養上清を回収する。回収した培養上
清を濃縮し、ｇｏａｔａｎｔｉ−ｈｕｍａｎｕｒｏ
ｋｉｎａｓｅＩｇＧを用いたアフィニティ・クロマト
グラフィーにより分離精製し、該単鎖ウロキナーゼタイ
プ・プラスミノーゲン・アクチベータを得る。

【０００９】本発明の皮膚外用剤には、単鎖ウロキナー
ゼタイプ・プラスミノーゲン・アクチベータを０．００
０１〜１００単位／ｇ含有することが好ましい。０．０
００１単位／ｇ以下では創傷治癒効果が認められず、１
００単位／ｇ以上では創傷治癒効果が頭打ちとなり、不
経済である。また、本発明において皮膚外用剤に配合さ
れる正常ヒト表皮角化細胞の培養上清は、ヒトの皮膚か
ら既知の手法を用いて採取された正常ヒト表皮角化細胞
をプラスティックシャーレに播種後、無血清角化細胞増
殖培地にて培養し、その上清を回収して得ることができ
る。前記正常ヒト表皮角化細胞の培養上清には、有効成
分として正常ヒト表皮角化細胞が産生した単鎖ウロキナ
ーゼタイプ・プラスミノーゲン・アクチベータが含有さ
れることが必須であり、その含有量は皮膚外用剤に対し
て０．０００１〜１００単位／ｇとなるように含有する
ことが望ましい。０．０００１単位／ｇ以下では創傷治
癒効果が認められず、１００単位／ｇ以上では創傷治癒
効果が頭打ちとなり、不経済である。

【００１０】尚、本発明において、単鎖ウロキナーゼタ
イプ・プラスミノーゲン・アクチベータの活性の単位と
は、単鎖ウロキナーゼタイプ・プラスミノーゲン・アク
チベータを活性化した後、その活性を合成基質法により
測定し、標準品のウロキナーゼの活性に比較して、ウロ
キナーゼの国際単位に換算したものである。本発明の皮
膚外用剤には、通常化粧品、医薬品に用いられる他の成
分、例えば、水性成分、粉末成分、油性成分、界面活性
剤、保湿剤、増粘剤、防腐剤、酸化防止剤、香料、色
素、および薬剤等を本発明の効果を損わない範囲で適宜
配合してもよい。

【００１１】また、本皮膚外用剤の剤型は任意であり、
例えば、液剤、化粧水等の可溶化系や、乳液、クリーム
等の乳化系の他、軟膏、分散系等の剤型が可能である。
本発明の皮膚外用剤は創傷治癒効果に優れているため、
例えば、擦り傷、切り傷、掻き傷、靴擦れ、火傷、ひげ
そり後やシャンプー後の肌荒れ、ひび、あかぎれ等の改
善を目的とした、化粧水、クリーム、乳液、パック、頭
皮用化粧料等の化粧品や、創傷治療、消炎用軟膏等の医
薬品に広く適用される。

【００１２】

【実施例】次に実施例を上げて本発明を詳細に説明する
が、本発明の技術範囲がこれらの実施例に限定されるも
のでないことはいうまでもない。まず、正常ヒト表皮角
化細胞の培養上清および単鎖ウロキナーゼタイプ・プラ
スミノーゲン・アクチベータが、正常ヒト表皮角化細胞
の増殖を促進し、創傷治癒効果を有することを証明する
ため、正常ヒト表皮角化細胞の³Ｈ−チミジン取り込み
作用および創傷治癒効果ついて以下の試験を行った。

【００１３】（正常ヒト表皮角化細胞の³Ｈ−チミジン
取り込み作用）正常ヒト表皮角化細胞をプラスティック
シャーレに播種後、約７０％コンフルエントな状態まで
培養した。この時点で培地を各サンプルを含んだものに
交換し、以後２４時間培養した。培養終了２時間前に、
³Ｈ−チミジンを１μＣｉ／ｄｉｓｈずつ添加し、培養
を継続した。培養終了後、細胞内に取り込まれた³Ｈ−
チミジンの放射活性を液体シンチレーションカウンター
で測定した。結果を表１に示した。

