JPH06245660A - 毒性タンパクをコードする遺伝子を含む植物及びその 作出方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 植物染色体中に、ＲＮＡウイルスがコードし
ている特異的プロテアーゼの認識アミノ酸配列をコード
する遺伝子とその下流に毒性タンパクをコードする遺伝
子を組み込むことにより毒性タンパクをコードする遺伝
子を含む植物を作出する。 【効果】 遺伝子組換え技術を用いて毒性タンパクをコ
ードする遺伝子を含む植物を提供することができ、特に
リボヌクレアーゼを利用した今までにない新しいメカニ
ズムによって、プロテアーゼをコードするウイルスに対
する抵抗性を植物に付与することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、遺伝子組換え技術を用
いて毒性タンパクをコードする遺伝子を含む植物、特に
ＲＮＡウイルスに抵抗性を有する植物を作出する技術に
関する。

【０００２】

【従来の技術】ウイルス病に対する抵抗性を従来の古典
的育種法で付与することは、野生種とのかけあわせがそ
れほど容易でないことから多くの困難を伴う。従って、
実際上、ウイルス病の防除は、もっぱら媒介昆虫の防除
などの間接的手法に頼ってきた。

【０００３】近年、遺伝子組換え技術が発展し、この技
法を使って、ウイルス抵抗性植物の作出が可能になって
きた。現在までに試みられ成功している戦略は以下の通
りである。 (１) ウイルスコートタンパク遺伝子の導入 1986年にPowel Abelら(Science, 232, 738) によって、
タバコモザイクウイルス (ＴＭＶ) のコートタンパクを
発現する植物が、ＴＭＶ抵抗性になることが示されて以
来、数多くの研究室で、種々のウイルスを用いて同じア
イデアによる実験が行われ、ウイルス抵抗性形質転換植
物が作出されている。

【０００４】(２) サテライトＲＮＡの利用 サテライトＲＮＡは親ウイルスに複製を依存し、多くの
場合、親ウイルスの増殖を抑え、病徴を軽減する。これ
まで、サテライトＲＮＡのｃＤＮＡを植物に導入するこ
とによって、キュウリモザイクウイルス(Harisson et a
l., Nature, 328, 799) とタバコ輪点ウイルス(Gerlach
et al.,Nature, 328, 802) に対して、抵抗性のものが
作出された。

【０００５】(３) アンチセンスＲＮＡの利用 ウイルス由来のｃＤＮＡをアンチセンスで発現するよう
に植物に組み込み、感染時の複合体形成によってウイル
ス増殖を抑える。しかし、その効果は、他の方法に比較
して、それほど大きくないようである(Cuozzo et al.,
Bio/Technology, 6, 549）。

【０００６】(４) リボザイムの利用 リボザイムは、自己触媒切断するＲＮＡで、ウイルスＲ
ＮＡを特異的に切断するよう塩基配列をデザインするこ
とができる。成功例は、多くないが、Edingtonら("Vira
l Gene and Plant Pathogenesis" Springer-Verlag p.1
77, 1990) はＴＭＶの特異的な切断に応用している。

【０００７】(５) 非構成タンパクの導入 ＴＭＶの180kタンパクの中に54k タンパクに相当するオ
ープンリーディングフレームが存在し、複製酵素とコン
プレックスを形成するものと考えられている。この遺伝
子を組み込んだ形質転換植物は、ＴＭＶに抵抗性となっ
た (Golemboskiet al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
87, 6311)。

【０００８】本発明による抵抗性の付与はウイルスに感
染した時にのみ誘導されるという従来の方法にない特性
をもっている。今後、ヌクレアーゼの種類、発現量を変
えることによって接種葉でのヌクレアーゼによる感染細
胞のえそ誘導が十分期待できるものと考えられる。従来
の方法では高濃度（〜10μg/ml) のウイルス接種で抵抗
性は打破されていたが、本発明では接種葉での局部えそ
による抵抗性が期待できる。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、遺伝子組換
え技術を用いて毒性タンパクをコードする遺伝子を含む
植物、特にＲＮＡウイルスに抵抗性を有する植物を提供
することを目的とする。

