CZ87893A3

CZ87893A3 - Fibrinogen determination method

Info

Publication number: CZ87893A3
Application number: CZ93878A
Authority: CZ
Inventors: Hartmut Dr Lang; Berta Dr Moritz
Original assignee: Immuno Ag
Priority date: 1992-05-15
Filing date: 1993-05-12
Publication date: 1994-02-16
Also published as: FI932196A0; ES2123043T3; DE59308942D1; NO309902B1; ATE170569T1; HUT64146A; DK0570354T3; HU216866B; ATA99992A; JPH0646898A; EP0570354A1; EP0570354B1; MX9302827A; CA2096215A1; NO931773D0; FI932196A; AT399055B; NO931773L; HU9301401D0; SK48693A3

Description

Oblast techniky

Vynález se týká způsobu stanovení fibrinogenu enzymatickou reakcí s trombinem, protrombinovými fragmenty sthrom' bin like activity” nebo směsmi těchto látek a potom detekcí vzniklého fibrinu popř. štěpných produktů fibrinogenu. Dále vynález zahrnuje činidlo pro stanovení obsahu fibrinogenu v popřípadě neředěném a popřípadě také heparirý)bsahujícím vzorku plasmy.

Dosavadní stav techniky

Stanovení fibrinogenu v plasmě má velký význam v rámci výzkumu poruch srážení. Pro stanovení fibrinogenu jsou známy jak imunologické tak také funkční metody, jako např. testy srážení, gři testech srážení se stanoví obsah fibrinogenu měřením času , kdy se vytvoří sraženina.

3ěžnou metodu stanovení popsal Glauss íácta Haemat.17, 237-246, 1957). Gxalátová plasma se zředí v pufru o pH 7,4 a přidá se koncentrovaný trombinový roztok. Na závěr se stanoví doba až do bodu srážení. Doba srážení vzorku plasmy, který reagoval s trombinem je ale- úměrná obsahu fibrinogenu jen tehdy, když byl zvolen dostatečně velký přebytek trombinu k plasmě, aby byly překryty plasmové rušivé faktory. ^áa rušivý faktor je považován antitrombin III (AT III), který především spolu s heparinem účinně potlačuje působení trombinu. Heparin je obvyklé antiko agulační činidlo a používá se jako přísada při odběru krve nebo jako terapeuti^um. Obsah heparinu ve vzorku plasmy může vést k prodlouženým zobám srážení a tak k nesprávnému výsledku.

-2Působení antitrombinu ±11 v plasmě zde bude díky vysoké koncentraci trombinu a díky zředění plasmy a tím díky snížení koncentrací AT III popř. heparinu silně sníženo. Jestlise se ps^sma nebude ředit, je působení antitrombinu několikrát silnější a doba srážení se prodlužuje.

Zředění plasmy a s tím spojený další stupen zpracování znamená při rutinních pokusech zhačné zatížení. Vedle vyšších pracovních nákladů a dalšího nutného zpracování potenciálně infekční plasmy je každé Ředění zásadním zdrojem ohyb. Mimoto musí být ředění často provedeno tak, aby odpovídalo obsahu fibrinogenu, což ztěžuje práce s automatickými analyzátory.

Obvykle se ředění plasmy provádí za použití veronalového pufru, protože tento pufr usnadňuje tvorbu měřitelných fibrinových sraženin, což zejména ú plasmy s nízkým obsahem fibrinogenu usnadňuje stanovení. Veronal je ale současně také narkotikum s návykovým charakterem, čímž je: používání této substance značně ztíženo.

Další pokusy o vyřazení rušivého faktoru antitrombinu III popř. heparinu, zahrnují neutralizaci popř. odstranění heparinu. V Glinical Ghemistry 29, 614-617 (1983) je popsán způsob, podle kterého se heparin ve vzorku plasmy neutralizuje přídavkem polybrenu, Plasma se zředí v pufru o pH 7,4 a po · přídavku trombinu se přenese do fotometru. Potom se nefelometricky stanoví reakční rychlost.

Po přídavku enzymů hadího je^u s účinností podobnou trombinu (batroxobin) místo trombinu, může být fibrinogen v plasmě stanoven nezávisle na rušivých uvedených faktorech. Tyto enzymy hadího j;

^:u nejsou zejména inhibovány /ÍTIII popr. nepa- JFoužití proteinů, které nejsou oovažovsn.y za přirozené srážecí enzymy, jako např. enzymy hadích jedů, ve způsobu stanovení lidských proteinů je problematické. Reakce mezi enzymem zvířete, kterým není savec· a lidským proteinem jsou často nespecifické. V soulasu s principem biochemické analytiky, porovnávat a zkoumat jen stejné se stejným, ge snaha o to, používat pro stanovení lidských proteinů rovněž jen enzymy savců a mezi jinými lidské enzymy jako re akčního Dartnera.

