JPH0630793A - プロトロンビンフラグメントの使用 - Google Patents

プロトロンビンフラグメントの使用

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JPH0630793A
JPH0630793A JP5112798A JP11279893A JPH0630793A JP H0630793 A JPH0630793 A JP H0630793A JP 5112798 A JP5112798 A JP 5112798A JP 11279893 A JP11279893 A JP 11279893A JP H0630793 A JPH0630793 A JP H0630793A
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Hartmut Lang
ハルトムート・ラング
Berta Dr Moritz
ベルタ・モーリッツ
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Immuno AG
Immuno AG fuer Chemisch Medizinische Produkte
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Abstract

(57)【要約】 【目的】プロトロンビンフラグメントの新規な使用法の
提供。 【構成】 診断目的でトロンビン基質を分析するため
に、トロンビン様活性を有するプロトロンビンフラグメ
ント、好ましくはヒトのプロトロンビンフラグメント、
特にメイゾトロンビンまたはメイゾトロンビン（ｄｅｓ
Ｆ１）またはその混合物を使用する方法。 【効果】 インヒビターに起因する誤差源を避けて、ト
ロンビン基質を分析できる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、プロトロンビンフラグ
メントの新規な使用法に関し、さらに詳しくは、メイゾ
トロンビン、メイゾトロンビン（ｄｅｓＦ１）またはそ
の混合物の新規な使用法に関する。
【０００２】
【従来技術と発明が解決すべき課題】トロンビンを用い
てトロンビン基質を活性化することによりトロンビン基
質を測定することは、血液および血漿生産物の特性化に
おける重要な方法論である。即ち、例えば、フィブリノ
ーゲン、因子Ｖ、因子ＶＩＩＩまたはプロテンＣの濃度
および活性は、通常、血漿含有試料をトロンビンにより
活性化することで測定される。トロンビンは血液の凝固
カスケードにおいて指導的な役割を演ずる３６ｋＤのタ
ンパク質であり、その主要な機能は、フィブリノーゲン
のフィブリンへの変換であり、フィブリンは、これもま
たトロンビンで活性化される因子ＸＩＩＩの助けを得て
フィブリンネットワークを形成する。
【０００３】さらに、トロンビンは、因子Ｖ、因子ＶＩ
ＩＩ、およびプロテンＣのような血液凝固因子をも活性
化し、栓球の凝固をもたらす。他の多くのタンパク質、
例えばフィブロネクチン、トロンボスポンジンおよびア
ポリポタンパク質、様々なコラーゲン類、ラミニン等
［ストッカー（Stocker）, Sem. Thr.Hem. 17(2) p.114
(1991）の表１参照］も同様にトロンビンによって開裂
され得る。以下の記述では、そのようなタンパク質を
「トロンビン基質」と称する。凝固カスケードにおける
重要な位置の故に、トロンビンのインビボでの作用は活
性化のエフェクターおよびインヒビターによって非常に
正確にコントロールされている。
【０００４】しかしながら、特に、これらのインヒビタ
ーは、その試料に偽の結果を与え、または、存在するイ
ンヒビターに打ち勝つために分析に先立ち、過剰量のト
ロンビンを加えておかなければならないので、トロンビ
ン基質の分析を阻害する。例えば、重要なトロンビンイ
ンヒビターは抗トロンビンＩＩＩと協同するヘパリンで
ある。ヘパリンは、もしも供給血液がヘパリン処置を受
けていると、即ち、採血の直後に未熟な状態での凝固を
避けるためにヘパリンが混合されていると、あるいは患
者が抗凝固治療でヘパリンを投与されていると、実際に
あらゆる血液試料に含有されている。本来のトロンビン
インヒビターは抗トロンビンＩＩＩである。ヘパリンは