【００１０】

【課題を解決するための手段】本発明は、以下の発明を
包含する。 （１）ＲＮＡウイルスがコードしている特異的プロテア
ーゼの認識アミノ酸配列をコードする遺伝子とその下流
に毒性タンパクをコードする遺伝子が染色体中に組み込
まれていることを特徴とする毒性タンパクをコードする
遺伝子を含む植物。 （２）植物染色体中に、ＲＮＡウイルスがコードしてい
る特異的プロテアーゼの認識アミノ酸配列をコードする
遺伝子とその下流に毒性タンパクをコードする遺伝子を
組み込むことを特徴とする毒性タンパクをコードする遺
伝子を含む植物の作出方法。

【００１１】本発明において、ＲＮＡウイルスがコード
している特異的プロテアーゼの認識アミノ酸配列とは、
例えばＰＶＹ（ジャガイモウイルスＹ）の場合、次式：
-Val-Xaa-His(又はGln)-Gln−Ser(又はGly)- （式中、
Xaa は如何なるアミノ酸でもよいことを意味する。）を
いう。後述する実施例では、かかるアミノ酸配列とし
て、次式： -Val-His-His-Gln-Gly-で示されるアミノ酸
配列を用いた。

【００１２】また、毒性タンパクとは、植物細胞に対し
て毒性を有するタンパクをいい、例えばリボヌクレアー
ゼ、リボゾーム不活性化タンパク等が挙げられる。ここ
で、リボヌクレアーゼとしては、一本鎖ＲＮＡを切断す
るものであればよく、エキソ型、エンド型のいずれでも
よく、例えばリボヌクレアーゼＡ、リボヌクレアーゼＴ
１、リボヌクレアーゼＣＬ３、バルナーゼ、スタフィロ
コッカルヌクレアーゼ等が挙げられる。

【００１３】リボゾーム不活性化タンパクとしては、Ｐ
ＡＰ(Plant Molecular Biology, 20, 1111-1119(199
2))、ＭＡＰ(Journal of Biological Chemistry, 266,
8426-8430(1991)) 、リシン(Nucl. Acids. Res., 13, 8
019-8033(1985))等が挙げられる。本発明において、毒
性タンパクをコードする遺伝子は、ＲＮＡウイルスがコ
ードしている特異的プロテアーゼの認識アミノ酸配列を
コードする遺伝子の下流に組み込むことが必要である
が、この際、切断後に活性リボヌクレアーゼ等の毒性タ
ンパクが出現するよう結合部分をデザインしなければな
らない。

【００１４】ＲＮＡウイルスがコードしている特異的プ
ロテアーゼの認識アミノ酸配列をコードする遺伝子とそ
の下流の毒性タンパクをコードする遺伝子が遺伝子組換
え植物体中で発現するためには、少なくとも該遺伝子
（ＤＮＡ配列）がＲＮＡに転写されることが必要であ
り、そのためには、予め適当なプロモーター及びターミ
ネーター配列を連結してから組み込むことが好ましい。

【００１５】この際、プロモーターとしては、植物細胞
中で機能するあらゆるプロモーターを用いることがで
き、例えば、カリフラワーモザイクウィルス３５Ｓプロ
モーター、ノパリンシンターゼのプロモーターが挙げら
れる。ターミネーターとしても、植物細胞中で機能する
あらゆるターミネーターを用いることができ、例えば、
ノパリンシンターゼのターミネーターが挙げられる。

【００１６】植物細胞に、ＲＮＡウイルスがコードして
いる特異的プロテアーゼの認識アミノ酸配列をコードす
る遺伝子とその下流に毒性タンパクをコードする遺伝子
を導入するには、アグロバクテリウムを介した方法、エ
レクトロポーレーション、パーティクルガン等を、目的
とする植物の種類に応じて適宜用いることができる。遺
伝子導入のための植物材料としては、ジャガイモウイル
スＹ (ＰＶＹ) の被害の出るタバコ、ジャガイモ等から
適切なものを選択することができる。形質転換した植物
組織又は細胞を植物の種類に応じて適切な条件下で組織
培養することにより形質転換植物体を再生することがで
きる。

【００１７】本発明によれば、プロテアーゼをコードす
るウイルスに対する抵抗性を植物に付与することができ
る。このウイルスの中には、現在タバコのウイルス病の
中で最も大きな被害を出している黄斑えその病原ウイル
スも含まれる。本発明の形質転換植物は、通常はごく普
通に生育し、ウイルスに感染したときにのみ抵抗性の形
質を発現する。

【００１８】また、本発明によれば、植物ウイルス感染
に特異的にタンパク発現を誘導できる。例えば、植物細
胞に毒性のあるタンパクであっても、植物がある程度の
大きさに成長したときにウイルスを接種することによっ
て、生産誘導することも可能である。

