JPH0625300A - 免疫原性タンパク質、ｈｉｖ関連ペプチド及びアニオン性部分からなる共複合体ワクチン - Google Patents

免疫原性タンパク質、ｈｉｖ関連ペプチド及びアニオン性部分からなる共複合体ワクチン

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JPH0625300A
JPH0625300A JP3271684A JP27168491A JPH0625300A JP H0625300 A JPH0625300 A JP H0625300A JP 3271684 A JP3271684 A JP 3271684A JP 27168491 A JP27168491 A JP 27168491A JP H0625300 A JPH0625300 A JP H0625300A
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エー．エミニ エミリオ
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Abstract

(57)【要約】 【構成】 生理学的ｐＨにおいてアニオン性またはポリ
アニオン性を示す低分子量部分−ａ−につながっている
第一の共有結合連結のセット、およびヒト免疫不全ウイ
ルス（ＨＩＶ）主要中和決定基（ＰＮＤ）を含むペプチ
ドまたは免疫学的にそれと等価なペプチドにつながって
いる第２の共有結合連結のセットを有する、免疫原性タ
ンパク質もしくは複合タンパク質からなる新規な共複合
体が提供される。 【効果】 上記共複合体は、哺乳動物に抗ペプチド免疫
応答を誘発し、哺乳動物にＨＩＶ中和抗体を誘起し、Ｈ
ＩＶ感染もしくは後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）な
どのＨＩＶ病を予防するためのワクチンを製造し、ある
いはＨＩＶ感染もしくはＨＩＶ病を患うヒトを治療する
のに有用である。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】本発明は、新規な共有結合性ペプチド−蛋
白複合体及びその複合体を作る方法及びその複合体を使
用する方法に関する。ヒト免疫不全ウイルスを中和でき
る抗体に結合できる性質を有する主要中和決定基（ＰＮ
Ｄ）ペプチドは、免疫原性蛋白質または蛋白複合体、好
ましくは、ナイセリア（Neisseria)の外部膜蛋白複合体
（ＯＭＰＣ）からなるキャリヤーに複合化されている。
【０００２】用語“中和”は抗体に適用される場合に
は、生体内または生体外を問わず抗体にウイルスを曝す
るとＨＩＶ感染及び細胞融合、細胞感染、ＣＤ４レセプ
ター保有細胞枯渇及びウイルス増殖を含む疾患に特徴的
な認識されたウイルス媒介異常生理学的機能のあるもの
またはすべてのアテヌエーションまたは排除を生じるこ
とを意味する。これらの基準に合う中和性抗体は、ＨＩ
Ｖに感染した患者の血清中に検出されかつ疾患ＨＩＶ関
連抗原で免疫することによって動物及びヒトに誘発され
る。弱毒化または殺した丸ごとのＨＩＶ、ＨＩＶのサブ
ユニット蛋白、挿入ＨＩＶ遺伝子物質を含む生の組み換
え体ワクシニアウイルス及びＨＩＶ特異生ペプチドはす
べて予防のまたは治療の後感染免疫原として使用し得る
として評価されている。丸ごとのウイルスの使用は、わ
ずかながらワクチン受容者に活性の感染を生じさせる危
険性があるが、サブユニット−蛋白−ワクチンの使用は
ウイルスを中和する抗体の誘発に限定的に成功した。生
の組み換え体ワクシニアウイルスワクチンを使用すれば
確実である、しかし、良性ではあるが生のウイルスの導
入、特にすでに免疫無防備な受容者への導入における本
質的な危険性は明らかである。今までは、ペプチドベー
ス免疫原が最も有望であった。次の文献は、ワクチンの
評価を行う一般的な見解を提供する： Crit. Rev. in I
mmunol. ９巻、１５３頁、１９８９年（Lasky, A.)； C
omprehensive Therapy １５巻、４７頁、１９８９年
（Garris on, L. ）； Drus of Today, ２５巻、７０９
頁、１９８９年（Dalgleish, A.)； In Vivo ３巻、６
１頁、１９８９年（Schuhafer, E.P., Verma, R.
S.）； Annals of Internal Medicine １１０巻、３７
３頁、１９８９年（Fauci, A. S., et al)； Advances
in Immunol. ４７巻、３７７頁、１９８９年（Rosenber
g, Z. F., Fauci, A. S.）； AIDS ２巻、Ｓ１０７、１
９８９年（Snart, R. S.)
【０００３】この発明において興味の対象であるペプチ
ド（以下、主中和決定基（ＰＮＤｓ）という）が同定さ
れており、それは哺乳動物にＨＩＶ中和免疫応答を引き
出すことができる。免疫原性を、本発明の複合体上の他
のＨＩＶ関連又は非関連ペプチドに与えることができる
が、ここで特に興味の対象であるものは、ＨＩＶ III
Ｂ中の及びほどんどの他のＨＩＶ分離物、例えばＭＮ分
離物、中のＨＩＶエンベロープ糖たん白、gp１２０、の
２９６と３４１との間のアミノ酸に又はその近辺に位置
するＰＮＤである（Nature ３１３巻、２７７頁、１９
８５年（Ratner等）スキームに従って番号を付けてあ
る）。この領域のアミノ酸配列はＨＩＶ分離物の全域で
変化できるが、分離物の内部に保存されたコアアミノ配
列、Ｇly−Ｐro−Ｇly（ＧＰＧ）、は１回の研究におい
てテストされた分離物の９０％以上に現われ、一方、配
列Ｇly−Ｐro−Ｇly−Ａrg−Ａra−Ｐhe（ＧＰＧＲＡ
Ｆ）は多数の共通の分離物に現われる（Aids ２巻、Ｓ
４１、１９８８年（Goudsmit,J.））。比較的少なく保
存されているアミノ酸がＧＰＧトリマーの両側に現われ
る。ＧＰＧを含む５と８との間の最少のアミノ酸がＨＩ
Ｖ中和応答を誘発するために必要であると考えられる
〔ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８６巻、６７６８頁、１９８９年
（Javaherian 等）； Res. Virol. １４０巻、４１９
頁、１９８９年（Goudsmit 等）〕。
【０００４】直鎖状の又は環状のペプチドを使用して、
ＨＩＶ中和免疫応答を発生する複合体を作ることができ
る。アミノ酸配列中の小さな分岐、例えば、アラニンに
換えてバリンの使用又はグルタミン酸塩に換えてアスパ
ラギン酸塩の使用、が同様な免疫応答を引き出すことの
できるペプチドを生じる場合がある。さらに、保存三級
構造を有するけれども分岐の一級構造を有する（一連の
環状ＰＮＤペプチド（ｃＰＮＤｓ）のような）ペプチド
は同様な免疫応答を引き起すことができる。
【０００５】ＨＩＶは細胞に結合しない形で又は細胞に
結合した形で運搬されることが知られているので、ペプ
チジルエピトープはＢ−細胞及びＴ−細胞媒介免疫応答
の両方、例えば抗体産生及び抗体依存性細胞の細胞毒、
を引き起すことができることが抗ＨＩＶ免疫原として有
用であるための不可欠の条件である。上述の８he gp１
２０領域からのペプチド配列は両方の型の免疫応答を含
むことができることが示されている〔ＡＩＤＳ ２巻、
Ｓ４１、１９８８年（Goudsmit, J.）〕。
【０００６】さらに、有用な抗ＨＩＶワクチンを発生さ
せるために、ＰＮＤペプチド（それ自体では一般にあま
り免疫原性がない）をしばしば再生かつ定量できる様式
でキャリヤーに複合体化しなければならない。複合体に
されていないペプチドは、Ｂ−細胞媒介抗体産生の良質
でない誘発剤であるばかりでなく、それらはまた予防Ｔ
−細胞応答の弱い誘発剤である。本発明はこれらの問題
点をＰＮＤペプチドと免疫向上剤の新規な免疫学的複合
体を提供することによって解決した。
【０００７】Marburg 等の米国特許第４，６９５，６２
４号には、ハエモフィルス インフルエンザエ（Haemop
hilus Influenzae）ｂカプセル状ポリサッカライド、ポ
リリボシル リビトール ホスフェート（ＰＲＰ）、を
ネイセリア メニンギチヂス（Neisseria meningitidi
s）のＯＭＰＣへ共有結合させるための複合化学が開示
されている。その複合体は抗ＰＲＰ免疫応答を引き出す
ことができかつハエモフィルス インフルエンザエｂ感
染を予防するための免疫原として有用であった。本発明
の複合体は米国特許第４，６９５，６２４号の複合体に
は存在しないＨＩＶ ＰＮＤペプチドに対する完全に新
規な免疫応答を生じる。
【０００８】本発明の新規な複合体は、複合体のペプチ
ジル部分に対する哺乳動物の免疫応答を誘発するために
有用である。複合体のペプチド成分がＨＩＶ ＰＮＤペ
プチド、又はＨＩＶ ＰＮＤペプチドを認識する免疫応
答を誘発することができるペプチドを表わす場合、この
複合体は哺乳動物に抗ＨＩＶ ＰＮＤペプチド抗体を誘
発するために、哺乳動物にＨＩＶを中和する抗体を誘発
するために、またはＨＩＶ感染またはＡＩＤＳを含む疾
患にかかる前または後にヒトにワクチンを投与するため
に有用である。
【０００９】本発明の共複合体（coconjugate)は一般構
造j （ＰＥＰ−Ａ−）−ＰＲＯ−（−Ｂ−ａ- ）x を有するか、又はその製薬上許容し得る塩である。式
中：ＰＥＰはＨＩＶ ＰＮＤペプチド、すなわちＨＩＶ
ＰＮＤを認識する哺乳類の免疫応答を生起し得るペプ
チドであり；ＰＲＯは免疫原性のタンパク質又は複合タ
ンパク質、好ましくはナイセリア・メニンギチジス（Ne
isseria meningitidis）ｂの外膜複合タンパク質（ＯＭ
ＰＣ）であり；−Ａ−は共有結合、好ましくは二種間ス
ペーサー（bigeneric spacer）であり；−Ｂ−は共有結
合であり；−ａ- は生理的 pH においてアニオン性もし
くはポリアニオン性を有する低分子量部分であって、１
乃至５個のカルボン酸、スルホン酸もしくはホスホン酸
のアニオン形残基を有し；ｊはペプチド負荷であって、
共複合体中のペプチドの質量パーセントを表わし、複合
体中の全タンパク質質量の１％乃至９０％、好ましくは
１％乃至５０％であり；ｘは共複合体中の−Ｂ−ａ- の
モル数であって、好ましくはｍの１％乃至９０％、最も
好ましくはｍの１０％乃至５０％であり；ｍは複合（co
njngation)の前の免疫原性タンパク質ＰＲＯ中の反応性
求核官能部位のモル量である。
【００１０】本発明の共複合体は、タンパク質中に見ら
れる利用可能な求核官能部位“ｍ”たとえばリシンのア
ミノ基、ヒスチジンのイミダゾール基、又はセリン、ト
レオニンもしくはチロシンのヒドロキシル基などを利用
する方法で製造される。この方法は、順序、活性化法、
並びにタンパク質、ペプチド及びアニオン性基が異なり
得るいくつかのやり方で実施できる。この方法は： 方法１： １ａ） タンパク質の求核基を試薬たとえばＮ−アセチ
ルホモシステインチオラクトンと反応させてタンパク質
にチオール基を生成させ、 １ｂ） 工程１ａからのタンパク質のスルフヒドリル基
の一部を生理的 pH において負の荷電を有するアニオン
および求電子部位を含む試薬たとえばマレイミドアルカ
ン酸と反応させ、 １ｃ） 工程１ｂの生成物を予め求電子基をつけて誘導
体化したペプチドと反応させるか； 方法２： ２ａ） タンパク質の求核基を二官能性求電子試薬たと
えばマレイミドアルカン酸ヒドロキシスクシンイミドエ
ステルと反応させて求電子タンパク質を生成させ、 ２ｂ） 工程２ａの生成物の求電子部位の一部を求核部
位およびアニオンの両方を含む試薬たとえばα−メルカ
プト酢酸と反応させ、 ２ｃ） 工程２ｂの生成物を求核部位たとえばチオール
基を含むペプチドと反応させるか；又は 方法３： ３ａ） タンパク質の求核基の一部を求電子部位および
アニオンもしくはアニオン発生部（incipient anion)の
両方を含む試薬たとえばＮ−（ブロモアセチル）−６−
アミノカプロン酸又はコハク酸無水物と反応させ、 ３ｂ） 工程３ａの生成物の求核基の残りを試薬たとえ
ばＮ−アセチルホモシステインチオラクトンと反応させ
てタンパク質上にチオール基を生成させ、 ３ｃ） 工程３ｂの生成物を予め求電子基（好ましくは
マレイミドなど）をつけて誘導体化したペプチドと反応
させるか；又は 方法４： ４ａ） タンパク質の求核基の一部を求電子部位および
アニオンもしくはアニオン発生部の両者を含む試薬たと
えばＮ−（ブロモアセチル）−６−アミノカプロン酸又
はコハク酸無水物と反応させ、 ４ｂ） 工程４ａの生成物上の残りのタンパク質求核基
を二官能性求電子試薬たとえばマレイミドアルカン酸ヒ
ドロキシスクシンイミドエステルと反応させてそのタン
パク質上に求電子部位をつけ、 ４ｃ） 工程４ｂの生成物を求核基を含むペプチドたと
えばチオールと反応させることから成る。
【００１１】これらの方法はいずれも、免疫原性タンパ
ク質上に負の荷電およびペプチドをつけ、それぞれ異な
る理化学特性たとえば溶解度や凝集傾向を有する複合体
を生成させる。
【００１２】したがって、本発明の目的は、高い免疫原
性を示し、哺乳動物中に対してそのペプチジル部分に存
在するエピトープに特異的な免疫応答を生起しうる共複
合体を提供することである。別の目的は、ペプチド−タ
ンパク質複合体のペプチド部分がＨＩＶ主要中和決定基
を認識する哺乳動物の免疫応答を顕在化しうる共有結合
性の共複合体免疫原を提供することである。さらに別の
目的は、ヒト免疫不全ウイルスを中和する哺乳動物の抗
体応答を生起しうる共複合体免疫原を提供することであ
る。さらに別の目的は、水性媒体に可溶な共有結合性の
ペプチド−タンパク質複合体を高収率で生成する方法を
提供することである。さらに別の目的は、そのような共
複合体免疫原を用いて哺乳動物受容体に抗ペプチド、抗
ＨＩＶ、またはＨＩＶ中和免疫応答を生起することであ
る。さらに別の目的は、本発明の共複合体を含有するワ
クチン製剤を使用してＨＩＶ感染やＡＩＤＳなどの病気
にかかる前あるいはすでにかかったヒトを免疫化するこ
とである。
【００１３】定義及び略記号 ＡＡアッセイ ペプチド又はタンパク質を酸で加水分解して遊離アミ ノ酸とした後に定量する、アミノ酸分析法 Ａcm アセトアミドメチル；チオール保護基 活性化 ペプチド、タンパク質又はアニオン性部分を、その部 分を誘導体化できる試薬と反応させて、その後に起こ る望ましい反応を可能にすること エイズ（ＡＩＤＳ） 後天性免疫不全症候群 アミノ酸 酸性官能基とアミノ官能基の両方を有する分子；一般 式 H2N-CHR-COOH のよく知られたα−アミノ酸が２０ 種類あるが、式中のＲ基がこのアミノ酸の種類を決定 する；これらのアミノ酸は、立体化学的形態としてＤ 体又はＬ体のいずれかを有するが、小文字１字の省略 記号又はアミノ酸名の前の接頭辞「Ｄ−」によってと くに明記されない場合には、アミノ酸は天然あるいは Ｌ体である。このよく知られた２０種類のアミノ酸の 名称及びＲ基の式は、本明細書では以下の表に従がっ て１文字の符号で表わす、すなわち：アミノ酸名 ３文字コード １文字コード 側鎖（Ｒ） アラニン Ａla Ａ -CH3 アルギニン Ａrg Ｒ -(CH2)3NHCHNH2NH2 + アスパラギン Ａsn Ｎ -CH2CONH2 アスパラギン酸 Ａsp Ｄ -CH2COOH システイン Ｃys Ｃ -CH2SH グルタミン酸 Ｇlu Ｅ -(CH2)2COOH グルタミン Ｇln Ｑ -(CH2)2CONH2 グリシン Ｇly Ｇ -H ヒスチジン Ｈis Ｈ -CH2-イミダゾール イソロイシン Ｉle Ｉ -CH(CH3)CH2CH3 ロイシン Ｌeu Ｌ -CH2CH(CH3)2 リシン Ｌys Ｋ -(CH2)4NH3 + メチオニン Ｍet Ｍ -(CH2)2SCH3 フェニルアラニン Ｐhe Ｆ -CH2-フェニル プロリン Ｐro Ｐ -α, N-(CH2)3 セリン Ｓer Ｓ -CH2OH トレオニン Ｔhr Ｔ -CH(OH)CH3 トリプトファン Ｔrp Ｗ -CH2-インドール チロシン Ｔyr Ｙ -CH2-フェニル-OH バリン Ｖal Ｖ -CH(CH3)2 抗体 ホ乳類のＢ細胞が作る、特定の抗原と結合することが できるタンパク質 ＡＲＣ エイズ関連症候群 ＡＺＴ アジドチミジン；抗エイズ化合物 ２種間スペイサー 別々に誘導した部分を反応させた結果生ずる分子鎖又 は抱合体であり、このスペイサーを用いて形成した複 合体を分析のために分解すると、スペイサーが遊離し てそれを定量することができるので、共有結合の程度 を測定できる。 ＢＯＰ ベンゾトリアゾール−１−イルオキシトリス−（ジメ チルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロリン酸塩 キャッピング 低分子との反応によって複合体上の反応性部位をなく すこと Ｃbz ベンジルオキシカルボニル 複合体 共有結合したそれぞれ独立した化学物質から成る複合 （conjugate) 体であり、少なくとも１つの化学物質は望ましい抗原 （たとえばＨＩＶ ＰＮＤ）であり、もう一方の化学 物質は担体である 共複合体 担体に共有結合した抗原に加えて、その担体に共有結 （coconjugate) 合した低分子量アニオンを有する複合体；この用語は 単に複合体（conjugate)と省略形で用いられることが ある。 コアアミノ酸 ホニュウ類のＨＩＶ中和免疫応答を誘導するのに不可 欠な、ＨＩＶ ＰＮＤのアミノ酸 ＤＰＰＡ ジフェニルホスホリルアジド ＥＬＩＳＡ 酵素免疫吸着アッセイ Ｆmoc ９−フルオレニルメチルオキシカルボニル ＨＩＶ ヒトの免疫不全ウイルス、レンティ・ウイルス群の１ 種であり、エイズ及びそれに関連した症候群に関する 病因だと言われている。ＨＩＶは、また、ＨＴＬＶ（ ヒトＴ細胞リンパ球性ウイルス）、ＬＡＶ（リンパ節 腫張関連ウイルス）及びＡＲＶ（エイズ関連ウイルス ）としても知られている ＨＩＶ病 ＨＩＶ感染にまつわるものとして知られる何らかのあ るいはいくつかの生理学的機能不全の存在によって特 徴づけられる臨床的に認識される病気状態 免疫原 ホ乳類の免疫応答の刺激物質として有用な分子 免疫学的に等価 同じペプチドエピトープを認識することのできる抗体 なペプチド のように、ホ乳類のＨＩＶ中和免疫応答を誘導する働 きを共通に有する環状又は鎖状ペプチド ループアミノ酸 ペプチド環を形成する環状ＨＩＶ ＰＮＤ中のコアア ミノ酸を含むアミノ酸 標識アミノ酸 ＡＡアッセイにおいて、他のペプチド又はタンパク質 アミノ酸の作るシグナルの妨害を受けることのないシ グナルを有するアミノ酸、たとえばノルロイシン、オ ルニチン、β−アラニン、γ−アミノ酪酸。 Ｍtr ４−メトキシ−２，３，６−トリメチルフェニルスル ホニル ＮＥＭ Ｎ−エチルマレイミド ＯＭＰＣ 髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）の外膜複合タン パク質、免疫増強剤及びペプチドの担体として用いる ペプチド アミド（ペプチド）結合でつながったアミノ酸のポリ マー ＰＥＰ ペプチド ＰＮＤ 主要中和決定基：ＨＩＶ中和抗体に結合することがで きて、ＰＮＤを有する免疫原の接種に際してホ乳類の 受容者のＨＩＶ中和抗体を高めることができるペプチ ジル配列に対する名称 Ｐn Ｐs 連鎖球菌（Streptocococcus pnenmoniae）の莢膜多糖 ；この後に番号が続く場合には（たとえばＰn Ｐs ６ Ｂ）、その番号は当該菌の株を示す。 ＰＲＯ 免疫原タンパク質 タンパク質 大きなペプチド ＰＲＰ リン酸ポリリボシルリビトール 樹脂 固相合成用の固体支持体マトリクス Wang： ４−（ヒドロキシメチル）フェノキシメチルをコポリ スチレン−１％ジビニルベンゼン樹脂に結合させる、 これをバッチＦmoc 固相ペプチド合成に用いる、最後 に９５％ＴＦＡで樹脂より切断をして、同時に酸に反 応する側鎖保護基を脱保護する； Sasrin： ４−（ヒドロキシメチル）−３−メトキシフェノキシ メチルをコポリスチレン−１％ジビニルベンゼン樹脂 に結合し、これをバッチＦmoc 固相ペプチド合成に用 いて、最後に１％のＴＦＡ／CH2Cl2で樹脂より切断し て、残っている酸に不安定な側鎖保護基をとりのぞく ； Pepsyn KA ： ４−（ヒドロキシメチル）フェノキシメチルを、微粒 珪藻土に吸着させたポリアミド樹脂に結合し、これら 連続フローカラムＦmoc 固相ペプチド合成に用いる。 ペプチドは前記 Wang の樹脂と同様にして樹脂より切 りはなす； Pepsyn KH ： ４−（ヒドロキシメチル）−３−メトキシメチルを、 微粒珪藻土に吸着させたポリアミド樹脂に結合し、Ｆ moc 固相ペプチド合成に用いる、側鎖を保護したペプ チドを、 Sasrin 樹脂について述べたように樹脂から 切りはなす； ＳＣＭＨＣ Ｓ−カルボキシメチルホモシステアミン、共複合体免 疫原の分解により放出される、ＡＡアッセイで定量可 能な、酸に安定な二種間スペイサー； ＳＣＭＣ Ｓ−カルボキシメチルシステアミン、共複合体免疫原 の分解により放出されるＡＡアッセイで定量可能な、 酸に安定な二種間スペイサー； Ｚ ベンジルオキシカルボニル
【００１４】本発明の新規な共複合体 (coconjugate)
は、免疫原性タンパク質好ましくはナイセリア・メニン
ギチジス（Neisseria Meningitidis）ｂの外膜複合タン
パク質（ＯＭＰＣ）が、共有結合によりアニオン性部分
及びＨＩＶＰＮＤペプチドと結合したものである。
【００１５】この複合体は、活性化した上記ペプチド及
び酸性成分を活性化した上記タンパク質に共有結合でつ
なぐという方法で作られる。ペプチド、タンパク質及び
酸性成分は別々に活性化して求電子性もしくは求核性の
側基をつけ、それらが接触したときにペプチドとタンパ
ク質の間及び酸性成分とタンパク質の間に共有結合が形
成されるようにする。
【００１６】前記一連の反応の結果として得られる共有
結合性（covalent）共複合体においては、複数のペプチ
ド及び複数の酸性成分が免疫原性タンパク質の基礎の上
に適宜構築されていてもよい。
【００１７】上記ペプチド成分がＨＩＶ中和免疫応答を
誘発し得る場合には、本発明の複合体は、その免疫学的
有効量を必要に応じて免疫調整用抗ウイルスもしくは抗
菌化合物とともに哺乳動物に投与することができ、複合
体のペプチジル部分に対する動物の免疫応答を誘発した
り、動物中にＨＩＶ中和抗体を誘発したり、ヒトがＨＩ
Ｖに感染してＡＩＤＳ等の病気にかかるのを予防した
り、ＨＩＶ感染やＡＩＤＳ等の病気を患ったヒトに投与
したりするのに有用である。
【００１８】本発明の共複合体は一般構造j （ＰＥＰ−Ａ−）−ＰＲＯ−（−Ｂ−ａ- ) x を有し、あるいは製薬上許容し得るその塩である。式
中：ＰＥＰはＨＩＶＰＮＤペプチド、すなわちＨＩＶＰ
ＮＤを認識する哺乳動物の免疫応答を生起し得るペプチ
ドであり；ＰＲＯは免疫原性のタンパク質もしくは複合
タンパク質、好ましくはナイセリア・メニンギチジス
（Neisseria Meningitidis）ｂの外膜複合タンパク質
（ＯＭＰＣ）であり；−Ａ−は共有結合連結、好ましく
は二種間スペーサー（bigeneric spacer）であり；−Ｂ
−は共有結合連結であり；−ａ- は生理学的pHにおいて
アニオン性を有する低分子量部分であって、好ましくは
カルボン酸、スルホン酸及びホスホン酸のアニオン形の
１乃至５個の残基であり；ｊは共複合体中でのペプチド
の質量パーセントであって、好ましくは複合体中のタン
パク質の全質量の１％乃至５０％であり；ｘは共複合体
中での−Ｂ−ａ- のモル数であって、好ましくはｍの１
％乃至９０％、最も好ましくはｍの１０％乃至５０％で
あり；ｍは複合前の免疫原性タンパク質ＰＲＯ中の反応
性求核官能部位のモル量である。
【００１９】本発明の共複合体は、タンパク質中の利用
可能な求核官能部位ｍを利用する方法によって作られ
る。どの様なタンパク質にも求核官能基（Ｆ）n がある
ところ、ｍは反応に利用可能で且つ求核性を有するよう
な官能基の部分集合であり、たとえばリシンのアミノ
基、ヒスチジンのイミダゾール基、あるいはセリン、ト
レオニンまたはチロシンのヒドロキシル基等である。実
際には、ｍの値は、Ｎ−アセチルホモシステインチオラ
クトンでチオール化した後、Ellman検定〔Ellman，G.