抗トロンビンＩＩＩの効果を促進する。ヘパリン含有血
液または血漿試料では、面倒な方法でヘパリンを除去す
るか、ヘパリンを中和しておかないと、常にトロンビン
濃度、トロンビン基質活性化または反応速度分析に偽の
結果が出る恐れがある。
【０００５】このことは、ルーチンを目的とし、可能な
限り単純な方法が適する診断法にはまったく不適当な余
分な工程を含むことになる。何であれ、余分な工程は、
操作の経費を増大するばかりか、分析工程に一層の誤差
原因をもたらす可能性がある。トロンビンは血液中で、
活性化されていない前駆体タンパク質、即ち、プロトロ
ンビンから、幾つかの中間工程を経て成熟酵素として形
成される。成熟酵素はジスルフィド結合で結合した２つ
の鎖（ＡおよびＢ鎖）からなる。メイゾトロンビンまた
はメイゾトロンビン（ｄｅｓＦ１）は、プロトロンビン
のトロンビンへの不完全な活性化により形成される型の
プロトロンビンフラグメントである［ドイルら（Doyle
et al.）, J.Biol.Chem.265 (18), 10693-10701(199
0)、図１参照］。メイゾトロンビン（ｄｅｓＦ１）は、
プロトロンビンがトロンビンインヒビターの不在下に活
性化されて形成される。そのようにして、まずメイゾト
ロンビンが形成され、タンパク質分解的にフラグメント
Ｆ１が開裂されて、メイゾトロンビン（ｄｅｓＦ１）に
分解される。即ち、分子量は約７２ｋＤから約４８ｋＤ
まで減少する。これらのフラグメントは自己触媒的に分
解されるので、例えば、メイゾトロンビンは自己触媒作
用により迅速にα−トロンビンに変換される、不安定で
あると言われている。メイゾトロンビンおよびメイゾト
ロンビン（ｄｅｓＦ１）はまた、ヘビ毒酵素エカリンの
トロンビンへの作用によって生成する。
【０００６】ドイルらによって行われた実験により、プ
ロトロンビンとは対照的に、ウシメイゾトロンビンはト
ロンビンに比較して極めて低いプロテアーゼ活性を有す
ることが示された。メイゾトロンビンは例えばフィブリ
ノーゲンをフィブリンに開裂することができ、または低
い程度でプロテインＣを活性化することができるが、そ
れはヘパリンにより阻害されないか、阻害効果が、数段
低い［ストッカー（Stocker）およびミューラー（Muell
er）, Thrombosis and Haemostasis 65 (6) Abstract 8
55(1991)］。しかしながら、ヒトプロトロンビンフラグ
メントは実質上、例えばウシのそれよりも不安定である
ことも示された。しかし、あるヘビ毒がトロンビン基質
を開裂することが知られている。アンダーソン［Anders
son,Haemostasis 1, 31-43 (1972)］は幾つかのヘビ毒
がトロンビンと類似の、ＮＩＨ単位／mlにおいて同一の
トロンビン様活性を示すことを記載している。しかし、
ヒトタンパク質による診断域でヘビ毒を使用することは
非特異的相互作用（種間相互作用）の点で不都合であ
る。従って、とりわけヒト因子を測定するための診断法
には、哺乳類タンパク質のみ、好ましくはヒトタンパク
質のみを用いるための努力がなされてきたのである。分
析法における基本的な必要条件は、用いるタンパク質の
反応が明確であることである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明は、インヒビター
に起因する誤差源を避けて、プロトロンビンフラグメン
トの新規な使用を提供するという目的に基づく。これに
より、本発明は単純で正確なトロンビン基質の分析法を
提供する。即ち、本発明は、診断目的でトロンビン基質
を分析するために、トロンビン様活性を有するプロトロ
ンビンフラグメント、好ましくはヒトのプロトロンビン
フラグメント、特にメイゾトロンビンまたはメイゾトロ
ンビン（ｄｅｓＦ１）またはその混合物を使用すること
を目的とする。これらのフラグメントはまたトロンビン
が作用し得る基質を開裂することができることも分かっ
た。この文脈においてトロンビン様活性とは、至適ｐＨ
やイオン強度、阻害物質、促進物質、アロステリック相
互作用などの反応速度論、反応パラメーターは必ずしも
トロンビンのそれと同一でなないが、トロンビン基質を
開裂することができるプロテアーゼ活性を意味する。
【０００８】本発明の使用には、これら物質の抗トロン
ビンＩＩＩに対する親和性がトロンビン活性に比べて低
