JPH06296486A - 酸性アミラーゼ、その製造法およびそれを用いた澱粉分解物の製造法 - Google Patents
酸性アミラーゼ、その製造法およびそれを用いた澱粉分解物の製造法Info
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- JPH06296486A JPH06296486A JP5067974A JP6797493A JPH06296486A JP H06296486 A JPH06296486 A JP H06296486A JP 5067974 A JP5067974 A JP 5067974A JP 6797493 A JP6797493 A JP 6797493A JP H06296486 A JPH06296486 A JP H06296486A
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- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
Abstract
(57)【要約】
【目的】 ラクトバチルスＬ−１３７株の新規酸性アミ
ラーゼの単離。 【構成】 ラクトバチルスＬ−１３７株を培養して、至
適pＨ３.５〜４.５、分子量１５０,０００〜３００,０
００の酸性アミラーゼを単離する。これを、澱粉に作用
させて、主成分がマルトトリオース、マルトテトラオー
ス、マルトペンタオースであり、グルコース、マルトー
スを殆ど含まない澱粉分解物を得る。 【効果】 得られた酸性アミラーゼは低いpＨで澱粉物
質を加水分解し、その分解物は、低甘味度、吸湿性の向
上等の特性を有し、食品改良剤等として有用である。
ラーゼの単離。 【構成】 ラクトバチルスＬ−１３７株を培養して、至
適pＨ３.５〜４.５、分子量１５０,０００〜３００,０
００の酸性アミラーゼを単離する。これを、澱粉に作用
させて、主成分がマルトトリオース、マルトテトラオー
ス、マルトペンタオースであり、グルコース、マルトー
スを殆ど含まない澱粉分解物を得る。 【効果】 得られた酸性アミラーゼは低いpＨで澱粉物
質を加水分解し、その分解物は、低甘味度、吸湿性の向
上等の特性を有し、食品改良剤等として有用である。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、低いpＨで澱粉物質を
加水分解するのに有用な新規な酸性アミラーゼ、該アミ
ラーゼの製造法およびそれを用いた特異的な組成を有す
る澱粉分解物の製造法に関する。
加水分解するのに有用な新規な酸性アミラーゼ、該アミ
ラーゼの製造法およびそれを用いた特異的な組成を有す
る澱粉分解物の製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】アミ
ラーゼは澱粉を加水分解し、澱粉を液化させる酵素とし
て古くから知られ、従来から、澱粉工業、アルコール製
造工業、繊維工業、食品加工業など、産業上広範に用い
られている重要な酵素である。特に、食品分野におい
て、澱粉分解物、特にマルトオリゴ糖(グルコースのα
−１,４結合したもので重合度２〜１０のもの)は、低甘
味(砂糖を１００とした場合、１０〜３０)で、かつ低粘
度という性質を有しているため、食品改良剤として用い
られている。その上、溶解性も高く、マルトトリオース
(Ｇ３)を含んでいるものはその性質上、保湿性にも優れ
ている。
ラーゼは澱粉を加水分解し、澱粉を液化させる酵素とし
て古くから知られ、従来から、澱粉工業、アルコール製
造工業、繊維工業、食品加工業など、産業上広範に用い
られている重要な酵素である。特に、食品分野におい
て、澱粉分解物、特にマルトオリゴ糖(グルコースのα
−１,４結合したもので重合度２〜１０のもの)は、低甘
味(砂糖を１００とした場合、１０〜３０)で、かつ低粘
度という性質を有しているため、食品改良剤として用い
られている。その上、溶解性も高く、マルトトリオース
(Ｇ３)を含んでいるものはその性質上、保湿性にも優れ
ている。
【０００３】ところが、今まで一段の酵素反応でマルト
オリゴ糖を生成する型のアミラーゼは、澱粉に作用させ
ると、その分解物にグルコース(Ｇ１)やマルトース(Ｇ
２)が組成比で約２０〜３０重量％(以下、特に断らない
限り％は重量％である)程度含まれるのが普通である。
この場合、これらの糖が食品中に含まれてしまうことに
より、甘味度の上昇やアミノ酸、タンパク質との反応に
