JPH06279310A

JPH06279310A - ラクトフェリン酸加水分解物を有効成分とする抗菌剤およびそれを配合した化粧料

Info

Publication number: JPH06279310A
Application number: JP5098499A
Authority: JP
Inventors: Norihiro Tomono; 伴野規博; Yoshihiro Chikamatsu; 近松義博; Hiroshi Ando; 弘安藤
Original assignee: Ichimaru Pharcos Co Ltd
Current assignee: Ichimaru Pharcos Co Ltd
Priority date: 1993-03-31
Filing date: 1993-03-31
Publication date: 1994-10-04

Abstract

(57)【要約】（修正有）【目的】細菌、特に、皮膚常在病原菌、う蝕原菌に対し
極めて強い抗菌効果を有し、しかも毒性や刺激性がな
く、ヒトまたは動物の健康維持に役立つ、新規な抗菌剤
の開発と、それを配合した医薬品類、化粧品類などの皮
膚外用剤を提供する。【構成】鉄結合能消失性のラクトフェリン酸加水分解物
を有効成分として含有する抗菌剤およびそれを配合した
化粧料。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、鉄結合能消失性のラクトフェリ
ン酸加水分解物を有効成分とする、特に、皮膚常在病原
菌やう蝕原菌に対する生育抑制効果の高い新規な抗菌剤
と、その化粧料への応用に関するものである。

【０００２】

【産業上の利用分野】本発明による鉄結合能消失性のラ
クトフェリン酸加水分解物（以下、便宜上、ラクトフェ
リン酸加水分解物という。）は、細菌、特に、大腸菌、
黄色ぶどう球菌、その他の皮膚常在菌、あるいは、う触
原菌などに対し、その増殖を抑制する効果が極めて高
い。したがって、例えば、医薬品類、医薬部外品類、化
粧品類、その他ヒトや動物用の各種製剤などに配合し用
いることによって、それら細菌類からの感染を防御し健
康維持に役立つ。具体的な用途としては、例えば、皮膚
や口腔用の消毒液や洗浄剤（せっけん類を含む）といっ
たものや、あるいは、化粧水、ひげ剃り用剤（シェイビ
ングフォーム、シェイビングクリーム、ローションな
ど）、その他の外用ローション類、クリームや軟膏類、
歯磨き用剤、毛髪用剤（シャンプー、リンス、あるい
は、ヘアートニック、ヘアーリキッド、ヘアームースと
いったもの）などへの応用があげられる。それに、ウェ
ットタイプのティッシュや拭き取り用ペーパー類、除菌
用クロスといったものなどへの応用も有効的である。

【０００３】

【従来の技術】生体は、その皮膚や粘膜において、物理
的もしくは殺菌性物質や粘液の分布といった化学的な方
法によって微生物の侵入に抵抗している。また体内に侵
入した微生物に対しては、免疫グロブリンによる付着阻
止、食細胞による食作用、リゾチームによる溶菌作用な
ど、先天的で非特異的な感染抵抗や特定の病原菌に対す
る免疫応答などによって抵抗している。しかし、もし菌
の感染力が生体における抵抗力を上回ってしまえば、生
体には感染症状が現れる。例えば、黄色ブドウ球菌によ
る膿皮症などの感染性皮膚炎、アクチノバシルスなどに
よる歯周病、う触原菌による虫歯、それにアクネ菌など
によるニキビ等がそうである。こうした感染症の予防や
治療に対して、これまでさまざまな薬物が使用されてき
た。ところが、その大半を占める抗生物質や合成抗菌剤
などは、確かにその効果が強いが、副作用という深刻な
問題があり、それらの使用には厳重な注意が必要であ
る。

【０００４】こうしたなか、安全性が高く、使用しやす
い抗菌剤が求められるようになり、生体内において感染
防御を担っている物質が注目されるようになってきた。
このような物質としては、分泌型免疫グロブリンＡやリ
ゾチーム、ラクトフェリンなどが知られている。中でも
乳中に存在し、乳児の感染防御能を高める上で重要な役
割を果たしているラクトフェリンは、抗菌性（特開昭62
-249931）だけでなく抗酸化作用（特開平4-334310）、
抗炎症作用（特開平1-135726）、チロシナーゼ活性阻害
効果（特開平4-59714）など多様な機能が報告され、そ
の応用が種々検討されている。例えば、ラクトフェリン
の抗菌性はその鉄キレート力に由来し、菌に必要な鉄を
奪うことによりその増殖を抑制するものと考えられてい
る。しかしながら、その作用はそれほど強力ではなく、
また一時的なものであるため、単独では感染の予防およ
び治療剤としての効果が不十分であり、これまで、リゾ
チーム（特開昭62-249931）や分泌型免疫グロブリン
（特開平1-135726）などとの併用が検討されてきた。