いために、該物質のトロンビン様活性が、ヘパリンに敏
感でないという点で利点がある。既述の血漿タンパク質
を用いる診断分析は、かくして試料のヘパリン含有に無
関係であり、従って、単純な方法で行うことができる。
従って、フィブリノーゲン、因子Ｖ、因子ＶＩＩＩ、因
子ＸＩＩＩまたはプロテンＣのようなトロンビン基質
は、既述のプロトロンビン含有試薬を用いる活性化によ
って測定される。本発明によれば、トロンビン基質を測
定することができるばかりでなく、本発明によって活性
化されたトロンビン基質と任意の方法で相互作用する物
質を測定することができる。
【０００９】即ち、活性化されたトロンビン基質を通し
て、凝固カスケードの因子の間接的な測定に試薬を用い
ることができる。例えば因子ＶＩＩＩを試薬と混合し、
系中で活性化し得る。それにより、因子ＩＸの測定およ
びさらには因子Ｘの測定が可能になる。結果として、本
発明はまた、トロンビン基質を活性化し、次いで、活性
化トロンビン基質と直接または間接的に相互作用する血
漿タンパク質を分析することにおいて、トロンビン様活
性を有するプロトロンビンフラグメント、好ましくはヒ
トプロトロンビンフラグメント、特にメイゾトロンビ
ン、メイゾトロンビン（ｄｅｓＦ１）またはその混合物
を用いることにも関する。
【００１０】本発明によれば、メイゾトロンビンまたは
メイゾトロンビン（ｄｅｓＦ１）、好ましくはメイゾト
ロンビンまたはメイゾトロンビン（ｄｅｓＦ１）を、別
個にあるいは混合物として用いる。これらの物質は標準
化された方法、例えば、ヘビ毒を用いる制御された開裂
等によって得ることができ、驚くべきことには、これら
は診断に必要とされる、十分な安定性を示した。それら
の構造によりトロンビンと同様の作用を示し、抗トロン
ビンＩＩＩに対する親和性がトロンビンよりも低い、遺
伝子工学によって産生されたタンパク質は、本発明にお
ける使用に適する。本発明は、さらに、診断目的でトロ
ンビン基質を分析し、およびトロンビン基質を活性化
し、次いで、活性化トロンビン基質と直接または間接的
に相互作用する血漿タンパク質、例えば、因子Ｘａおよ
び因子Ｖａのような凝固カスケードのタンパク質、を測
定するのための、トロンビン様活性を有するプロトロン
ビンフラグメント、好ましくはヒトプロトロンビンフラ
グメント、特にメイゾトロンビン、メイゾトロンビン
（ｄｅｓＦ１）またはその混合物を含有する試薬を包含
する。
【００１１】既述のプロトロンビンフラグメントを含有
し、本発明に従って用いられる試薬は、所望により、凍
結乾燥されていてもよく、さらに、所望により、診断目
的に用いることができる活性化し得るトロンビン基質を
含有していても良い。本発明はまた、１または数個の活
性化され得る血漿タンパク質、Ｃａ2+イオンおよび、所
望により、リン脂質をも含有する試薬を包含し、または
該試薬はさらに検出試薬をも含有していてもよい。さら
に、特許請求にかかる試薬と検出試薬を含有する単純な
テストキットを製造することができる。
【００１２】そのテストキットは、少なくとも、 １）トロンビン様活性を有するプロトロンビンフラグメ
ント、とりわけメイゾトロンビン、メイゾトロンビン
（ｄｅｓＦ１）またはその混合物を含有する試薬、、ま
たは ２）トロンビン様活性を有するプロトロンビンフラグメ
ント、とりわけメイゾトロンビン、メイゾトロンビン
（ｄｅｓＦ１）またはその混合物を含有し、さらに１〜
数個の活性化され得る血漿タンパク質を含有する試薬、
および ３）検出試薬、を含有する。さらに好ましくは、 ４）トロンビン基質をも含有する。検出方法の選択、即
ち、検出試薬の選択は、明らかに試料が含有する分析さ
れるべき物質の性質に依存する。例えば、活性化された
プロテインＣは、色素原基質Ｓ ２２３８（Kabi)によ
って測定される。それにより凝固時間の測定が可能であ
るか、または標識した物質を用いることが可能になる。
【００１３】
【実施例】以下に実施例を挙げ、本発明をさらに詳しく
説明する。 １.メイゾトロンビンの調製および分子量の分布 １.１ 固定化エカリンの調製 エカリン（Pentapharm）をＢｒＣＮ−活性化Sepharose
(Pharmacia)に２５０Ｕ／ｍｌゲルの濃度でアクセンら