よる褐変現象(メイラード反応)、異性化など食品の風
味、外観において悪影響を及ぼすことになる。
オリゴ糖を生成する型のアミラーゼは、澱粉に作用させ
ると、その分解物にグルコース(Ｇ１)やマルトース(Ｇ
２)が組成比で約２０〜３０重量％(以下、特に断らない
限り％は重量％である)程度含まれるのが普通である。
この場合、これらの糖が食品中に含まれてしまうことに
より、甘味度の上昇やアミノ酸、タンパク質との反応に
よる褐変現象(メイラード反応)、異性化など食品の風
味、外観において悪影響を及ぼすことになる。
【０００４】現在までにマルトオリゴ糖生成型アミラー
ゼの中で、比較的Ｇ１やＧ２の生成が少なく、Ｇ３以上
のオリゴ糖を生成するものが幾つか存在している[特開
昭６３−２３７７８６号公報、Ｙoshiyuki Ｔakahashi,
Ａgric. Ｂiol. Ｃhem., ４７, ２１９３−２１９９
(１９８３)など]。しかし、得られる分解物におけるＧ
１とＧ２の組成比が１０％を下回るものは知られていな
い。
ゼの中で、比較的Ｇ１やＧ２の生成が少なく、Ｇ３以上
のオリゴ糖を生成するものが幾つか存在している[特開
昭６３−２３７７８６号公報、Ｙoshiyuki Ｔakahashi,
Ａgric. Ｂiol. Ｃhem., ４７, ２１９３−２１９９
(１９８３)など]。しかし、得られる分解物におけるＧ
１とＧ２の組成比が１０％を下回るものは知られていな
い。
【０００５】また、酸性領域に至適pＨが存在している
アミラーゼが幾つか知られている[特開昭６０−２１８
２号公報、特開昭６１−１１５４８４号公報、特開昭６
２−９１１８１号公報、特開昭６３−１９６２８８号公
報、Ａgric. Ｂiol. Ｃhem.,４６, ７−１３(１９８
２); Ｊ. Ｂacteriol., １２８, ５１５−５２１(１９
７６); Ｓtarch Ｉstaerke, ３１, １６６−１７１(１
９７９)]。しかし、それを用いた分解物はいずれも一般
のアミラーゼと大差がない。また、特開平４−６６０８
４号公報にも新規な酸性アミラーゼが開示されている
が、それによる澱粉分解物には依然としてＧ１やＧ２が
含まれる。
アミラーゼが幾つか知られている[特開昭６０−２１８
２号公報、特開昭６１−１１５４８４号公報、特開昭６
２−９１１８１号公報、特開昭６３−１９６２８８号公
報、Ａgric. Ｂiol. Ｃhem.,４６, ７−１３(１９８
２); Ｊ. Ｂacteriol., １２８, ５１５−５２１(１９
７６); Ｓtarch Ｉstaerke, ３１, １６６−１７１(１
９７９)]。しかし、それを用いた分解物はいずれも一般
のアミラーゼと大差がない。また、特開平４−６６０８
４号公報にも新規な酸性アミラーゼが開示されている
が、それによる澱粉分解物には依然としてＧ１やＧ２が
含まれる。
【０００６】最近、ある種のラクトバチルス属の微生物
が特異的な澱粉分解能を有することが報告されたが
(Ｊ．Ｆerment．Ｂioeng., ７３, ３, １９３−１９７
(１９９２))。しかしながら、その酵素は未だ単離され
るに至っていない。本発明者らは、かかるラクトバチル
ス属の微生物の酵素ついて研究を重ねる間に、当該微生
物が、酸性側で安定な、比較的高分子量の新規なアミラ
ーゼを産生することを見出し、その単離に成功した。ま
た、当該アミラーゼがＧ１やＧ２を殆ど含まない澱粉分
解物を生成することを見出した。
が特異的な澱粉分解能を有することが報告されたが
(Ｊ．Ｆerment．Ｂioeng., ７３, ３, １９３−１９７
(１９９２))。しかしながら、その酵素は未だ単離され
るに至っていない。本発明者らは、かかるラクトバチル
ス属の微生物の酵素ついて研究を重ねる間に、当該微生
物が、酸性側で安定な、比較的高分子量の新規なアミラ
ーゼを産生することを見出し、その単離に成功した。ま
た、当該アミラーゼがＧ１やＧ２を殆ど含まない澱粉分
解物を生成することを見出した。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明は、上記本発明者
らの知見に基づいて完成されたものであって、次の性質
を有する新規な酸性アミラーゼ: (１)至適pＨ３.５〜４.５、(２)pＨ３.５〜５.０の範囲
で最大活性の５０％を保持、(３)作用温度３０℃〜４５
℃で、至適作用温度３５℃付近、(４)pＨ６以上の活性
は最大活性の数％以下、(５)５０℃以上の活性は最大活
性の数％以下、(６)５５℃３０分間の処理で失活、およ
