HU216866B - Eljárás és reagens fibrinogén meghatározására - Google Patents

Abstract

A találmány fibrinőgén meghatárőzására szőlgáló őlyan eljárást ésreagenst ír le, amelyben trőmbinnal vagy trőmbinszerű hatássalrendelkező prőtrőmbinfragmentűmőkkal vagy ezek keverékével fibrinőgéntenzimes útőn átalakítják, majd a keletkezett fibrint, illetvefibrinőgén hasítási termékeket kiműtatják. Az eljárásra jellemző, hőgya fibrinőgén enzimes átalakítását 4–7,3 pH-tartőmányb n végzik. ŕ

Description

A találmány fibrinogén meghatározására szolgáló eljárásra vonatkozik, amelyben trombinnal vagy trombinszerű aktivitást kifejtő protrombinfragmentumokkal vagy ezek keverékével végezzük az enzimes átalakítást, és a kapott fibrin, illetve fibrinogén hasítási termékek kimutatására. A találmány tárgyát képezi továbbá egy reagens, amely adott esetben hígítatlan, és adott esetben heparintartalmú plazmaminta fibrinogéntartalmának a meghatározására szolgál.

Az alvadási zavarok vizsgálata szempontjából nagy jelentősége van a plazmában lévő fibrinogén meghatározásának. A fibrinogén meghatározására mind immunológiai, mind funkcionális módszerek - például alvadási vizsgálatok - ismeretesek. Az alvadási vizsgálatokban a fibrinogéntartalmat az alvadékképződési idővel mérik.

Egy szokásos meghatározási módszert írt le Clauss [Acta Haemat., 17., 237-246. (1957)]. Oxalátos plazmát pufferrel (pH = 7,4) hígítanak, és hozzáadják a koncentrált trombinoldatot. Ezután mérik az alvadási pontig eltelt időt. A trombinnal átalakított plazmaminta alvadási ideje azonban csak akkor arányos a fibrinogéntartalommal, ha elegendően nagy feleslegben adják a trombint a plazmához, hogy a plazmából származó zavaró faktorokat kiiktassák. Zavaró faktorként jön számításba az antitrombin III (ATIII), amely főként a heparinnal együtt hatékonyan gátolja a trombinhatást. A heparin egy általánosan használt antikoaguláns, amelyet vérvételkor használnak, vagy mint terapeutikumot alkalmaznak. A plazmaminta heparintartalma meghosszabbíthatja az alvadási időket, és ez hamis eredményhez vezet.

Az antritrombin III hatása a plazmában a magas trombinkoncentráció, valamint a plazma hígítása következtében, és ennek megfelelően az ATIII-, illetve heparinkoncentrációk csökkenése következtében erősen csökken. Ha a plazmát nem hígítják, az antitrombinhatás sokkalta erősebb lesz, s ez az alvadási időt meghosszabbítja.

A plazma hígítása és az eljárás ezzel összefüggő további lépései a rutinmeghatározásoknál jelentős tehertételt jelentenek. A nagyobb költségektől és a potenciálisan fertőzött plazmával való járulékos foglalkozástól eltekintve, minden hígítás elvileg egy hibaforrás. Ezenkívül gyakran a fibrinogéntartalomnak megfelelően kell végezni a hígításokat, amely az automata analizátorokkal való munkát nehezíti meg.

A plazma hígításához rendszerint veronálpuffert használnak, mivel ez a puffer a mérhető fibrinalvadékok képződését megkönnyíti, és ez, különösen a kevés fibrinogént tartalmazó plazmáknál, a meghatározást javítja. A Veronái azonban ugyanakkor egy kábítószer jellegű narkotikum, és ezért az ezzel az anyaggal való tevékenységet lehetőleg el kellene kerülni.

