JPH06298749A - ベンゾチアゾールスルホンアミド誘導体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 プロテインキナーゼＣ、ミオシン軽鎖キナー
ゼ等の蛋白質リン酸化酵素阻害活性を有するベンゾチア
ゾールスルホンアミド誘導体およびその酸付加塩並びに
それらを有効成分とする蛋白質リン酸化酵素阻害作用に
基づく喘息治療剤または予防剤を提供するものである。 【構成】 本発明は、一般式（１） 【化１】 〔式中、Ａは低級アルキレン基、Ｒ¹ は水素原子または
低級アルキル基、Ｒ² およびＲ³ は各々独立に水素原子
もしくは低級アルキル基か、または一緒にて低級アルキ
レン基、Ｒ⁴ は水素原子、低級アルキル基、アミジノ基
または置換フェニル基（１〜２個の水素原子、低級アル
キル基、低級アルコキシ基もしくはハロゲン原子、また
はメチレンジオキシ基で置換された）−低級アルキル基
を示す）で表されるベンゾチアゾールスルホンアミド誘
導体およびその薬学上許容される酸付加塩ならびにそれ
らを有効成分とする蛋白質リン酸化酵素阻害作用に基づ
く喘息治療剤または予防剤である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、蛋白質リン酸化酵素阻
害活性を有するベンゾチアゾールスルホンアミド誘導体
およびその医薬用途に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】ＷＯ９２−１４７１２号国際公開明細書
には、抗ヒスタミン作用に基づく気管支平滑筋弛緩作用
を有するベンゾチアゾールスルホニルアミノエチル誘導
体、具体的には１−〔２−（６−ベンゾチアゾールスル
ホニルアミノ）エチル〕−４−〔３−（フェノキシ）プ
ロピル〕ピペラジンが開示されているが、蛋白質リン酸
化酵素阻害作用を有することについては記載はない。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】生体内には種々の蛋白
質リン酸化酵素（プロテインキナーゼＣ、ｃＡＭＰ依存
性キナーゼ、ｃＧＭＰ依存性キナーゼ、ミオシン軽鎖キ
ナーゼなど）が存在し、それらに対する阻害剤は循環器
系医薬品、制癌剤などへの幅広い用途が考えられてい
る。このような状況下で、より優れた上記の薬理作用を
有する新規化合物を提供することが望まれている。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記の課
題を解決するために鋭意研究した結果、新規化合物であ
る後記一般式で示されるベンゾチアゾールスルホンアミ
ド誘導体が優れたプロテインキナーゼＣおよびミオシン
軽鎖キナーゼ阻害活性を有することを見出し、本発明を
完成したものである。すなわち、本発明は、一般式
（１）

【０００５】

【化５】 〔式中、Ａは炭素数１〜４個のアルキル基で置換されて
もよい炭素数２〜６個のアルキレン基を示し、Ｒ¹ は水
素原子または炭素数１〜４個のアルキル基を示し、Ｒ²
およびＲ³ は各々独立に水素原子もしくは炭素数１〜６
個のアルキル基を示すか、またはＲ² およびＲ³ は一緒
にて炭素数１〜４個のアルキル基で置換されてもよい炭
素数１〜４個のアルキレン基を示し、Ｒ⁴ は水素原子、
炭素数１〜６個のアルキル基、アミジノ基または式

【０００６】

【化６】 （式中、Ｂは炭素数１〜４個のアルキル基で置換されて
もよい炭素数１〜６個のアルキレン基を示し、Ｒ⁵ およ
びＲ⁶ は各々独立に水素原子、炭素数１〜６個のアルキ
ル基、炭素数１〜６個のアルコキシ基もしくはハロゲン
原子を示すか、またはＲ⁵ およびＲ⁶ は一緒にてメチレ
ンジオキシ基を形成する）〕で表されるベンゾチアゾー
ルスルホンアミド誘導体およびその薬学上許容される酸
付加塩を提供することを目的とするものである。

【０００７】また、本発明は前記一般式（１）で表され
るベンゾチアゾールスルホンアミド誘導体およびその薬
学上許容される酸付加塩を有効成分として含有すること
を特徴とする蛋白質リン酸化酵素阻害作用に基づく喘息
治療剤または予防剤を提供することを目的とするもので
ある。