の方法（Axen、１９６７）に従い結合させた。 １.２ メイゾトロンビンの調製 ゲル１mlを４Ｕのプロトロンビン（血漿から得、ＤＥＡ
Ｅ−Sephadexに吸着させて精製した後、さらにクロマト
グラフィーで精製）を０.０２Ｍ Ｎａ−酢酸バッファ
ー、０.１５Ｍ ＮaＣl、ｐＨ５.２中で室温で１時間イ
ンキュベーションした。次いで、生産物をろ過してゲル
から分離した。
【００１４】１.３ 分子量の分布 固有のＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびイムノブロッティング
（第１抗体：抗Ｆ．ＩＩ、兎ポリクローナル抗体；第２
抗体：ペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ウサギ抗体）の後、
分子量分布を決定し、定量を行った。生産物は以下の分
子量分布を示した；トロンビン様活性：６７−７５ｋＤ
（３１％）、４５−５０ｋＤ（４０％）；さらに、以下
の点が分かった：＞１００ｋＤ（７％）、３２−３８ｋ
Ｄ（１３％）、＜２０ｋＤ（９％）。 参考：アクセン（Axen R.）、ポラス（Porath A.R.）、
エルンバック（Ernback J.S.） Nature 214, 1392-140
4, 1967。
【００１５】２.フィブリノーゲンの測定 ２.１ 正常血漿の凝固時間 凍結乾燥した正常血漿（Reference Plasma 100%; Immun
o）１mlをヘパリン（０；０.３；０.６；１.０および
２.０Ｕ／ｍｌ）の存在下または非存在下で水１mlに溶
解した。血漿２００μlを３７℃で２分間インキュベー
ションした。その後、上記１.に従って調製した５.８Ｎ
ＩＨ−アナローガスＵ／ｍｌメイゾトロンビン、または
３.３Ｕ／ｍｌまたは１０.０Ｕ／ｍｌトロンビン(Throm
bin Reagent, Immuno）の溶液２００μlで凝固を開始し
た。血餅が形成されるまでの時間をSchnitger-Gross co
agulometer (Amelung)により測定した。表１から、トロ
ンビン製剤の凝固時間は試料のヘパリン含有量によって
延長されるが、メイゾトロンビンの作用はヘパリンの影
響を殆ど受けないことが分かる。
【００１６】
【表１】 凝固時間（秒） 試料のヘパリン含有量（Ｕ／ｍｌ） ０ ０.３ ０.６ １.０ ２.０ トロンビン（NIH-U/ml） ３.３ １６.１ ９６.１ ＞４００ ＞４００ ＞４００ １０ ７.０ １５.６ ６７.４ ＞４００ ＞４００ メイゾトロンビン（NIH-アナローガスU/ml） ５.８ ５.５ ６.１ ７.６ ８.０ ８.６
【００１７】２.２ フィブリノーゲンのための標準曲
線 凍結乾燥した正常血漿（２.１参照）を蒸留水１mlに溶
解し、種々のトロンビンインヒビター（抗トロンビンＩ
ＩＩ、ヘパリンまたは抗トロンビンＩＩＩ／ヘパリン複
合体（AtheplexR,Immuno）各１Ｕ／ｍｌ）を添加し、ま
たは添加せずに、０.１Ｍりん酸緩衝液（ｐＨ７.５）で
種々の濃度に希釈した。これらから得た試料１００μl
を同じ緩衝液５０μlと混合し、３７℃で２分間インキ
ュベーションした。１０.５ＮＩＨ−アナローガスＵ／
ｍｌのメイゾトロンビン（Pentapharm)または５ＮＩＨ
−Ｕ／ｍｌのトロンビン（Thrombin Reagent，Immun
o）の溶液１５０μlを加えた後、凝固時間を２.１と同
様の方法で測定した。
【００１８】
【表２】 トロンビンによる凝固時間（秒） 加えたインヒビター なし Atheplex ＡＴＩＩＩ ヘパリン 試料濃度 １７.１ ＞３００ ＞３５０ ＞３００ １：２ ２１.６ ６１.６ ＞３５０ ５０.４ １：４ ２７.６ ３７.１ １０１.６ ３６.１ １：８ ４１.６ ３８.６ ５４.６ ４８.９
【表３】 メイゾトロンビンによる凝固時間（秒） 加えたインヒビター なし Atheplex ＡＴＩＩＩ ヘパリン 試料濃度 １５.１ １６.０ １９.７ ２５.５ １：２ ２３.６ ２６.６ ２８.８ ３１.６ １：４ ３４.６ ３６.６ ３７.１ ３９.１ １：８ ５６.１ ５７.６ ５４.０ ６０.６
【００１９】３.凝固カスケードの活性化物質としての
診断薬中のメイゾトロンビン 正常血漿（２.１参照）中の因子ＶＩＩＩを、ヘパリン
０；１；２；５または１０ Ｕ／ｍｌの添加において、
上記１.に従って製造したメイゾトロンビン（０；３ま