L.，Arch. Biochem. Biophys.,８２，７０（１９５
９）〕で全遊離スルフヒドリル基を定量するか、あるい
はアミノ酸分析で検定できるブロモアルキルアミノ酸で
アルキル化することにより定められる。ｊの値はペプチ
ドの分子量を通じてｍ及びｘと関係している。すなわ
ち、 ｊ＝（ペプチドの分子量）（ｍ−ｘ）／（共複合体タン
パク質の全量） である。すなわちｊは共複合体タンパク質の全量に対す
る質量％である。
【００２０】共複合体の製造は、順序、活性化方法、な
らびにタンパク質、ペプチド及びアニオン性基の反応を
異にする幾つかのやり方で実施できる。次の様な工程を
含み得る： 方法１ １ａ） タンパク質の求核基をＮ−アセチルホモシステ
インチオラクトンの様な試薬と反応させてタンパク質上
にチオール基を生成させ、 １ｂ） 工程１ａからのタンパク質のスルフヒドリル基
の一部をマレイミドアルカン酸、ブロモ酢酸、ブロモア
セチル−６−アミノヘキサン酸、ヨード酢酸あるいは
−プロピオラクトンの様な求電子部位及び生理学的pHに
おいて負の荷電を有するアニオンを含む試薬と反応さ
せ、 １ｃ） 工程１ｂの生成物を予め求電子基を付けて誘導
体化したペプチドと反応させる。本発明の一つの好適な
態様がこの方法によって作られ、それは構造
【化２２】 を有し、あるいは製薬上許容し得るその塩である。式
中：ＰＥＰ、ＰＲＯ、ｊ、ｍ及びｘは上記に定義した通
りであり；（Ｆ）n-m はＰＲＯ上における官能基Ｆn の
全数から誘導体化された官能基の数ｍを引いたものであ
り；−Ｒ−は： ａ） −低級アルキル−、 ｂ） −置換低級アルキル−、 ｃ） −シクロアルキル−、 ｄ） −置換シクロアルキル−、または ｅ） −フェニル−、 であり；−Ｒ1 は： ａ） −水素、 ｂ） −低級アルキル、または ｃ） −SO3H； であり；−Ｓ−はイオウであり；−ａ- は低分子量アニ
オンまたはカルボン酸、スルホン酸もしくはホスホン酸
から選ばれる５つ以下の残基からなるポリアニオンであ
る。低級アルキルとは１乃至８個の炭素原子を有する直
鎖状または有枝鎖状のアルキルである。置換低級アルキ
ル及びシクロアルキルは、−NH2 、−NHCOCH3 、アルキ
ルアミノ、カルボキシ、カルボキシ低級アルキル、スル
ホノまたはホスホノ置換基を有することができる。
【００２１】同様に、構造
【化２３】 （式中のすべての記号は前記に定義した通りである。）
を有する本発明の好ましい態様は次の方法２によって作
られる。この方法では： ２ａ） タンパク質の求核基をマレイミドアルカン酸ヒ
ドロキシスクシンイミドエステルの様な二官能性の求電
子試薬と反応させて求電子タンパク質を生成させ、 ２ｂ） 工程２ａの生成物の求電子部位の一部を −メ
ルカプト酢酸、２−メルカプトエチルスルホン酸、２−
メルカプトコハク酸、２−メルカプトエチルホスホン
酸、３−メルカプトプロピオン酸、または２−メルカプ
ト安息香酸の様な求核部位及びアニオンを有する試薬と
反応させ、 ２ｃ） 工程２ｂの生成物をチオール基の様な求核部位
を含むペプチドと反応させる。
【００２２】同様に、構造
【化２４】 （式中、Ｒ2 はカルボニル、低級アルキルまたは低級ア
ルキルアシルアミノであり、他のすべての記号は前記に
定義した通りである。) を有する本発明の好適な態様は
次の方法３によって作られる。この方法では： ３ａ） タンパク質の求核基の一部をＮ−（ブロモアセ
チル）−６−アミノカプロン酸、無水グルタル酸、無水
トリカルバリル酸、無水ヘミメリト酸、無水ピロメリト
酸、無水フタル酸、ヨード酢酸、グリオキシル酸ナトリ
ウムシアノボロヒドリド、４−カルボキシベンズアルデ
ヒド−ナトリウムシアノボロヒドリド、無水スルホ酢酸
または無水コハク酸の様な求電子部位及びアニオンもし
くはアニオン発生部を含む試薬と反応させ、 ３ｂ） 工程３ｂの生成物上の残りの求核基をＮ−アセ
チルホモシステインチオールラクトンの様なタンパク質
上にチオール基を生成する試薬と反応させ、 ３ｃ） 工程３ｂの生成物を予め求電子基好ましくはマ
レイミドを付けて誘導体化したペプチドと反応させる。
【００２３】構造
【化２５】 を有する本発明の共複合体の別の好適な態様は次の方法
４によって作られる。この方法では： ４ａ） タンパク質の求核基の一部をＮ−（ブロモアセ
チル）−６−アミノカプロン酸、無水グルタル酸、無水
トリカルバリル酸、無水ヘミメリト酸、無水ピロメリト
酸、無水フタル酸、ヨード酢酸、グリオキシル酸ナトリ
ウムシアノボロヒドリド、４−カルボキシベンズアルデ
ヒド−ナトリウムシアノボロヒドリド、無水スルホ酢酸
または無水コハク酸の様な求電子部位及びアニオンもし
くはアニオン発生部を含む試薬と反応させ、 ４ｂ） 工程４ａの生成物上の残りのタンパク質求核基
をマレイミドアルカン酸ヒドロキシスクシンイミドエス
テルの様な二官能性の求電子試薬と反応させてタンパク
質上に求電子部位を付け、 ４ｃ） 工程４ｂの生成物をチオールの様な求核基を含
むペプチドと反応させる。
【００２４】上記方法はいずれも、免疫原性タンパク質
上に負の荷電及びペプチドを付け、それぞれ異なる理化
学的特性例えば溶解度及び凝集傾向を有する複合体を作
るものである。
【００２５】方法１のきわめて好ましい態様を下記及び
図式１に詳細に述べる。図式にしたがえば免疫原性タン
パク質はナイセリア・メニンギチジス（Neisseria Meni
ngitidis）の外膜複合タンパク質（ＯＭＰＣ）である
が、他の免疫原性タンパク質を用いてもよい。この方法
では： ａ１） 全部でｎモルの求核基（リシンやアミノ末端に
由来する遊離のアミノ基等）を有するＯＭＰＣ（Ｉ）を
チオール化剤好ましくはＮ−アセチルホモシステインチ
オラクトンと反応させて親硫剤(thiophile) との反応に
利用できるスルフヒドリル基をｍモル有するＯＭＰＣ−
ＳＨ(II)を生成させ、 ａ２） 工程ａ１でＯＭＰＣに付けられた利用可能なス
ルフヒドリルの数を好ましくはEllman検定により定量し
てｍの値を定め〔Ellman，G. L., Arch. Biochem. Bioc
hem. Biophys.,８２，７０（１９５９）〕； ｂ） 工程ａ１の生成物を親硫反応に関与しないアニオ
ン性基を有する親硫剤ｘモルと反応させ〔この場合の濃
度は例えばEllman消光検定で定めることができる。好ま
しくはマレイミド−Ｒ−酸（マレイミド−Ｒ−ａ- ）を
用いる（Ｒ及び−ａ- は上記に定義した通りである）。
特に好ましいのはマレイミドエタンホスホン酸、マレイ
ミドエタンスルホン酸、マレイミドグルタル酸、マレイ
ミドコハク酸であり、最も好ましいのはマレイミドプロ
ピオン酸である。ｘはｍの１％乃至９０％好ましくは１
０％乃至５０％であり、かくして（ｍ−ｘ）モルの反応
性スルフヒドリルが親硫剤との反応後にＯＭＰＣ(III)
上に残存することになる。〕； ｃ） 工程ｂの生成物を予め求電子基、好ましくはマレ
イミドアルカン酸、最も好ましくはマレイミドプロピオ
ン酸を付けて誘導体化したＨＩＶＰＮＤの過剰量（＞ｍ
−ｘ）と接触させて本発明の共複合体(IV)を生成させる
〔上記誘導体化は誘導化すべきでないペプチド上の全ア
ミノ基をＮ保護した後に、遊離ペプチドアミノ基を二官
能性の試薬、好ましくはマレイミドアルカノイルオキシ
スクシンイミド、最も好ましくはマレイミドプロピオニ
ルオキシスクシンイミドと反応させることにより行うこ
とができる。〕。
【００２６】共複合体生成物はその特徴的な理化学的特
性を利用する多くの方法により精製することができる。
例えば、共複合体をイオン強度が０．００１乃至１Ｍで
pHが６乃至１０であるような緩衝液中、好ましくはイオ
ン強度が０．０１乃至０．１ＭでpHが６乃至１０である
ような水性媒体中で精製することができる。上記に代
え、もしくは加えて、共複合体を超遠心して上澄液を捨
てることにより濃縮精製してもよい。共複合体は生理学
的に許容される緩衝液中に再懸濁させ、必要により無菌
濾過することができる。
【化２６】
【００２７】ｘ対ｍの好ましい比は、複合体の沈殿が生
ずるまでアニオンの量をだんだんと減らしていきながら
（すなわちｘの値を下げていきながら）複合体を調製す
ることにより定められる。
【００２８】上記及び図式Ａに示した方法を改変して、
免疫原性タンパク質をマレイミド誘導体の様な親硫剤と
共有結合するように誘導体化し、ペプチド及び低分子量
アニオン−ａ- を遊離スルフヒドリルと共有結合するよ
うに活性化してもよい。この変法及び他の変法（前記し
た方法３及び方法４を含む）は当然に本発明の範囲に含
まれるものであり、またこれらの方法の様々な改変、例
えば活性種の反応順序や反応体の比を代えたりしたもの
も本発明に含まれる。
【００２９】本発明の複合体を作る方法はペプチド−タ
ンパク質複合体が所望され、特にペプチドの免疫原性を
高めたいような場合におけるあらゆる共複合体の製造に
適用することができる。またこの方法は水性媒体中にお
けるペプチド−タンパク質複合体の溶解度が通常きわめ
て低い場合に特に有効である。ここに開示された特徴的
な方法がなければ、ＨＩＶＰＮＤペプチドとＯＭＰＣと
の複合体は水性媒体にきわめて溶けにくいため、収率は
低く、精製物の無菌濾過は行えず、複合体化の過程にお
ける操作そのものも困難となる。
【００３０】ここに記載された複合体は不活性な担体と
の組成物中に含有され、適切に調剤すればワクチンとし
て有用である。この調剤とは、投与に先立ちワクチン製
造分野で知られたようにミョウバンに吸着させる、ある
いは懸濁剤やアジュバントと組み合わせることを含むこ
とができる。本発明の共有結合複合体化した免疫原の使
用方法は、 （ａ）ＨＩＶ ＰＮＤペプチドの構造と機能の関連を調
べるために実験室で用いる： （ｂ）ほ乳動物中に免疫原として投与してＨＩＶ中和抗
体を誘導し、その抗体を単離して、ＨＩＶ感染の予防、
感染後のＨＩＶ増殖の阻止、あるいはエイズを含むＨＩ
Ｖの感染や疾患に苦しむ人の治療をするためにヒトに投
与する： （ｃ）ヒトをＨＩＶ感染に対して免疫するため、またＨ
ＩＶ感染後のヒトを治療するため、またエイズを含むＨ
ＩＶ感染や疾患の患者に追加抗原刺激をおこなってＨＩ
Ｖ中和免疫反応を高めるためのワクチンとして用いる：
ことを含む。
【００３１】実験室的に使用する場合、動物に投与して
抗ＰＮＤペプチド、抗ＨＩＶ抗体、抗ＨＩＶ中和免疫反
応を誘導するのに有用である。この動物は共有結合複合
体で追加抗原刺激を行ない、免疫反応を高めることがで
きる。このような動物から抗体を単離するには、当分野
で知られた方法に従い動物を瀉血し、血液を遠心して細
胞成分を血清から分離し、必要ならば血清から抗体蛋白
を単離する。このような抗体あるいは抗血清は、動物中
に抗ＰＮＤペプチド、抗ＨＩＶ、ＨＩＶ中和抗体を誘導
する際の、複合体中のＨＩＶ ＰＮＤペプチドの効率を
明らかにするために用いることができる。抗ペプチド抗
体の誘導を測定するためのインビトロのアッセイには、
遊離のペプチドと抗血清を用いたＥＬＩＺＡアッセイが
有用である。インビトロで抗血清のＨＩＶ中和能を測定
するには、生きているＨＩＶと抗血清標品を一緒にイン
キュベートし、ついでこのＨＩＶ標品をＣＤレセプター
を有する細胞とインキュベートして抗血清による細胞の
保護の程度を測定する。これらのアッセイおよび所定の
共複合体の投与によって産生された抗血清はＰＮＤペプ
チドの構造と機能の関連を研究するためにもちいること
ができる。
【００３２】上述したように共複合体はほ乳動物の抗体
産生反応を誘導するのに有用で、このような抗体はＨＩ
Ｖ感染の予防、感染後のＨＩＶ増殖の阻害、あるいはエ
イズを含むＨＩＶの感染や疾患の患者の治療をするため
にヒトに投与して受動免疫を与えるために用いることが
できる。
【００３３】この共複合体はヒトをＨＩＶ感染に対して
免疫するため、またＨＩＶ感染後のヒトを治療するた
め、またエイズを含むＨＩＶ感染や疾患の患者に投与す
るワクチンとして有用であり、またＨＩＶウイルス陽性
血清の評価を得たヒトにワクチンとして投与するために
有用である。この共複合体は、ＡＺＴのような他の抗Ｈ
ＩＶ化合物、あるいはもっと一般的な抗ウイルス剤、抗
生物質、免疫調節剤（下記表Ｉ参照）と一緒に投与する
ことができる。
【００３４】ワクチン内の免疫原は様々な分子構造をと
ることができる。抗原性共複合体ＩＶの単一分子種はエ
イズあるいはＡＲＣを含むＨＩＶ疾患の予防および治療
に有用かつ適切な抗原として、十分なことが多い。カク
テルの形での他の抗原もまた有用であり、このカクテル
はペプチド／全蛋白の質量比がことなる複合体の混合物
からなる。加えて、混合物中の複合体はＰＮＤのアミノ
酸配列が異なることができる。
【００３５】免疫学的ベクター、キャリヤーあるいはア
ジュバントを免疫学的賦形剤として、従来の免疫学的研
究、実施にしたがって加えることができる。本発明のワ
クチンの製造のさいに、アジュバントは加えても加えな
くても良い。ミョウバンがヒト用のワクチンには典型的
かつ好ましいアジュバントであり、揺変性かつ粘性で均
一な水酸化アルミニウムゲルの形が好ましい。例を挙げ
ると本発明の１実施態様は、賦形剤としてミョウバンを
用い、選ばれた免疫原すなわち抗原のセットとして複合
体のカクテルを用いて、患者に予防接種するものであ
る。
【００３６】本発明のワクチンは、表Ｉの他のエイズ抗
ウイルス剤、免疫調節剤、抗生物質、ワクチンの有効量
と組み合わせて、感染暴露の前あるいは後に効果的に投
与することができる。（原典：Market Letter １１月３
０日号、２６−２７頁（１９８７）、Genetic Engeneer
ing News８巻、２３頁（１９８８年１月）） 表１ Ａ．抗ウイルス剤 薬剤名 製造者 適応症 AL-721 Ethigen ARC BETASERON Triton Bioscience エイズ、ＡＲＣ Ｋ
Ｓ （インターフェロンβ） ＣＡＲＲＩＳＹＮ Ｃａｒｒｉｎｇｔ
ｏｎ Ｌａｂｓ ARC （ポリマンノアセテート） CYTOVENE Syntex CMV （ガンシクロビル） DDC Hoffmann-La Roche エイズ、ARC （ジデオキシシチジン） FOSCARNET Astra AB HIV 感染、CMV （ホスホノホルメートトリナトリウム） 網膜炎 HPA-23 Rhone-Poulenc Sante HIV 感染 ORNIDYL Merrell Dow PCP （エフロルニチン） PEPTIDE T Peninsula Labs エイズ （オクタペプチド配列） RETICULOSE Advanced Viral Research エイズ、ARC （ヌクレオホスホプロテイン） 薬剤名 製造者 適応症 IR（ジドブジン、AZT) Burroughs Wellcome エイズ、進行したARC 、 小児エイズ、KS、 無症候性 HIV、 非重度 HIV、神経学的合併症 RIFABUTIN Adria Labs ARC （アンサマイシン LM427) （トリメトレキセート） Warner-Lambert PCP UA001 上野製薬 エイズ、ARC VIRAZOLE Viratek/ICN エイズ、ARC 、KS （リバビリン） WELLFERON Burroughs Wellcome KS、HIV 、 （αインターフェロン） RETROVIRと併用 ZOVIRAX Burroughs Wellcome エイズ、ARC 、 （アシクロビル） RETOROVIR と併用 − − − − − − − − − − − − − − − − − − 略号：エイズ（後天性免疫不全症候群）、ＡＲＣ（エイ
ズ関連症候群）、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス、日和
見感染をおこし、エイズ患者を失明あるいは死に至らし
める。）、ＨＩＶ（ヒト免疫不全症ウイルス、ＬＡＶ、
ＨＴＬＶ−ＩＩＩあるいはＡＲＶとしても知られる）、
ＫＳ（カポシ肉腫）、ＰＣＰ（カリニ肺炎、日和見感
染）、ＰＧＬ（持続性全身リンパ節腫脹） Ｂ．免疫調節剤 薬剤名 製造者 適応症 ABPP Upjohn 進行性エイズ、KS （ブロピリミン） AMPLIGEN DuPont ARC, PGL （ミスマッチRNA) HEM Research （抗ヒトαインターフェロン Advanced Biotherapy Concept エイズ、ARC 、KS 抗体） コロニー増殖因子（GM-CSF) Sandoz Genetics Instiute エイズ、ARC 、HIV 、 KS CL246,738 American Cynamid エイズ IMREG-1 Imreg エイズ、ARC 、PGL 、 KS IMREG-2 Imreg エイズ、ARC 、PGL 、 KS IMUTHIOL Merieux Institute エイズ、ARC （ジエチル ジチオカルバメート） IL-2 Cetus エイズ、KS （インターロイキン−２） Hoffmann-La Roche Immunex INTRON-A Schering-Plough ＫＳ （インターフェロンα） ＩＳＯＰＲＩＮＯＳＩＮＥ Newport ARC 、PG
L 、HIV （イノシンパラノベックス） 血清陽性患者 （メチオニンエンケファリン）TNI Pharmaceuticals エイズ、ARC MTP-PE Ciba-Geigy KS （ムラミル−トリペプチド） THYMOPENTIN(TP-5) Ortho Pharmaceuticals HIV 感染 （胸腺化合物） ROFERON Hoffmann-La Roche KS （インターフェロンα） （組換えエリスロポエチン） Ortho Pharmaceuticals エイズ−レトロビル 治療関連重度 貧血 TREXAN DuPont エイズ、ARC （ナルトレキソン） TNF(腫瘍壊死因子） Genentech ARC,インターフェロンγ と併用 ｃ．抗生物質 薬剤名 製造者 適応症 PENTAM 300 LyphoMed PCP （ペンタミジン イセチオネート） ｄ．ワクチン 薬剤名 製造者 適応症 Gag Merck エイズ、ARC
【００３７】本発明のワクチンを、免疫調節剤、抗生物
質、あるいはワクチンと組み合わせる範囲は上の表にあ
げたものに限定されるものではなく、原則としてエイズ
の治療に役立つ医薬組成物との組み合わせをすべて含む
ことは、理解されるであろう。本発明のエイズあるいは
ＨＩＶワクチンは、ＨＩＶ暴露前後に、ＨＩＶの感染あ
るいは疾患を予防または治療するために用いられるワク
チンであって、免疫原に特異的な免疫反応を引き起こす
ことができるものを包含する。本発明の複合体は、ワク
チンとして用いられた場合、免疫学的に有効な量を投与
される。ほ乳動物に投与して、抗ペプチド、抗ＨＩＶ、
ＨＩＶ中和性免疫反応を引き起こすには、用量として、
複合体蛋白の１μｇ−５００μｇの範囲、好ましくは５
０μｇ−３００μｇを投与する必要がある。初回の投与
後、約２週間経過後に、追加抗原刺激を行い、さらにも
う一度、血清中の抗体価が減少したさいに行なうことが
できる。複合体は筋肉内、あるいは都合の良いまたは効
率のよい経路で投与するが、濃度は１０μｇ／mlと１mg
／ml、好ましくは５０−１００μｇ／mlの間であり、合
計容量は免疫学的効力に必要とされる量とする。複合体
は水酸化アルミニウムゲルまたはRibiアジュバント（Ｇ
Ｂ ２２２０２１１Ａ，ＵＳ 優先権２１２，９１９
（１９８８年６月２９日出願）にあらかじめ吸着させ、
注射前に滅菌生理食塩水に懸濁することができる。
【００３８】蛋白部分は免疫のエンハンサーとして働く
べきである。蛋白を選択するにあたっては、被投与者の
非特異的免疫反応の活性化（reactogenicity) を起こさ
ないものが望ましい。米国特許第４，６５９，６２４号
において、Marburg らは Neisseria meingitidisの外膜
蛋白複合体（ＯＭＰＣ）を用いてポリサッカライド−蛋
白質複合体を作成した。ＯＭＰＣは本発明においても適
していることが証明された。他の免疫原性蛋白質を用い
ることも可能である。