【０００８】前記一般式（１）における基Ａは、炭素数
１〜４個のアルキル基で置換されてもよい炭素数２〜６
個のアルキレン基として定義される。炭素数２〜６個の
アルキレン基としては、例えばエチレン、トリメチレ
ン、テトラメチレン、ペンタメチレン、ヘキサメチレン
が挙げられるが、エチレン基が特に好ましい。このアル
キレン基はそのいずれかの置換位置に直鎖または分鎖の
炭素数１〜４個のアルキル基、例えば、メチル、エチ
ル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、１
−メチルプロピル、ｔ−ブチル基等で置換されていても
よい。

【０００９】基Ｒ¹ において定義される炭素数１〜４個
のアルキル基としては、分鎖を有していてもよく、例え
ばメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、
イソブチル、１−メチルプロピル、ｔ−ブチル基等が挙
げられるが、メチル、エチル基が好ましい。基Ｒ² およ
びＲ³ において定義される炭素数１〜６個のアルキル基
としては、分鎖を有していてもよく、例えばメチル、エ
チル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、
１−メチルプロピル、ｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシル
基等が挙げられるが、メチル、エチル、プロピル基等が
好ましい。

【００１０】また、基Ｒ² およびＲ³ は一緒にて炭素数
１〜４個のアルキレン基として定義される。このアルキ
レン基としては、例えばメチレン、エチレン、トリメチ
レン、テトラメチレンが挙げられるが、エチレン、トリ
メチレン等が好ましい。このアルキレン基はそのいずれ
かの置換位置に直鎖または分鎖の炭素数１〜４個のアル
キル基、例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロ
ピル、ブチル、イソブチル、１−メチルプロピル、ｔ−
ブチル基等で置換されていてもよく、メチルエチレンが
好ましい一例である。基Ｒ⁴ において定義される炭素数
１〜６個のアルキル基としては、分鎖を有していてもよ
く、例えばメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、
ブチル、イソブチル、１−メチルプロピル、ｔ−ブチ
ル、ペンチル、ヘキシル基等が挙げられる。

【００１１】また、基Ｒ⁴ において定義される一般式
（２）で表される基において、ベンゼン環は１〜２個の
いずれかの置換位置に同じかまたは異なって炭素数１〜
６個のアルキル基、炭素数１〜６個のアルコキシ基また
はハロゲン原子で置換されていてもよく、また、メチレ
ンジオキシ基で置換されていてもよい。上記の炭素数１
〜６個のアルキル基としては、分鎖を有していてもよ
く、例えばメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、
ブチル、イソブチル、１−メチルプロピル、ｔ−ブチ
ル、ペンチル、ヘキシル基等が挙げられる。

【００１２】炭素数１〜６個のアルコキシ基としては分
鎖を有していてもよく、例えばメトキシ、エトキシ、プ
ロポキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、イソブトキシ、
１−メチルプロポキシ、ｔ−ブトキシ、ペンチルオキ
シ、ヘキシルオキシ基等が挙げられる。ハロゲン原子と
しては、例えば塩素原子、臭素原子、弗素原子等が挙げ
られる。

【００１３】更に、一般式（２）で表される基における
基Ｂは、炭素数１〜４個のアルキル基で置換されてもよ
い炭素数１〜６個のアルキレン基として定義される。炭
素数２〜６個のアルキレン基としては、例えばメチレ
ン、エチレン、トリメチレン、テトラメチレン、ペンタ
メチレン、ヘキサメチレンが挙げられるが、エチレン基
が特に好ましい。このアルキレン基はそのいずれかの置
換位置に直鎖または分鎖の炭素数１〜４個のアルキル
基、例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピ
ル、ブチル、イソブチル、１−メチルプロピル、ｔ−ブ
チル基等で置換されていてもよい。

【００１４】上記で示される一般式（２）で表される基
のうち、無置換、ハロゲン原子またはメチレンジオキシ
基で置換されたベンジル、フェニルエチル基が好ましい
一例である。

【００１５】前記の一般式（１）で表される本発明のベ
ンゾチアゾールスルホンアミド誘導体（１）の具体例と
して、以下の化合物を挙げることができる。 （１）１−（７−ベンゾチアゾールスルホニル）ホモピ
ペラジン （２）１−（７−ベンゾチアゾールスルホニル）ピペラ
ジン （３）１−（７−ベンゾチアゾールスルホニル）−２−
メチルピペラジン （４）１−（７−ベンゾチアゾールスルホニル）エチレ
ンジアミン （５）１−（７−ベンゾチアゾールスルホニル）−４−
メチルエチレンジアミン （６）１−（６−ベンゾチアゾールスルホニル）ピペラ
ジン （７）Ｎ−［２−（３，４−メチレンジオキシベンジル
アミノ）エチル］−７−ベンゾチアゾールスルホンアミ
ド