たは５Ｕ／ｍｌ）で活性化し、因子Ｘａおよび色素原基
質を介して間接的に分析した。この目的のために、アッ
セイImmunochrom FVIII:CR (Immuno AG)を業者の指示に
従って用い、試薬Ａにはメイゾトロンビンを加え、試薬
Ｂにはポリブレンを用いなかった。この分析にはトロン
ビンが含まれており、そのために分析系中の活性な凝固
因子の測定において、メイゾトロンビンとトロンビンを
直接比較することができる。以下の表は、因子ＶＩＩＩ
の活性化への血漿中のヘパリン含有量による影響が、メ
イゾトロンビンの存在下では、より少ないことを示して
いる。
【表４】 ヘパリン （Ｕ／ｍｌ） ０ １ ２ ５ １０ メイゾトロンビン （ＮＩＨ−アナローガスＵ／ｍｌ） 発色（％） ０ １００ ９９ ９５.６ ８０ ５２.１ ３ １００ ９９ ９７.４ ８７.８ ７３.３ ５ １００ １００ ９８ ９２.２ ８０.１

Claims (15)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 トロンビン様活性を有するプロトロンビ
    ンフラグメントを用いる診断目的のトロンビン基質分析
    法。
  2. 【請求項２】 活性化されたトロンビン基質と直接また
    は間接的に相互作用する血漿タンパク質を測定するため
    にトロンビン様活性を有するプロトロンビンフラグメン
    トを用いる、トロンビン基質の活性化法。
  3. 【請求項３】 該プロトロンビンフラグメントがヒト起
    源である請求項１または２の方法。
  4. 【請求項４】 該プロトロンビンフラグメントが、メイ
    ゾトロンビン、メイゾトロンビン（ｄｅｓＦ１）および
    その混合物から選択される請求項１または２の方法。
  5. 【請求項５】 診断目的でトロンビン基質を分析するた
    めの手段として用いられる、トロンビン様活性を有する
    プロトロンビンフラグメントを含有する試薬。
  6. 【請求項６】 活性化されたトロンビン基質と直接また
    は間接的に相互作用する血漿タンパク質を測定するため
    に、トロンビン基質を活性化する手段として用いられ
    る、トロンビン様活性を有するプロトロンビンフラグメ
    ントを含有する試薬。
  7. 【請求項７】 該プロトロンビンフラグメントがヒト起
    源である請求項５または６の試薬。
  8. 【請求項８】 該プロトロンビンフラグメントが、メ
    イゾトロンビン、メイゾトロンビン（ｄｅｓＦ１）およ
    びその混合物から選択される請求項５または６の試薬。
  9. 【請求項９】 さらに、少なくとも１個の活性化され得
    る血漿タンパク質およびＣａ2+イオンをも含有する請求
    項５または６の試薬。
  10. 【請求項１０】 さらにリン脂質をも含有する請求項９
    の試薬。
  11. 【請求項１１】 さらに検出試薬をも含有する請求項５
    または６の試薬。
  12. 【請求項１２】 トロンビン様活性を有するプロトロン
    ビンフラグメントを含有する試薬と、検出試薬とを含有
    するテストキット。
  13. 【請求項１３】 該試薬が、さらに少なくとも１個の活
    性化され得る血漿タンパク質およびＣａ2+イオンをも含
    有する請求項１２のテストキット。
  14. 【請求項１４】 プロトロンビンフラグメントを含有す
    る該試薬が、さらにリン脂質をも含有する請求項１３の
    テストキット。
  15. 【請求項１５】 さらにトロンビン基質をも含有する請
    求項１２、１３または１４のテストキット。
JP5112798A 1992-05-15 1993-05-14 プロトロンビンフラグメントの使用 Pending JPH0630793A (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
AT0100092A AT397391B (de) 1992-05-15 1992-05-15 Verwendung von prothrombinfragmenten
AT1000/92 1992-05-15

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