び(７)カラムクロマトグラフィーにより測定した分子量
約１５０,０００〜３００,０００、を提供するものであ
る。
らの知見に基づいて完成されたものであって、次の性質
を有する新規な酸性アミラーゼ: (１)至適pＨ３.５〜４.５、(２)pＨ３.５〜５.０の範囲
で最大活性の５０％を保持、(３)作用温度３０℃〜４５
℃で、至適作用温度３５℃付近、(４)pＨ６以上の活性
は最大活性の数％以下、(５)５０℃以上の活性は最大活
性の数％以下、(６)５５℃３０分間の処理で失活、およ
び(７)カラムクロマトグラフィーにより測定した分子量
約１５０,０００〜３００,０００、を提供するものであ
る。
【０００８】また、本発明はラクトバチルス属に属する
該新規酸性アミラーゼ産生能を有する微生物を培養して
アミラーゼを産生させ、その培養物から該アミラーゼを
回収する該新規アミラーゼの製造法および該アミラーゼ
を澱粉に作用させることにより、マルトトリオース(Ｇ
３)、マルトテトラオース(Ｇ４)およびマルトペンタオ
ース(Ｇ５)を主成分とし、実質的にグルコース(Ｇ１)お
よびマルトース(Ｇ２)を含まない澱粉分解物を得る澱粉
分解物の製造法も提供するものである。以下、本発明を
詳細に説明する。
該新規酸性アミラーゼ産生能を有する微生物を培養して
アミラーゼを産生させ、その培養物から該アミラーゼを
回収する該新規アミラーゼの製造法および該アミラーゼ
を澱粉に作用させることにより、マルトトリオース(Ｇ
３)、マルトテトラオース(Ｇ４)およびマルトペンタオ
ース(Ｇ５)を主成分とし、実質的にグルコース(Ｇ１)お
よびマルトース(Ｇ２)を含まない澱粉分解物を得る澱粉
分解物の製造法も提供するものである。以下、本発明を
詳細に説明する。
【０００９】本発明の新規酸性アミラーゼは、当該アミ
ラーゼ産生能を有するラクトバチルス属に属する微生
物、代表的には上記Ｊ. Ｆerment. Ｂiolog., ７３,
３, １９３−１９７(１９９２)に記載されるラクトバチ
ルスＬ−１３７株により産生される。該菌株は発酵食品
より分離されたラクトバチルスに属する微生物であり、
１９９３年２月１２日に工業技術院生命工学工業技術研
究所に、ＦＥＲＭ Ｐ−１３４２５の寄託番号の下に寄
託されている。この菌株の菌学的性質を表１に示す。
ラーゼ産生能を有するラクトバチルス属に属する微生
物、代表的には上記Ｊ. Ｆerment. Ｂiolog., ７３,
３, １９３−１９７(１９９２)に記載されるラクトバチ
ルスＬ−１３７株により産生される。該菌株は発酵食品
より分離されたラクトバチルスに属する微生物であり、
１９９３年２月１２日に工業技術院生命工学工業技術研
究所に、ＦＥＲＭ Ｐ−１３４２５の寄託番号の下に寄
託されている。この菌株の菌学的性質を表１に示す。
【００１０】
【表１】
【００１１】また、糖からの酸およびガスの産生は表２
に示すとおりである。
に示すとおりである。
【００１２】
【表２】
【００１３】これらの結果より、「バージエーズ・マニ
ュアル・オブ・デターミネイティブ・バクテリオロジ
ー」第８版に基づいて本菌株はラクトバチルス属の微生
物と同定された。この微生物は、ＤＮＡのグアニンとシ
トシン(Ｇ＋Ｃ)の含量が４５.１％と類似しているラク
トバチルス・プランタラム(Ｌactobacillus plantaru
m)と比較すると、セロビオース、ラクトース、マンニト
ール、メリビオース、キシロース、可溶性澱粉について
の酸の産生が異なる。すなわち、Ｌ−１３７株ではメリ
ビオースおよび可溶性澱粉から酸を産生するのに対し、
ラクトバチルス・プランタラムでは産生しない。また、
セロビオース、ラクトース、マンニトールについては、
Ｌ−１３７株では酸を産生しないのに対し、ラクトバチ
ルス・プランタラムはこれらの糖から酸を産生する。
ュアル・オブ・デターミネイティブ・バクテリオロジ
ー」第８版に基づいて本菌株はラクトバチルス属の微生
物と同定された。この微生物は、ＤＮＡのグアニンとシ
トシン(Ｇ＋Ｃ)の含量が４５.１％と類似しているラク
トバチルス・プランタラム(Ｌactobacillus plantaru
m)と比較すると、セロビオース、ラクトース、マンニト
ール、メリビオース、キシロース、可溶性澱粉について
の酸の産生が異なる。すなわち、Ｌ−１３７株ではメリ
ビオースおよび可溶性澱粉から酸を産生するのに対し、
ラクトバチルス・プランタラムでは産生しない。また、
セロビオース、ラクトース、マンニトールについては、
Ｌ−１３７株では酸を産生しないのに対し、ラクトバチ