【００１９】

【実施例】以下、実施例により本発明を更に具体的に説
明するが、本発明の範囲は以下の実施例に限定されるも
のではない。以下の実施例では、ジャガイモウイルスＹ
(ＰＶＹ) をターゲットに、以下の手順をふんで、実際
に抵抗性植物を作出した。

【００２０】１. 牛由来のリボヌクレアーゼＡ (RNase
A) の遺伝子をクローニングした。 ２. この遺伝子を市販の植物発現ベクターpBI121 (東洋
紡) に、β−グルクロニダーゼに融合タンパクとなるよ
う、サブクローニングした。これはβ−グルクロニダー
ゼのＮ末端約1/4 にRNaseA遺伝子を接続したもので、境
界域にＰＶＹがコードしている特異的プロテアーゼの認
識アミノ酸配列をコードする遺伝子を挿入してある。そ
のため、ＰＶＹに感染した細胞において上記融合タンパ
クが特異的プロテアーゼにより切断されて、活性を有す
るRNaseAが発現するようにデザインされている。

【００２１】３. 得られた組換えプラスミド(pBI-LTP)
でタバコの形質転換を行い、得られた約40個体の形質転
換タバコにＰＶＹを接種して、抵抗性を示すかどうか解
析した。 ４. かなりの形質転換体で、病徴の遅延及び軽減が観察
され、本発明によって、ウイルス抵抗性が付与できるこ
とを確認した。

【００２２】（実施例１） RNaseA 遺伝子のクローニン
グ (１) 市販されている牛胸腺ＤＮＡ 1μg と第一、第二
鎖プライマーを加え、２分間沸騰させた後、急冷した。
これに、バッファーなどを以下に示す組成になるように
加え、ＰＣＲ反応液とした。プライマーの塩基配列を以
下に示す。

【００２３】

【化１】

【００２４】(２) ＰＣＲ反応液 (50μl ) は、67mMト
リス、pH8.８、16.6mM硫酸アンモニウム、6.７mM MgC
l₂、10mMメルカプトエタノール、 200mM dNTPs、 1μg
のプライマー及び５単位のTth DNA ポリメラーゼ（東洋
紡）を含むように混合した。 (３) 反応の条件は、１サイクルを92℃で1.5 分加熱し
た後、42℃で2.5 分インキュベーションし、72℃で３分
反応させ、ＤＮＡサーマルサイクラー (宝酒造)で25回
このサイクルを行った。

【００２５】(４) この反応物５μl を２％濃度のアガ
ロース電気泳動によって、期待どおりの長さを有するこ
とを確認した。 (５) そのＤＮＡバンドをアガロースより切り出し、Ｄ
ＥＡＥメンブラン (Ｓ＆Ｓ) にトラップして回収した。
ＤＥＡＥメンブランによる核酸の回収は、常法どおり
で、例えば、“モルキュラークローニング”（マニアテ
スら、1989コールドスプリングハーバーラボラトリープ
レス）などの教科書中に容易に発見できる。

【００２６】(６) 上記ＤＮＡをSnaBI とSacIで切断
し、そのＤＮＡ断片をプラスミド、Bluescript SK+（東
洋紡）のEcoRI とSacI部位に常法 (例えば上記“モルキ
ュラークローニング”, マニアテスら）でクローニング
した。 (７）挿入ＤＮＡの塩基配列は、Ｔ７シーケンスキット
(ファルマシア）を用いて、その手順書に従い決定し
た。この塩基配列はNucl. Acids Res., 16, 5491-5502
(1988) に記載の塩基配列と一致した。

【００２７】（実施例２）植物発現ベクターへのクロー
ニング及び植物形質転換 (１）ＰＣＲで増やした上記ＤＮＡをSnaBI とSacIで切
断し、そのＤＮＡ断片を植物発現ベクターpBI121 (東洋
紡）のSnaBI-SacI部位に常法によって、挿入した。得ら
れた組換えプラスミドをpBI-LTP(図１）と命名し、この
プラスミドを使用してタバコの形質転換をした。タバコ
としては、ＢＹ−４を用いた。