【００３９】グラム陰性菌からＯＭＰＣを精製する方法
はいろいろ工夫されている。Fraschら、J. Exp. Med.１
４０巻、８７頁（１９７４）、同１４７巻、６２９頁
（１９７８）, Zollinger ら、米国特許第４，７０７，
５４３号（１９８７）、Helting ら、Acta Path. Micro
biol. Scand. Sect. C. ８９巻６９頁（１９８１）、He
ltngら、米国特許第４，２７１，１４７号参照。本発明
で用いたＯＭＰＣは基本的にはHelting の方法によって
調製した。さらに、主要外膜蛋白質であるNeisseria me
ningitidisのクラス２蛋白（Murakamiら、Infection an
d Immunity, ５７巻、２３１８頁（１９８９））のよう
なＯＭＰＣのサブユニットはＨＩＶ ＰＮＤペプチドに
対するほ乳類の免疫反応を誘導するのに必要な免疫活性
促進をもたらした。これらのサブユニットは単離したＯ
ＭＰＣをかい離させても得られるし、組換えによって必
要なＯＭＰＣ免疫原性部分を発現させて生産することも
できる。ＯＭＰＣサブユニットの調製と使用方法は併願
の米国特許出願番号５５５，３２９、５５５，９７８、
および５５５，２０４に開示してある。これらの複合体
形成に用いられるＨＩＶペプチドは線状あるいは環状ペ
プチドであることができる。これら線状あるいは環状ペ
プチドはこの分野で知られた化学合成の手法を用いて、
あるいはその部分の組換え発現により、または単離され
たＨＩＶ蛋白質の断片として得ることができる。環状Ｈ
ＩＶ ＰＮＤは線状ペプチドを環化することにより合成
できる。たとえば（ａ）少なくとも２つのシステインを
含むペプチドを酸化してジスルフィド結合した環を作成
する。（ｂ）アミド結合した環を作成する。（ｃ）チオ
エーテル結合した環を作成する。このようなペプチドを
合成する方法はここに説明されるが、この説明は網羅的
あるいは限定するものではない。本発明の複合体は、構
成要素のペプチドがＨＩＶＰＮＤであり、ほ乳動物にＨ
ＩＶを認識する免疫反応を引き起こすことができるなら
ばかならず有用である。
【００４０】当分野で良く知られたＰＮＤペプチドおよ
び本発明に開示するが別に継続出願（米国特許出願番号
５５５，１１２および５５５，２２７）において特許を
請求している新規ＰＮＤペプチドはともに、ほ乳類にお
いてＨＩＶ中和免疫反応（ＨＩＶ中和抗体の産生を含
む）を誘導できるペプチド配列と定義される。
【００４１】本発明に置いて克服された主要な点は、Ｈ
ＩＶの単離株間の配列の変動である。上に定義したＰＮ
Ｄペプチドはgp１２０の三番目の超可変領域に存在し、
多くの単離株においてある種のアミノ酸は決まった位置
に存在することが見出されているが、厳密に保存された
一次配列のモチーフは存在しない。本発明においては広
範囲の保護を得るのに必要な多くの異なる単離株のＰＮ
Ｄ配列のカクテルを複合体にすることができるので、こ
の難点を乗り越えることができる。あるいは、保護範囲
の広い複合体のカクテルは、単一あるいは数種のＨＩＶ
単離株に対し保護効果のあるペプチド部分を有する複合
体を別々に作成してから混合することによっても作成す
ることができる。
【００４２】gp１２０のアミノ酸２９６から３４１の間
またはその近傍に存在するアミノ酸が、ＰＮＤを定義す
る基準に合うことが示された。ＨＩＶの単離株ＩＩＩＢ
において、４１アミノ酸配列は以下のように報告されて
いる（３文字コードとアミノ酸名は「略号および定義」
を参照）。 −INCTRPNNNTRKSIRIQRGPGRAFVTIGKIGNMRQAHCNIS − 〔２つのシステインは互いにジスルフィド結合してルー
プを形成している〕 三量体-Gly Pro Gly- はＰＮＤループの先端で露出して
いる。異なる単離株のgp１２０のこれと同一部位は山羊
やモルモットの免疫系に対し、keyhole-limpetヘモシア
ニンと複合化して投与した場合、単離株特異的中和抗体
を誘導する。上に示した４１量体配列中の主要中和エピ
トープは、ＧＰＧトリマーを囲む８アミノ酸からなる
（Javaherianら、ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８６巻、６７６８
頁（１９８９）) 。下記の表IIに、本発明の複合体に用
いられる異なる長さ、組成の線形ポリペプチドを多数示
す。表にしたペプチド配列を有するペプチドを含む単離
株の名は、参照し易くするためにそのペプチドに付けた
名称とともに記してある。各ペプチドの左側のｒの文字
はそのペプチドがＰＳＡにその位置で連結する可能性を
示している。さらに、ノルロイシンやオルニチンのよう
なマーカーアミノ酸はｒ−の一部をなすことができる。
【化２７】
【００４３】このリストは可能性のあるＰＮＤ配列を網
羅したものではなく、むしろ有用なＰＮＤ一次配列を示
唆し、説明するものである。したがってここに記載され
たように複合体として本発明の免疫原を形成するペプチ
ドは、表にあげられたどのペプチドでもよいし、これら
の配列が示唆するところの免疫学的に等価な変異体でも
よい。変異体の性質については次ぎに考察する。
【００４４】このＨＩＶ ＰＮＤの一次配列は、保存さ
れたコアアミノ酸配列を有するように見える。そのコア
アミノ酸配列は Gly-Pro-Gly-Arg（−ＧＰＧＲ−）から
なる四量体配列からなり、その両側はＨＩＶ単離株の間
で違いが大きい。単離株のいくつかは、このテトラマー
の中も異なっており、−ＧＰＧＫ−、ＧＰＧＱ−、−Ｇ
ＬＧＱ−などのコア配列を有する。これらすべての可能
性のある配列は本開示の範囲内にあり、本発明による複
合体形成に役立つペプチド配列とするものである。
【００４５】ペプチドの長さは交叉反応性の免疫反応を
促進するにあたって重要な因子である。すなわち、所定
のペプチド性エピトープに対して惹起された免疫反応
は、決定的中和エピトープのほかに同一あるいは異なる
ＨＩＶ単離株の類似のエピトープをエピトープ中のアミ
ノ酸の数に基づいて認識する。さらに、ペプチドの長さ
によって、ＨＩＶ中和反応の原因となる決定基が免疫シ
ステムに曝される確率が決まる。
【００４６】エピトープ提示の確率を最大にするため
に、ＰＮＤペプチドを所定の三次元構造に固定する化学
的手法が開発された。上記のＨＩＶ ＩＩＩＢの４１量
体アミノ酸ＰＮＤは、システイン−システイン間のジス
ルフィド結合により、１つのルプ構造をとることが知ら
れている。このジスルフィド結合は脆弱なため、ループ
が開いてペプチドが線状構造で存在する可能性がある。
したがって、線状ペプチドに加えて新規なジスルフィド
結合環状ペプチドあるいは新規な強固な環状構造を有す
るＨＩＶ ＰＮＤペプチドをここに開示し、別に遊離の
ペプチドとして米国特許出願第５５２，１１２および５
５５，２２７中に開示するが、これらペプチドはすべて
本発明の複合体形成においてＰＥＰ部分として利用でき
る。
【００４７】これらの複合体形成に用いられるペプチド
は天然の蛋白質（たとえばgp１２０）の断片として、あ
るいはその部分の組換え発現により、またはこの分野で
知られた化学合成の手法を用いて得ることができる。さ
らに新規な環状ＰＮＤはここに記載する方法により合成
することができる。配列には天然のＬ−アミノ酸でも天
然にない、すなわちＤ−アミノ酸でも含むことができ
る。さらに複合化の化学的手法は柔軟性があるので、ペ
プチド誘導化試薬を適切に選択すれば複合化は成功す
る。
【００４８】合成ペプチドは、液中や固相保持体上での
様々な手法により調製されている。基礎的な原理と技術
をカバーする優れたテキストは、「ペプチド合成の原
理」（Bodanzky, M., Springer-Verlag(１９８４））,
「固相ペプチド合成」（StwertJ.M.,Young, J.D., Pier
ce Chemical Company (１９８４第２版）、「ペプチ
ド」（Gross, E, Meienhofer, J., Academic Press（１
９７９）であるが、ここにのべるプロセスはこれらテキ
ストの記載に限定されるものではない。
【００４９】合成環状ペプチドは２組にわけて合成され
る。まず線状ペプチドを合成するには、Milligen９０５
０ペプチドシンセサイザーあるいはＡＢＩ４３１Ａペプ
チドシンセサイザーを用い、９−フルオレニルメチルオ
キシ−カルボニル（Fmoc）化学と既知の試薬である側鎖
が保護されたFmoc- アミノ酸ペンタフルオロフェニルエ
ステルを用いるか、または誘導化Wang樹脂とFmoc化学手
法および試薬としてその場で調製された側鎖が保護され
たＦｍｏｃアミノ酸対称無水物を用いた。
【００５０】つぎに線状ペプチドは液中あるいはまだ固
相に保持された状態で、環状化される。環状化は当分野
で既知の方法で行なうことができるが、その方法として
はたとえば ａ）ループを形成する予定の線状ペプチド配列の両端に
システイン残基を組み込み、既知の酸化条件下ジスルフ
ィド結合を起こさせる。 ｂ）ａ）と同様にシステイン残基を組み込んだペプチド
を調製するが、システインを遊離のスルフヒドリル基と
して保持し（あるいは脱保護されて遊離スルフヒドリル
基となるＡｃｍで保護されたチオールとして保持）、こ
のペプチドをｏ−キシレンジブロミドあるいは同様な試
薬（たとえばジイオジド、ジクロリド、ジハロゲン化さ
れたＣ2-4 の直鎖あるいは分岐低級アルキル）で処理す
る。このような試薬はシステインのイオウ原子と反応し
て環状構造を形成するがその構造中ではベンゼンまたは
アルキルに結合した２つの強固なチオエーテル結合が存
在する。 ｃ）線状ペプチドの一端のアミノ酸と他の端のアミノ酸
のカルボキシル基とをＤＰＰＡ、ＢＯＰなどのペプチド
結合形成を仲介する試薬によりアミド結合させる。これ
ら戦略のいずれも以下に詳しくとりあげるが、まずこれ
らの方法で調製した環状ペプチドの一般的な説明をす
る。
【００５１】本複合体の発明を以下のペプチドまたはそ
の製造方法に限定することなく、適当な保護基を外した
後に本発明にしたがって連結できるＰＮＤペプチドは、
ＰＥＰ構造で表わされるものを包含し、上記の表IIの線
状ペプチドおよび以下の環状ペプチドを含む：
【化２８】 〔式中ｒはＰＥＰとＰＳＡの間の連結部位であって、R1
がマーカーアミノ酸でない場合はマーカーアミノ酸１個
を意味することができる。R1は ａ）結合、または ｂ）１から５個のアミノ酸からなるペプチドであって、
アミノ酸分析スペクトル中２０個の天然アミノ酸とは離
れた場所に移動するマーカーアミノ酸を一個含むことが
できる。このマーカーアミノ酸としてはノルロイシン、
γ−アミノ酪酸、βアラニン、あるいはオルニチンが好
ましい：R2は、 ａ）R3が少なくとも２個以上のアミノ酸からなるペプチ
ドである場合、単結合あるいは１７個までのアミノ酸か
らなるペプチド、または ｂ）R3が単結合である場合は、２ないし１７個のアミノ
酸からなるペプチド： R3は。 ａ）R2が少なくとも２個以上のアミノ酸からなるペプチ
ドである場合、単結合あるいは１７個までのアミノ酸か
らなるペプチド、または ｂ）R2が単結合である場合は、２ないし１７個のアミノ
酸からなるペプチド： -GPGR-は四量体-GLyProGlyArg-： R4は、 ａ）R7がR8である場合、R7がメチン炭素に結合した-NH-
CH-CO-である、または ｂ）R7がカルボニルまたは -COCH2CH2CH(CONH2)NHCO- の場合、R3からR7およびR5への単結合である：R5は ａ）マーカーアミノ酸をふくむことができる１個ないし
５個のアミノ酸からなるペプチド、 ｂ）-OH 、 ｃ）-COOH 、 ｄ）-CONH2、 ｅ）-NH2、または ｆ）存在しない、 である：R6は ａ）R7に対する任意の結合( ．．．．．．．）が存在し
ない場合、通常のＬ−またはＤ−アミノ酸の側鎖から選
択されるアミノ酸側鎖（定義および略号の表参照）、 ｂ）R7がR8の場合、-R8-S-S-または-R8-S-R8-R9-R8-S-
、 ｃ）R7が
【化２９】 場合、-R8-NH- である。R7は ａ）-R8-
【化３０】 R8は単結合あるいは１ないし８個の炭素の低級アルキル
である。R9は ａ）R10 、あるいは ｂ）キシレンである。 R10 は ａ）低級アルキル、または ｂ）-CH2-O-CH2- である： ここで基は互いに独立であり、ペプチドがアミノ酸の末
端アミノ基を保護して合成された場合、アミンの保護基
であるベンジルオキシカルボニル（Ｚ）あるいはスルフ
ヒドリル基の保護基であるアセトアミドメチル（Acm)の
ような末端アミノ保護基は当分野で知られた方法および
ここに例示された方法にしたがって除去することができ
る。脱保護されて露出した基は、リンカーｒを介して免
疫原性蛋白質との連結結合形成に用いることができる。
【００５２】以降、ＰＮＤペプチドのコアを形成し、環
状ペプチドでループを形成することになるアミノ酸配
列、-R2-GPGR-R3-、のことをループアミノ酸という。し
かしR6とT7の間の任意結合が存在しない場合、構造ＰＥ
Ｐは線状で、表IIの全線状ペプチドをさす。
【００５３】ペプチドが環状であれ線状であれ、ＰＥＰ
のR2およびR3を意味するアミノ酸配列は、表II中の-GPG
R-コア四量体を囲む配列を含めてどのアミノ酸の組み合
わせでもよい。したがって-R2-GPGR-R3-であらわされる
コアアミノ酸はさらに進んで下記のコアアミノ酸構造を
有するものと定義することができる。 -Xn X1X2-GPGR- X3X4Xm - 式中-GPGR-は四量体 -GlyProGlyArg- であるX1はR2の構
成体で下記から選ばれる： ａ）セリン ｂ）プロリン ｃ）アルギニン ｄ）ヒスチジン ｅ）グルタミン ｆ）スレオニン X2はR2の構成要素で下記から選ばれる： ａ）イソロイシン ｂ）アルギニン ｃ）バリン ｄ）メチオニン Xn はR2の構成要素であって単結合あるいは１５アミノ
酸までのペプチドである。X3はR3の構成要素であって下
記から選ばれる： ａ）アラニン ｂ）アルギニン ｃ）バリン X4はR3の構成要素であって下記から選ばれる： ａ）フェニルアラニン ｂ）イソロイシン ｃ）バリン ｄ）ロイシン Xm はR3の構成要素であって、単結合あるいは１５アミ
ノ酸までのペプチドである。本発明の好適な実施態様と
しては、たとえばＨＩＶのＭＮ単離株のＰＮＤのように
X2はイソロイシンである。またペプチドのループ中に全
部で１２−３０アミノ酸が含まれることが好ましい実施
態様である。
【００５４】環状ペプチドとは不安定なジスルフィド結
合による構造であるか、あるいは安定な結合あるいは構
造を介して形成される環である。安定な結合とは不安定
なジスルフィド結合以外の共有結合を指す。このような
安定な結合の例はアミドおよびチオエーテル結合であ
る。これらの共有結合はキシレンや低級アルキル、-CH2
-O-CH2のような架橋構造、またはアミノ酸ペプチド結合
架橋を介する。架橋構造を変えるおよび／またはペプチ
ドに含まれるアミノ酸の数や種類を変えることにより免
疫システムに提示されるエピトープを微妙に調節し、環
のループ構造の立体構造を最適にすることができる。た
とえば架橋構造としてｏ−キシレンを用いるとたとえば
炭素数８の直鎖低級アルキルを架橋に用いた場合よりル
ープの構造がタイトになる。したがって本発明の複合体
は、ＰＮＤエピトープが抗ペプチド、抗ＨＩＶ、ＨＩＶ
中和、抗エイズ免疫反応をほ乳類中に起こさせるにあた
っての構造と機能との関係を分析するのに有用であると
ともに、エイズを含むＨＩＶ疾患にたいするワクチン製
剤の成分としても有用である。
【００５５】得られた合成ペプチドはＦＡＢ−ＭＳ、逆
相ＨＰＬＣ、アミノ酸分析あるいは核磁気共鳴（ＮＭ
Ｒ）によって同定される。
【００５６】ａ．ジスルフィド結合したシステイン基を
介した環状ペプチド ループアミノ酸配列の両側にシステイン残基を有するペ
プチドは酸化的条件下で、ジスルフィド結合により環状
となる。ジスルフィド結合をさせる方法は当分野で良く
知られている。本発明におけるジスルフィド結合化の例
は、ｃＰＮＤ４を製造する実施例５に示してある。実施
例５においては、システインのAcm 誘導体を用いてジス
ルフィド化したｃＰＮＤをつくるプロセスが示してある
が、他の方法も同様に用いることができる。ｃＰＮＤ３
３を製造する実施例１８においては、２個の遊離のスル
フヒドリル基を有するペプチドを希薄トリフルオロ酢酸
中で希釈し１−５０時間以上、約１０−４０℃において
ジスルフィド結合を形成させる。本発明においてはジス
ルフィド結合したペプチドが好ましい。
【００５７】よって、本発明の好適な実施態様としては
ペプチドは以下の構造
【化３１】 あるいは、その医薬的に許容される塩である；式中 ｒはａ）水素 ｂ）
【化３２】 式中Ｗは好ましくは-(CH2)2-、-(CH2)3-、あるいはR6で
あって、R6は
【化３３】 式中R7は低級アルキル、低級アルコキシあるはいハロで
ある：R1は ａ）単結合、または ｂ）マーカーアミノ酸１個を含んでいても良い１ないし
５のアミノ酸からなるペプチド： R2は３ないし１０アミノ酸からなるペプチドである：R3
は３ないし１０アミノ酸からなるペプチドである：-GPG
R-は四量体-GlyProGlyArg-である：R5は ａ）-OH 、 ｂ）マーカーアミノ酸をふくむことができる１個ないし
５個のアミノ酸からなるペプチド、または ｃ）-NH2である： R8は炭素数１から８の間の低級アルキルである：
【００５８】低級アルキルとは特に断わらない限り、直
鎖あるいは分岐アルキルで炭素数１から８のものであ
る。以降、ＰＮＤペプチドのコアを形成し、環状ペプチ
ドでループを形成することになるアミノ酸配列、-R2-Gl
yProGlyArg-R3-、のことをループアミノ酸という。本発
明の１実施態様に置いて、以下の構造を有する環状ペプ
チド
【化３４】 は、以下の構造
【化３５】 を有する線状ペプチドを環化することにより調製され
る。式中-GPGR-は四量体-GlyProGlyArg-である：X1はR2
の構成体で下記から選ばれる： ａ）セリン ｂ）プロリン ｃ）アルギニン ｄ）ヒスチジン ｅ）グルタミン（これが好ましい） ｆ）スレオニン X2はR2の構成要素で下記から選ばれる： ａ）イソロイシン（これがもっとも好ましい） ｂ）アルギニン（好ましい） ｃ）バリン ｄ）メチオニン Ｘn はR2の構成要素であって１つのアミノ酸あるいは８
アミノ酸までのペプチドである：X3はR3の構成要素であ
って下記から選ばれる： ａ）アラニン、 ｂ）アルギニン ｃ）バリン X4はR3の構成要素であって下記から選ばれる： ａ）フェニルアラニン ｂ）イソロイシン ｃ）バリン ｄ）ロイシン Ｘm はR3の構成要素であって、１つのアミノ酸あるいは
８アミノ酸までのペプチドである。
【００５９】新規なジスルフィド結合環状ペプチドは２
相にわけて合成される。まず線状ペプチドを合成するに
は、Milligen 9050 ペプチドシンセサイザーあるいはAB
I431A ペプチドシンセサイザーを用い、９−フルオレニ
ルメチルオキシ−カルボニル（Fmoc) 化学的手法と既知
の試薬である側鎖が保護されたFmoc- アミノ酸ペンタフ
ルオロフェニルエステルを用いるか、または誘導化Wang
樹脂とFmoc法および試薬としてその場で調製された側鎖
が保護されたFmocアミノ酸対称無水物を用いた。
【００６０】つぎに線状ペプチドは液中あるいはまだ固
相に保持された状態で、ループを形成する予定の線状ペ
プチド配列の両端にシステイン残基を組み込み、既知の
酸化条件下ジスルフィド結合を起こさせて環状化され
る。好適な実施態様としてはペプチドを（ａ）H2O2、
（ｂ）空気中の酸素、（ｃ）約0.１−0.５％ＴＦＡを含
むCH3CN 水溶液、（ｄ）約0.１Ｍフェリシアニンのいず
れかにさらして環化する。好ましい方法は空気中の酸素
にさらすことである。
【００６１】得られた合成ペプチドはＦＡＢ−ＭＳ、逆
相ＨＰＬＣ、アミノ酸分析あるいは核磁気共鳴（ＮＭ
Ｒ）によって同定される。本発明において有用なペプチ