【００１４】

【表１】正常ヒト表皮角化細胞の³Ｈ−チミジン取り込みに対する各種サンプルの作用 ────────────────────────────── サンプル放射活性(%)^* ────────────────────────────── コントロール（無添加）１００．０正常ヒト表皮角化細胞の上清１７５．８ｓｃーｕＰＡ^** １５２．３ ──────────────────────────────^* 放射活性はコントロールに対する百分率で示した。^** ｓｃーｕＰＡは単鎖ウロキナーセ゛タイフ゜・フ゜ラスミノーケ゛ン・アクチヘ゛ータ
を示す。

【００１５】コントロール群（何も添加しなかった培地
で培養）で細胞内に取り込まれた³Ｈ−チミジンの放射
活性を１００％とした場合、正常ヒト表皮角化細胞の培
養上清群（１０単位／ｇの単鎖ウロキナーゼタイプ・プ
ラスミノーゲン・アクチベータを含有する培地で培養）
に取り込まれた³Ｈ−チミジンの放射活性は１７５．８
％、また、単鎖ウロキナーゼタイプ・プラスミノーゲン
・アクチベータ群（１０単位／ｇの単鎖ウロキナーゼタ
イプ・プラスミノーゲン・アクチベータを含有する培地
で培養）においても１５２．３％という何れも高い放射
活性を示した。この結果、正常ヒト表皮角化細胞の培養
上清および単鎖ウロキナーゼタイプ・プラスミノーゲン
・アクチベータには顕著な正常ヒト表皮角化細胞の増殖
促進効果を有することが明らかとなった。また、２本鎖
ウロキナーゼタイプ・プラスミノーゲン・アクチベータ
（活性型ウロキナーゼ）には本試験おいて表皮角化細胞
増殖促進効果は認められなかった。

【００１６】（創傷治癒効果）生後６週間のウィスター
系ラット５匹を１群として試験を行った。全てのラット
は毛を刈り、ネンブタールにより麻酔を行い、正中線に
沿って背部皮膚を約２ｃｍ切開した後、直ちに切開部を
ミツヘル縫合した。正常ヒト表皮角化細胞の培養上清
（１０単位／ｇの単鎖ウロキナーゼタイプ・プラスミノ
ーゲン・アクチベータを含有）、単鎖ウロキナーゼタイ
プ・プラスミノーゲン・アクチベータの生理食塩水溶液
（１０単位／ｇの単鎖ウロキナーゼタイプ・プラスミノ
ーゲン・アクチベータを含有）、正常ヒト表皮角化細胞
の培養に用いた培地、および生理食塩水をそれぞれ各群
のラットに０．１ｍｌずつ１日２回連続２週間創傷部に
塗布した。２週間後に縫合糸を外し、切開部分の長さが
１ｃｍとなるように皮膚切片を作製した。この切片の切
断張力を東洋測器株式会社製テンシロンＵＴＭ−４を用
いて測定した。結果は表２に示す通りであった。

【００１７】

【表２】創傷治癒に対する各種サンプルの効果 ───────────────────────────── サンプル平均張力(g/cm) ───────────────────────────── 培地３３０生理食塩水２８０正常ヒト表皮角化細胞の上清５０５ｓｃーｕＰＡ^* ４９０ ───────────────────────────── ^*ｓｃーｕＰＡは単鎖ウロキナーセ゛タイフ゜・フ゜ラスミノーケ゛ン・アクチヘ゛ータを示す。

【００１８】コントロールの培地塗布群の平均張力が３
３０ｇ／ｃｍであったのに対し、正常ヒト表皮角化細胞
の培養上清塗布群の平均張力は５０５ｇ／ｃｍと高い値
を示した。このことから、正常ヒト表皮角化細胞の培養
上清に皮膚損傷の修復効果が認められ、顕著な創傷治癒
効果があることが判明した。また、コントロールの生理
食塩水塗布群の平均張力が２８０ｇ／ｃｍであったのに
対し、単鎖ウロキナーゼタイプ・プラスミノーゲン・ア
クチベータの生理食塩水溶液の塗布群も、４９０ｇ／ｃ
ｍと高い値を示し、このことから、単鎖ウロキナーゼタ
イプ・プラスミノーゲン・アクチベータも皮膚損傷の修
復効果を有し、顕著な創傷治癒効果があることが判明し
た。