ルス・プランタラムはこれらの糖から酸を産生する。
【００１４】以上のことから、ラクトバチルスＬ−１３
７株はラクトバチルス属の新規な微生物とされており、
本菌株の産生する本発明の酸性アミラーゼも、その至適
pＨ、分子量および特異的な澱粉分解物を生成するとこ
ろから、従来の酸性アミラーゼとは異なる新規なもので
ある。
７株はラクトバチルス属の新規な微生物とされており、
本菌株の産生する本発明の酸性アミラーゼも、その至適
pＨ、分子量および特異的な澱粉分解物を生成するとこ
ろから、従来の酸性アミラーゼとは異なる新規なもので
ある。
【００１５】本発明の酸性アミラーゼの詳細な酵素学的
性質は以下のとおりである。 作用および基質特異性 可溶性澱粉および糊化澱粉に作用するが、未糊化澱粉に
は作用しない。また、プルラン、グリコーゲンにも作用
する。
性質は以下のとおりである。 作用および基質特異性 可溶性澱粉および糊化澱粉に作用するが、未糊化澱粉に
は作用しない。また、プルラン、グリコーゲンにも作用
する。
【００１６】作用ｐＨ 本酵素を０.３％可溶性澱粉存在下、グリシン・塩酸緩
衝液、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液中で４０℃で３０分反
応させると、pＨ３.５において最大活性の７０％を示
し、pＨ４.０〜５.０において８０％の活性を有する
が、pＨ３以下および５.５以上で急激な活性の低下がみ
られ、pＨ２.０および６.０では活性を示さない。
衝液、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液中で４０℃で３０分反
応させると、pＨ３.５において最大活性の７０％を示
し、pＨ４.０〜５.０において８０％の活性を有する
が、pＨ３以下および５.５以上で急激な活性の低下がみ
られ、pＨ２.０および６.０では活性を示さない。
【００１７】pＨ安定性 本酵素をグリシン・塩酸緩衝液、酢酸緩衝液、リン酸緩
衝液を用いて、氷中１６時間放置すると、その残存活性
は、pＨ３.５〜５.０において最大活性の５０％以上で
ある。
衝液を用いて、氷中１６時間放置すると、その残存活性
は、pＨ３.５〜５.０において最大活性の５０％以上で
ある。
【００１８】作用温度 本酵素のpＨ４.５における至適温度は３５℃付近であ
り、７０％以上の活性を有する温度は４５℃までであ
る。活性は５０℃以上で急激に低下し、５５℃での活性
は殆どみられない。
り、７０％以上の活性を有する温度は４５℃までであ
る。活性は５０℃以上で急激に低下し、５５℃での活性
は殆どみられない。
【００１９】温度安定性 本酵素をpＨ４.０および５mＭカルシウムイオン存在下
で２０℃〜６０℃で３０分間放置後の活性は、４０℃ま
でほぼ最大活性に近く、４５℃以上で急激に低下し、５
０℃以上では完全に失活する。
で２０℃〜６０℃で３０分間放置後の活性は、４０℃ま
でほぼ最大活性に近く、４５℃以上で急激に低下し、５
０℃以上では完全に失活する。
【００２０】分子量 本酵素の分子量は、ゲル濾過カラムクロマトグラフィー
(セファロースＣＬ−４Ｂ、ファルマシア社製)における
移動度より、約１５０,０００〜３００,０００、好まし
くは１８０,０００〜２２０,０００、さらに好ましくは
２００,０００前後である。
(セファロースＣＬ−４Ｂ、ファルマシア社製)における
移動度より、約１５０,０００〜３００,０００、好まし
くは１８０,０００〜２２０,０００、さらに好ましくは
２００,０００前後である。
【００２１】本酵素による澱粉分解物 本酵素を１％可溶性澱粉存在下、pＨ４.５、５０mＭ酢
酸緩衝液で４０℃、６０分間反応させた場合の分解物
は、Ｇ３、Ｇ４およびＧ５が主成分(組成比が約９０％)
であり、Ｇ１およびＧ２は５％以下である。
酸緩衝液で４０℃、６０分間反応させた場合の分解物
は、Ｇ３、Ｇ４およびＧ５が主成分(組成比が約９０％)
であり、Ｇ１およびＧ２は５％以下である。
【００２２】かくして、本発明の酸性アミラーゼを製造
するには、該アミラーゼ産生能を有するラクトバチルス
属に属する微生物、代表的にはラクトバチルスＬ−１３
７株であり、または該アミラーゼ産生能を有する、例え
ば、化学的変異手段、遺伝子操作技法等の公知手段によ
るその変異株を培地で培養する。用いる培地の組成は特
に限定するものではなく、ラクトバチルス属の微生物培
養に通常用いられるものが使用できる。例えば、窒素源
としては、コーン・スティープ・リカー、ポリペプト