ドはさらに以下の（ｉ），（ii) に記載するようにして
調製することができる。
【００６２】ｉ．固相状態でのペプチド環化 システインあるいはその他の遊離のスルフヒドリル基を
側鎖を持つアミノ酸であるC1とC2をループアミノ酸の両
端に有するペプチドを当分野で知られた方法により調製
する（上述）。環状ＰＮＤにおいて、スルフヒドリル基
を有する側鎖（-R8-SH) は環化して-R8S- 基となる。反
応性のある側鎖（Ｒ基）を有するアミノ酸を組み込む場
合は適切にＲ基が保護された形で用いる。例えば、ヒス
チジンはトリフェニルメチル（Trt), あるいはBoc で保
護し、アルギニンは４−メトキシメチル−２，３，６−
トリメチルフェニルスルホニル（Mtr)で保護する。
【００６３】好ましくは、Acm で保護されたC2がすでに
結合している樹脂、たとえばFmoc-L-Cys(Amc)-O-Wang樹
脂を購入する。ループアミノ酸のアミノ末端に組み込ま
れたシステイン残基（C1）もまたAcm 誘導体である。C1
とC2のどちらも付加的なアミノ酸であるR1とR5にそれぞ
れ結合できる。このR1、R5はキャリア分子と複合体を形
成するのに利用され、あるいはノルロイシンやオルニチ
ンが用いられた場合はアミノ酸分析用のマーカーとして
働く。
【００６４】アセトアミドメチル化システインのＳは、
室温約１５時間、樹脂と親和性のある溶液、たとえば１
−５０％の有機酸濃度（好適には１０％酢酸を含む無水
ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ））中、各Acm 基にたい
し約４倍の過剰モル重金属塩（たとえば酢酸水銀（Hg(O
Ac)2) と反応させる。生じた重金属チオエーテル( たと
えばペプチドの酢酸水銀チオエーテル、ＰＥＰ（Ｓ−Ag
OAc)）は，洗浄し、乾燥する。過剰のＤＭＦ中硫化水素
を加えると、不溶性の金属硫化物（たとえば水銀硫化物
HgS)と遊離のスルフヒドリル基を有するペプチドが得ら
れる。遊離のスルフヒドリル基はついで上記の方法の１
つによって酸化される。別法としてはAcm で保護された
チオールは、メタノール／ＤＭＦ溶中でヨウ素で処理す
ることにより直接環状ジスルフィドに変換することもで
きる。
【００６５】ii. 溶液中でのペプチドの環化 基本的には上述の固相環化法と同様であるが２点の主要
な違いがある。ペプチドがpepsyn KA 樹脂から９５％Ｔ
ＦＡ／４％エタンジチオール／１％チオアニソールで切
り出されると、酸に不安定な側鎖保護基も同時にはず
れ、Cys(Trt)基は遊離の−SH官能基を与える。しかしCy
s(Acm)保護が用いられる場合、別に線状ペプチドを樹脂
についたままあるいは外した状態で酢酸水銀／硫化水素
を開裂して遊離の−SH基にする必要がある。
【００６６】１つの方法はCys(Acm)保護基とSasrinまた
はPepsyn KH を用い、完全に保護されたペプチドを１％
TFA／CH2Cl2で樹脂から開裂する方法を用いるものであ
る。酢酸水銀／硫化水素でCys(Acm)を遊離の−SH基に変
換し、環化は別に保護したペプチドにおいて行なう。こ
の時点でペプチドはその場で選択的にＮ−末端がマレイ
ミド化されることができる。酸に不安定な側鎖保護基を
９８％ＴＦＡ／２％チオアニソールで開裂し、環状ペプ
チドをＨＰＬＣで単離する。しかし好ましい方法はペプ
チドを樹脂から切り出し、上述の方法の１つで環化をお
こさせるものである。もっとも好ましい方法は約１−５
０時間の間、１０から４０℃のあいだで空気酸化させる
ことである。
【００６７】本発明において特に好ましい実施態様は、
構造（ＳＥＱ ＩＤ：１）を有するペプチド（ｃＰＮＤ
３３) である。
【化３６】 を、アミノ末端ノルロイシンか内部のリシンの１つを介
してＭＩＥＰに連結し、構造の１つあるいは混合物を作
る。
【化３７】
【化３８】 〔式中、ｊは複合体中のペプチドの質量（％）で、好ま
しくは複合体中の全蛋白質量の１１から５０％である。
ｘは陰性の置換基を含む低分子残基のモル数であり、好
ましくはｍの１％から９０％のあいだにある、もっとも
好ましいのは１０％と５０％のあいだである。ｍは、複
合化するまえの免疫原性蛋白質ＰＲＯ中の反応性求核性
官能基のモル数である。〕 これらはほ乳動物中に免疫原として投与してＨＩＶ中和
抗体を誘導し、あるいはＨＩＶ疾患や感染を予防するワ
クチンとして、またエイズを含むＨＩＶの感染や疾患の
患者の治療を予防するためのワクチンを調製するのに有
用である：
【００６８】ｂ．ｏ−キシレンまたは低級アルキルにチ
オエーテル連結を介した環状ペプチドｉ．固相状態での
ペプチド環化 システインあるいはその他の遊離のスルフヒドリル基を
側鎖に持つアミノ酸であるC1とC2をループアミノ酸の両
端に有するペプチドを当分野で知られた方法により調製
する（上述）。環化しおわったＰＮＤにおいては、C1と
C2は上に示したＰＥＰ構造のR6とR7の基の一部となる。
反応性のある側鎖（Ｒ基）を有するアミノ酸を組み込む
場合は適切にＲ基が保護された形で用いる。例えば、ヒ
スチジンはトリフェニルメチル（Trt), アルギニンは４
−メトキシメチル−２，３，６−トリメチルフェニルス
ルホニル（Mtr)で保護する。（「ペプチド合成の原理」
（Bodanzky, M., Springer-Verlag(1984)), 「固相ペプ
チド合成」（Stwert J.M.,Young, J.D., Pierce Chemic
al Company(1984第２版）、「ペプチド」（Gross,E, Me
ienhofer, J., Academic Press(1979))
【００６９】好ましくは、Acm で保護されたC2がすでに
結合している樹脂、たとえばFmoc-L-Cys(Amc)-O-Wang樹
脂を購入する。ループアミノ酸のアミノ末端に組み込ま
れたシステイン残基（C1）もまたAcm 誘導体である。C1
とC2のどちらも付加的なアミノ酸であるR1とR5にそれぞ
れ結合できる。このR1、R5はキャリヤ分子と複合体を形
成するのに利用され、あるいはノルロイシンやオルニチ
ンが用いれらた場合はアミノ酸分析用のマーカーとして
働く。
【００７０】アセトアミドメチル化システインのＳは、
室温約１５時間、樹脂と親和性のある溶媒、たとえば１
−５０％の有機酸濃度（好適には１０％酢酸を含む無水
ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ））中、各Acm 基にたい
し約４倍の過剰モル重金属塩（たとえば酢酸水銀（Hg(O
Ac)2) と反応させる。生じた重金属チオエーテル（たと
えばペプチドの酢酸水銀チオエーテル、ＰＥＰ（S-AgOA
c)) は，洗浄し、乾燥する。過剰のＤＭＦ中硫化水素を
加えると、不溶性の金属硫化物（たとえば水銀硫化物Hg
S)と遊離のスルフヒドリル基を有するペプチドが得られ
る。
【００７１】ペプチドと等モルのｏ−キシレンジブロミ
ドまたはジクロリド、ジブロム化またはジクロル化低級
アルキル、あるいは所望の架橋長さをあたえる１，３−
ジハロゲン化-CH2-O-CH2- の混合物を誘導体化した樹脂
に加える。大過剰の四級アミン、好ましくはＤＭＦ中の
トリエチルアミン（NEt3) を徐々に加える。ビススルフ
ヒドリルペプチド部分との反応を室温で約１６時間進行
させて、樹脂に結合した状態の、架橋基で誘導体化され
た環状ペプチドを得る。酸に不安定な側鎖の保護基の脱
離と、樹脂からの切り出しは、４％１，２−エタンジオ
ールと１％チオアニソールの存在下で９５％トリフルオ
ロ酢酸で処理することにより行なう。溶解した環状ペプ
チドはついで濾過して樹脂と分離する。濾液は溶媒を留
去して粗製残渣をＨＰＬＣで精製する。ＨＰＬＣは当分
野に知られた方法、たとえば逆相ＨＰＬＣによって行な
う。
【００７２】ii. 溶液中でのペプチドの環化 基本的には上述の固相環化法と同様であるが２点の主要
な違いがある。ペプチドがpepsyn KA 樹脂から９５％Ｔ
ＦＡ／４％エタンジオール／１％チオアニソールで切り
出されると、必要な遊離の−SH官能基を与えるCys(Trt)
基を含め酸に不安定な側鎖保護基も同時にはずれる。し
かしCys(Acm)保護が用いられる場合、別に線状ペプチド
を樹脂についたままあるいは外した状態で酢酸水銀／硫
化水素を開裂して遊離の−SH基にする必要がある。
【００７３】しかしながら好ましい１つの方法はCys(Ac
m)保護基とSasrinまたはPepsyn KHを用い、完全に保護
されたペプチドを１％ＴＦＡ／CH2Cl2で樹脂から開裂す
る方法も用いるものである。酢酸水銀／硫化水素でCys
(Acm)を遊離の−SH基に変換し、環化は別に保護したペ
プチドにおいて行なう。酸に不安定な側鎖保護基を９８
％ＴＦＡ／２％チオアニソールで開裂し、環状ペプチド
をＨＰＬＣで単離する。未反応のキシレンジブロミドの
ような過剰の試薬を保護基の脱離に先立って除去するに
は、まず１段階濃度勾配逆相ＨＰＬＣを行なってからよ
り選択的な濃度勾配溶出を行なうので便利である。
【００７４】このサブセクションの方法により調製され
た環状ＨＩＶ ＰＮＤペプチドは以下に示すサンプルｃ
ＰＮＤを包含するがこれに限定されるものではない。こ
のサブセクションの方法は一般に小さいペプチドに適用
でき、、特に５個から３０個までのアミノ酸からなるペ
プチドに適用できる。最適な環のサイズは-GPG- 三量体
を含む５から１０個のあいだのアミノ酸を含むものであ
る。この環のサイズは適切なアミノ酸の数と組み合わせ
を有する線状ペプチドから環を作成することにより容易
に保つことができる。このサブセクションｂ．（ｉ）と
（ii) に記載されたプロセスで得られた代表的なペプチ
ドを以下に示す。複合体発明はこれらの特定の実施態様
であるＨＩＶ環状ＰＮＤペプチドに限定されるものでは
ない。他の線状ＨＩＶ ＰＮＤペプチド配列もこれらの
ペプチドを作成したのと基本的に同一のやり方で環状に
することができる。互いに異なった一次配列を有するペ
プチドを作成することができ、それらは抗ペプチド、抗
ＨＩＶあるいはＨＩＶ中和性免疫反応を引き出すことが
できるかぎり、本発明においては有益である。
【化３９】
【００７５】ｃ．アミド結合形成を経る環化 複合体形成用の新規のアミド結合した環状ペプチドは、
基本的に２相で調製される。初めに、線状ペプチドを調
製するが、これにはたとえばＡＢＩ−４３１Ａペプチド
シンセサイザーを用い、既知の固相ペプチド合成化学手
法、たとえばFmoc法と適切に側鎖が保護されたFmoc−ア
ミノ酸を試薬に用いる。
【００７６】次に、線状ペプチドを樹脂から切り出し、
溶液中で環化を行なうが、これはアミノ末端のイソグル
タミンの遊離のアミノ基、あるいはロープアミノ酸の片
端のリジンのε−あるいはα−アミノ基をループアミノ
酸のカルボキシ末端の遊離のカルボキシル基とを、ＤＰ
ＰＡ、ＢＯＰなどのペプチド結合形成を行なわせる試薬
によりアミド結合させることにより行なう。本サブセク
ションに従って合成されたペプチドは、高速電子衝撃質
量分析法（ＦＡＢ−ＭＳ）、逆相ＨＰＬＣ、アミノ酸分
析あるいは核磁気共鳴スペクトル（ＮＭＲ）によって同
定される。
【００７７】したがって、ペプチド−ポリサッカライド
−蛋白質複合体の非常に好ましい実施態様は、第一の共
有結合のセット、すなわちＯＭＰＣ−〔マレイミドプロ
ピオン酸、マレイミドエタンホスホン酸、マレイミドグ
ルタル酸、あるいはマレイミドエタンスルホン酸〕と、
第二の共有結合のセット、すなわちＯＭＰＣ−〔上述し
たように調製したアミド結合した環状ＨＩＶ ＰＮＤ〕
を有する複合体である。ＰＮＤが優勢な単離株、たとえ
ばＨＩＶ ＩＩＩＢあるいはＨＩＶ ＭＮ単離株から得
られたもである場合、複合体ワクチンまたはこのような
複合体ワクチンの混合物はエイズあるいはＡＲＣの予防
あるいは治療に非常に有益である。以下の構造
【化４０】
【化４１】
【化４２】
【化４３】 〔式中、ｊは複合体中のペプチドの質量（％）で、好ま
しくは複合体中の全蛋白質量の１１から５０％である。
ｘは陰性の置換基を含む低分子残基のモル数であり、好
ましくはｍの１％から９０％のあいだにある、もっとも
好ましいのは１０％と５０％のあいだである。ｍは、複
合化するまえの免疫原性蛋白質ＰＲＯ中の反応性求核性
官能基のモル数である。〕 これらはほ乳動物中に免疫原として投与してＨＩＶ中和
抗体を誘導し、あるいはＨＩＶ疾患や感染を予防するワ
クチンとして、またエイズを含むＨＩＶの感染や疾患の
患者の治療をするためのワクチンを調製するのに有用で
ある。
【００７８】下記実施例は本発明の複合体を製造及び使
用する方法について更に具体的に説明するために示され
ている。しかしながら、示された実施例は本発明の範囲
を制限するものとして解釈されるべきではない。
【００７９】Ａ．ペプチド製造例： 実施例１ｃＰＮＤ１を形成する溶液環化： 無水ＤＭＦ（２０ml）
を脱気し、ＨＰＬＣ単離直鎖１１マ−Ｈ−NleCHIGPGRAF
C(２０mg、１７μmol)を溶解し、窒素雰囲気下で密閉し
た。無水ＤＭＦ（５０μl)中ｏ−キシリレンジブロミド
（４．７mg、１７．９μmol)の溶液を加えた。次いでＤ
ＭＦ中NEt3（１１．９μl 、８５．２μmol)）を約６．
５時間かけて加えた。塩基の添加終了後約１時間目に溶
液を乾燥させた。残渣をエーテルに再懸濁し、遠心して
不溶性生成物を沈降させ、しかる後再乾燥した。高速原
子衝突質量スペクトル測定（ＦＡＢ−ＭＳ）により分析
された一部は１２７５の主イオン〔Ｍ＋Ｈ〕+ を示し
た。バイダック（Vydac)Ｃ１８カラム（０．４６×２
５．０cm）において２．０ml／min で０．１％ＴＦＡ／
２４％CH3CN を用い２１５nmでモニターされた均等逆相
ＨＰＬＣでは約１８．５min の保持時間を有するシャー
プな生成物ピークを示した。プレパラティブ規模の単離
を２４〜２９％CH3CN から１０ml／min で１３５分間に
わたりランし、これらの条件で保持時間７６．４１min
の生成物を集め、分析条件下で再クロマトグラフィーに
付してその同一性を確認した。アミノ酸分析及び４００
MHz ＮＭＲ分析は下記構造ｃＰＮＤ１と一致した：
【化４４】
【００８０】実施例２ｃＰＮＤ２を形成する溶液環化： 実施例１で記載された
操作に従ったが、但し直鎖１０マ−Ｈ-Nle-CIGPGRAFC-O
H （２０mg、１９．３μmol)を用いた。塩基添加後、溶
液を窒素下で更に９時間保った。ＦＡＢ−ＭＳでは〔Ｍ
＋Ｈ〕+ ＝１１３８及び〔Ｍ＋Na〕+ ＝１１６０を示し
たが、これはｃＰＮＤ２に関して提示された構造と一致
した。２本の２．１２×２５cmのバイダックＣ１８カラ
ムを用いたプレパラティブＨＰＬＣは２４〜２８％CH3C
N ／０．１％ＴＦＡから１０ml／min で９０分間にわた
り行った。溶出液を２１５nmでモニターし、保持時間６
３．４２及び７０．８２min の２つの生成物ピークを集
め、乾燥し、ＦＡＢ−ＭＳに付した。双方の物質が１１
３８の〔Ｍ＋Ｈ〕+ を有したが（後のピークは１１６０
の〔Ｍ＋Na〕+ も有した）、これは下記構造ｃＰＮＤ２
と一致する：
【化４５】
【００８１】実施例３ｃＰＮＤ３を形成する溶液環化： 実施例１及び２で用い
られた同様の操作をここでは用いたが、但し直鎖１５マ
−Ｈ-Nle-CRIQRGPGRAFVTC-OH（２１．２mg、１１．９２
μmol)を用い、NEt3を約１０時間かけて加えた。更に５
時間の塩基との接触を分析ＨＰＬＣによる分析前に行っ
た。粗生成物のＦＡＢ−ＭＳでは１７７９の単一で強い
〔Ｍ＋Ｈ〕+ を示したが、これは下記ｃＰＮＤ３の構造
と一致する：
【化４６】
【００８２】実施例４ｃＰＮＤ１を形成する固体状態環化： 直鎖ＰＮＤペプチ
ドをＡＢＩ−４３１Ａペプチドシンセサイザーでワン
（Wang) 樹脂上Fmoc-L-Cys(Acm)-O-ワン樹脂（０．６１
meq ／ｇ）から出発して製造した。Fmoc化学及びFmoc−
アミノ酸対称無水物（４倍過剰、その場で製造）を試薬
として０．２５mmol規模で用い、下記ペプチド７４５mg
を得た：
【化４７】 Hg(OAc)2（６４mg、０．２mmol）をＤＭＦ（０．５ml）
中１０％酢酸に溶解し、前記の乾燥樹脂（１４９mg、
０．０５meq)に加えた。更にＤＭＦ（０．２ml）中１０
％酢酸を膨潤樹脂に加え、溶液を一夜撹拌した。次いで
樹脂を濾過し、ＤＭＦ（５×１ml）、CH2Cl2（３×１m
l）及びエーテル（３×２ml）で洗浄した。次いで樹脂
を乾燥し、H2S 飽和ＤＭＦ１mlしかる後その二次分を加
えた。次いで樹脂を濾過し、前記のように洗浄し、しか
る後乾燥して、黒色樹脂状粉末（１７９mg）を得た。Ｄ
ＭＦ（２ml）中ｏ−キシリレンジブロミド（３．２mg）
及びNEt3（３．４μｌ）の混合液を室温で樹脂（３５m
g）に加え、１６時間反応させた。樹脂を濾過し、前記
のように洗浄し、乾燥した。Fmocを室温で２０分間にわ
たるＤＭＦ（１ml）中２０％ピペリジンとの処理で除去
した。樹脂を再び前記のように洗浄し、乾燥した。ｃＰ
ＮＤ１ペプチドを室温で６時間にわたる９５％ＴＦＡ／
４％エタンジチオール／１％チオアニソール（１ml）と
の処理で樹脂から開裂させ、付随的にＴrt及びＭtr保護
基を除去した。溶液を濾過し、樹脂を更に１００％ＴＦ
Ａ（３×１ml）で洗浄し、合わせた濾液を２０℃／０．
１mm圧で蒸発させた。エーテルに不溶性の物質を抽出
（３×２ml）により除去し、不溶性粗生成物を２０℃／
０．１mm圧で再乾燥させた。０．４６×２５cmバイダッ
クＣ１８カラムを用いた分析ＨＰＬＣを用いて生成物を
同定した。実施例１から得られた生成物との比較で、真
正生成物が存在することを確認した（１２．９７min に
対して保持時間１２．８８min ）。プレパラティブＨＰ
ＬＣは連続した２本の２．１２×２５cmバイダックＣ１
８カラムを用い１０ml／min で２５〜３０％CH3CN ／
０．１％ＴＦＡから９０分間行った。５４．１２min で
溶出したピークを集めた。実施例１で製造された物質と
一緒のこの物質の分析規模同時クロマトグラフィーでは
単一のシャープなピークを示した。ＦＡＢ−ＭＳは１２
７５の〔Ｍ＋Ｈ〕+ を有し、これでｃＰＮＤ１の製造を
確認した（構造に関し前実施例１参照）。
【００８３】実施例５ジスルフィド結合ｃＰＮＤ４の固体状態合成： 直鎖ＰＮ
ＤペプチドをＡＢＩ−４３１Ａペプチドシンセサイザー
でワン樹脂上Fmoc-L-Cys(Acm)-O-ワン樹脂（０．６１me
q ／ｇ）から出発して製造した。Fmoc化学及びFmoc−ア
ミノ酸対称無水物（４倍過剰、その場で製造）を試薬と
して０．２５mmol規模で用い、下記ペプチド７４５mgを
得た：
【化４８】 ５％メタノール／無水ＤＭＦ（１ml）中ヨウ素の溶液を
前記の乾燥誘導化ワン樹脂に加え、室温で４時間撹拌し
た。樹脂を濾過し、無水ＤＭＦ（５×２ml）で洗浄し、
最後にＤＭＦ（２ml）に再懸濁した。水中チオ硫酸ナト
リウム０．１Ｍ溶液２滴を加え、数秒間撹拌した。樹脂
を水性９５％ＤＭＦ（３×２ml）、無水ＤＭＦ（２m
l）、塩化メチレン（３×２ml）、エーテル（３×２m
l）で洗浄し、乾燥した。Fmoc及び他の保護基を２０分
間にわたるＤＭＦ中２０％ピペリジンとの処理で除去
し、樹脂を洗浄し、乾燥した。樹脂を室温で６時間にわ
たる９５％ＴＦＡ／４％エタンジチオール／１％チオア
ニソール（１ml）との処理でジスルフィド結合環状ペプ
チドから開裂させた。溶液を濾過し、樹脂を更に１００
％ＴＦＡ（３×１ml）で洗浄し、合わせた濾液を乾燥し
た。エーテルに不溶性の物質を抽出（３×２ml）で除去
し、溶液を再乾燥した。連続した２本の２．１２×２５
cmバイダックＣ１８逆相カラムを用いたプレパラティブ
ＨＰＬＣ及び９０分間にわたる２０〜２４％CH3CN の勾
配溶出によりこれらの条件下３６．６６min で溶出する
シャープなピークを単離した。分析ＨＰＬＣにより公知
のジスルフィド結合環状標準とプレパラティブＨＰＬＣ
から得られた生成物との同時クロマトグラフィーで単一