【００１９】実施例１、２および比較例１、２（化粧
水）表３に示した各組成の水相およびアルコール相を調製
し、これらを混合可溶化した後、濾過を行い、化粧水を
製造した。実施例１は単鎖ウロキナーゼタイプ・プラス
ミノーゲン・アクチベータを含有する化粧水、実施例２
は正常ヒト表皮角化細胞の培養上清（単鎖ウロキナーゼ
タイプ・プラスミノーゲン・アクチベータを含有）を含
有する化粧水であり、比較例１および２はそれぞれ実施
例１および２のコントロールである。

【００２０】これらの化粧水を用いて、人体パネルで肌
荒れ改善効果試験を行った。すなわち、女性および男性
の健常人に対し、ミスリン樹脂によるレプリカ法を用い
て顔面表面形態のレプリカを取った。それを顕微鏡で観
察し、皮紋の状態および角層の剥離状態から、表４の基
準に基づいて肌荒れ状態１あるいは２と評価されたパネ
ラーを選出した。選ばれたパネラーの顔面の左右それぞ
れに実施例１と比較例１、または実施例２と比較例２の
化粧水を、各群３０人ずつに塗布し、１日２回連続４週
間塗布した。４週間後、再び上記のレプリカ法で同様に
肌の状態を調べ、表４の基準に従って評価した。

【００２１】その結果、各々の実施例と比較例の評点の
差によって肌荒れ改善効果を見ると、表５に示すよう
に、評点の差は１名を除き全員が０点以上であり、評点
の差が＋２以上あったパネラーは実施例１と比較例１の
群で３０名中２３名（７７％）、実施例２と比較例２の
群で３０名中２１名（７０％）であった。また、評点の
差が＋１以上、すなわち比較例に比して実施例の方が肌
荒れ改善効果が優れていたパネラーは、何れの群におい
ても３０名中２７名（９０％）にも達した。以上のよう
に、本発明の実施例１および２の化粧水には優れた肌荒
れ改善効果が認めれられた。

【００２２】

【表３】肌荒れ改善効果試験 ──────────────────────────────────── 成分組成（重量％）実施例１比較例１実施例２比較例２ ──────────────────────────────────── （アルコール相）エタノール 5.0 5.0 5.0 5.0 ポリオキシエチレン 0.5 0.5 0.5 0.5 オレイルアルコールメチルパラベン 0.05 0.05 0.05 0.05 香料 0.05 0.05 0.05 0.05 （水相）Ｌ-アラビノース 4.1 4.1 4.1 4.1 グリセリン 2.0 2.0 2.0 2.0 1,3-ブチレングリコール 2.0 2.0 2.0 2.0 クエン酸 0.01 0.01 0.01 0.01 クエン酸ナトリウム 0.1 0.1 0.1 0.1 ｓｃーｕＰＡ（100単位/g） 10.0 0 0 0 正常ヒト表皮角化細胞の培養上清 0 0 10.0 0 (ｓｃーｕＰＡを100単位/g含有) 培地 0 0 0 10.0 イオン交換水 76.19 86.19 76.19 76.19 ──────────────────────────────────── ＊表中ｓｃーｕＰＡは単鎖ウロキナーゼタイプ・プラス
ミノーゲン・アクチベータを示す。

【００２３】

【表４】レプリカ法による肌の状態の評価基準 ─────────────────────────────── 評点肌の状態備考 ─────────────────────────────── １皮溝、皮丘の消失肌荒れ広範囲の角層のめくれ２皮溝、皮丘が不鮮明肌荒れ角層のめくれ３皮溝、皮丘は認められる普通肌４皮溝、皮丘が鮮明普通肌５皮溝、皮丘が鮮明で整っている美しい肌 ───────────────────────────────

【００２４】

【表５】人体パネルによる肌荒れ改善効果（表中の数字は各評点に相当するパネラーの数） ──────────────────────────────────── 実施例の評点−比較例の評点試験群 −４ −３ −２ −１０＋１＋２＋３＋４ ──────────────────────────────────── 実施例１と００００３４１２１０１比較例１ ──────────────────────────────────── 実施例２と０００１２６１４７０比較例２ ────────────────────────────────────