A zavaró faktoroknak, így az antitrombin III-nak, illetve a heparinnak a kiküszöbölésére irányuló további kísérletek a heparin semlegesítését, illetve eltávolítását foglalják magukban. A Clinical Chemistry [29., 614617. (1983)] című folyóiratban egy olyan eljárást ismertettek, amely szerint ha a plazmához polibrént adnak, ez a heparint semlegesíti. A plazmát pufferrel (pH=7,4) felhígítják és a trombin hozzáadása után fotométerbe helyezik. A reakciósebességet nefelometriásan határozzák meg.

Trombin helyett trombinszerű hatással rendelkező kígyóméregenzimek (Batroxobin) használatával a plazmafibrinogént a fent említett zavaró faktorok ellenére is meg lehet határozni. Ezeket a kígyóméregenzimeket ugyanis az ATIII, illetve heparin nem gátolja.

Humán proteinek meghatározására alkalmas eljárásokban az olyan proteineknek az alkalmazása, amelyek nem számítanak természetes alvadási enzimeknek, mint például a kígyóméregenzimek, számos problémát vet fel. A nem emlősállat eredetű enzimek és a humán proteinek közötti reakciók gyakran nem specifikusak. A biokémiai analitika elvének megfelelően, hogy ugyanis csak az azonos az azonossal hasonlítható és vizsgálható, az a nézet, hogy humán proteinek meghatározásához ugyancsak emlősállatokból származnak enzimek, és főként humán enzimek használhatók reakciópartnerként.

Trombin a protrombin aktiválása révén állítható elő. Az aktiválás folyamán köztitermékként meizotrombin (MT) és meizotrombin(desFl) keletkezik. A trombin köztitermékei azonban, ellentétben a protrombinnal, a trombinéhoz hasonló proteázaktivitást fejtenek ki („thrombin like activity”). Ezek tehát képesek arra, hogy azokat a szubsztrátumokat, amelyeket a trombin át tud alakítani, szintén elhasítsák. A „thrombin like activity” tehát szintén proteázaktivitás, amely trombinszubsztrátumokat tud hasítani, de reakciókinetikája és reakcióparaméterei, mint a pH vagy ionerősség-optimum, inhibitorai, effektorai, alloszterikus kölcsönhatásai stb., nem feltétlenül kell azonosak legyenek a trombinéival.

Összehasonlították pH 7,4-nél a szarvasmarha-meizotrombin (MT), a meizotrombin(desF 1) [MT(desFl)] és trombinenzimek aktivitását [J. Bioi. Chem., 265., 10693-10701. (1990)]. A meizotrombin a trombin „fibrinogén clotting” aktivitásának csak 2%-át képviselte. Ez a csekély aktivitás arra vezethető vissza, hogy az MT összetételében az MT(desFl) mennyisége 10-15%. Úgy találták, hogy az MT(desFl) aktivitása a trombin aktivitásának 14%-át teszi ki.

A fibrinogénnek fibrinné való enzimes átalakításához használt vizsgálatot rendszerint 7,4-8,0 pH-tartományban végzik el. Általában ezt a pH-tartományt használják a trombin enzimes reakcióinál, és ez megfelel a fiziológiai pH-tartománynak. A trombinaktivitás optimális pH-értéke közel 8.

A találmány azt a feladatot tűzi ki céljául, hogy eljárást adjon fibrinogén meghatározására olyan alvadási vizsgálat révén, amely az ismert eljárások ismertetett hátrányait elkerüli, és főként hígítatlan plazmákkal is, valamint a plazma ATIII-, illetve heparintartalma ellenére is elvégezhető.

Ezt a feladatot a találmány egy, a trombininhibitoroktól messzemenően független fibrinogénmeghatározási eljárással oldja meg. Ebben az eljárásban trom2

HU 216 866 Β binnal, „trombinszerű hatással rendelkező” protrombinfragmentumokkal vagy ezek keverékével végezzük a fibrinogén átalakítását, majd a kapott fibrint, illetve a fibrinogén hasítási termékeket kimutatjuk. Az eljárásra jellemző, hogy a fibrinogén enzimes átalakítását 4-7,3 pH-tartományban végezzük, és a keletkezett fibrin kimutatása az alvadási idő, illetve a fibrinogén hasítási termékek meghatározásán alapul. Végül észleljük a kapott fibrinalvadékokat. Az alvadási idő meghatározásával végzett kimutatás fotometriás vagy turbidimetriás módszer lehet. A „trombinszerű hatással rendelkező” protrombinfragmentumokként főként az MT és MT(desFl) vagy ezek keveréke jön számításba. A felhasznált enzimek koncentrációját, illetve keverési arányát úgy kell megválasztani, hogy egy mintában ez egyenes arányosságot biztosítson a fibrinogéntartalom lehetőleg tág határai között.