'‘•rombin může být vyroben aktivací protrombinu. Jako mezisttoně vznikají během aktivace meizotrombinjá (MT) a meizotrombin (desF1). Dvojrětezcové trombinové meziprodukty ale vykazují za přítomnosti protrombinu proteásovou aktivitu, která je podobná aktivitě trombinu (thrombin like activity). Jsou tedy schopny popřípadě štěpit substráty, které by mohly být přeměněny trombinem. Thrombin like activity je také proteásová aktivita, která umožňuje štěpit trombinov^ substráty jejichž reakční kinetika a reakční parametry, jako pH- nebo optima iontové síly, inhibitory, efektory, alostérické vedlejší působení atd. nemusí bezpodmínečně být shodné s těmito parametry pro trombin.

Aktivity hovězího enzymu meizotrombinu, meizotrcmbinu (desF1) a trombiňu^porovnány v J.of 3iol.Ohemistry 265, 10693-10701 (1990) při hodnotě pH 7,4. Meizotrombin vykazuje jen 2% fibrinogen ciotting activity trombinu. Tato snížená aktivita může však také opět být 10 až 15 5 obsahu MT(desFl) v přípravku MT. ?ro MT(desF1 ) byla nalezena aktivita 14 % trombinu.

Test enzymatické přeměny fibrinogenu na fibrin se obvykle provádí při hodnotě pH v oblasti 7,4 až 3,0. Tatc oblast pH se obvykle používá při enzymatických reakcích trombinu, nebot odpovídá fyziologickému rozsahu pH. Optimální pH hodnota oro trombinovou aktivitu leží blízko oK 8.

-4Gílem vynálezu nalezení způsobu stanovení fibrinogenu pomocí testů srážení, který by odstranil uvedené nevýhody známých způsobů a mohl být zejména prováděn také ve vzorcích neředěné plasmy nezávislá na obsahu AT III- popř-. heparinu.

Podstata vynálezu

Tato úioha je podle vynálezu řešena způsobem stanovení fibrinogenu. nezávislým, na inhibitorech trombinu enzymatickou přeměnou trombinem, protrombinovými fragmenty s trombin like activity” nebo směsmi těchto látek a potom detekcí vzniklého fibrinu popř. štěpných produktů fibrinogenu, který se vyznačuje tím, že se enzymatická přeměna fibrinogenu provádí při pH v rozsahu 4 až 7,3 a detekce? vzniklého fibrinu se provádí stanovením doby srážení popřípadě fibrinogenovýoSt štěpnýmfi. produkty. Potom se deteguje vzniklá sraženina fihřinu. Detekce se může provádět fotcmetrickým nebo turbidimetrickým stanovením doby srážení. K protrombinovým fragmentům s ”trombin like activity” se počítají zejména směsi MT, MT(desF1) nebo těchto látek samotných. Koncentrace popř. poměry směsí použitých enzymů se volí tak, že je zaručen lineární vztah v co možno nejširším rozsahu obsahu fibrinogenu ve vzorku.

^x‘aké proteiny vyrobené genovou technikou, které na základě své struktury vykazují aktivitu podobnou trombinu a v porovnání s trombinem vykazují nepatrnou aktivitu k antitrombinu ITT, jsou vhodné pro způsob podle vynálezu.

Provedení způsobu stanovení v uvedené oblasti pH činí toto tak dalece nezávislým na uvedených rušivých faktorech AT ITI a heparinu, že stanovení fibrinogenu může být provedeno jednoduchým způsobem ve zředěném a popřípadě také hepann obsahujícím vzorku plasmy, přídavný stupen ředění plasmy může

-0být při způsobu podle vynálezu vynechán, Čímž se výsledelc testu zlepší vyloučením eventuálního zdroje chyb.

Vynález spočívá na poznatku, že je- možno potlačit inhibici trombinu působením JST Ill/heparinem při pH 4 až 7,3, při čemž přes suboptimální podmínky je dosaženo trombinové aktivity k enzymatické přeměně fibrinogenu. O něco snížená aktivita trombinu má dokonce tu výhodu, že doby srážení nejsou příliš krátké a jsou snadno zaznamenatelné.

^ři použití trombinu, protrombinových fragmentů s trombin like activity” nebo jejich směsí,) že trombinová aktivita v uvedeném rozsahu pH, výhodně při pH 5 až 7 nebo nejvýhodněji při pH asi 6, je optimální pro stanovení fibrinogenu nezávisle na inhibitorech trombinu.

Enzymatická přeměna fibrinogenu se výhodně provádí v pufru s molaritou tlumících solí v rozsahu 0,02 až 0,5 M, nejvýhodněji s pufrem 0,1 až 0,25 M. Iontová síla se popřípadě může zvýšit přídavkem solí, jako je chlorid sodný. Bylo zjištěno, že trombin je především při nízkých iontových sílách necitlivý vůči áT III -inhibici. ?ro provedení způsobu podle vynález.u je ale také použitelné prostředí s pufrovací kapacitou v porovnání s plasmovým vzorkem stejnou nebo vyšší, aby se zachovalo určené pH během způsobu stanovení.