【０００５】本発明者らは、ラクトフェリンの抗菌機構
についての研究を重ねてきた結果、ラクトフェリンを酸
で加水分解すると、抗菌活性が増大する傾向がみられる
ことを知り、さらにラクトフェリンの分解程度とその抗
菌活性についての検討を進める過程において、ラクトフ
ェリンの持つ鉄結合能を一つの指標とした時、それが消
失する程度まで加水分解することにより、抗菌効果が分
解前の数十倍にまで増強されることを見い出し、本発明
を完成するに至った。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、細
菌、特に、皮膚常在病原菌、う蝕原菌に対し極めて強い
抗菌効果を有し、しかも毒性や刺激性がない、ヒトまた
は動物の健康維持に役立つ新規な抗菌剤の開発と、それ
を配合した医薬品類、化粧品類などの皮膚外用剤を提供
することにある。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明によれば、少なく
とも 0.001 ％（但し、単位は重量％で、以下、特に断
わりのない限り同じとする。）、望ましくは 0.01 〜
0.1 ％濃度のラクトフェリン酸加水分解物を溶液、粉
末、ゾル、ゲル、エマルジョン、ワックス状等様々な形
態で、皮膚に塗布、塗擦、スプレー（エアロゾル）して
投与する。ラクトフェリン酸加水分解物は、公知の皮膚
外用剤（化粧料を含む）の基剤等に常法により配合し
て、ローション、スキンクリーム、乳液、ヘアートニッ
ク、シャンプー、リンス、その他の化粧料、または医薬
品、医薬部外品（人およびその他の動物用）などの薬
液、軟膏等の製剤として用いることができる。またラク
トフェリン酸加水分解物は、ビタミン類、動植物エキ
ス、皮膚機能亢進剤、各種界面活性剤、溶剤、香料、着
色料、殺菌剤、防腐剤、抗酸化剤、保湿剤やその他の各
種添加剤、各種化粧品基剤に対しても安定であり、これ
らと併用し配合することももちろん可能である。

【０００８】本発明に使用するラクトフェリン酸加水分
解物は、どのような由来のラクトフェリンから誘導され
たものであっても差し支えはない。例えば、組織培養や
化学合成、遺伝子組み替えで得られたラクトフェリンを
用いることも可能である。またラクトフェリンの製造法
は、公知の製造法を採用しても何等差し支えない。本発
明では、ラクトフェリンを鉄結合性が消失する程度まで
分解するので、分解前のラクトフェリンは、鉄が結合し
たもの、あるいは結合していないものの何れであっても
構わない。またラクトフェリンを酸で加水分解する場
合、特に制限はないが、80〜100 ℃においてごく短時間
で、鉄結合能が消失する程度に部分的に分解すればよ
い。以下に本発明について、実施例をもって詳しく説明
する。

【０００９】

【実施例】ラクトフェリンの酸加水分解新鮮な牛ホエーの硫安沈殿物を水に溶解し、セファデッ
クスG-25のカラムに通し脱塩した。脱塩した蛋白を pH
7.3 のリン酸緩衝生理食塩水 (PBS)に溶解し、抗牛ラク
トフェリンモノクローナル抗体アフィニティカラムに通
し、さらに PBSで洗浄した。その後、0.15M の食塩を含
む pH 3.7 の 0.25M−酢酸ナトリウム緩衝液で、カラム
より牛由来のラクトフェリンを溶出した。次に、この溶
出液を50％クエン酸にて pH を３以下に調整した後、95
℃で５分〜３時間加熱処理し酸加水分解を行なった。こ
うして各処理時間毎に得られた処理液を凍結乾燥し、鉄
結合能が 0〜50 ％のラクトフェリン分解物を得た。

【００１０】尚、鉄結合能についての求め方は、バソフ
ェナンスロリン法を用いる血清鉄測定法を応用し、次の
ような方法で行った。また、測定に使用する試薬は、エ
フイーテストワコー（和光純薬工業株式会社製）を用い
た。（ラクトフェリン分解物の鉄結合能測定法）酸加水分解
を行う過程において、それぞれ処理時間の異なる処理液
から沈澱を除去し、各々 0.5mL を採取し、これらに塩
化第二鉄溶液 1 mL を加え 5分間室温で攪拌する。次
に、炭酸ナトリウム 0.15 g を入れ軽く攪拌し、30分放
置後、3000 rpm で 10 分間遠心する。得られた 1 mL
に、試薬第１液（界面活性剤含有緩衝液）をそれぞれ 1
mL 加え、95℃の水浴中で 2分間加熱する。冷却後、試
薬第２液（還元剤：L-アスコルヒ゛ン酸溶液）1mL を添加し、2
000 rpm で 2分間遠心分離する。次いで、上澄みをそれ
ぞれ 1.5 mL 採り、試薬第３液（発色剤：ハ゛ソフェナンスロリンス
ルホン酸ナトリウム溶液）0.5 mL を加えた時の 535 nm におけ
る吸光度を測定し、各処理時間ごとの処理液の ODA と
する。同様に、試薬第４液（鉄標準液：200μg／dL）0.
5 mL につき、試薬第１液を1mL 加え、以下同様に操作
し吸光度 ODB を得る。各処理時間ごとのラクトフェリ
ン分解物の鉄結合能量は、次式より算出する。