A géntechnológiai úton előállított proteinek, amelyek szerkezetük alapján a trombinhoz hasonló aktivitást fejtenek ki, és a trombinnal összehasonlítva az antitrombin III-mal szemben kisebb affinitást mutatnak, szintén alkalmasak a találmány szerinti eljárásban való felhasználásra.

A meghatározás kivitele az adott pH-tartományban az említett zavaró faktoroktól - ATIII és heparin annyira nem fiigg, azaz ezekre annyira érzéketlen, hogy a fibrinogénmeghatározást hígítatlan és adott esetben heparint tartalmazó plazmamintában is el lehet végezni. A plazma hígításával kapcsolatos eljárási lépéseket a találmány szerinti eljárásnál ki lehet hagyni, és így a vizsgálati eredmény egy esetleges hibaforrás kiküszöbölése révén pontosabb lesz.

A találmány annak felismerésén alapul, hogy egyrészt az ATIII/heparin trombingátló hatása 4-7,3 pHtartományban elhanyagolható, és így a szuboptimális körülmények ellenére a trombinaktivitás a fibrinogén enzimes átalakításához elégséges. A trombin enyhén csökkent aktivitása még azzal az előnnyel is jár, hogy az alvadási idők nem túl rövidek, és így az alvadási időket könnyebb észlelni.

A trombinnak, a „trombinszerű hatással rendelkező” protrombinfragmentumoknak vagy ezek keverékének felhasználásakor meglepő módon kiderült, hogy a fibrinogénmeghatározáshoz optimális, említett pH-tartományban - előnyösen pH 5-7 között, vagy legelőnyösebben pH 6-nál - a trombinszerű aktivitás nem függ a trombininhibitoroktól.

A fibrinogén enzimes átalakítását előnyösen 0,02-0,5 M, legelőnyösebben 0,1-0,25 M koncentrációban puffersókat tartalmazó pufferben végezzük. Az ionerőt adott esetben sók - például nátrium-klorid hozzáadásával növelhetjük. Megállapítottuk, hogy a trombin, főként alacsony ionerősség mellett, az ATIII által kifejtett gátlásra nem érzékeny. A találmány szerinti eljárás kivitelezéséhez azonban a plazmamintáéval azonos vagy magasabb pufferkapacitás biztosítása az előnyös, hogy a meghatározás folyamán egy meghatározott pH-t tudjunk tartani.

A fibrinogénmeghatározást hígítatlan és adott esetben heparint tartalmazó olyan plazmamintában is igen jól el tudjuk végezni, amelyben a heparin semlegesítetlen formában fordul elő.

A találmány tárgyát képezi a fibrinogéntartalom meghatározásához szolgáló olyan reagens is, amely adott esetben a hígítatlan és adott esetben a heparint tartalmazó plazmamintában lévő trombininhibitoroktól messzemenően független, és trombint vagy „trombinszerű hatással rendelkező” protrombinfragmentumokat vagy ezek keverékét tartalmazza. A szóban forgó reagens a fibrinogén enzimes átalakítására szolgál egy olyan pufferben, amelynek pH-tartománya 4-7,3 lehet. A reagens hatására képződő fibrint úgy mutatjuk ki, hogy meghatározzuk az alvadási időt, illetve a fibrinogén hasítási termékeket. A reagens a fibrinogén egyszerű meghatározására szolgál, anélkül, hogy vele járna a plazmaminták körülményes hígítása vagy a plazmamintában lévő heparin semlegesítése vagy eltávolítása.