【００２８】(２）タバコの形質転換はリーフデスク法
によって行った。本実施例では、“植物バイオテクノロ
ジーII” (山田康之、岡田吉美編、1991年、東京化学同
人）のp.164-165 に詳細に記載されている方法を用い
た。即ち、タバコ（ＢＹ−４）のリーフディスクを滅菌
し、目的のプラスミドを凍結融解法によって獲得させた
アグロバクテリウム・チュメファシエンス(LBA4404) の
懸濁液に約30秒浸すことによって接種した。約２日間抗
生物質を含まない培地で培養して感染させた後、リーフ
ディスクを洗浄し、抗生物質を含む培地に置いて形質転
換細胞を選抜した。

【００２９】(３）形質転換カルスは、カナマイシン (1
00 μg/ml）とクラフォラン (250 μg/ml）を含むムラ
シゲスクーグ培地で選抜された。 (４）形質転換体は、25℃、16時間照明下で育成され
た。シューティングしたものは、発根培地に移し、発根
を誘起した後、鉢上げした。 (５）鉢上げ後、約２週間ほど温室 (24〜27℃）で育成
した後、ＰＶＹの接種試験に供した。

【００３０】なお、以上のようにして得られた形質転換
タバコは、日本たばこ産業（株）生命科学研究所に種子
として保有されており、本発明を試験研究のために実施
しようとする者に、一定の条件下で分譲する用意がある
ものである。 （実施例３）ＰＶＹ接種試験 形質転換タバコの葉40個体に、カーボランダムをふりか
け、純化ＰＶＹ−Ｏを１〜５μg/mlの濃度で塗沫接種
し、水でリンスした。ＰＶＹは0.１Ｍの燐酸バッファー
に懸濁した。接種後、約１カ月にわたって、病徴を観察
し、記録した。

【００３１】その結果、50％の形質転換タバコで、対照
区の非形質転換タバコと比較して、明らかな病徴の軽減
と遅延が認められた。10個体の対照タバコと12個体の形
質転換タバコにＰＶＹ (２μg/ml）を接種し、約１カ月
にわたって病徴を観察した結果を図２に示す。図２にお
いて、病徴の程度については、４段階のスケールインデ
ックスを作出し、数値化した。

【００３２】以上の結果は、ＰＶＹが感染した時に特異
的にRNaseAを植物細胞で生産できたことを意味し、例え
ば毒性のあるタンパクの発現を植物の生育の途中で誘導
し、生産させたい場合などに有効である。

【００３３】

【発明の効果】本発明によれば、遺伝子組換え技術を用
いて毒性タンパクをコードする遺伝子を含む植物を提供
することができ、特にリボヌクレアーゼを利用した今ま
でにない新しいメカニズムによって、プロテアーゼをコ
ードするウイルスに対する抵抗性を植物に付与すること
ができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】組換えプラスミドpBI-LTP を示す図である。 Nos-pro ：ノパリンシンターゼのプロモーター、 Nos-ter ：ノパリンシンターゼのターミネーター、 ＲＢ ：Ｔｉプラスミドのライトボーダー、 ＬＢ ：Ｔｉプラスミドのレフトボーダー、 35S-pro ：カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモ
ーター、 ＧＵＳ ：β−グルクロニダーゼのＮ末端からSnaBI 部
位まで、 RNaseA ：RNaseAの遺伝子 ＮＰＴII：ネオマイシンフォスフォトランスフェラーゼ
遺伝子

【図２】ＰＶＹ接種後の平均病徴程度の推移を示す図で
ある。 ０：無病徴、 １：上葉に病徴様反応、 ２：マイルド
モザイク、３：激しいベインクリアリング又はベインバ
ンディング又は黄化、ＮＡ：形質転換植物

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/84 (72)発明者 小岩井 晃 神奈川県横浜市緑区梅が丘６番地２ 日本 たばこ産業株式会社生命科学研究所内

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ＲＮＡウイルスがコードしている特異的
   プロテアーゼの認識アミノ酸配列をコードする遺伝子と
   その下流に毒性タンパクをコードする遺伝子が染色体中
   に組み込まれていることを特徴とする毒性タンパクをコ
   ードする遺伝子を含む植物。
2. 【請求項２】 毒性タンパクがリボヌクレアーゼである
   請求項１記載の植物。
3. 【請求項３】 植物染色体中に、ＲＮＡウイルスがコー
   ドしている特異的プロテアーゼの認識アミノ酸配列をコ
   ードする遺伝子とその下流に毒性タンパクをコードする
   遺伝子を組み込むことを特徴とする毒性タンパクをコー
   ドする遺伝子を含む植物の作出方法。
4. 【請求項４】 毒性タンパクがリボヌクレアーゼである
   請求項３記載の作出方法。