ピークを得た。ＦＡＢ−ＭＳで１１７１の〔Ｍ＋Ｈ〕+
を得たが、これは下記ジスルフィド結合環状構造のｃＰ
ＮＤ４と一致する：
【化４９】
【００８４】実施例５ｂ １．
【化５０】 の合成 （C135H220N42O33S2 式量＝３０２３．６） ２６マーは０．０８１meq ／ｇ（約６０４mg）の部分的
ラセミ化Fmoc-L-Cys(Trt)-OPKA樹脂〔ミリゲン（Millig
en) バッチＢ ０９０４２６〕２．４７ｇ（０．２００
meq ）から出発してミリゲン＃９０５０シンセサイザー
で組立てた。樹脂を等容量のガラスビーズ（シグマ１５
０〜２１２μm ）と混ぜた。混合物を連結された２本の
１×１０cmカラムに完全に充填した。試薬はFmoc−Pft
エステルであったが（但しトレオニンの場合にそれはｄ
ＨＢｔであった）、これをＮ−メチルピロリジン溶媒中
４倍モル過剰で用いた。側鎖保護はＹ（tert−ブチ
ル）、Ｋ（Boc)、Ｒ（Mtr)、His(Boc)、Ｔ（tert−ブチ
ル）、Ｃ（Trt)であった。プロトコールはＫ7 、Ｉ9 、
Ｉ11、Ｇ12、Ｐ13、Ｇ14、Ｒ15、Ｆ17、Ｙ18、Ｔ19、Ｔ
20、Ｉ73、Ｉ24と二重カップリングさせるために修正し
た。アシル化リサイクル時間はＧ14及びＡ16を除くすべ
ての単位で３０〜６０分間並びにＩ9(２Ｘ）、Ｉ11（２
Ｘ）、Ｉ23（２Ｘ）及びＩ24（２Ｘ）で９０分間まで延
長した。誘導化された樹脂を遊離末端アミンとして維持
し、CH2Cl2で洗浄し、風乾した。乾燥誘導化樹脂及びガ
スラビーズの混合物を振動トレー上で穏やかに撹拌しな
がら密閉フラスコ中２３℃で８時間かけて９５％ＴＦ
Ａ、４％エタンジチオール、１％CH3SPh（３０ml）に再
懸濁した。次いで明黄色混合液を濾過し、不溶物を１０
０％ＴＦＡ（３×２０ml）で徹底的に抽出した。合わせ
た暗橙色濾液を蒸発させて、淡黄褐色油状ゴム物を得
た。エーテル（２０ml）で摩砕時にこの物質は直ちに無
色固体物となったが、これを更にエーテル（３×２０m
l）摩砕でフィルターに移した。乾燥後、粗生成物を微
細な無色粉末（５８３mg）として得た。水性０．１％Ｔ
ＦＡ／２０％CH3CN に溶解されたサンプル約５０μｇの
０．４６×２５．０cmバイダックＣ１８カラム分析逆相
ＨＰＬＣでは主成分及び後に溶出する副成分を示した。
これらは連続した２本の２．２１×２５．０cmプレパラ
ティブカラムへの３０mg及び更に５０mgのサンプル注入
後に別々に回収した。全部で３５．２mgの最初に溶出す
る物質及び８．２mgの後に溶出する物質を凍結乾燥後に
回収した。ＦＡＢ−ＭＳで〔Ｍ＋Ｈ〕+ ＝３０２２．１
及び〔Ｍ＋Na〕+＝３０４４．２を得たが、これは計算
質量と一致する。
【００８５】２．環状ジスルフィドの製造：（ＳＥＯ
ＩＤ：１：）
【化５１】 ａ．K3Fe(CN)6 誘導酸化： 直鎖２６マージチオール化合物（３５．０mg）を２３℃
で脱気蒸留水（３８ml）に溶解して、pH２．７３の澄明
無色溶液を得た。pHを０．１Ｎ NH4OHで８．５に調整
し、溶液を窒素雰囲気で覆った。物質の一部を分析逆相
ＨＰＬＣで直ちにランしたところ、これは初期ピークの
出現で証明されるように酸化をうけていることがわかっ
た。磁気撹拌しながら、０．０１Ｍ K3Fe(CN)6の新鮮調
製溶液を窒素下２３℃で電動皮下シリンジにより加え
た。ＨＰＬＣによる少量の分析ではより早い溶出時間へ
の出発物質の全変換を示した。反応混合液（pH８．３）
を１０％水性酢酸と混ぜ、撹拌して、pH４．０とした。
溶液を濾過して不溶性物質を除去し、淡黄色溶液を蒸発
させ、しかる後凍結乾燥して、淡黄色粉末約２７．９mg
を得た。物質を０．１％ＴＦＡ、２０％CH3CN に溶解
し、プレパラティブＨＰＬＣで勾配溶出させた。主な最
初に溶出するピーク及び後に溶出するピーク（４：１）
を別々に回収し、凍結乾燥して、初期溶出物質６．１mg
及び後溶出物質１．５mgを得た。最初に溶出する物質の
ＦＡＢ−ＭＳ分析：〔Ｍ＋Ｈ〕+ ３０１９．７、〔Ｍ＋
Na〕 + ３０２４．５；後に溶出する物質のＦＡＢ：ＭＳ
分析：〔Ｍ＋Ｈ〕+ ３０２１．０〔Ｍ＋Na〕+ 初期物質
＝３０４１．５；そのすべては環化ｃＰＮＤ３３に関す
る正確な質量に相当する。後に溶出する物質はＤ−シス
テイン異性体である。生成物のアミノ酸分析では環化生
成物に関して予想されるアミノ酸組成を示し、後に溶出
する物質がＤ−システイン含有ジアステレオマーである
ことを確認した。 ｂ．空気酸化： 前記（１）で製造された直鎖２６マー（８６mg、２８．
４μmol)）を２３℃で水性０．１％ＴＦＡ、２０％アセ
トニトリル（２８４ml）に溶解し、溶液を空気に開放放
置させた。環化を逆相ＨＰＬＣでモニターしたところ、
サンプルは２４時間で初期溶出物質にほぼ完全に変換さ
れることがわかり、出発直鎖物質はほぼ完全に消失し
た。澄明な無色溶液を約８mlまで蒸発させ、しかる後８
６mgの場合と同様に製造されたサンプル１０mgを更に追
加した。合わせたサンプルを約９mlまで蒸発させた。濁
った無色溶液を連続した２本の２．２１×２５．０cmバ
イダックＣ１８カラムにおいて２回の別々のランでＨＰ
ＬＣ分離を付した。物質の２つのピーク、即ち最初に溶
出するピーク及び後に溶出するピークを別々に集めた。
各ピークを別々に蒸発させ、凍結乾燥して、最初の及び
後の物質３０．１mg及び９．７mgを各々得た。最初に溶
出する物質を最初に溶出する環化物質の他の調製物と合
わせて、全部で４７．５mgの淡紅色綿毛状粉末を得た。
この物質の分析ＨＰＬＣで単一ピークを得た。
【００８６】実施例６ペプチド結合ｃＰＮＤ７の溶液合成： 直鎖ペプチドCbz-
Nle-Lys(Boc)-His(Trt)-Ile-Gly-Pro-Gly-Arg(Mtr)-Ala
-PheをＡＢＩ４３１Ａペプチドシンセサイザーで固相法
に従い市販Fmoc−フェニルアラニル−ｐ−アルコキシベ
ンジルアルコール樹脂３７３mg（０．１mmol）を用いて
合成した。ベンジルオキシカルボニル（Cbz)保護形で購
入されたノルロイシンを除き、用いられたＬ−アミノ酸
は適切な酸不安定性側鎖保護基を有するフルオレニルメ
トキシカルボニル（Fmoc）誘導体であった。ポリペプチ
ド誘導化樹脂生成物を焼結ガラス漏斗に移し、ジクロロ
メタンで洗浄し、乾燥して、ポリペプチド−樹脂生成物
０．６ｇを得た。ペプチドを１６時間にわたるＴＦＡ：
１，２−エタンジオール：アニソールの９５：２：３混
合液６mlとの処理で樹脂から開裂した。反応混合液を焼
結ガラス漏斗で濾過し、樹脂をＴＦＡ１０mlで洗浄し、
濾液を合わせた。約１〜２mlの黄色油状物に濃縮後、直
鎖ペプチドを５０mlずつジエチルエーテル４００mlでの
摩砕及び焼結ガラス漏斗での濾過により回収した。１％
ＴＦＡ１００mlへの溶解しかる後凍結乾燥で直鎖ペプチ
ド２９８mgを得た。ペプチド粉末をＤＭＦ８００mlに溶
解し、ジイソプロピルエチルアミン０．４２mlで中和
し、ジフェニルホスホリルアジド０．０７７mlで処理し
た。溶液を暗所中４℃で７０時間撹拌して環状ラクタム
を形成させた。氷酢酸３mlの添加で反応停止後、反応混
合液を約１〜２mlの油状物に濃縮し、１０％水性酢酸に
溶解し、凍結乾燥した。環状ペプチドをＧ−１５サイズ
排除クロマトグラフィーにより移動相として５％酢酸を
用い精製した。ＵＶ検出でモニターされたペプチドを含
有する画分をプールし、凍結乾燥して、乾燥環状ペプチ
ド１３５mgを得た。得られたすべての結果は下記構造ｃ
ＰＮＤ７と一致した：
【化５２】 これは下記式でも示される：
【化５３】
【００８７】実施例７水素形のｃＰＮＤ８を得るｃＰＮＤ７の脱保護 ｃＰＮＤ７の脱保護は３０％水性酢酸２０mlへの環状ペ
プチドの溶解及び１０％パラジウム炭素１００mg上４０
psi(約２．８kg／cm2 ）で１６時間の水素添加により行
った。反応混合液をセライトで濾過して触媒を除去し、
濾液を凍結乾燥した。バイダックＣ１８セミプレプカラ
ムを用いた逆相ＨＰＬＣを利用して純粋な脱保護環化ペ
プチド８．５mgを得た。この脱保護方法は遊離水素形の
ペプチドを得るためベンジルオキシカルボニルＮ保護ペ
プチドとして合成されたすべてのペプチドに適用可能で
あり、得られたペプチドは複合化のためアミノ末端で活
性化してもよい。生成物の構造はＦＡＢ−ＭＳ、分析Ｈ
ＰＬＣ及びアミノ酸分析で確認したが、すべての結果は
下記構造ｃＰＮＤ８と一致した：
【化５４】 これは下記式でも示される：
【化５５】
【００８８】実施例８ｃＰＮＤ１０の合成： ペプチドアミノ末端にAcm 保護Ac
−システインを有するｃＰＮＤ１０の合成は実施例１で
用いられた操作と同一であるが、但しここでの合成では
Z-Nle ではなくFmoc−ノルロイシンを含み、更にアミノ
酸Ac-Cys(Acm) をＮ末端アミノ酸として用いた。このた
め直鎖ペプチドAc-Cys(Acm)-Nle-Lys(Boc)-His(Trt)-Il
e-Gly-Pro-Gly-Arg(Mtr)-Ala-Pheは市販Fmoc-Nle及びFm
oc-Cys(Acm) を用いて組立てた。実施例１操作のこの修
正はＮ末端Ac-Cys(Acm) が望まれる他のｃＰＮＤペプチ
ドの合成にも適用可能である。
【００８９】実施例９ｃＰＮＤ９を得るｃＰＮＤ１０の脱保護： Acm 保護Ac-C
ys(Acm) はアサトン，Ｅ．ら，ケミカル・ソサエティ，
パーキントランスアクション，第Ｉ巻，第２０５７頁，
１９８５年〔Atherton , E. et al., Chem. Soc. Perki
n Trans.，I, 2057(1985) 〕で記載された操作に従い遊
離Ac-Cys-SH(遊離スルフヒドリル）形のペプチドに変換
してもよい。この操作はブロモアセチル化又はマレイミ
ド化タンパク質又は多糖類のように親チオ剤との複合化
のためペプチドのAcm チオール保護の除去にも適用可能
である。ｃＰＮＤ１０の一部を１０％水性酢酸に溶解
し、トリフルオロ酢酸水銀（１０倍過剰）で処理した。
pHを４に再調整し、溶液を室温で撹拌しながら、Ｓ−Ac
m 基の開裂を逆相ＨＰＬＣでモニターした。反応が終了
したと判断された後、溶液を硫化水素ガスで飽和させ
た。硫化水銀（II) 沈殿を遠心除去し、ｃＰＮＤ９をＲ
Ｐ−ＨＰＬＣで精製した。ｃＰＮＤ９の構造及び純度を
ＦＡＢ−ＭＳ、分析ＨＰＬＣ及びアミノ酸分析により確
認した。
【００９０】実施例７〜２６実施例６〜９及び１９〜２０の方法に従い合成されたｃ
ＰＮＤペプチド： ｃＰＮＤ７、ｃＰＮＤ８、ｃＰＮＤ
９、ｃＰＮＤ１０、ｃＰＮＤ３１及びｃＰＮＤ３２の合
成に各々関する前記実施例６〜９及び後記実施例２５〜
２６で確立された操作を、多数の異なる単離物から環状
形の合成ＰＮＤペプチドの合成に際してペプチド一次配
列の変化及び適切な保護基の導入を除きいかなる実質的
修正もなく適用した。このためこれらの方法に従い合成
された下記ペプチドのすべては本発明の複合体を形成す
るため必要であればＮ末端脱保護して−ｒ−で複合化し
てもよい：
【化５６】
【化５７】
【化５８】
【００９１】実施例２５ｃＰＮＤ３１の合成： Fmoc-Phe- ワン樹脂２ｇ（０．６
meq ／ｇ）をＡＢＩ４３１Ａシンセサイザーにいれた。
Fmoc単一カップリングプロトコールを用いてFmoc-Ala、
Fmoc-Arg(Tos) 、Fmoc-Pro、Fmoc-Ile、Fmoc-His(Trt)
、Boc-Lys(Fmoc) 及びCbz-Nle を付加し、下記配列を
有する直鎖ペプチド樹脂３．７ｇを得た： Boc-Lys(Nε-Z-Nle)-His(Trt)-Ile-Gly-Pro-Gly-Arg(To
s)-Ala-Phe. ペプチドを２時間にわたる９５％ＴＦＡ、５％水との処
理で樹脂から開裂させた。樹脂を濾去し、ＴＦＡを減圧
蒸発により濾液から除去し、残渣をジエチルエーテルで
摩砕した。沈殿物を濾取し、乾燥して、下記配列を有す
る直鎖ペプチド１．７ｇを得た： H-Lys(Nε-Z-Nle)-His-Ile-Gly-Pro-Gly-Arg(Tos)-Ala-
Phe ペプチドを室温で一夜ＤＭＦ（１０ml）中Boc-イソグル
タミン-ONp（０．７１ｇ、２nmol) 及びＤＩＥＡ（０．
３５ml、２mmol）で処理した。ＤＭＦを蒸発させ、残渣
をジエチルエーテルで処理した。沈殿物を濾取し、酢酸
エチルで洗浄した。乾燥ペプチド（１．９ｇ）をＴＦＡ
（１００ml）で０．５時間処理した。ＴＦＡを減圧蒸発
させ、残渣をジエチルエーテルで摩砕し、沈殿物を濾取
し、乾燥させる。ペプチドをセファデックスＧ−１０に
おいて溶離液として１０％水性酢酸により脱塩した。ペ
プチド画分を凍結乾燥して下記ペプチド１．２ｇ（０．
７９mmol）を得た： H-isoGln-Lys(Nε-Z-Nle)-His-Ile-Gly-Pro-Gly-Arg(To
s)-Ala-Phe ２バッチ（０．５５ｇ、０．３６mmol）のペプチドを氷
冷ＤＭＦ１０００mlに別々に溶解し、ＤＩＥＡ（０．１
６ml、０．９mmol）及びＤＰＰＡ（０．１２ml）を加
え、溶液を室温で一夜撹拌した。ＤＭＦを減圧蒸発さ
せ、残渣を合わせ、CHCl3 に溶解した。有機画分を５％
水性クエン酸で洗浄し、しかる後MgSO4 で乾燥し、蒸発
させて、粗製環状ペプチド０．７８ｇを得た。この物質
を０℃で２時間アニソール（１ml）含有液体ＨＦ（１０
ml）で処理した。ＨＦを蒸発させ、残渣を逆相ＨＰＬＣ
で勾配溶出により（バイダックＣ１８、０〜５０％CH3C
N 、５０分間、緩衝液として０．１％水性ＴＦＡ使用）
精製し、純粋なｃＰＮＤ３１（Ｍ＋Ｈ＝１２０４）２５
０mgを得た。
【化５９】
【００９２】実施例２６ｃＰＮＤ３２の合成： ｃＰＮＤ３１の合成に関して実施
例２５で用いられたのと本質的に同様の操作をここでは
用いたが、但し環化された直鎖ペプチドは下記配列を有
しており： H-isoGln-Lys(Nε-Z-Nle)-Gln-Arg(Tos)-Gly-Pro-Gly-A
rg(Tos)-Ala-Phe 下記構造を有するｃＰＮＤ３２を得た：
【化６０】
【００９３】実施例２７マレイミドエタンホスホン酸（ＭＥＰＡ）の製造： エト
キシカルボニルマレイミド１６９mgを０℃で水１ml中２
−アミノエチルホスホン酸１２５mg及び炭酸ナトリウム
１０６mgに加えた。混合液を２０分間撹拌し、しかる後
水４mlを加え、混合液を室温で１時間撹拌した。溶液を
希硫酸でpH５．５に酸性化し、減圧下で１mlに濃縮し
た。生成物を水で展開される３枚の１０００μ逆相ＴＬ
Ｃプレートによるクロマトグラフィーで単離した。４つ
のバンドがＵＶ光下における展開プレートの試験で観察
された。原位置から１５〜１６．７cmの第三バンドを単
離した：マレイミドエタンホスホン酸ナトリウム塩１０
０mgを非晶質粉末として回収した。D2O 中の２００MHz
ＮＭＲスペクトルでは７．２ppm でシングレットとして
マレイミド水素並びに４．０及び２．２ppm でマルチプ
レットとしてエチレン水素を示した。
【００９４】実施例２８マレイミドエタンスルホン酸（ＭＥＳＡ）の製造： 実施
例２７の反応条件を用い、但し２−アミノエタンホスホ
ン酸の代わりにタウリン１２３mgを用いて、マレイミド
エタンスルホン酸のナトリウム塩をＴＬＣ及び凍結乾燥
により非晶質粉末として回収する。
【００９５】実施例２９マレイミドコハク酸及びマレイミドグルタル酸の製造 実施例２７においてアミノエタンホスホン酸の代わりに
アスパラギン酸１３３mg又はグルタミン酸１５７mgを用
い、マレイミドコハク酸及び２−マレイミドグルタル酸
のナトリウム塩を各々得る。
【００９６】Ｂ．中間生成物の活性化及び共同結合体形
成の実例 実施例３０ OMPC−SHの調製 １０ミリリットルのOMPC（３．２mg／ml）を４３，００
０ rpm、４℃、２時間の遠心にかけた。OMPC沈殿物を８
mlのチオール化溶液（１０mlのホウ酸緩衝液pH１１中に
８５mgEDTA、１７mg DTT、及び４６mgＮ−アセチルホモ
システインチオラクトンを含む）で再懸した。チオール
化反応は室温で一晩かけて行なった後、溶液を４３，０
００ rpm、４℃、２時間の遠心にかけた。OMPC−SHを１
０mlの０．０１Ｍリン酸緩衝液pH８で再懸濁後、遠心に
かけて、９．３mlの０．０１Ｍリン酸緩衝液pH８で懸濁
した。エルマン（Ellman) アッセイによりスルフヒドリ
ル力価は０．４９６μmoles/mlであった。
【００９７】実施例３１ マレイミドプロピオニル−cPND１５の調製 １０ミリグラムのcPND１５トリフルオロアセテート塩を
０．３mlのH2O ：ＭｅＣＮが１：２である混合液で溶解
した。この溶液を氷浴中で冷却後、１００μＬの０．３
４５Ｍ ＮａＨＣＯ３ 溶液、３．５mgのマレイミドプ
ロピオニック酸Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステルを
添加した。反応は攪拌しながら１時間行ない、その後３
μＬのトリフルオロ酢酸により停止させた。反応混合液
を０．２ミクロンフィルターで濾過した。このフィルタ
ーを０．２mlの水で洗浄後、これらの濾液を採集して
２．１５×２５cmビダック(Vydac) Ｃ１８の逆相カラム
にかけた。カラムからの溶出は１０分間、流速１０ml／
min 、２５％ MeCN／０．１％TFA 、次にさらに２０分
間、２５から４０％MeCN／０．１％TFA の濃度勾配を用
いて、均一に溶出させた。２０から３２分の間における
溶出液を濃縮及び凍結乾燥して、７mgのマレイミドプロ
ピオニル−cPND１５のトリフルオロ酢酸塩を白色無定形
粉末として回収した。FAB −MSは１２６２に主要イオン
（Ｍ＋Ｈ）を示した。反応停止後のマレイミドの力価は
エルマンアッセイにより、０．５４μmoles/mgマレイミ
ドプロピオニル−cPND１５であった。
【００９８】実施例３２ マレイミドプロピオニル−cPND３１の調製 実施例３１、３７の方法により６mgのcPND３１のトリフ
ルオロ酢酸塩を８．３mgのマレイミドプロピオニルＮ−
ヒドロキシスクシニミドエステルを含む０．４mlの０．
３２２Ｍ NaHCO3 溶液及び１．２mlの１：２ H2O：MeCN
と反応させた後、１０．５μｌのTFA で反応を停止させ
た。調製用HPLC（３０％MeCN／０．１％TFA ）で１０分
間、さらに５分間、３０−５０％MeCNの濃度勾配を用い
て均一に溶出し、溶出ピーク１８−２５分間において回
収した。これを凍結乾燥し、その２６mgについてマレイ
ミド力価は０．５７μＭ／mgであった。FAB −MSは１３
５６において主要イオン（Ｍ＋Ｈ）を示した。アミノ酸
分析よりNle ＝４６０、β−アラニン＝４２０、及びLy
s ＝４６０ｎmoles/mgであった。NMR 分析は６．９３ p
pm（マレイミドＨ）において一重線を示した。
【００９９】実施例３３ マレイミドプロピオニル−cPND８の調製 実施例３１の方法により３．５mgのcPND８トリフルオロ
酢酸塩を１．５mgのマレイミドプロピオニル（Ｎ−ヒド
ロキシ）スクシニミドを含む、０．２４mlの１：２mg H
2O：MeCN溶液で反応させ、さらにそこへ０．１２mlの
０．１７５Ｍ NaHCO3 溶液を添加した。２．６mgのマレ
イミドプロピオニル−cPND８が回収され、これを調製用
HPLCにかけた（３０％MeCN／０．１％ TFA１０分間、３
０−５０％MeCN濃度勾配でさらに１０分間）、２２．５
−３０分における溶出ピーク部分を集め、濃縮、凍結乾
燥を行なった。FAB −MS：１２２８でＭ＋Ｈ、１２５０
でＭ＋Na、NMR(D20)６．８５ ppmでマレイミドヒドロジ
ェン
【０１００】実施例３４ マレイミドプロピオニル−cPND３２の調製 実施例５の方法により、１０ミリグラムのcPND３２トリ
フルオロ酢酸塩を０．３mlの１：２なる H2O：MeCN混合
液と０．１mlの０．３５Ｍ NaHCO3 溶液で溶解した。
３．２mgのマレイミドプロピオニルオキシスクシニミド
を加えてマレイミドプロピオニル−cPND３２トリフルオ
ロ酢酸塩を得た。このペプチドは２５から４０％MeCNの
濃度勾配を持つ０．１％TFA により調製用HPLCより溶