【式１】また、酸加水分解前の溶液についても同様の操作を行
い、ラクトフェリンの飽和鉄結合能量についてを求め、
次式により各処理液の鉄結合能とする。

【式２】

【００１１】

【実施例】皮膚常在菌に対する抗菌効果（試料の調製）実施例で得た異なる鉄結合能を有するラ
クトフェリン分解物を精製水に溶解し試料とする。ま
た、対照として未分解のラクトフェリンを同様に用い
た。（試験方法）供試菌として、次のものを用いた。１．大腸菌２．黄色ブドウ球菌３．アクネ菌また、培地については次のものを用いた。尚、Ａ，Ｂと
もに121℃で15分間滅菌したものを用意した。Ａ．供試菌１用として、1%ポリペプトン水溶液（pH=7）Ｂ．供試菌２，３用として、1%ポリペプトン＋0.1％酵
母エキス水溶液（pH=7）試験方法としては、あらかじめ保存スラントより菌体を
一白金耳とり、上記それぞれの培地で、37℃、16時間振
とう培養し前培養液を作成する。液体培地(4 ml)に試料
200μL を添加した後、供試菌の前培養液を1％接種
し、37℃で8時間培養する。培養後、波長 660 nm で濁
度を測定し、各供試菌の生育度とした。（試験結果）結果は表１の通りである。

【表１】上記の試験で最も効果の高かったラクトフェリン酸加水
分解物について、次は有効的濃度を検討するため、系へ
の添加濃度を変えて同じく行ってみた。その結果は表２
に示す通りであった。

【表２】これらの結果から明らかなように、鉄結合能が消失する
まで分解したラクトフェリン酸加水分解物が、最もその
効果が高く、未分解ラクトフェリンに比べ何れの供試皮
膚常在菌においても10倍程度の強い活性が認められた。

【００１２】

【実施例】う蝕原菌に対する抗菌効果（試料の調製）上記と同様、実施例で得た異なる鉄結合
能を有するラクトフェリン分解物を精製水に溶解し試料
とする。また、対照として未分解ラクトフェリンを用い
て同様に行なった。（試験方法）供試菌として、次のものを用いた。１．ストレプトコッカス・ミュータンスまた、培地は、次のものを使用した。Ａ．ＧＡＭ寒天培地（直径9 cm）試験方法としては、供試菌懸濁液の 100μL を培地中に
塗り広げ、30分間静置後、培地中央にペーパーディスク
（直径6 mm）をおき、試料30μLを滴下し、Gas Pack(BB
L) により 37℃ で48時間嫌気培養後、形成される生育
阻止円を計測した。（試験結果）結果は表３のとおりである。

【表３】これについても最も効果の高かったラクトフェリン酸加
水分解物について、その有効的濃度を検討するため、系
への添加濃度を変えて同じく行ってみた。その結果は表
４に示す通りであった。

【表４】この試験においても、鉄結合能が消失するまで分解した
ラクトフェリン酸加水分解物が最も効果が高く、未分解
ラクトフェリンに比べ、20倍程度のう蝕原菌に対する抗
菌効果が見られた。

【００１３】上記の種々の試験結果から、効果の高いラ
クトフェリン酸加水分解物を容易かつ高収率に得る製造
法について検討してみた。その方法を一例として下記参
考例に示すが、かかる方法に限定されるわけではない。（参考例）ラクトフェリン酸加水分解物の製造法新鮮な牛ホエーの硫安沈殿物を水に溶解し、セファデッ
クスG-25のカラムに通し脱塩した。脱塩した蛋白を pH
7.3 のリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に溶解し、抗牛ラク
トフェリンモノクローナル抗体アフィニティカラムに通
し、さらに PBSで洗浄した。その後、0.15Ｍの食塩を含
む pH3.7 の 0.25Ｍ−酢酸ナトリウム緩衝液でカラムよ
り牛由来のラクトフェリンを溶出した。溶出物を 50％
−クエン酸にて pH を３以下に調製した後、沸騰水浴上
にて95℃にまで加熱、そのまま１時間ほど放置し加水分
解を行う。（反応終点の一つの目安として、溶液の赤橙
色が消える程度まで行うとよい。また、確認しにくい場
合は、予め塩化第二鉄のようなものを微量添加してお
き、加水分解することもできる。）分解物を冷却後、2
Ｎ−水酸化ナトリウム溶液にて pH を中性付近に調整
し、精製水で３日間透析し、透析物を凍結乾燥してラク
トフェリン酸加水分解物を得る。