【００２５】また、以下の実施例３〜８の組成で常法に
より各皮膚外用剤を製造したところ、何れも良好な創傷
治癒効果および肌荒れ改善効果を示した。なお、ｓｃー
ｕＰＡは単鎖ウロキナーゼタイプ・プラスミノーゲン・
アクチベータを示す。実施例３クリームセトステアリルアルコール３．５wt％スクワラン３８．０ミツロウ３．０還元ラノリン５．０ステアリン酸エチル４．０１，３−ブチレングリコール２．０グリセリン２．０ｓｃーｕＰＡ（５００単位／ｇ）１０．０エチルパラベン適量香料適量イオン交換水残量

【００２６】実施例４乳液エタノール３．０wt％ステアリン酸１．５セチルアルコール０．５ミツロウ２．０ポリオキシエチレン（１０）オレイルアルコール２．０プロピレングリコール３．０正常ヒト表皮角化細胞の培養上清２０．０（ｓｃーｕＰＡを１００単位／ｇ含有）エチルパラベン適量香料適量イオン交換水残量

【００２７】実施例５パックポリビニルアルコール１０．０wt％ポリエチレングリコール３．０プロピレングリコール１５００５．０エタノール１０．０正常ヒト表皮角化細胞の培養上清１０．０（ｓｃーｕＰＡを１００単位／ｇ含有）メチルパラベン適量香料適量イオン交換水残量

【００２８】実施例６頭皮用化粧料１，３−ブチレングリコール６．５wt％ポリエチレングリコール１５００５．０エタノール５．５水酸化カリウム０．０５ｓｃーｕＰＡ（５００単位／ｇ）１０．０２ーヘキシルデシルパルミテート１０．０スクワラン５．０ビタミンＥアセテート０．１５カルボキシビニルポリマー０．２ブチルパラベン適量香料適量イオン交換水残量

【００２９】実施例７軟膏ワセリン４０．０wt％ステアリルアルコール１５．０モクロウ２０．０ポリオキシエチレン（１０）オレイルアルコール０．５ｓｃーｕＰＡ（５００単位／ｇ）１０．０イオン交換水残量

【００３０】実施例８リップトリートメントキャンデリラロウ９．０wt％固形パラフィン８．０ミツロウ５．０カルナバロウ５．０ラノリン１１．０イソプロピルミリステート１０．０ｓｃーｕＰＡ（５００単位／ｇ）１．０防腐剤・酸化防止剤適量香料適量ヒマシ油残量

【００３１】

【発明の効果】以上説明したように、本発明に係る皮膚
外用剤は、表皮角化細胞増殖促進作用が認められた単鎖
ウロキナーゼタイプ・プラスミノーゲン・アクチベー
タ、または該アクチベータを含有する正常ヒト表皮角化
細胞の培養上清を配合することにより、優れた創傷治癒
効果および肌荒れ防止および改善効果を得ることが可能
となる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者笠原永吏子神奈川県横浜市港北区新羽町1050番地株式会社資生堂第一リサーチセンター内 (72)発明者伊藤明神奈川県横浜市港北区新羽町1050番地株式会社資生堂第一リサーチセンター内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】単鎖ウロキナーゼタイプ・プラスミノー
ゲン・アクチベータを含有することを特徴とする皮膚外
用剤。
【請求項２】請求項１記載の皮膚外用剤において、単
鎖ウロキナーゼタイプ・プラスミノーゲン・アクチベー
タを０．０００１〜１００単位／ｇ含有することを特徴
とする皮膚外用剤。
【請求項３】正常ヒト表皮角化細胞を無血清角化細胞
増殖培地にて培養することによって産生した単鎖ウロキ
ナーゼタイプ・プラスミノーゲン・アクチベータを含有
する培養上清を配合することを特徴とする皮膚外用剤。
【請求項４】請求項３記載の皮膚外用剤において、正
常ヒト表皮角化細胞の培養上清は正常ヒト表皮角化細胞
が産生した単鎖ウロキナーゼタイプ・プラスミノーゲン
・アクチベータを皮膚外用剤に対して０．０００１〜１
００単位／ｇとなるように含有することを特徴とする皮
膚外用剤。