ン、肉汁エキス、酵母エキス、カザミノ酸が使用でき、
炭素源としては、グルコース、マルトース、乳糖、各種
澱粉、可溶性澱粉、澱粉液化液、デキストリン等が使用
できる。これらの窒素源、炭素源の他に各種塩(マグネ
シウム塩、マンガン塩、鉄塩、ナトリウム塩など)や各
種ビタミンを必要により添加してもよい。
するには、該アミラーゼ産生能を有するラクトバチルス
属に属する微生物、代表的にはラクトバチルスＬ−１３
７株であり、または該アミラーゼ産生能を有する、例え
ば、化学的変異手段、遺伝子操作技法等の公知手段によ
るその変異株を培地で培養する。用いる培地の組成は特
に限定するものではなく、ラクトバチルス属の微生物培
養に通常用いられるものが使用できる。例えば、窒素源
としては、コーン・スティープ・リカー、ポリペプト
ン、肉汁エキス、酵母エキス、カザミノ酸が使用でき、
炭素源としては、グルコース、マルトース、乳糖、各種
澱粉、可溶性澱粉、澱粉液化液、デキストリン等が使用
できる。これらの窒素源、炭素源の他に各種塩(マグネ
シウム塩、マンガン塩、鉄塩、ナトリウム塩など)や各
種ビタミンを必要により添加してもよい。
【００２３】本発明に使用する微生物の生育初発pＨお
よび生育pＨは弱酸性であるので、適当なpＨ調整剤
(例、炭酸カルシウム等)を用いて培地のpＨを６.０〜
７.０、好ましくは６.２〜６.６に調整する必要があ
り、酢酸ナトリウムのような各種緩衝液を用いることも
できる。
よび生育pＨは弱酸性であるので、適当なpＨ調整剤
(例、炭酸カルシウム等)を用いて培地のpＨを６.０〜
７.０、好ましくは６.２〜６.６に調整する必要があ
り、酢酸ナトリウムのような各種緩衝液を用いることも
できる。
【００２４】培養は静置培養、緩やかな振とう培養のよ
うな通常の培養法が採用でき、温度約２０℃〜４０℃、
好ましくは３０℃で２０時間〜７２時間程度の培養によ
り培地中に酸性アミラーゼが分泌され、蓄積される。培
養後、遠心分離等の常套の分離手段により菌体を除去す
る。得られた粗酵素液は、そのまま本発明の酸性アミラ
ーゼとしての活性を有するが、所望により、硫酸アンモ
ウニム等の塩析、エタノール、アセトンなどの溶媒沈澱
法、限外濾過法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル
濾過クロマトグラフィー等の一般的な酵素精製法により
精製することもできる。
うな通常の培養法が採用でき、温度約２０℃〜４０℃、
好ましくは３０℃で２０時間〜７２時間程度の培養によ
り培地中に酸性アミラーゼが分泌され、蓄積される。培
養後、遠心分離等の常套の分離手段により菌体を除去す
る。得られた粗酵素液は、そのまま本発明の酸性アミラ
ーゼとしての活性を有するが、所望により、硫酸アンモ
ウニム等の塩析、エタノール、アセトンなどの溶媒沈澱
法、限外濾過法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル
濾過クロマトグラフィー等の一般的な酵素精製法により
精製することもできる。
【００２５】また、得られた酵素を公知の酵素剤調製法
により、要すれば、適当な担体、希釈剤、賦形剤と共に
液体や固体の製剤としてもよく、また、固定化酵素とし
てもよく、そのような酵素も本発明の範囲内のものであ
る。
により、要すれば、適当な担体、希釈剤、賦形剤と共に
液体や固体の製剤としてもよく、また、固定化酵素とし
てもよく、そのような酵素も本発明の範囲内のものであ
る。
【００２６】本発明における澱粉分解物の製造は、該酵
素の活性条件下、例えば、pＨ３〜５、温度２０〜４５
℃で、該酵素を、例えば、バッチ式または連続式で澱粉
に作用させることにより製造できる。用いる澱粉は、特
に、限定するものではなく、例えば、可溶性澱粉、デキ
ストリン等が挙げられ、通常、固形分濃度０.５〜３０
％程度で０.５〜２時間酵素を作用させるとＧ３〜Ｇ５
を主成分(例、含量８０％以上)とし、実質的にＧ１およ
びＧ２を含まない(例、５％以下)所望の澱粉分解物が得
られる。
素の活性条件下、例えば、pＨ３〜５、温度２０〜４５
℃で、該酵素を、例えば、バッチ式または連続式で澱粉
に作用させることにより製造できる。用いる澱粉は、特
に、限定するものではなく、例えば、可溶性澱粉、デキ
ストリン等が挙げられ、通常、固形分濃度０.５〜３０
％程度で０.５〜２時間酵素を作用させるとＧ３〜Ｇ５
を主成分(例、含量８０％以上)とし、実質的にＧ１およ
びＧ２を含まない(例、５％以下)所望の澱粉分解物が得