【００１４】本発明の優れた抗菌効果を有するラクトフ
ェリン酸加水分解物について、それの皮膚外用剤への応
用を検討するため、パネラーによる48時間クローズドパ
ッチテストを実施し、その安全性についてを評価してみ
た。以下に、その方法および結果について詳記する。

【００１５】

【実施例】安全性試験（試料の調製）実施例あるいは参考例で示した方法によ
り製造した抗菌効果の高いラクトフェリン酸加水分解物
を用い、以下の組成で柔軟性化粧水を作り試料とした。
尚、対照としてラクトフェリン酸加水分解物の代わりに
精製水を加えた供試品を製し、同時に行なった。（柔軟性化粧水の処方）エタノ−ル１０.０％モノラウリン酸ポリオキシエチレンソルビタン１.０パラオキシ安息香酸メチル０.２香料０.２精製水７７.５グリセリン５.０ 1,3−ブチレングリコール６.０ラクトフェリン酸加水分解物０.１（試験方法）健康成人30名（男性11名：24〜40歳、女性
19名：19〜46歳）をパネラーとしクローズドパッチテス
トを行なった。まず、試料をろ紙を入れた Finn chambe
r に適量滴下し、Scanpor tapeを用いて上背部に48時間
貼布した。判定は除去後１時間、そして24時間について
行なった。無反応（−）わずかな紅斑（±）明らかな紅斑（＋）（試験結果）表５にパッチテスト結果の集計表を示す。

【表５】表５の結果より、本発明のラクトフェリン酸加水分解物
は、化粧品配合用原料として安全に利用できる成分であ
ると判定した。

【００１６】次に、本発明のラクトフェリン酸加水分解
物を用いて、いくらかの化粧料を製した。尚、各化粧料
の製造については常法により行い、また、ラクトフェリ
ン酸加水分解物は実施例あるいは参考例の方法により製
造したものを使用した。

【００１７】

【実施例】ピールオフパックの処方例精製水６６.５％グリセリン５.０プロピレングリコール４.０ポリビニルアルコール１５.０エタノール８.０ポリオキシエチレングリコール１.０パラオキシ安息香酸メチル０.２香料０.２ラクトフェリン酸加水分解物０.１上記の処方でピールオフパックを製した。

【００１８】

【実施例】コールドクリームの処方例サラシミツロウ１１.０％流動パラフィン２２.０ラノリン１０.０アーモンド油１５.０ホウ砂０.５パラオキシ安息香酸メチル０.２精製水４０.９香料０.３ラクトフェリン酸加水分解物０.１上記の処方でコールドクリームを製した。

【００１９】

【実施例】シャンプーの処方例ラウリル硫酸トリエタノールアミン５.０％ポリオキシエチレンラウリルエーテル硫酸ナトリウム１２.０ 1,3−ブチレンエタノール４.０ラウリン酸ジエタノールアミド２.０エデト酸二ナトリウム０.１パラオキシ安息香酸メチル０.２香料０.３精製水７６.３ラクトフェリン酸加水分解物０.１上記の処方でシャンプーを製した。

【００２０】

【発明の効果】本発明のラクトフェリン酸加水分解物
は、抗菌スペクトラムが広く優れた抗菌剤として評価さ
れる。また、本発明の抗菌剤は、副作用がなく安全であ
る。したがって、はじめに記載したような各種の製剤や
トイレタリー商品に配合し日常的に使用することによっ
て、細菌感染による膿皮症やニキビ肌、また虫歯、歯周
病といった症状を予防し、ヒトやその他の動物の健康維
持に役立つものと考える。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ａ６１Ｋ 7/16 7252−4Ｃ 7/48 9051−4Ｃ // Ａ６１Ｋ 37/14 8314−4Ｃ

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】鉄結合能消失性のラクトフェリン酸加水
分解物を有効成分として含有する抗菌剤
【請求項２】鉄結合能消失性のラクトフェリン酸加水
分解物を有効成分として含有する請求項第１項記載の抗
菌剤を配合した化粧料