出、分離された。
【０１０１】実施例３５ マレイミドプロピオニル−cPND１５とマレイミドプロピ
オン酸（MPA)とのOMPC−SHの結合 OMPC（１０mlの３．２mg／ml溶液）を実施例３０に従が
いチオール化して０．４９６μMSH/mlを含む溶液を調製
した。分離用チューブ１本当り約４mgのMPA を含む３ml
の水溶液を分注して力価を測定した。マレイミド含有量
は８．３８μＭ／mlであった。実施例３１からのMPP −
cPND１５を０．８mlの水に溶解して、力価測定すると、
マレイミドの含有量は３．８４μＭ／mlであった。１７
２μｌ（０．４eq）の MPA溶液を遠心用チューブ中のOM
PC−SH溶液に加えて、窒素気流下で、静かに攪拌した。
この混合液を室温で１０分間反応させた後、５４０μｌ
（０．６eq）のマレイミドプロピオニル−cPND１５溶液
を添加した。反応停止後、１時間静置して遠心（１００
０ rpm、１分間）にかけた。上清を４Ｌの０．０１Ｍリ
ン酸緩衝液pH７．５で透析（１２，０００−１４，００
０分子量カット）した。透析は緩衝液を新たらしくし
て、さらに８時間続けた。この混合液をストッパ付きの
バイアル瓶に入れて冷蔵庫で保存した。ローリー（Lowr
y)タンパクアッセイ法により、２．８２mg結合タンパク
／mlであり、アミノ酸分析より２７１ｎmoles ノルロイ
シン／mlであった。１．１１mg／ナノモルの分子量にも
ちいたペプチド容量率は１０．７％として計算された。
全体回収率（すなわちタンパク回収率）は約８０％であ
った。未反応の過剰 MPP−cPND１５は凍結乾燥する事に
より回収した。
【０１０２】実施例３６ マレイミドブチリル−cPND３１、（MBP −cPND３１）の
調製 実施例３１の方法により、１０．６ミリグラムのcPND３
１トリフルオロ酢酸塩を、０．４５mlの１：２水：MeCN
及び０．１５mlの０．２５Ｍ NaHCO3 から成る溶液で溶
解した。γ−マレイミドブチル酸Ｎ−ヒドロキシスクシ
ニミドエステル（４．３mg）を加えて、０℃で１時間、
攪拌した。３μｌのトリフルオロ酢酸を加えて反応を停
止させ、ペプチドを調製用HPLCにより単離した：３０％
MeCN／１％TFA １０分間、さらに１０分間３０−５０％
MeCNの濃度勾配を用いて溶出。２１．２から２５分にお
けるピーク部分を集め濃縮後、凍結乾燥して３．８mgの
白色粉末を得た。FAB −MSは１３６９でＭ＋Ｈを示す。
【０１０３】実施例３７ マレイミドプロピオニル−cPND３１とマレイミドプロピ
オン酸とのOMPC−SHの結合；至適 MPAの決定：マレイミ
ドプロピオン酸（MPP ）の比率：段階希釈したマレイミ
ドプロピオン酸（MPA)をOMPC−SH（０．５９μMSH/ml）
を含むpH８、０．１Ｍリン酸緩衝液の入った６本のチュ
ーブに加えた。１０分後、過剰のマレイミドプロピオニ
ル−cPND３１を、それぞれのチューブに添加し、残存SH
基と反応させた。１時間後、それらのチューブを遠心
（１０００RPM 、１分）にかけ、各チューブにおける上
清中の吸光度を、波長２７５nmを用いて測定した。チュ
ーブ４−６においては濃厚な沈殿物が確認された。チュ
ーブ１−３の上清を４リッターの０．０１Ｍリン酸緩衝
液pH８で透析した後、各溶液について分析した： チューブ＃ 1 2 3 4 5 6 ％MPA 67 50 33 25 17 10 吸光度（２７５nm） 4.05 3.9 6 0.4 0.11 05 ローリータンパク （mg／ml） 2.15 1.95 2.4 ND' ND ND AAアッセイ (Nle)2 63.6 78.6 157 ND ND ND タンパク容量率 3.5％ 4.8 ％ 7.9 ％ ND ND ND １． ND ＝未決定 ２． ｎmoles/ml ３． mgペプチド（Nle)／mg総タンパク
【０１０４】実施例３８ MPP −cPND３１とマレイミドホスホニックアシッド（ME
PA) とのOMPC−SHの結合：実施例３０の方法により調製
されたOMPC−SH懸濁液の一部（０．５８７μ MSH／mlを
２ml）をそれぞれ２本の遠心用チューブに入れた。１０
３μｌ（３．７３μＭマレイミド／ml、０．３３eq）の
MEPAをチューブ＃１に加え、チューブ＃２には７８．６
μｌ（０．２５eq）を加えた。１５分後、MPP −cPND３
１、３．２２μＭマレイミド／mlをそれぞれのチューブ
に加えた（＃１へ２１２μｌ及び＃２へ２３８μｌ）。
１時間後、両チューブともに沈殿物の形成はなかった。
０．０１Ｍリン酸緩衝液pH８による透析後、それらのチ
ューブに対する溶液を回収し分析した： チューブ ＃１ ＃２ Au／２７５ ７．５ ８．２ ローリータンパク、mg／ml ２．３４ ２．５２ Nle 、nM／ml １８３ ２５０ ペプチド容量率、“ｊ” ９．４％ １２．３％
【０１０５】実施例３９ MPP −cPND８とマレイミドプロピオン酸（MPA)とのOMPC
−SHの結合：実施例３５の方法により、MPA （４７６μ
ｌ、４．３６μＭマレイミド／ml、０．４eq）の水溶液
をOPMC−SH（８．４ml、０．６２μＭSH／ml）の懸濁液
に加え、さらにMPP −cPND３２（５６０μＬ、５．５８
μＭマレイミド／ml、０．６eq）を加えた。実施例３５
の反応に従がい、９．０mlの懸濁液を得た：Au／２７５
＝６．９；ローリータンパク２mg／ml：Nle ＝２７５ｎ
Ｍ／ml、ペプチド容量率：１４．８９％。
【０１０６】実施例４０ MPP −cPND３２とMPA とのOMPC−SHの結合：実施例３０
に従がい調製されたOMPC−SH（９ml、６００μＭSH／m
l）の懸濁液へMPA （３９２μｌ、５．５μＭマレイミ
ド／ml、０．４eq）の水溶液を加えた。１０分後、MPP
−cPND３２（７０４μｌ、４．６μｍマレイミド／ml：
０．６eq）の溶液を添加し、この混合液を室温で１時間
反応させた。次にこの反応液を遠心（１０００RPM 、１
分間）にかけ、上清を４リットルの０．１Ｍリン酸緩衝
液pH７．５に対して透析した。透析後、結合体を含む懸
濁液を回収し、４℃で保存した。
【０１０７】実施例４１ MBP −cPND３１とMPA とのOMPC−SHの結合：実施例３５
の方法により、MPA （０．４eq）の水溶液をOMPC−SHの
懸濁液へ加えた後、マレイミドブチリルcPND３１（０．
６eq）の溶液を加えた。生成物を０．０１Ｍリン酸緩衝
液pH８に対する透析で精製した後、懸濁液として回収し
た。
【０１０８】実施例４２ マレイミドプロピオニル−OMPC（MP−OMPC）の調製 １０mlのOMPC（３．２ng／nl）を４３，０００RPM 、４
℃、２時間の遠心にかけ、得られた沈殿物を１．６mgの
重炭酸ナトリムを含む１：１ H2O：MeCNの冷溶液８mlで
再懸濁した。マレイミドプロピオニルＮ−ヒドロキシス
クシニミド（２．６mg）を加えて、この混合液を１時
間、氷中で攪拌した。２mlの０．１Ｍリン酸緩衝液pH６
を加えて、４３，０００RPM 、４℃、２時間の遠心にか
けた。マレイミド化OMPCを０．０１Ｍ緩衝液pH７で再懸
濁した後、遠心にかけて、再度、０．１Ｍリン酸緩衝液
pH８で懸濁した。マレイミド含有量はエレマン（Ellma
n）アッセイにより、量のわかっているＮ−アセチルシ
ステインを用いて測定された。
【０１０９】実施例４３ チオール酢酸（TAA ）とcPND９−SHとのマレイミドプロ
ピオニル−OMPCの反応：実施例４２の方法で調製された
マレイミドプロピオニル−OMPC（８ml、０．６μＭマレ
イミド／ml）の懸濁液へTAA （１９２μl 、１０μmole
s SH／ml、０．４eq）の溶液を加えて、激しく攪拌し
た。１０分間、cPND９（７２０μl 、０．４μＭSH／m
l、０．６eq）を加えて、室温で１時間静置した。この
混合液を遠心（１０００RPM 、１分間）し、その上清を
４Ｌの０．０１Ｍリン酸緩衝液pH７．５に対して１８時
間、透析した。新たな緩衝液でさらに８時間、透析を続
けた。得られた透析懸濁液を回収し、４℃に保存した。
アミノ酸及びローリータンパク分析によりペプチド容量
率を計算した。
【０１１０】実施例４４ チオール化スクシノイルOMPCの調製 １０mlのOMPC（３．２mg／ml）を４３，０００ RPM、４
℃、２時間の遠心にかけ、得られたOMPC沈殿物を６．３
mlのホウ酸緩衝液pH１１で再懸濁した。２ミリミッター
のOMPC懸濁液を氷中冷却されている３本のチューブにそ
れぞれ入れた。少量のスクシニックアンヒドライド（ア
セトニトリル中０．１Ｍ）をそれぞれのチューブに加え
て、激しく攪拌した。スクシニックアンヒドライド溶液
をチューブ＃１（８μl ）、チューブ＃２（１６μl
）、及びチューブ＃３（３２μl ）づつ添加した。反
応は０℃で２時間、室温で１時間行ない、その後各チュ
ーブに２mlのチオール化溶液（１０mlのホウ酸緩衝液pH
１１中に８５mgEDTA、１７mg DTT及び４６mgＮ−アセチ
ルホモシステインチオラクトンを含む）を加えた。チオ
ール化反応を室温で一晩行なった後、各チューブを４
３，０００RPM 、４℃、２時間の遠心にかけた。各チュ
ーブにおけるチオール化スクシノイルOMPCを１０mlの
０．０１リン酸緩衝液pH８で再懸濁した後、さらに遠心
を行ない、２mlの０．０１Ｍリン酸緩衝液pH８で再懸濁
した。各チューブにおけるスルフヒドリル力価はエルマ
ンアッセイにより測定された。
【０１１１】実施例４５ MPP −cPND３１とチオール化スクシノイルOMPCの結合：
実施例２０によるチオール化再懸濁スクシノイルOMPCの
各チューブに対して等量のマレイミドプロピオニル−cP
ND３１の溶液を処理した。反応を１時間行なった後、そ
れらのチューブを１０００ RPM、１分間の遠心にかけ
た。上清を１Ｌの０．０１Ｍリン酸緩衝液pH８を用いて
透析した。結合体を回収してノルロイシン及びタンパク
含有量の分析を行なった。
【０１１２】実施例４６ 本発明におけるマレイミドプロピオニル−cPND３１ある
いはマレイミドプロピオニル−cPND３３−OMPC−マレイ
ミドプロピオン酸結合体の動物への接種方法：一連の接
種においてアラムがアジュバントとして使用された。接
種材料はその結合体の最終濃度が３００μｇ／mlになる
様に生理食塩水で溶解して、調製された。前処理された
アラム（アルミニウムヒドロキサイドゲル）はその最終
量が５００μｇ／ml アルミニウムになる様に溶液へ加
えられた。結合体のアラムゲルへの吸着は室温で２時間
行なった。吸着後、結合体を保有するゲルを生理食塩水
で２回洗浄し、タンパク濃度が３００μｇ／mlになる様
に食塩水で再懸濁した。アラム吸着あるいはラビ（Rab
i) アジュバントによる結合体の３００μｇ容量３種、
あるいは１００μｇ容量３種をそれぞれアフリカミドリ
ザルに接種した。各容量は筋肉内へ接種された。また接
種は１ヵ月おきに行なった（０．４及び８週目）２週間
ごとに動物から採血し、以下の実施例に記載されている
様に特異的抗体の産生をアッセイする為に、それぞれの
血液から血清試料を調製した。
【０１１３】実施例４７ 抗ペプチドIgG 抗体に関する血清の分析 各血清試料を酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA)により
検査した。ポリスチレンミクロタイタープレートを−ウ
ェル０．５μｇの合成ペプチド（OMPCとは結合しない）
でコーティングする。使用溶液は合成ペプチドを含むリ
ン酸緩衝液生理食塩水（PBS)で、４℃で行なった。次に
各ウェルを０．０５％ツィーン２０を含むPBS(PBS −
Ｔ）で洗浄した。PBS −Ｔで連続希釈された被検血清を
ペプチド固相ウェルへ加え、３６℃、１時間、ペプチド
との吸着反応を行なった。PBS −Ｔで洗浄後、アルカリ
ホスファターゼ結合ヤギ抗ヒトIgG を各テストウェルへ
加えて、３６℃で１時間反応させた。すべてのウェルを
大量のPBS −Ｔで洗浄後、０．５ mM MgCl2・６H2O を
含む０．１％ｐ−ニトロフェニルホスフェートの１０％
ジエタノールアミンpH９．８を各ウェルに加えた。次い
で起こる反応は室温で３０分間した後、そこへ３．０Ｎ
NaOH を加える事により停止させた。被検血清中の抗体
とペプチドとの相互作用が強ければ強いほど、そのウェ
ル中におけるアルカリホスファターゼの結合量は増大す
る。ホスファターゼ酵素は、ｐ−ニトロフェニルホスフ
ェートの崩壊を媒介し波長４０５nmにおける光を吸収し
うる物質を形成させる。よって、ELISA 反応の最終段階
における４０５nmの光に対する吸光度とペプチドと結合
した抗体との間には直接的な関係がある。マレイミドプ
ロピオニル−cPND３１−OMPC−マレイミドプロピオン酸
あるいはマレイミドプロピオニル−cPND３３−OMPC−マ
レイミドプロピオン酸結合体を接種したすべてのサルに
おいてペプチドと特異的に結合しうる抗体が検出され
た。
【０１１４】実施例４８ HIV 感染を特異的に中和しうる活性物質に関する血清の
分析 ウィルス中和活性の検出はロバートソン（Robertson)
等、ジェイ・ヴィロル・メソッズ、（J.Virol.Method
s)、第２０巻、１９５−２０２（１９８８）記載の方法
によるアッセイで行なわれる。このアッセイにより被検
血清中の特異的HIV中和活性が測定される。このアッセ
イは、MT−４細胞、ヒトＴ−リンパ球細胞系は容易にHI
V の感染を受けウィルスの増殖後、感染の結果として細
胞は死滅してしまうという所見を基礎にしているアッセ
イ方法である。アッセイに先立って、被検血清を５６
℃、６０分間、加熱処理するこの操作はHIV 増殖を非特
異的に阻害する物質を消去する為に必要な操作である。
熱処理した血清をRPMI−１６４０細胞培養培地で連続希
釈し、HIV の標準感染容量と混合する。アッセイに使用
する前に、この容量はアッセイ用に培養してあるMT−４
細胞を７−８日目にすべて死滅させてしまうのに必要な
ウィルスの最小量として決められているものである。血
清とウィルスの接触を３７℃で１時間行ない、次にそこ
へ１０％仔牛血清を含むRPMI−１６４０増殖培地に懸濁
された１．０×１０5 個のMT−４細胞を加え、３７℃、
５％ CO2気流下で７日間培養する。培養最終時にメタボ
リック色素、 DTTを各培養中に添加する。この色素は光
学的検査において黄色を示す。生きた細胞の存在による
代謝産物は、この色素を青色を示す物質に変える。中和
されたHIV はその標的細胞であるMT−４細胞中では増殖
できず、それにより細胞を死滅させる事ができない。よ
って陽性中和活性はメタボリック色素を添加してその青
色の発現をもってアッセイされる。マレイミドプロピオ
ニル−cPND３３−OMPC−マレイミドプロピオン酸結合体
を接種したすべてのサルにおいて、上記に示す様にヒト
免疫不全ウィルスを中和しうる特異的抗体が検出され
た。
【０１１５】実施例４９ cPND３３とOMPCの結合 １．３−マレイミドプロピオン酸無水物の調製 ３−マレイミドプロピオン酸（２２６mg）に５mLの酢酸
無水物を作用させ１３０℃で３．７５時間、加熱処理し
た。さらに室温で一晩おいた。溶液は濃縮されて油状成
分となり、そのNMR スペクトル（CDCl3)はホモアンヒド
ライドの混合液と酢酸の無水物とマレイミドプロピオン
酸の混合物である事を示している。スタートの酸はカル
ボニル付近のメチレンを２．６８ ppmにおける三重線と
して表わし、一方無水物においては２．８１ ppmにおい
て共鳴が表われる。精製は分画昇華により効果的に行な
われ、最初は７０℃で０．２mm次に１２０℃で０．２mm
である。後者の分画をCDCl3 に溶解して昇華物より取り
出し３４mgの純粋ホモアンヒドライドが溶剤の蒸発によ
り得られる。CDCl3 より再結晶化され融点、１４３−１
４７℃をもつシクロセキサン物質が得られた。
【０１１６】２．“cPND３３の選択的アシル化 cPND３３（２２．５mg、７０％ペプチドで１５．７５mg
あるいは５．２１２ミクロモルに相当）を１２．０mlの
０．１Ｍスルホン酸モルフォリノエタン緩衝液pH５．２
５で溶解し氷浴中で冷却した。この溶液の分析及び反応
は２５％水性アセトニトリル：０．１％トリフルオロ酢
酸（TFA)を溶離液とした２５cmのODSカラムを用いたHPL
Cにより行なわれた。マレイミドプロピオン酸無水物
（２．０mg、６．２５ミクロモル）を０．６００mLの無
水テトラヒドロフランで溶解しこの溶液の０．５mL（無
水物の５．２ミクロモルに相当）を上記ペプチド溶液に
加えた。３０秒後に７ミクロリッターを取り出し、HPLC
で評価した。このアッセイを０．２５、０．５０、１．
２５、２．２５及び３．０時間で繰り返し行なった。
３．５時間後、この溶液を凍結乾燥した。凍結乾燥物質
を２．０mLの２０％水性アセトニトリルで溶解後０．２
ミクロンフィルターで濾過して、２１．２mm×２５cmゾ
ルバックス（Zorbax）Ｃ−１８カラムに０．７００mLづ
つ３回にわけてクロマトグラフィーを行なった。次の方
法で溶出した：流速＝１０mL／min ：２５％水性アセト
ニトリル／０．１％TFA （１２分間）の均一溶出：２８
％アセトニトリル（１０ min）の勾配溶出：３５％アセ
トニトリル（８分間）の勾配溶出。最終画分を濃縮単離
し凍結乾燥により８．９mgの出発材料（終わりから２番
目の画分）及び、質量スペクトル（FAB)が３１７２の分
子量を示す産生物９．６mgが回収された（すなわちcPND
３３のモノーマレイミドプロピオニル誘導体）。この産
生物は、リジンの欠損を調べる配列分析によりさらに解
析された（配列中におけるリジンの欠損は末端アミノ酸
のアシル化を意味する）。この結果は大部分の、しかし
すべてではないマレイミドプロピオニル部分がカルボキ
シル基末端にかくれたリジンと結合する事を示してい
る。
【０１１７】３．マレイミド化cPND３３とチオール化OP
MCの結合 Ａ．少量実験 水性３−マレイミドプロピオン酸（MPA)溶液（１mg／m
l）を調製した。次の操作により力価測定した：２．９
８mLのＮ−アセチルシステイン（PO4 緩衝液pH８．０中
０．２ミクロモル／mL）溶液へ０．０２mLのマレイミド
プロピオン酸溶液を加えた。１０分後に、０．１００mL
のエルマン（Ellman）試薬を添加した。O.D.は４１２nm
を用い、本試料を対称ビーム中に及び“ブランク”（試
料の代わりに水を使用）を試料ビーム中に入れて測定さ
れた。力価５．０ミクロモル／mLの３−マレイミドプロ
ピオン酸がこのエルマン“吸光度”アッセイにより検出
された。上記のマレイミド化ペプチド（MPP)（水中９．
６mg／０．８００mL）も同様に力価測定され、２．７ミ
クロモル／mLが検出された。Ｎ−アセチルホモシステイ
ンチオラクトンを有するチオール化OPMCはエルマンアッ
セイにより力価0.７７５ミクロモルSH／mlとして検出さ
れた。反応性のあるこのチオール化OPMC溶液０．５ml
へ、０．０４４mLのMPA 溶液を加えて１０分間、室温で
反応させ、さらに０．０４４mLのMPP 溶液を加えた。結
合体の沈殿形成は認められなかった。 Ｂ．大量実験 ８．５mL（６．６ミクロモルのSH）の上記チオール化OP
MC溶液へ０．８５mLの MPA溶液（４．２５ミクロモルあ
るいは６５％MPA ）を加えて１０分間反応し、さらに、
０．８５mLのMPP 溶液（２．３ミクロモルあるいは３５
％MPP ）を加えた。４℃で１６時間反応させた後、沈殿
物が確認された。この沈殿物を懸濁し、０．００５mLの
５Ｎ NaOH によりpH８．１３に調整した。３時間後、少
量の沈殿を低速遠心により取り出した。結合体を４３Ｋ
rpm、４℃、２時間の超遠心に２回かけさらに精製し
た。沈殿物を０．０３Ｍリン酸緩衝液pH 、に再懸濁し
ダウンスホモジナイザーにかけた。最終結合体溶液につ
いてタンパク（fd：０．９２mg／ml）アッセイ及びアミ
ノ酸分析（Nle ＝６０．３５ナノモル／mL、つまりペプ
チド：ベーターアラニン１３９．６ナノモル、すなわち
結合体のトータルマレイミド化合物）を行なった。これ
はタンパク量に対するペプチドの２０．４％容量率に相
当する。この結合体はアミノ末端ノルロイシンあるいは
３個の内部リジンを介したOMPC結合cPND３３の混合物で
ある。ウサギを用いた試験により、本結合体はHIV 中和
抗体の上昇に効果的である事が認められた。
【０１１８】本発明の原理を上記明細に、説明を目的と
した実施例と伴に示してはあるが、特許請求の範囲の中
に記載されているように、本発明の実施には一般的な変
法、適応、改良あるいは削除などが含まれている事はよ
く知られている事である。
【配列表】
【０１１９】配列番号：１ 配列の長さ：２６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：両形態 配列の種類：ペプチド 配列の特徴 特徴を表わす記号：Modified Site 存在位置：１ 他の情報：Nle 特徴を表わす記号：Disulfide bond 存在位置：２．．２６ 配列： Leu Cys Tyr Asn Lys Arg Lys Arg Ile His Ile Gly Pro 1 5 10 Gly Arg Ala Phe Tyr Thr Thr Lys Asn Ile Ile Gly Cys 15 ２０
２５
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (31)優先権主張番号 ７１５２７８ (32)優先日 1991年６月19日 (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (72)発明者 ステフェン マルブルグ アメリカ合衆国，08840 ニュージャーシ ィ，メチュチェン，コンコード アヴェニ ュー 50 (72)発明者 リチャード エル．トルマン アメリカ合衆国，07059 ニュージャーシ ィ，ウォーレン，アッパー ウォーレン ウェイ 29 (72)発明者 エミリオ エー．エミニ アメリカ合衆国，19301 ペンシルヴァニ ア，パオリ，ファッグス マナー レーン ６

Claims (24)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 生理学的 pH においてアニオン性または
    ポリアニオン性を示す低分子量部分−ａ- につながって
    いる第１の共有結合連結のセット、及びヒト免疫不全ウ
    イルス（ＨＩＶ）主要中和決定基（ＰＮＤ）を含むペプ
    チドまたは免疫学的にそれと等価なペプチドにつながっ
    ている第２の共有結合連結のセットを有する免疫原性タ
    ンパク質または複合タンパク質からなる共複合体。
  2. 【請求項２】 該免疫原性タンパク質が実質的にナイセ
    リア・メニンギチジス（Neisseria Meningitidis）ｂの
    外膜複合タンパク質（ＯＭＰＣ）からなり、該ＰＮＤペ
    プチドが鎖状構造、ジスルフィド結合環状構造、アミド
    結合環状構造またはチオエーテル結合環状構造を有する
    請求項１記載の共複合体。
  3. 【請求項３】 該ＰＮＤペプチドが配列： −ＧlyＰroＧlyＡrg−，−ＧlyＰroＧlyＬys−，−Ｇly
    ＰroＧlyＶal−，−ＧlyＰroＧlyＧln−，−ＧlyＬeuＧ
    lyＧln−，−ＧlyＰroＧlyＡrgＡlaＰhe−, −ＨisＩle
    ＧlyＰroＧlyＡrgＡlaＰhe−，又は−ＧlnＡrgＧlyＰro
    ＧlyＡrgＡlaＰhe−。 からなる請求項２記載の共複合体。
  4. 【請求項４】 該ＰＮＤペプチドがコアすなわちループ
    アミノ酸構造： −ｘ−Ｘn −Ｘ1 −Ｘ2 −ＧＰＧＲ−Ｘ3 −Ｘ4 −Ｘm
    −ｙ− 〔式中：−ＧＰＧＲ−は４量体−ＧlyＰroＧlyＡrg−で
    あり；Ｘ1 は： ａ） セリン、 ｂ） プロリン、 ｃ） アルギニン、 ｄ） ヒスチジン、 ｅ） グルタミン、または ｆ） トレオニンであり； Ｘ2 は： ａ） イソロイシン、 ｂ） アルギニン ｃ） バリン、または ｄ） メチオニンであり； Ｘn は結合または１５個以下のアミノ酸からなるペプチ
    ドであり； Ｘ3 は： ａ） アラニン、 ｂ） アルギニン、または ｃ） バリンであり； Ｘ4 は： ａ） フェニルアラニン、 ｂ） イソロイシン、 ｃ） バリン、または ｄ） ロイシンであり； Ｘm は結合または１５個以下のアミノ酸からなるペプチ
    ドであり；−ｘ−および−ｙ−は互に共有結合して環状
    ペプチド（これはＯＭＰＣに共有結合する）を形成す
    る。〕を有するＰＮＤペプチド、または製薬上許容し得
    るその塩である請求項３記載の共複合体。
  5. 【請求項５】 ｘとｙの間の環状共有結合構造が： ａ） ループアミノ酸の一方の側のアミノ基とループア
    ミノ酸の他方の側のカルボキシル基との間のアミド結
    合、 ｂ） ループアミノ酸の両側のスルフヒドリル含有アミ
    ノ酸同士の間のキシリレンチオエーテルまたは低級アル
    キルチオエーテル結合、または ｃ） ループアミノ酸の両側のスルフヒドリル含有アミ
    ノ酸同士の間のジスルフィド結合からなる請求項４記載
    の共複合体。
  6. 【請求項６】 生理学的 pH においてアニオン性または
    ポリアニオン性を示す低分子量部分−ａ- につながって
    いる第１の共有結合連結のセット、及びヒト免疫不全ウ
    イルス（ＨＩＶ）主要中和決定基（ＰＮＤ）を含むペプ
    チドにつながっている第２の共有結合連結のセットを有
    し、上記第１、第２もしくは両方の共有結合連結のセッ
    トがマレイミドの誘導体を含む、免疫原性タンパク質ま
    たは複合タンパク質からなる共複合体。
  7. 【請求項７】 低分子量アニオン性部分−ａ- と免疫原
    性タンパク質との間の共有結合連結が基Ｒからなってい
    て構造−Ｒ−ａ- 〔式中：−Ｒ−は： ａ） 低級アルキル、 ｂ） 置換低級アルキル、 ｃ） シクロアルキル、 ｄ） 置換シクロアルキル、または ｅ） フェニルであり； −ａ- は、カルボン酸、スルホン酸またはホスホン酸の
    アニオン形から運ばれる１乃至５個の残基である。〕を
    形成している請求項６記載の共複合体。
  8. 【請求項８】 該免疫原性タンパク質が実質的にナイセ
    リア・メニンギチジス（Neisseria Meningitidis）ｂの
    外膜複合タンパク質（ＯＭＰＣ）である請求項７記載の
    共複合体。
  9. 【請求項９】 構造：j （ＰＥＰ−Ａ−）−ＯＭＰＣ−（−Ｂ−ａ- ）x 〔式中：−ａ- は生理学的 pH においてアニオン性また
    はポリアニオン性を示す低分子量部分であってカルボン
    酸、スルホン酸またはホスホン酸のアニオン形である１
    乃至５個の残基からなり；ｘは共複合体中のＢ−ａ- の
    モル数であってｍの１乃至９０％であり；ｍは複合前に
    おける免疫原性タンパク質ＰＲＯ中の反応性求核官能部
    位のモル量であり；ＰＥＰは実質的にＨＩＶＰＮＤから
    なり；ｊはペプチド負荷であって全共複合体タンパク質
    の１乃至５０％であり；−Ａ−は実質的に連結： 【化１】 からなり；−Ｂ−は実質的に連結： 【化２】 からなり；−Ｓ−はイオウであり；−Ｒ1 は： ａ） 水素、 ｂ） 低級アルキル、または ｃ） −SO3Hであり； −Ｒ2 は： ａ） 低級アルキル、 ｂ） カルボニル、または ｃ） 低級アルキルアシルアミノである。〕を有する請
    求項８記載の共複合体または製薬上許容し得るその塩。
  10. 【請求項１０】 該ＰＥＰが： 【化３】 〔式中：ｒはＰＥＰとＯＭＰＣとが結合する位置であ
    り；Ｒ1 は： ａ） 結合、または ｂ） １乃至５個のアミノ酸からなるペプチド（標識ア
    ミノ酸を含んでいてもよい。）であり；Ｒ2 は： ａ） Ｒ3 が少なくとも２個のアミノ酸からなるペプチ
    ドであるときは、結合または１７個以下のアミノ酸から
    なるペプチドであり、あるいは ｂ） Ｒ3 が結合であるときは２乃至１７個のアミノ酸
    からなるペプチドであり； Ｒ3 は： ａ） Ｒ2 が少なくとも２個のアミノ酸からなるペプチ
    ドであるときは、結合または１７個以下のアミノ酸から
    なるペプチドであり、あるいは ｂ） Ｒ2 が結合であるときは２乃至１７個のアミノ酸
    からなるペプチドであり；−ＧＰＧＲ−は４量体−Ｇly
    ＰroＧlyＡrg−であり；Ｒ4 は： ａ） Ｒ7 がＲ8 のときは−NH−CH−CO−（Ｒ7 がメチ
    ン炭素に結合する）であり、あるいは ｂ） Ｒ7 が： 【化４】 のときはＲ3 からＲ7 およびＲ5 への結合であり；Ｒ5
    は： ａ） １乃至５個のアミノ酸からなるペプチド（標準ア
    ミノ酸を含んでいてもよい）、 ｂ） −OH、 ｃ） −COOH、 ｄ） −CONH2 、 ｅ） −NH2 、または ｆ） 不存在であり； Ｒ6 は： ａ） Ｒ7 への任意結合（−−−−−−）が不存在のと
    きは通常のＬまたはＤアミノ酸のアミノ酸側鎖（定義お
    よび略号の表を参照）のいずれか、 ｂ） Ｒ7 がＲ8 のときは−Ｒ8 −Ｓ−Ｓ−もしくは−
    Ｒ8 −Ｓ−Ｒ8 −Ｒ9−Ｒ8 −Ｓ−、あるいは ｃ） Ｒ7 が 【化５】 のときは−Ｒ8 −ＮＨ−であり；Ｒ7 は： ａ） −Ｒ8 −、 ｂ） −Ｃ＝Ｏ、または ｃ） 【化６】 であり；Ｒ8 は結合または１乃至８個の炭素原子からな
    る低級アルキルであり；Ｒ9 は： ａ） Ｒ10、または ｂ） キシリレンであり； Ｒ10は： ａ） 低級アルキル、または ｂ） −CH2 −Ｏ−CH2 −であり； −Ｒ2 −ＧＰＧＲ−Ｒ3 −はＰＥＰのコアすなわちルー
    プアミノ酸構造である。〕に限定される請求項８記載の
    共複合体。
  11. 【請求項１１】 ＰＥＰコアアミノ酸構造−Ｒ2 −ＧＰ
    ＧＲ−Ｒ3 −が −Ｘn Ｘ1 Ｘ2 −ＧＰＧＲ−Ｘ3 Ｘ4 Ｘm − 〔式中−ＧＰＧＲ−は四量体−ＧlyＰroＧlyＡrg−であ
    る：Ｘ1 はＲ2 の構成体で下記から選ばれる： ａ） セリン ｂ） プロリン ｃ） アルギニン ｄ） ヒスチジン ｅ） グルタミン ｆ） スレオニン Ｘ2 はＲ2 の構成要素で下記から選ばれる： ａ） イソロイシン ｂ） アルギニン ｃ） バリン ｄ） メチオニン Ｘn はＲ2 の構成要素であって単結合あるいは１５アミ
    ノ酸までのペプチドである。Ｘ3 はＲ3 の構成要素であ
    って下記から選ばれる： ａ） アラニン ｂ） アルギニン ｃ） バリン Ｘ4 はＲ3 の構成要素であって下記から選ばれる： ａ） フェニルアラニン ｂ） イソロイシン ｃ） バリン ｄ） ロイシン Ｘm はＲ3 の構成要素であって、単結合あるいは１５ア
    ミノ酸までのペプチドである。〕である請求項１０記載
    の共複合体。
  12. 【請求項１２】 ＰＥＰが下記構造 【化７】 【化８】 【化９】 【化１０】 【化１１】 〔式中ｒは複合体のペプチドと陰イオン性ポリサッカラ
    イドの間の連結位置である。ただしｃＰＮＤ３３はアミ
    ノ末端Ｎleあるいは内部のリジン残基を介して結合され
    ている〕を有するペプチドの１つまたはそれ以上からな
    る請求項１０記載の複合体。
  13. 【請求項１３】 下記の構造 【化１２】 【化１３】 〔式中−ａ- は生理的 pH でアニオン、あるいはポリア
    ニオン性性質を有し、１から５個までのカルボン酸、ス
    ルホン酸、またはホスホン酸残基を有する低分子部分：
    ｘは共複合体中のａ- のモル数であって、ｍの１％から
    ９０％の間にある：ｍは複合体化する前のＯＭＰＣの反
    応性親核性官能基のモル量である：ＰＥＰは基本的にＨ
    ＩＶ ＰＮＤの一つである：（Ｆ）n-m はＰＲＯ上の官
    能基の総数Ｆn から誘導体化された官能基の数Ｆmを減
    じたものである：−Ｒ−は ａ） 低級アルキル、 ｂ） 置換低級アリール、 ｃ） シクロアルキル、 ｄ） 置換シクロアルキル、 ｅ） フェニルである： −Ｒ1 は ａ） 水素、 ｂ） 低級アルキル、 ｃ） 低級アルキルアシルアミノである： −Ｓ−はイオウである：ＯＭＰＣはナイセリア・メニン
    ギチジスｂの外膜複合蛋白質である〕を有する複合体。
  14. 【請求項１４】 以下の構造 【化１４】 【化１５】 【化１６】 【化１７】 〔式中、変数はすべて請求項１３で規定するとおりであ
    る〕を有する請求項１３の複合体または医薬的に許容さ
    れるその塩。
  15. 【請求項１５】 請求項１、請求項６、請求項１３また
    は請求項１４記載の複合体と不活性の担体からなり、そ
    の他のアジュバントあるいは免疫調節物質を含んでも良
    い医薬組成物。
  16. 【請求項１６】 下記の構造 Ｊ（ＰＥＰ−Ａ−）−ＰＲＯ−（−Ｂ−ａ- ）x 〔式中ＰＥＰはＨＩＶ ＰＮＤペプチドまたはＨＩＶ
    ＰＮＤを認識できるほ乳類の免疫応答を誘導できるペプ
    チドである：ＰＲＯは免疫原性蛋白質あるいは蛋白質複
    合体である：−Ａ−は共有結合連結であって、好ましく
    は２種間スペーサーである：−Ｂ−は共有結合連結であ
    る：−ａ- は生理的 pH で陰イオン性、あるいはポリア
    ニオン性性質を有し、１から５個までのカルボン酸、ス
    ルホン酸、またはホスホン酸残基を有する低分子量部
    分：ｊはペプチド荷重であって、複合体中のペプチドの
    質量のパーセントであり、複合体中の全蛋白質量の１％
    から９０％のあいだにある：ｘは共複合体中の−Ｂ−ａ
    - のモル数であって、ｍの１％から９０％の間にある：
    ｍは複合体化する前のＯＭＰＣの反応性親核性官能基の
    モル量である〕の構造を有する複合体またはその医薬的
    に許容される塩を製造する方法であって、 １ａ） スルフヒドリル基を蛋白質に付加する試薬と蛋
    白質の求核性基とを反応させ、 １ｂ） 工程１ａにおいて蛋白質に付加されたスルフリ
    ル基のフラクションと、求電子性基および生理的 pH で
    負の電荷を有するアニオンを含む試薬とを反応させ、 １ｃ） 工程１ｂの生成物と、あらかじめ誘導体にした
    ペプチドとを反応させて求電子性基をペプチドに付加す
    る：または ２ａ） 蛋白質の求核性基と、二官能性求電子性試薬と
    を反応させて求電子性蛋白質を生じさせ、 ２ｂ） 工程ａの生成物上の求電子部位のフラクション
    と、求核性基およびアニオン性基の両方を含む試薬とを
    反応させ、 ２ｃ） 工程２ｂの生成物と、求核性基を含むペプチド
    とを反応させる：または、 ３ａ） 蛋白質の求核性基のフラクションと、アニオン
    またはインシピエントアニオンと求電子性基の両方を含
    む試薬とを反応させ、 ３ｂ） 工程３ａの生成物上の求核性基の残余のフラク
    ションと、チオール基を蛋白質に発生させる試薬とを反
    応させ、 ３ｃ） 工程３ｂの生成物と、あらかじめ誘導体にした
    ペプチドとを反応させて求電子性基を付加する：または ４ａ） 蛋白質の求核性基のフラクションと、アニオン
    またはインシピエントアニオンと求電子性基の両方を含
    む試薬とを反応させ、 ４ｂ） 工程４ａの生成物上の残余の蛋白質求核性基
    と、二官能性求電子試薬とを反応させて求電子性部位を
    蛋白質に付加し、 ４ｃ） 工程４ｂの生成物を、求電子性基を含むペプチ
    ドとを反応させる： 工程を特徴とする方法。
  17. 【請求項１７】 ＰＲＯがナイセリア・メニンギチジス
    ｂのＯＭＰＣである、以下の構造 【化１８】 〔式中−ａ- は生理的 pH で陰イオン性、あるいはポリ
    アニオン性性質を有し、１から５個までのカルボン酸、
    スルホン酸、またはホスホン酸残基を有する低分子部
    分：ｊはペプチド荷重であって、複合体中のペプチドの
    質量のパーセントであり、複合体中の全蛋白質量の１％
    から９０％のあいだにある：ｘは共複合体中の−Ｂ−ａ
    - のモル数であって、ｍの１％から９０％の間にある：
    ｍは複合体化する前のＯＭＰＣの反応性親核性官能基の
    モル量である：−Ｒ−は ａ） 低級アルキル、 ｂ） 置換低級アリール、 ｃ） シクロアルキル、 ｄ） 置換シクロアルキル、 ｅ） フェニルである： −Ｒ1 は ａ） 水素、 ｂ） 低級アルキル、 ｃ） 低級アルキルアシルアミノである： −Ｓ−はイオウである：〕を有する共複合体またはその
    医薬的に許容される塩を製造する請求項１６記載の方法
    であって、 １ａ） スルフヒドリル基を蛋白質に付加する試薬と蛋
    白質の求核性基とを反応させ、 １ｂ） 工程１ａにおいて蛋白質に付加されたスルフリ
    ル基のフラクションと、求電子性基および生理的 pH で
    負の電荷を有するアニオンを含む試薬とを反応させ、 １ｃ） 工程１ｂの生成物と、あらかじめ誘導体にした
    ペプチドとを反応させて求電子性基をペプチドに付加す
    る： 工程を特徴とする方法。
  18. 【請求項１８】 ＰＲＯがナイセリア・メニンギチジス
    ｂのＯＭＰＣである、以下の構造 【化１９】 〔式中−ａ- は生理的 pH で陰イオン性、あるいはポリ
    アニオン性性質を有し、１から５個までのカルボン酸、
    スルホン酸、またはホスホン酸残基を有する低分子部
    分：ｊはペプチド荷重であって、複合体中のペプチドの
    質量のパーセントであり、複合体中の全蛋白質量の１％
    から９０％のあいだにある：ｘは共複合体中の−Ｂ−ａ
    - のモル数であって、ｍの１％から９０％の間にある：
    ｍは複合体化する前のＯＭＰＣの反応性親核性官能基の
    モル量である：−Ｒ−は ａ） 低級アルキル、 ｂ） 置換低級アリール、 ｃ） シクロアルキル、 ｄ） 置換シクロアルキル、 ｅ） フェニルである： −Ｒ1 は ａ） 水素、 ｂ） 低級アルキル、 ｃ） 低級アルキルアシルアミノである： −Ｓ−はイオウである：〕を有する共複合体またはその
    医薬的に許容される塩を製造する請求項１６記載の方法
    であって、 ２ａ） 蛋白質の求核性基と、二官能性求電子性試薬と
    を反応させて求電子性蛋白質を生じさせ、 ２ｂ） 工程ａの生成物上の求電子部位のフラクション
    と、求核性基およびアニオン性基の両方を含む試薬とを
    反応させ、 ２ｃ） 工程２ｂの生成物と、求核性基を含むペプチド
    とを反応させる： 工程を特徴とする方法。
  19. 【請求項１９】 ＰＲＯがナイセリア・メニンギチジス
    ｂのＯＭＰＣである、以下の構造 【化２０】 〔式中−ａ- は生理的 pH で陰イオン性、あるいはポリ
    アニオン性性質を有し、１から５個までのカルボン酸、
    スルホン酸、またはホスホン酸残基を有する低分子部
    分：ｊはペプチド荷重であって、複合体中のペプチドの
    質量のパーセントであり、複合体中の全蛋白質量の１％
    から９０％のあいだにある：ｘは共複合体中の−Ｂ−ａ
    - のモル数であって、ｍの１％から９０％の間にある：
    ｍは複合体化する前のＯＭＰＣの反応性親核性官能基の
    モル量である：−Ｒ−は ａ） 低級アルキル、 ｂ） 置換低級アリール、 ｃ） シクロアルキル、 ｄ） 置換シクロアルキル、 ｅ） フェニルである： −Ｒ1 は ａ） 水素、 ｂ） 低級アルキル、 ｃ） 低級アルキルアシルアミノである： −Ｓ−はイオウである：〕共複合体またはその医薬的に
    許容される塩を製造する請求項１６記載の方法であっ
    て、 ３ａ） 蛋白質の求核性基のフラクションと、アニオン
    またはインシピエントアニオンと求電子性基の両方を含
    む試薬とを反応させ、 ３ｂ） 工程３ａの生成物上の求核性基の残余のフラク
    ションと、チオール基を蛋白質に発生させる試薬とを反
    応させ、 ３ｃ） 工程３ｂの生成物と、あらかじめ誘導体にした
    ペプチドとを反応させて求電子性基を付加する： 工程を特徴とする方法。
  20. 【請求項２０】 ＰＲＯがナイセリア・メニンギチジス
    ｂのＯＭＰＣである、以下の構造 【化２１】 〔式中−ａ- は生理的 pH で陰イオン性、あるいはポリ
    アニオン性性質を有し、１から５個までのカルボン酸、
    スルホン酸、またはホスホン酸残基を有する低分子部
    分：ｊはペプチド荷重であって、複合体中のペプチドの
    質量のパーセントであり、複合体中の全蛋白質量の１％
    から９０％のあいだにある：ｘは共複合体中の−Ｂ−ａ
    - のモル数であって、ｍの１％から９０％の間にある：
    ｍは複合体化する前のＯＭＰＣの反応性親核性官能基の
    モル量である：−Ｒ−は ａ） 低級アルキル、 ｂ） 置換低級アリール、 ｃ） シクロアルキル、 ｄ） 置換シクロアルキル、 ｅ） フェニルである： −Ｒ1 は ａ） 水素、 ｂ） 低級アルキル、 ｃ） 低級アルキルアシルアミノである： −Ｓ−はイオウである：〕を有する共複合体またはその
    医薬的に許容される塩を製造する請求項１６記載の方法
    であって、 ４ａ） 蛋白質の求核性基のフラクションと、アニオン
    またはインシピエントアニオンと求電子性基の両方を含
    む試薬とを反応させ、 ４ｂ） 工程４ａの生成物上の残余の蛋白質求核性基
    と、二官能性求電子試薬とを反応させて求電子性部位を
    蛋白質に付加し、 ４ｃ） 工程４ｂの生成物を、求電子性基を含むペプチ
    ドとを反応させる： 工程を特徴とする方法。
  21. 【請求項２１】 請求項１、請求項６、または請求項１
    ３記載の組成物と不活性担体からなる医薬組成物の免疫
    的に有効な量をほ乳動物に投与することからなり、場合
    によっては追加の複合体を投与して免疫反応を高めるこ
    ともできる、ほ乳類に投与して抗ＰＮＤペプチド、抗Ｈ
    ＩＶ、ＨＩＶ中和性免疫応答を高める方法。
  22. 【請求項２２】 ほ乳動物がヒトである請求項２１記載
    の方法。
  23. 【請求項２３】 請求項１、請求項６、または請求項１
    ３記載の共複合体と不活性担体からなる医薬組成物の免
    疫的に有効な量をヒトに単独あるいは免疫調節剤、アジ
    ュバント、抗ウイルス剤とともに投与し、場合によって
    は追加の複合体を投与して抗ＰＮＤペプチド、抗ＨＩ
    Ｖ、ＨＩＶ中和性免疫反応を高めることを特徴とする、
    ＨＩＶ感染の危険性のあるヒト、すでにＨＩＶ陽性血清
    を有するヒトあるいはエイズ患者を治療または予防する
    方法。
  24. 【請求項２４】 請求項１、請求項６、請求項１２また
    は請求項１３記載の複合体および不活性の担体からなる
    組成物の免疫的に有効な量を単独あるいは免疫調節剤、
    アジュバント、抗ウイルス剤とともにほ乳動物に投与
    し、場合によっては追加の複合体を投与して抗ＰＮＤペ
    プチド、抗ＨＩＶ、ＨＩＶ中和性免疫応答を高め、得ら
    れた抗血清あるいはその抗血清から単離した抗体を十分
    量投与することを特徴とする、ＨＩＶ感染の危険性のあ
    るヒトを受動的に保護し、すでにＨＩＶ感染したヒトの
    ＨＩＶ増殖からヒトを保護し、エイズ患者を治療する方
    法。
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Families Citing this family (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2047078A1 (en) * 1990-07-19 1992-01-20 Steven S. Bondy Cyclic hiv principal neutralizing determinant peptides
CA2047033A1 (en) * 1990-07-19 1992-01-20 Elizabeth E. Sugg Cyclic hiv principal neutralizing determinant peptides
CA2047042A1 (en) * 1990-07-19 1992-01-20 John Hannah Cyclic hiv principal neutralizing determinant peptides
CA2058876A1 (en) * 1991-12-19 1993-06-20 Maria A. Bednarek Cyclic hiv principal neutralizing determinant peptides
GB2271995A (en) * 1992-10-15 1994-05-04 Merck & Co Inc HIV peptide conjugated via anionic spacer to protein
GB2282380A (en) * 1993-09-30 1995-04-05 Merck & Co Inc Conjugate of epitopes of HIV with a protein complex from Neisseria
GB2282378A (en) * 1993-09-30 1995-04-05 Merck & Co Inc Conjugates of epitopes of HIV with a protein complex from Neisseria
US6664367B1 (en) * 1994-07-21 2003-12-16 Biosynthema, Inc. Stable analogs of bioactive peptides containing disulfide linkages
GB2294047A (en) * 1994-10-14 1996-04-17 Merck & Co Inc Synthetic peptides for use as epitopes specific for HIV
EP1098666B1 (en) * 1998-07-17 2013-01-16 The United States of America, represented by the Secretary, Department of Health and Human Services Water-soluble drugs and methods for their production
US6747055B1 (en) 1998-07-17 2004-06-08 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Water-soluble drugs and methods for their production
DE19936715A1 (de) * 1999-08-06 2001-02-15 Ticona Gmbh Emissionsarme eingefärbte Polyoxymethylen-Formmassen
EP1290230A4 (en) * 2000-06-02 2004-10-20 Merck & Co Inc HEPATITIS C VIRUS CONJUGATE
DE60107022T2 (de) 2000-07-24 2005-11-24 Health Research Inc. Verfahren zur Detektion von Prostata-spezifischem Membran-Antigen in Serum
US20030224011A1 (en) * 2001-05-29 2003-12-04 Conley Anthony J Hepatitis c virus conjugates
EP1569955A2 (en) * 2002-12-03 2005-09-07 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Gp120 specific antigens, conjugates thereof, methods for their preparation and uses thereof
WO2004073659A2 (en) * 2003-02-14 2004-09-02 Merck & Co., Inc. HIV gp120 MIMOTOPE ANTIGEN
EP1603590A4 (en) * 2003-03-07 2008-08-27 Merck & Co Inc INFLUENZA VIRUS VACCINE
DE602004031051D1 (de) * 2003-12-18 2011-02-24 Angeletti P Ist Richerche Bio Verfahren zur herstellung eines peptid-träger-konjugats mit hoher immunogenizität
EP1885395A4 (en) * 2005-05-16 2009-12-02 Merck & Co Inc METHOD FOR INCREASING IMMUNIGENICITY OF PLASMODIUM ANTIGENS
EP2638058B1 (en) 2010-11-12 2017-01-11 Merck Sharp & Dohme Corp. Enolase peptide conjugate vaccines against staphylococcus aureus
US9649375B2 (en) 2013-03-14 2017-05-16 The Administrators Of The Tulane Educational Fund Immunogenic peptide conjugate and method for inducing an anti-influenza therapeutic antibody response therewith
KR102289985B1 (ko) 2014-12-08 2021-08-17 삼성디스플레이 주식회사 표시 장치

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS61186400A (ja) * 1984-12-20 1986-08-20 メルク　エンド　カムパニー　インコーポレーテッド 細菌由来中性多糖類と免疫原性タン白との安定な、共有結合された多糖―タンパク質結合体、該結合体の製造方法並びに該結合体を含む医薬組成物
JPH0222300A (ja) * 1987-02-02 1990-01-25 Swiss Serum & Vaccine Inst Bern 免疫原性接合体およびその製法ならびに免疫を生ぜしめる方法

Family Cites Families (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4767842A (en) * 1973-05-07 1988-08-30 The Ohio State University Antigenic modification of polypeptides
US4762913A (en) * 1973-05-07 1988-08-09 The Ohio State University Antigenic modification of polypeptides
US4691006A (en) * 1983-03-04 1987-09-01 Ohio State University Antigenic modification of polypeptides
US4902506A (en) * 1983-07-05 1990-02-20 The University Of Rochester Immunogenic conjugates
US4695624A (en) * 1984-05-10 1987-09-22 Merck & Co., Inc. Covalently-modified polyanionic bacterial polysaccharides, stable covalent conjugates of such polysaccharides and immunogenic proteins with bigeneric spacers, and methods of preparing such polysaccharides and conjugates and of confirming covalency
US4956273A (en) * 1985-10-24 1990-09-11 Southwest Foundation For Biomedical Research Synthetic peptides and method of use for diagnosis and vaccination for AIDS and ARC
US5017688A (en) * 1986-06-12 1991-05-21 Biogen, Inc. Peptides involved in the pathogenesis of HIV infection
AU7786387A (en) * 1986-07-21 1988-02-10 Southwest Foundation For Biomedical Research Composition of matter and method of immunizing against viral causative agents of aids and arc
EP0525828A3 (en) * 1986-08-01 1993-02-24 Repligen Corporation Recombinant polypeptides and their uses, including assay for aids virus
CA1329124C (en) * 1987-02-02 1994-05-03 Jerald C. Sadoff Conjugate malaria vaccine
AU1711888A (en) * 1987-04-24 1988-12-02 Biogen, Inc. Immunotherapeutic methods and compositions
IL87391A0 (en) * 1987-08-27 1989-01-31 Repligen Corp Hiv proteins and peptides,dna coding therefor,vectors comprising such dna,the use of the proteins and peptides in diagnosis of aids and vaccine compositions containing them
US5019387A (en) * 1987-09-08 1991-05-28 Duke University Production of antibodies to HIV
US5013548A (en) * 1987-09-08 1991-05-07 Duke University Production of antibodies to HIV
NL8702403A (nl) * 1987-10-09 1989-05-01 Stichting Centr Diergeneeskund Oligopeptiden en gebruik daarvan voor diagnostische en vaccinatiedoeleinden voor aids en arc.
EP0311228A3 (en) * 1987-10-09 1990-05-02 Repligen Corporation Recombinant polypeptides and their uses, including assay for aids virus
JPH01190636A (ja) * 1988-01-22 1989-07-31 Green Cross Corp:The 制癌作用物質複合体
DE3802060A1 (de) * 1988-01-25 1989-07-27 Boehringer Mannheim Gmbh Hapten-protein-konjugate und ihre verwendung
CA1341285C (en) * 1988-02-12 2001-08-14 Chang Yi Wang Synthetic peptides for the detection of antibodies to hiv gp120 envelope protein for diagnosis of aids and pre-aids conditions and as vaccines
EP0339504A3 (en) * 1988-04-26 1990-09-12 The Du Pont Merck Pharmaceutical Company Human immunodeficiency virus (hiv) env-coded peptide capable of eliciting hiv-inhibiting antibodies in mammals
KR900701836A (ko) * 1988-10-03 1990-12-04 라메쉬 엘. 라탄 신규 hiv 단백질 및 aids의 진단, 예방 또는 치료에 유용한 펩티드
IL94558A0 (en) * 1989-06-06 1991-03-10 Merck & Co Inc Conjugate immunogen for aids and vaccine and pharmaceutical compositions containing it
GB8923123D0 (en) * 1989-10-13 1989-11-29 Connaught Lab A vaccine for human immunodeficiency virus
DE3934366A1 (de) * 1989-10-14 1991-04-18 Chemotherapeutisches Forschungsinstitut Georg Speyer Haus Vakzine zum schutz vor hiv-virusinfektionen, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung als diagnostikum und immuntherapeutikum
CA2047078A1 (en) * 1990-07-19 1992-01-20 Steven S. Bondy Cyclic hiv principal neutralizing determinant peptides
DE4033714C3 (de) * 1990-10-24 1995-09-07 Brahms Diagnostica Gmbh Neues Hapten-Analytikum basierend auf dem Prinzip einer Antigen-Antikörper-Reaktion

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS61186400A (ja) * 1984-12-20 1986-08-20 メルク　エンド　カムパニー　インコーポレーテッド 細菌由来中性多糖類と免疫原性タン白との安定な、共有結合された多糖―タンパク質結合体、該結合体の製造方法並びに該結合体を含む医薬組成物
JPH0222300A (ja) * 1987-02-02 1990-01-25 Swiss Serum & Vaccine Inst Bern 免疫原性接合体およびその製法ならびに免疫を生ぜしめる方法

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