られる。
【００２７】得られた分解物はその主成分がマルトトリ
オース、マルトテトラオース、マルトペンタオースであ
り、グルコース、マルトースを殆ど含んでいないので、
低甘味度、吸湿性の向上等のすぐれた特性を有し、食品
改良剤等として使用でき、医薬等の分野における使用も
期待できる。
オース、マルトテトラオース、マルトペンタオースであ
り、グルコース、マルトースを殆ど含んでいないので、
低甘味度、吸湿性の向上等のすぐれた特性を有し、食品
改良剤等として使用でき、医薬等の分野における使用も
期待できる。
【００２８】
【実施例】以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳しく
説明するが、これに限定されるものではない。なお、本
明細書において、アミラーゼ活性の測定は次のようにし
て行った。１％の可溶性澱粉(ナカライテスク(株)製ア
ミラーゼ定量用)５０μlと、０.１Ｍ酢酸ナトリウム−
酢酸緩衝液(所定のpＨに調整したもの)７５μlとを混合
し、４０℃５分間保温した。ついで、酵素液２５μlを
添加し、所定の温度で所定の時間反応させ、直ちに１.
０Ｎ水酸化ナトリウム５０μlと混合し反応を停止さ
せ、ソモジー・ネルソン(Ｓomogyi−Ｎelson)法で反応
液の還元糖を測定した。酵素１単位(unit)は１分間に１
μmolのグルコースを生成する酵素量とした。
説明するが、これに限定されるものではない。なお、本
明細書において、アミラーゼ活性の測定は次のようにし
て行った。１％の可溶性澱粉(ナカライテスク(株)製ア
ミラーゼ定量用)５０μlと、０.１Ｍ酢酸ナトリウム−
酢酸緩衝液(所定のpＨに調整したもの)７５μlとを混合
し、４０℃５分間保温した。ついで、酵素液２５μlを
添加し、所定の温度で所定の時間反応させ、直ちに１.
０Ｎ水酸化ナトリウム５０μlと混合し反応を停止さ
せ、ソモジー・ネルソン(Ｓomogyi−Ｎelson)法で反応
液の還元糖を測定した。酵素１単位(unit)は１分間に１
μmolのグルコースを生成する酵素量とした。
【００２９】実施例１ 可溶性澱粉１０g、ポリペプトン５g、酵母エキス５g、
および金属溶液(硫酸マグネシウム１１５g、硫酸マンガ
ン２４g、塩化ナトリウム２４g、硫酸第一鉄２gを１リ
ットルの水に溶かしたもの)５mlを１リットルの水に溶
かした液体培地(pＨ６.５)に、pＨ調整剤として炭酸カ
ルシウム２０gを添加した。ラクトバチルスＬ−１３７
株を植菌後、３０℃で２日間、静置培養を行った。培養
後、培養液を７０００rpmで遠心分離し、菌体における
未使用の炭酸カルシウムを除去した。ついで、培養上清
に最終濃度が５０mＭ酢酸緩衝液(pＨ４.５)および１mＭ
フッ化フェニルメチルスルホニル(ＰＭＳＦ)となるよう
にこれらを添加し、排除分子量:５万の限外濾過膜(東洋
濾紙(株)製)で限外濃縮を行なった。これを陰イオン交
換クロマトグラフィー(ＤＥＡＥ−セファロース ＣＬ
−６Ｂ ファルマシア製)に付し、０〜０．５Ｍ塩化ナ
トリウムの直線濃度勾配を用いて分画した。活性画分を
回収後、上記の限外濾過膜で脱塩濃縮し、ゲル濾過クロ
マトグラフィー(セファロース ＣＬ−４Ｂ ファルマ
シア製)を行った。ゲル濾過によるアミラーゼ活性を有
するピークの比活性は、１８.５unit／mgであり、培養
上清から比較すると約６００倍と比活性が向上した。
および金属溶液(硫酸マグネシウム１１５g、硫酸マンガ
ン２４g、塩化ナトリウム２４g、硫酸第一鉄２gを１リ
ットルの水に溶かしたもの)５mlを１リットルの水に溶
かした液体培地(pＨ６.５)に、pＨ調整剤として炭酸カ
ルシウム２０gを添加した。ラクトバチルスＬ−１３７
株を植菌後、３０℃で２日間、静置培養を行った。培養
後、培養液を７０００rpmで遠心分離し、菌体における
未使用の炭酸カルシウムを除去した。ついで、培養上清
に最終濃度が５０mＭ酢酸緩衝液(pＨ４.５)および１mＭ
フッ化フェニルメチルスルホニル(ＰＭＳＦ)となるよう
にこれらを添加し、排除分子量:５万の限外濾過膜(東洋
濾紙(株)製)で限外濃縮を行なった。これを陰イオン交
換クロマトグラフィー(ＤＥＡＥ−セファロース ＣＬ
−６Ｂ ファルマシア製)に付し、０〜０．５Ｍ塩化ナ
トリウムの直線濃度勾配を用いて分画した。活性画分を
回収後、上記の限外濾過膜で脱塩濃縮し、ゲル濾過クロ
マトグラフィー(セファロース ＣＬ−４Ｂ ファルマ
シア製)を行った。ゲル濾過によるアミラーゼ活性を有