【００１６】（８）Ｎ−［２−（３−クロロベンジルア
ミノ）エチル］−７−ベンゾチアゾールスルホンアミド （９）Ｎ−［２−［１−（３−クロロフェニル）エチ
ル］アミノエチル］−７−ベンゾチアゾールスルホンア
ミド （１０）Ｎ−［２−（３−フルオロベンジルアミノ）エ
チル］−７−ベンゾチアゾールスルホンアミド

【００１７】ベンゾチアゾールスルホンアミド誘導体
（１）の酸付加塩としては、薬学上許容される非毒性の
塩であって、例えば、塩酸、臭化水素酸、リン酸、硫酸
等の無機酸との酸付加塩、酢酸、クエン酸、酒石酸、乳
酸、コハク酸、フマル酸、マレイン酸、メタンスルホン
酸、グルタミン酸、アスパラギン酸などの有機酸との酸
付加塩を挙げることができる。他の公知の酸との付加塩
も包含されることは言うまでもない。

【００１８】本発明のベンゾチアゾールスルホンアミド
誘導体（１）の製造は種々の方法で製造することができ
る。例えば、一般式（３）

【００１９】

【化７】 （式中、Ｘはハロゲン原子を示し、Ｒ¹ は前記と同じ意
味を有する）で表される化合物を不活性溶媒中一般式
（４） （式中、Ｒ² 、Ｒ³ およびＲ⁴ は前記と同じ意味を有す
る）で表されるアミンを反応させることにより得られ
る。上記化合物（３）は、一般式（５）

【００２０】

【化８】 （式中、Ｒ¹ は前記と同じ意味を有する）で表されるス
ルホン酸を公知の方法によりスルホニルハロゲナイドに
変換することにより得られる。例えば、塩化チオニルで
クロル化する方法は好適な一例である。

【００２１】化合物（３）とアミン（４）との反応で使
用される不活性溶媒としては、例えばジクロロメタン、
クロロホルム等のハロゲン化炭化水素、テトラヒドロフ
ラン、ジオキサン、ジエチルエーテルなどのエーテル
類、ジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムア
ミド、アセトニトリル等が挙げられる。これらは単独、
あるいは混合溶媒として用いることができる。

【００２２】上記の反応においては、酸受容体の存在下
で行うのが好ましい。用いられる酸受容体としては、例
えば、炭酸水素ナトリウム、水酸化ナトリウム、炭酸カ
リウム、炭酸ナトリウム、水酸化カリウム、ナトリウム
メチラートのようなアルカリ金属化合物、ピリジン、ト
リメチルアミン、トリエチルアミンのような有機第３級
アミンが挙げられる。

【００２３】上記反応における化合物（３）の使用量
は、アミン（４）に対し、１〜２０倍モル、好ましくは
１〜１０倍モルである。酸受容体の非存在下では２．５
〜５倍モルであることが特に好ましく、酸受容体の存在
下では１〜３倍モルであることが特に好ましい。反応温
度は、一般的には−３０〜１２０℃であり、好ましくは
−２０〜５０℃程度である。反応時間は、一般的には
０．５〜４８時間であり、好ましくは０．５〜６時間で
あるが、薄層クロマトグラフイー（ＴＬＣ）、高速液体
クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等により反応経過を追
跡することが可能であるから、アミン（４）の消失を待
って適宜反応を終了させればよい。

【００２４】このようにして得られた目的化合物（１）
を遊離塩基の状態で反応液から採取するには、反応溶媒
が親水性溶媒である場合には、該溶媒を留去し、残渣を
非親水性溶媒に溶解した後、弱アルカリ水溶液、水等で
洗浄して、溶媒を留去することにより行われる。反応溶
媒が非親水性溶媒である場合には、そのまま弱アルカリ
水溶液、水等で洗浄した後、溶媒を留去することにより
行われる。

【００２５】本発明の目的化合物（１）は公知の方法に
より酸付加塩を形成することができる。例えば、目的化
合物（１）をメタノール、エタノールなどのアルコール
類に溶解し、当量もしくは数倍量の酸を加えることによ
り、それらの酸付加塩を得ることができる。用いられる
酸としては、塩酸、臭化水素酸、リン酸、硫酸等の無機
酸、酢酸、クエン酸、酒石酸、乳酸、コハク酸、フマル
酸、マレイン酸、メタンスルホン酸、グルタミン酸、ア
スパラギン酸等などの有機酸を挙げることができる。勿
論、他の公知の酸も使用できることは言うまでもない。

【００２６】さらに、上記酸付加塩から、公知の方法に
よりアルカリ処理することにより目的化合物（１）を得
ることができる。得られた目的化合物（１）またはその
酸付加塩をさらに精製する場合には、公知の方法、例え
ば、再結晶化、シリカゲル等の公知の担体を用いるカラ
ムクロマトグラフィーにより行うことができる。

【００２７】本発明のベンゾチアゾールスルホンアミド
誘導体（１）およびその薬学的に許容される酸付加塩
（以下、単に「本発明化合物」ということがある）は、
強い蛋白質リン酸化阻害作用を示し、ラットに３００ｍ
ｇ／ｋｇ経口投与しても、死亡例は認められなかったこ
とから、医薬として使用しても安全な化合物であり、医
薬品の活性成分として有用な物質である。従って、本発
明の他の態様によれば、本発明化合物と薬学的に投与可
能な担体および希釈液の少なくとも１種とを含有する医
薬組成物が提供される。

【００２８】上記医薬組成物の製剤化のための剤形とし
ては、錠剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤、懸濁剤、カプ
セル剤、注射剤等が挙げられるが、その製造のために
は、これらの製剤に応じた各種担体が使用される。例え
ば、経口剤の担体としては、乳糖、白糖、ブドウ糖、で
んぷん、結晶セルロース等の賦形剤；ヒドロキシプロピ
ルセルロース、カルボキシメチルセルロース、でんぷ
ん、アラビアゴム、ゼラチン、ブドウ糖、白糖、トラガ
ント、アルギン酸ナトリウム等の結合剤；カルボキシメ
チルセルロース、でんぷん炭酸カルシウム等の崩壊剤；
ステアリン酸、精製タルク、蔗糖脂肪酸エステル、水素
添加植物油、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸
カルシウム等の滑沢剤；ラウリル硫酸ナトリウム、大豆
レシチン、蔗糖脂肪酸エステル、ポリソルベート８０等
の界面活性剤；レシチン、大豆油、グリセリン等の添加
剤、流動性促進剤、着色剤等を挙げることができる。ま
た吸入剤の調製の際には、ポリクロルモノフルオロメタ
ン等の溶媒として用いることができる。

【００２９】本発明化合物を注射剤等の非経口剤とする
場合には、希釈剤として一般に注射用蒸留水、生理食塩
水、ブドウ糖水溶液、注射用植物油、プロピレングリコ
ール、ポリエチレングリコール等を使用することができ
る。さらに必要に応じて、殺菌剤、防腐剤、安定剤、等
張化剤、無痛化剤等を加えてもよい。

【００３０】本発明化合物（１）またはその薬学上許容
される酸付加塩をヒトに投与する際は、錠剤、散剤、顆
粒剤、坐剤、懸濁剤、カプセル剤等の形で経口投与する
ことができ、また、点滴を含む注射剤、さらにクリーム
またはスプレーの形で非経口投与することができる。そ
の投与量は、投与形態、患者の年齢、体重、症状の度合
い等によって異なるが、一般には成人１日当り３〜３０
０ｍｇを１〜３回に分けて投与される。投与期間は数日
〜２ヵ月の連日投与が一般的であるが、患者の症状によ
り、１日投与量、投与期間共に増減することができる。

【００３１】

【発明の効果】本発明のベンゾチアゾールスルホンアミ
ド誘導体（１）およびその薬学上許容される酸付加塩
は、プロテインキナーゼＣ、ミオシン軽鎖キナーゼ等の
蛋白質リン酸化酵素阻害活性を有し、モルモット摘出気
管標本におけるＫＣｌ収縮に対する気管平滑筋弛緩作用
を有するので、蛋白質リン酸化酵素阻害作用に基づく喘
息治療剤または予防剤として有用である。

【００３２】

【実施例】次に、実施例を挙げて本発明化合物の製造例
について更に詳細に説明する。尚、各実施例で得られた
目的物の核磁気共鳴スペクトル（ＮＭＲ）および質量分
析スペクトル（ＭＳ）は後記の表４に記載する。