A találmányt az alábbi példában részletesebben ismertetjük, anélkül azonban, hogy ezzel korlátoznánk a találmány oltalmi körét.

Példa

Fibrinogénmeghatározás pH 6 és pH 8 mellett

Összehasonlításképpen pH 6 és pH 8 mellett plazmamintákban meizotrombin és trombin használatával meghatároztuk az alvadási időket a fibrinogéntartalom függvényében. A meizotrombint humán protrombin aktiválásával állítottuk elő, immobilizált ekarint (Pentapharm) használva, Stocker és Müller előírása szerint [Thromb. Haemostasis, 65., abstr. 855. (1991)]. A vizsgálatokhoz különböző fibrinogéntartalmú plazmamintákat használtunk.

A plazmaminta 50 μΐ-éhez hozzáadtunk 100 μΐ puffért (0,2 M trisz.HCl-puffer, pH=8, vagy 0,2 M foszfátpuffer, pH=6) vagy trombint (10 NIH E/ml, Thrombin Reagent, IMMUNO), és az alvadási időket 37 °C-on Schnitger-Gross-koagulométerrel (Amelung) határoztuk meg. A meghatározást heparin jelenlétében (1 E/ml) és heparin nélkül is elvégeztük.

A táblázatokból kitűnik, hogy pH 6 mellett a fibrinogéngörbék lefutása független a minta heparintartalmától. A mintában lévő heparintartalom azonban pH 8 mellett meghosszabbítja az alvadási időket; ugyanezt észleltük mindkét alvadási enzimnél, mind a meizotrombinnál, mind a trombinnál.

Meizotrombin

Fibrinogén- tartalom (mg/ml)	pH 8	pH 6
heparin nélkül	heparinnal	heparin nélkül	heparinnal
310	8,0	10,6	30,4	30,1
238	11,1	15,1	50,7	49,1
94	26,0	35,5	166,4	157,5
62,5	35,6	>250	>250	>250

HU 216 866 Β

Trombin

Fibrinogén-	pH 8	pH 6
tartalom (mg/ml)	heparin nélkül	hcparinnal	heparin nélkül	hcparinnal
373	11,6	>200	18,6	17,3
310	16,1	>200	24,1	24,1
238	25,6	>200	28,4	30,1
100	50,0	>200	85,9	89,8

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

Claims (4)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Trombininhibitor-hatásra messzemenően érzéketlen eljárás fibrinogén meghatározására trombinnal, trombinszerű hatással rendelkező protrombin fragmentumokkal vagy ezek keverékével végzett enzimes átalakítással, és ezt követően a keletkezett fibrin, illetve fibrinogén hasítási termékek kimutatásával, azzal jellemezve, hogy a fibrinogén enzimes átalakítását 4-7,3 pH-tartományban végezzük és a keletkezett fibrin kimutatását az alvadási idő, illetve a fibrinogén hasítási termékek meghatározásával végezzük.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a fibrinogén enzimes átalakítását 0,02-0,5 M, előnyösen 0,1-0,25 M puffersókat tartalmazó olyan pufferben végezzük, amelynek ionerősségét sók - például nátrium-klorid - hozzáadásával megnöveltük.
3. 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a fibrinogénmeghatározást hígítatlan és adott esetben heparint is tartalmazó plazmamintából végezzük.
4. 4. Trombininhibitorokra messzemenően érzéketlen reagens fibrinogéntartalom meghatározására, adott esetben hígítatlan és adott esetben heparint tartalmazó plazmamintából, azzal jellemezve, hogy trombint vagy trombinszerű hatással rendelkező protrombinffagmentumokat vagy ezek keverékeit tartalmazza fibrinogén enzimes átalakítása céljából, és a keletkezett fibrint ezt követő, az alvadási idő, illetve a fibrinogén hasítási termékek 4-7,3 pH-tartományt biztosító pufferben való mérésével végzett kimutatására.