するピークの比活性は、１８.５unit／mgであり、培養
上清から比較すると約６００倍と比活性が向上した。
【００３０】実施例２ 各種pＨ緩衝液(０.１Ｍ)７５μl、１％可溶性澱粉５０
μl、酵素液(ゲル濾過精製品)２５μlで、４０℃にて、
３０分間反応させ、還元糖の増加をソモジー・ネルソン
法で測定することによって、各種pＨにおける酵素活性
を比較した。なお、pＨ３.５における活性を１００％と
して比較した。結果を表３に示す。
μl、酵素液(ゲル濾過精製品)２５μlで、４０℃にて、
３０分間反応させ、還元糖の増加をソモジー・ネルソン
法で測定することによって、各種pＨにおける酵素活性
を比較した。なお、pＨ３.５における活性を１００％と
して比較した。結果を表３に示す。
【００３１】
【表３】
【００３２】実施例３ ０.１Ｍ酢酸緩衝液７５μl、１％可溶性澱粉５０μl、
酵素液(１unit／ml)２５μlを各温度、３０分反応さ
せ、還元糖の増加をソモジー・ネルソン法で測定するこ
とによって、各温度における酵素活性を比較した。な
お、３５℃における酵素活性を１００％とした。結果を
表４に示す。
酵素液(１unit／ml)２５μlを各温度、３０分反応さ
せ、還元糖の増加をソモジー・ネルソン法で測定するこ
とによって、各温度における酵素活性を比較した。な
お、３５℃における酵素活性を１００％とした。結果を
表４に示す。
【００３３】
【表４】
【００３４】実施例４ ０.１Ｍ酢酸緩衝液(pＨ４.５)１.５ml、１％可溶性澱粉
１ml、酵素液(１unit／ml)０.５mlを４０℃、６０分間
反応させ、反応生成物を高速液体クロマトグラフィーで
確認した。カラムはＡsahipak ＮＨ2Ｐ−５０(旭化成
製)で行ない、アセトニリトル／水(６０:４０)で溶出
し、示差屈折計により検出し、データ処理装置で組成比
を求めた。結果を表５に示す。
１ml、酵素液(１unit／ml)０.５mlを４０℃、６０分間
反応させ、反応生成物を高速液体クロマトグラフィーで
確認した。カラムはＡsahipak ＮＨ2Ｐ−５０(旭化成
製)で行ない、アセトニリトル／水(６０:４０)で溶出
し、示差屈折計により検出し、データ処理装置で組成比
を求めた。結果を表５に示す。
【００３５】
【表５】
【００３６】Ｇ１:グルコース Ｇ２:マルトース Ｇ
３:マルトトリオース Ｇ４:マルトテトラオース Ｇ５:マルトペンタオース Ｇ６:マルトヘキサオース
３:マルトトリオース Ｇ４:マルトテトラオース Ｇ５:マルトペンタオース Ｇ６:マルトヘキサオース
【００３７】実施例５ ０.１Ｍ酢酸緩衝液(pＨ４.５)７５μl、１％各種基質溶
液５０μlおよび酵素液(１unit／ml)２５μlを４０℃、
３０分間反応させたときに生じる還元糖量をソモジー・
ネルソン法で測定することにより、分解性を比較した。
なお、可溶性澱粉の場合を１００％とした。結果を表６
に示す。
液５０μlおよび酵素液(１unit／ml)２５μlを４０℃、
３０分間反応させたときに生じる還元糖量をソモジー・
ネルソン法で測定することにより、分解性を比較した。
なお、可溶性澱粉の場合を１００％とした。結果を表６
に示す。
【００３８】
【表６】
【００３９】
【発明の効果】本発明によれば、新規な酸性アミラーゼ
が提供でき、これにより食品改良剤等として有用な、主
成分がマルトトリオース、マルトテトラオース、マルト
ペンタオースであり、グルコース、マルトースを殆ど含
まない澱粉分解物が得られる。
が提供でき、これにより食品改良剤等として有用な、主
成分がマルトトリオース、マルトテトラオース、マルト
ペンタオースであり、グルコース、マルトースを殆ど含
まない澱粉分解物が得られる。
Claims (4)
- 【請求項１】 次の性質を有するアミラーゼ: (１)至適pＨ３.５〜４.５、 (２)pＨ３.５〜５.０の範囲で最大活性の５０％を保
持、 (３)作用温度３０℃〜４５℃で、至適作用温度３５℃付
近、 (４)pＨ６以上の活性は最大活性の数％以下、 (５)５０℃以上の活性は最大活性の数％以下、 (６)５５℃３０分間の処理で失活、および (７)カラムクロマトグラフィーにより測定した分子量約
１５０,０００〜３００,０００。 - 【請求項２】 ラクトバチルス属に属する請求項１記載
のアミラーゼ産生能を有する微生物を培養してアミラー
ゼを産生させ、その培養物から該アミラーゼを回収する
ことを特徴とする請求項１記載のアミラーゼの製造法。 - 【請求項３】 微生物がラクトバチルスＬ−１３７株で