【００３３】実施例１ １−（７−ベンゾチアゾールスルホニル）ホモピペラジ
ン塩酸塩（化合物１） ７−ベンゾチアゾールスルホン酸１２ｇに塩化チオニル
１２０ｍｌとジメチルホルムアミド１．２ｍｌを加え３
時間加熱還流後、減圧下、塩化チオニルを留去した。残
渣を氷水１００ｍｌで溶解し、飽和炭酸ナトリウム水溶
液でｐＨ６に調整し、ジクロロメタン１００ｍｌで抽出
した。このジクロロメタン層を氷冷下、ホモピペラジン
１６．８ｇを含むジクロロメタン１００ｍｌの溶液に３
０分で滴下し、０〜５℃で１時間撹拌した。

【００３４】反応終了後、反応液を水２００ｍｌで洗浄
し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、減圧下溶媒を
留去した。残渣をシリカゲル（和光ゲルＣ−２００、和
光純薬社製、日本国、６００ｇ）カラムにチャージし、
溶出溶媒としてメタノール−クロロホルム混合溶媒（５
〜１０％メタノール）を用いるカラムクロマトグラフィ
ーにより精製し、１−（７−ベンゾチアゾールスルホニ
ル）ホモピペラジン１０．８ｇ（収率６５％）を得た。

【００３５】得られた１−（７−ベンゾチアゾールスル
ホニル）ホモピペラジン２．８ｇをメタノール２０ｍｌ
に溶解し、当量の塩酸水を加え、１０分間撹拌した。減
圧下溶媒を留去し、残渣をエタノール−水より再結晶し
て表題の化合物を得た。収量２．７（収率８６％）

【００３６】実施例２ １−（７−ベンゾチアゾールスルホニル）ピペラジン塩
酸塩（化合物２） 実施例１において、ホモピペラジン１６．８ｇの代わり
にピペラジン１４．４ｇを用いて同様に行い、表題の化
合物を得た。

【００３７】実施例３ １−（７−ベンゾチアゾールスルホニル）−２−メチル
ピペラジン塩酸塩（化合物３） 実施例１において、ホモピペラジン１６．８ｇの代わり
に２−メチルピペラジン１６．８ｇを用いて同様に行
い、表題の化合物を得た。

【００３８】実施例４ １−（７−ベンゾチアゾールスルホニル）エチレンジア
ミン塩酸塩（化合物４） ７−ベンゾチアゾールスルホン酸１２ｇに塩化チオニル
１２０ｍｌとジメチルホルムアミド１．２ｍｌを加え３
時間加熱還流後、減圧下、塩化チオニルを留去した。残
渣を氷水１００ｍｌで溶解し、飽和炭酸ナトリウム水溶
液でｐＨ６に調整し、ジクロロメタン１００ｍｌで抽出
した。このジクロロメタン層を氷冷下、エチレンジアミ
ン１０．１ｇを含むジクロロメタン１００ｍｌの溶液に
３０分で滴下し、０〜５℃で１時間撹拌した。反応終了
後、反応液に水２００ｍｌを加え、ｐＨ４〜６に調整し
た後、分液した。水層を減圧乾固し、残渣を水から再結
晶して表題の化合物を得た。収量８．８ｇ（収率５４
％）

【００３９】実施例５ １−（７−ベンゾチアゾールスルホニル）−４−メチル
エチレンジアミン塩酸塩（化合物５） 実施例４において、エチレンジアミン１０．１ｇの代わ
りに１−メチルエチレンジアミン１２．４ｇを用いて同
様に行い、表題の化合物を得た。

【００４０】実施例６ １−（６−ベンゾチアゾールスルホニル）ピペラジン塩
酸塩（化合物６） 実施例１において、７−ベンゾチアゾールスルホン酸１
２ｇの代わりに６−ベンゾチアゾールスルホン酸、ホモ
ピペラジン１６．８ｇの代わりにピペラジン１４．４ｇ
を用いて同様に行い、表題の化合物を得た。

【００４１】実施例７〜１０ Ｎ−〔２−（３，４−メチレンジオキシベンジルアミ
ノ）エチル〕−７−ベンゾチアゾールスルホンアミド塩
酸塩（化合物７）、 Ｎ−〔２−（３−クロロベンジルアミノ）エチル〕−７
−ベンゾチアゾールスルホンアミド塩酸塩（化合物
８）、 Ｎ−〔２−〔１−（３−クロロフェニル）エチル〕アミ
ノエチル〕−７−ベンゾチアゾールスルホンアミド塩酸
塩（化合物９）および Ｎ−（２−（３−フルオロベンジルアミノ）エチル）−
７−ベンゾチアゾールスルホンアミド塩酸塩（化合物１
０）

【００４２】実施例１において、ホモピペラジン１６．
８ｇの代わりに各々１−（３，４−メチレンジオキシベ
ンジル）−エチレンジアミン３２．６ｇ、１−（３−ク
ロロベンジル）−エチレンジアミン３１．０ｇ、１−
（１−（３−クロロフェニル）エチル）−エチレンジア
ミン３３．３ｇおよび１−（３−フルオロベンジル）−
エチレンジアミン２８．２ｇを用いて同様に行い、各々
表題の化合物を得た。

【００４３】実施例１１ ミオシン軽鎖キナーゼ（ＭＬＣＫ）の阻害作用 被験薬である各阻害剤は、本発明品については実施例に
記載の化合物番号で表示した。対照品として１−〔２−
（６−ベンゾチアゾールスルホニルアミノ）エチル〕−
４−（３−（フェノキシ）プロピル）ピペラジン二塩酸
を用いた。

【００４４】（１）阻害活性測定法 各阻害剤の阻害活性測定にはリン酸化されたミオシン軽
鎖（ＭＬＣ）を特異的に認識する抗体（ＭＬＣＰ抗体）
を用いたＭＬＣＫ活性測定系を用いた。ＭＬＣはニワト
リ砂嚢よりペリーらの方法〔ジャーナル・オブ・バイオ
ケミストリー、２１１巻、２６７−２７２頁（１９８３
年）〕に従って、分子量２０ｋＤａのＭＬＣを精製し
た。ＭＬＣＫはウォルシュらの方法〔メソッズ・イン・
エンザイモロジー、９９巻、２７９−２８８頁（１９８
３年）〕の方法に従って精製した。

【００４５】カルモジュリンは豚脳よりヤザワの方法
〔ジャーナル・オブ・バイオケミストリー，８７巻，１
３１３−１３２０頁（１９８０年）〕に従って精製した
ものを用いた。ＭＬＣＰ抗体は、ＭＬＣのリン酸化部位
のセリンを含む前後１２残基の配列を持った合成ペプチ
ドを抗原として用い作成した。先ず、ＭＬＣのＮ末端を
基準として１１番目のリジンから２２番目のフェニルア
ラニンまでの配列にシステインをＣ末端に加えたペプチ
ドを合成した（ＫＫＲＰＱＲＡＴＳＮＶＦＣ）。

【００４６】この合成ペプチドに対してＡＴＰ存在下で
ＭＬＣＫによるリン酸化を行い、高速液体クロマトグラ
フィーにて精製した。このペプチドをシャミセン貝ヘモ
シアニン（ＫＬＨ）とコンジュゲートした。この時のコ
ンジュゲート効率は１１０−１４８ｎｍｏｌペプチド／
ｍｇＫＬＨであった。このコンジュゲート体をウサギ１
羽当り１回につき０．２ｍｇをアジュバントと混合して
ウサギに免疫させた。５回の免疫の後、ＭＬＣＰ抗体の
抗体価が十分に上昇したのを確認し、ＩｇＧ画分として
精製し、保存した。

【００４７】ＭＬＣＫ活性測定は以下のように行なっ
た。ＭＬＣをリン酸バッファー（ＰＢＳ）で希釈して５
μｇ／ｍｌに調製し、９６穴イムノプレートに一穴あた
り１００μｌ分注し、吸着させた。４℃で１晩放置後、
未吸着のＭＬＣをＰＢＳにて洗浄した。各穴に２５ｍＭ
トリス緩衝液（ｐＨ７．５）、３ｍＭ塩化マグネシウ
ム、１ｍＭ塩化カルシウム、０．１％２−メルカプトエ
タノール、１ｍｇ／ｍｌ牛血清アルブミン、２０μｇ／
ｍｌカルモジュリン、０．１μｇ／ｍｌＭＬＣＫおよび
２０、３０、５０、１００μＭのＡＴＰを含む反応混液
を加え、反応を開始した。３分後に１００μｌの２０％
リン酸を加え反応を停止し、０．２％トライトンＸ−１
００を含むＰＢＳ（ＴｒＰＢＳ）でプレートを３回洗浄
した。

【００４８】洗浄した各穴に０．０５％トゥイーン２０
を含むＰＢＳ（ＴｗＰＢＳ）で５００倍希釈したＭＬＣ
Ｐ抗体を一次抗体として各穴に１００μｌ加え、１時間
室温で放置した。ＴｒＰＢＳで３回洗浄後、二次抗体と
してペルオキシダーゼ標識したヤギの抗ウサギＩｇＧ抗
体（カッペル社）をＴｗＰＢＳで１０００倍希釈した溶
液を各穴１００μｌ加え、室温で１時間放置した。Ｔｒ
ＰＢＳで３回洗浄後、２ｍｇ／ｍｌオルトフェニレンジ
アミン、０．０４％過酸化水素水を含む発色液を各穴１
００μｌ加え、十分発色後４．５Ｍ硫酸を３０μｌ加え
て発色を停止し、バイオラッド社製のマイクロプレート
リーダーで吸光度を測定した。この吸光度はリン酸化を
受けたＭＬＣ量に比例するので、ＭＬＣＫ活性とするこ
とができる。

【００４９】阻害剤の阻害活性測定時には反応混液中に
適当な濃度の阻害剤を加え、その際の反応活性を測定
し、二重逆数プロットにより阻害活性を求めた。測定結
果は表１に示すとおりである。 （２）測定結果

【００５０】

【表１】

【００５１】実施例１２ プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）の阻害作用 被験薬である各阻害剤は、本発明品については実施例に
記載の化合物番号で表示した。対照品として１−〔２−
（６−ベンゾチアゾールスルホニルアミノ）エチル〕−
４−（３−（フェノキシ）プロピル）ピペラジン二塩酸
を用いた。

【００５２】（１）阻害活性測定法 各阻害剤の阻害能測定には、医学生物研究所のプロテイ
ンキナーゼＣ活性測定キットを用いた。ＰＫＣはラット
脳より稲垣らの方法〔（ジャーナル・オブ・バイオケミ
ストリー，２６０巻，２９２２−２９２５頁（１９８５
年）〕に従って精製したものを用いた。測定キットの９
６穴プレートに反応混液〔２５ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ
７．５）、３ｍＭ塩化マグネシウム、１ｍＭ塩化カルシ
ウム、０．１％２−メルカプトエタノール、１ｍｇ／ｍ
ｌ牛血清アルブミン、５０μｇ／ｍｌホスファチジルセ
リン、１０μｇ／ｍｌＰＫＣおよび１，３，５，１０μ
ＭＡＴＰ）を１穴あたり１００μｌ加えた。

【００５３】尚、予め各穴にはＰＫＣの基質となるペプ
チドが吸着させてある。３分後、１００μl ２０％リン
酸で反応を停止した。各穴をＴｒＰＢＳで３回洗浄後、
キットに含まれる１次抗体をＴｗＰＢＳで１０倍希釈し
たものを各穴１００μｌ加え、室温で１時間放置した。
ＴｒＰＢＳで３回洗浄後、ペルオキシダーゼで標識した
抗マウスＩｇＧ（バイオラッド社製）をＴｗＰＢＳで１
０００倍希釈したものを各穴１００μｌ加え、室温で１
時間放置した。ＴｒＰＢＳで３回洗浄後、２ｍｇ／ｍｌ
オルトフェニレンジアミン、０．０４％過酸化水素水を
含む発色液を１００μｌ加え十分に発色した後、４．５
Ｍ硫酸を３０μｌ加えて発色を停止し、バイオラッド社
製マイクロプレートリーダーで発色を定量した。

【００５４】阻害能測定には反応混液中に適当な濃度の
阻害剤を加え、その際のＰＫＣ活性を測定して２重逆数
プロット法を用いて阻害能を求めた。測定結果は表２に
示すとおりである。 （２）測定結果

【００５５】

【表２】

【００５６】上記の結果から明らかな通り、本発明化合
物はミオシン軽鎖キナーゼ（ＭＬＣＫ）、プロテインキ
ナーゼＣ（ＰＫＣ）等の蛋白質リン酸化酵素に対して強
い阻害活性を有するのに対し、ＷＯ９２−１４７１２号
国際公開明細書に記載の対照品は阻害活性を有しないこ
とが認められた。

【００５７】実施例１３ モルモットより摘出した気管標本におけるＫＣｌ収縮に
対する気管平滑筋弛緩作用 （１）ＫＣｌ収縮に対する阻害試験方法 モルモットの摘出気管標本を用いる方法（高木，小沢；
薬物学実験，１００−１０２頁、１９６０年、南山堂、
藤原，柴田；薬理学基礎実験法，１３１−１３４頁、１
９８２年、杏林出版）に従って、本発明化合物の気管平
滑筋弛緩作用を測定した。

【００５８】３５０〜５００ｇの雄性モルモット（ハー
トレート系、黒田純系動物）の摘出気管標本をクレブス
・ヘンスライト栄養液（インドメタシン３μＭ含有）を
満たしたマグヌス装置（容量２０ｍｌ）に等尺性（初期
負荷１．５ｇ）に吊るし、９５％酸素、５％炭酸ガス通
気下、液温を３７℃に保ちながら、ＫＣｌ水溶液（終濃
度２０ｍＭ）をマグヌス管内に適用して気管標本を収縮
させた。

【００５９】収縮が安定した後、蒸留水または生理食塩
水に溶かした本発明化合物をマグヌス管内に累積的に加
え、その弛緩作用を観察し、用量反応曲線を得た。測定
終了後、パパベリン１００μＭ添加により最大弛緩を求
め、その時の弛緩率を１００％とした。標本数は全て３
とした。対照品として１−〔２−（６−ベンゾチアゾー
ルスルホニルアミノ）エチル〕−４−（３−（フェノキ
シ）プロピル）ピペラジン二塩酸を用いた。

【００６０】（２）測定結果 測定結果は表３に示すとおりである。

【００６１】

【表３】 上記の結果から明らかな通り、本発明化合物はモルモッ
ト摘出気管標本におけるＫＣｌ収縮に対する気管平滑筋
弛緩作用を有するのに対し、ＷＯ９２−１４７１２号国
際公開明細書に記載の対照品は殆ど気管平滑筋弛緩作用
を有しないことが認められた。

【００６２】

【表４】

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 9/99 9359−4Ｂ //(Ｃ０７Ｄ 417/12 277:00 9051−4Ｃ 317:00） 9165−4Ｃ

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 一般式（１） 【化１】 〔式中、Ａは炭素数１〜４個のアルキル基で置換されて
   もよい炭素数２〜６個のアルキレン基を示し、Ｒ¹ は水
   素原子または炭素数１〜４個のアルキル基を示し、Ｒ²
   およびＲ³ は各々独立に水素原子もしくは炭素数１〜６
   個のアルキル基を示すか、またはＲ² およびＲ³ は一緒
   にて炭素数１〜４個のアルキル基で置換されてもよい炭
   素数１〜４個のアルキレン基を示し、Ｒ⁴ は水素原子、
   炭素数１〜６個のアルキル基、アミジノ基または式 【化２】 （式中、Ｂは炭素数１〜４個のアルキル基で置換されて
   もよい炭素数１〜６個のアルキレン基を示し、Ｒ⁵ およ
   びＲ⁶ は各々独立に水素原子、炭素数１〜６個のアルキ
   ル基、炭素数１〜６個のアルコキシ基もしくはハロゲン
   原子を示すか、またはＲ⁵ およびＲ⁶ は一緒にてメチレ
   ンジオキシ基を形成する）〕で表されるベンゾチアゾー
   ルスルホンアミド誘導体およびその薬学上許容される酸
   付加塩。
2. 【請求項２】 一般式（１） 【化３】 〔式中、Ａは炭素数１〜４個のアルキル基で置換されて
   もよい炭素数２〜６個のアルキレン基を示し、Ｒ¹ は水
   素原子または炭素数１〜４個のアルキル基を示し、Ｒ²
   およびＲ³ は各々独立に水素原子もしくは炭素数１〜６
   個のアルキル基を示すか、またはＲ² およびＲ³ は一緒
   にて炭素数１〜４個のアルキル基で置換されてもよい炭
   素数１〜４個のアルキレン基を示し、Ｒ⁴ は水素原子、
   炭素数１〜６個のアルキル基、アミジノ基または一般式
   （２） 【化４】 （式中、Ｂは炭素数１〜４個のアルキル基で置換されて
   もよい炭素数１〜６個のアルキレン基を示し、Ｒ⁵ およ
   びＲ⁶ は各々独立に水素原子、炭素数１〜６個のアルキ
   ル基、炭素数１〜６個のアルコキシ基もしくはハロゲン
   原子を示すか、またはＲ⁵ およびＲ⁶ は一緒にてメチレ
   ンジオキシ基を形成する）で表される基を示す〕で表さ
   れるベンゾチアゾールスルホンアミド誘導体およびその
   薬学上許容される酸付加塩を有効成分として含有するこ
   とを特徴とする蛋白質リン酸化阻害作用に基づく喘息治
   療剤または予防剤。