Výhodně se provádí stanovení fibrinogenu ±2k z neředěného a popřípadě také heparinobsahujícího vzorku plasmy, ve kterém je také přítomen v neutralizované formě.

Vynález se týká také činidla pro stanovení obsahu fibrinogenu v širokém rozsahu nezávislého na inhibitorech trombinu vzorku popřípadě zředěné s popřípadě také heparin obsahující plasmy obsahujícíhotrombin, protrombinové fragmenty s trombin like activity nebo jejich směsi pro enzymatickou /-opřeměnu fibrinogenu v pufru o pH v rozsahu 4 až 7,3 a potom pro detekci vzniklého fibrinu stanovením doby srážení, popř. štěpných produktů fibrinogenu. Činidlo slouží k jednoduchému stanovení fibrinogenu, bez zdlouhavého ředění vzorků plasmy nebo neutralizace popř. odstranění heparinu ze vzorků plasmy.

Vynález bude blíže vysvětlen následujícími příklady.

Příklady provedení vynálezu

Stanovení fibrinogenu při pH 6 a pH 8:

Pro porovnání se použijí meizotrombin a trombin při pH 6 a pH 8 a stanoví se doba srážení v závislosti na obsahu fibrinogenu ve vzorcích plasmy, líeizotrombin se připraví aktivací lidského protrombinu zmobilizovaným ecarinemífa.Pentapharm) postupem podle Stockera a Mflllera (Thromb.Hsemostasis 65(6), abstrakt 855(1991)). Vzorky, obsahující plasmu s různým obsahem fibrinogenu byly připraveny pro testování.

/ul vzorky plasmy byly smíseny se 100 /ul pufru (0,2 M Tris HCl-pufr, pH 8 nebo 0,2M fosfátový pufr, pH 6) a 150 /ul meizotrombinu (15 NIH-analog j./ml) nebo trombinu (10 NIH jk/ml). Thrombin ^eagent, fa.Immuno) a při 37 °0 se stanoví doba srážení Schnitger-Oross-koagulometrem (Fa. Anelung). Stanovení se provádí jak za nepřítomnosti tak za přítomnosti heparinu (1 j./ml).

tabulek je zřejmé, že průběh průběh křivek vz

4pro fibrinogen je při pH vzorku. Obsahem heparinu pH S prodlouží; a to jak bin jako srážecí enzym.

nezávislý na obsahu heparinu ve ve vzorku se vsak coby srážení při oro meizotrombin tak také pro trom*7 i-t V Š Vk U.iiO—.i

obsah fibrinogenu.	oH bez hep.	g s hep.	pH 6 bez hep.	s hep,
(mg/ml)
31 0	ε,ο	10,6	30,4	30,1
238	11,1	15,1	50,7	49,1
94	26,0	35,5	166,4	157,5
62,5	35,6	>250	7*250	x*250
Trombin
obsah fibrinogenu.	pH bez hep.	8 ► s hep.	pH 6 bez hep.	s hep
(mg/ml)
373	11,6	>200	18,6	17,3
310	1 6,1	^200	24,1	24,1
238	25,6	>200	28,4	30,1
100	50,0	>200	85,9	89,8

I

W'? 'Τ*;·~0Χ4 *ih <·Α·:^:

120 00 ΡΠΑιΐ.·· HShcva 2

ΖΨ á'M-7

Claims

PATENTOVÉ N A E O K Ϊ

1 . Způsob stanovení fibrinogenu v širokém rozsahu nezávislý na inhibitorech trombinu enzymatickou přeměnou trombinem, protrombinovými fragmenty s trombin like activity nebo jejich směsmi a potom detekcí vzniklého fibrinu popř. štěpných produktů fibrinogenu, vyznačující se t í m, že se enzymatická přeměna fibrinogenu provádí při pH v rozsahu 4 až 7,3 a detekce vzniklého fibrinu se provádí stanovením, doby srážení popř. štěpných produktů fibrinogenu.
2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se enzymatická přeměna fibrinogenu provádí v pufru s molaritou tlumících solí v rozsahu od 0,02 do 0,5 M, výhodně 0,1 až 0,25 jakož i po zvýšení iontové síly přídavkem solí, jako je N-aCl.
3. Způsob podle nároku 1,vyznačující se t í m, že se stanovení fibrinogenu provádí ze zředěného a popřípadě také heparin obsahujícího vzorku plasmy.
4. Činidlo pro stanovení obsahu fibrinogenu široce nezávislého na inhibitorech trombinu v popřípadě nezředěném a popřípadě také heparin obsahujícím vzorku plasmy, obsahující trombin, protrombinové fragmenty s trombin like activity nebo jejich směsi pro enzymatickou přeměnu fibrinogenu a potom pro detekci vzniklého fibrinu pomocí doby srážení popř. štěpných produktů fibrinogenu v pufru o pH v rozmezí 4 až 7,3

< r— >· — Σ’ o <-

c