ある請求項２記載の製造法。 - 【請求項４】 請求項１項記載のアミラーゼを澱粉に作
用させることにより、マルトトリオース、マルトテトラ
オースおよびマルトペンタオースを主成分とし、実質的
にグルコースおよびマルトースを含まない澱粉分解物を
得ることを特徴とする澱粉分解物の製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP06797493A JP3469265B2 (ja) | 1993-02-22 | 1993-03-26 | 酸性アミラーゼ、その製造法およびそれを用いた澱粉分解物の製造法 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5-31688 | 1993-02-22 | ||
| JP3168893 | 1993-02-22 | ||
| JP06797493A JP3469265B2 (ja) | 1993-02-22 | 1993-03-26 | 酸性アミラーゼ、その製造法およびそれを用いた澱粉分解物の製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06296486A true JPH06296486A (ja) | 1994-10-25 |
| JP3469265B2 JP3469265B2 (ja) | 2003-11-25 |
Family
ID=30002089
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP06797493A Expired - Fee Related JP3469265B2 (ja) | 1993-02-22 | 1993-03-26 | 酸性アミラーゼ、その製造法およびそれを用いた澱粉分解物の製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3469265B2 (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1001033A3 (fr) * | 1998-10-30 | 2000-06-07 | Institut de Recherche pour le Développement ( IRD) | Procédé de production de farines lactiques et produits obtenus |
| JP2010119350A (ja) * | 2008-11-20 | 2010-06-03 | Hiroshima Prefecture | マルトオリゴ糖高含有乳酸発酵物、その製造方法及びそれを含有する飲食品、飼料、又はこれらの原材料 |
| WO2023190332A1 (ja) * | 2022-03-29 | 2023-10-05 | 株式会社ヤクルト本社 | 発酵食品及びその製造方法 |
-
1993
- 1993-03-26 JP JP06797493A patent/JP3469265B2/ja not_active Expired - Fee Related
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1001033A3 (fr) * | 1998-10-30 | 2000-06-07 | Institut de Recherche pour le Développement ( IRD) | Procédé de production de farines lactiques et produits obtenus |
| JP2010119350A (ja) * | 2008-11-20 | 2010-06-03 | Hiroshima Prefecture | マルトオリゴ糖高含有乳酸発酵物、その製造方法及びそれを含有する飲食品、飼料、又はこれらの原材料 |
| WO2023190332A1 (ja) * | 2022-03-29 | 2023-10-05 | 株式会社ヤクルト本社 | 発酵食品及びその製造方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3469265B2 (ja) | 2003-11-25 |
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|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |