JPH06206828A - アトピー性皮膚炎予防・治療剤 - Google Patents
アトピー性皮膚炎予防・治療剤Info
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- JPH06206828A JPH06206828A JP5251606A JP25160693A JPH06206828A JP H06206828 A JPH06206828 A JP H06206828A JP 5251606 A JP5251606 A JP 5251606A JP 25160693 A JP25160693 A JP 25160693A JP H06206828 A JPH06206828 A JP H06206828A
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- Japan
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- human
- atopic dermatitis
- ige
- sfcεriα
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【構成】 本発明は、ヒトＩｇＥとの結合が可能な蛋
白、具体的には高親和性免疫グロブリンＥ受容体α鎖や
ヒトＩｇＥとの結合が可能な高親和性免疫グロブリンＥ
受容体α鎖可溶性断片を有効成分とするアトピー性皮膚
炎予防・治療剤である。 【効果】 本発明により、アレルギー反応をその根源に
おいて遮断する臨床上有用なアトピー性皮膚炎予防・治
療剤が提供される。
白、具体的には高親和性免疫グロブリンＥ受容体α鎖や
ヒトＩｇＥとの結合が可能な高親和性免疫グロブリンＥ
受容体α鎖可溶性断片を有効成分とするアトピー性皮膚
炎予防・治療剤である。 【効果】 本発明により、アレルギー反応をその根源に
おいて遮断する臨床上有用なアトピー性皮膚炎予防・治
療剤が提供される。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ヒトＩｇＥとの結合が
可能なペプチドの新規用途に関する。より詳細には高親
和性免疫グロブリンＥ受容体α鎖（ＦｃεＲＩα）やヒ
トＩｇＥとの結合が可能な高親和性免疫グロブリンＥ受
容体α鎖可溶性断片（ｓＦｃεＲＩα）からなるアトピ
ー性皮膚炎予防・治療剤に関する。
可能なペプチドの新規用途に関する。より詳細には高親
和性免疫グロブリンＥ受容体α鎖（ＦｃεＲＩα）やヒ
トＩｇＥとの結合が可能な高親和性免疫グロブリンＥ受
容体α鎖可溶性断片（ｓＦｃεＲＩα）からなるアトピ
ー性皮膚炎予防・治療剤に関する。
【０００２】
【従来技術】Ｉ型アレルギー反応とは、外来性因子の侵
入によってマスト細胞や好塩基球からヒスタミンやロイ
コトリエン等の化学伝達物質や種々の酵素が遊離し、こ
れが組織を障害する炎症を惹起するものである。このア
レルギー反応の背景にあるアトピー素因とは、一定の物
質に対する先天的過敏症のことを言い、本人および家族
に気管支喘息やアレルギー性鼻炎として発現し、この素
因は遺伝すると言われている。
入によってマスト細胞や好塩基球からヒスタミンやロイ
コトリエン等の化学伝達物質や種々の酵素が遊離し、こ
れが組織を障害する炎症を惹起するものである。このア
レルギー反応の背景にあるアトピー素因とは、一定の物
質に対する先天的過敏症のことを言い、本人および家族
に気管支喘息やアレルギー性鼻炎として発現し、この素
因は遺伝すると言われている。
【０００３】アトピー性皮膚炎とは、このような素因の
上に生じる皮膚炎であって、その自覚的な症状としては
著明な掻痒感があり、掻爬によって皮疹は増悪し慢性化
すると言われている。また、このようなアトピー性皮膚
炎の掻痒感は発作的に出現することが多く、かつ僅かな
刺激によって誘発、増強される傾向がある。
上に生じる皮膚炎であって、その自覚的な症状としては
著明な掻痒感があり、掻爬によって皮疹は増悪し慢性化
すると言われている。また、このようなアトピー性皮膚
炎の掻痒感は発作的に出現することが多く、かつ僅かな
刺激によって誘発、増強される傾向がある。
【０００４】アトピー性皮膚炎に対してはこれまでに多
くの治療法が試みられてきているが、満足な効果を上げ
ていないことが多い。現在、副腎皮質ホルモン外用剤を
主体とする外用療法を中心に、抗ヒスタミン剤をはじめ
とする止痒剤等が用いられているが、副作用等の問題を
有しており、安全性の高い且つ優れたアトピー性皮膚炎
予防・治療剤が待ち望まれている。
くの治療法が試みられてきているが、満足な効果を上げ
ていないことが多い。現在、副腎皮質ホルモン外用剤を
主体とする外用療法を中心に、抗ヒスタミン剤をはじめ
とする止痒剤等が用いられているが、副作用等の問題を
有しており、安全性の高い且つ優れたアトピー性皮膚炎
予防・治療剤が待ち望まれている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、アレ
ルギー反応をその根源において遮断する臨床上有用なア
トピー性皮膚炎予防・治療剤を提供することにある。
ルギー反応をその根源において遮断する臨床上有用なア
トピー性皮膚炎予防・治療剤を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を達成するために鋭意研究を重ねた結果、ヒトＩｇＥと
の結合が可能なペプチドを、予防的に投与することによ
りアトピー性皮膚炎の発症を抑制することができ、又、
症状が悪化してからでもヒトＩｇＥとの結合が可能なペ
プチドを投与すればその症状が改善されることを見出
し、本発明を完成した。
を達成するために鋭意研究を重ねた結果、ヒトＩｇＥと
の結合が可能なペプチドを、予防的に投与することによ
りアトピー性皮膚炎の発症を抑制することができ、又、
症状が悪化してからでもヒトＩｇＥとの結合が可能なペ
プチドを投与すればその症状が改善されることを見出
し、本発明を完成した。
【０００７】本発明は、かかる新知見に基づいて完成さ
れたものであり、ヒトIgＥとの結合が可能なペプチドを
有効成分とするアトピー性皮膚炎予防・治療剤に関す
る。
れたものであり、ヒトIgＥとの結合が可能なペプチドを
有効成分とするアトピー性皮膚炎予防・治療剤に関す
る。
【０００８】本発明において、ヒトＩｇＥとの結合が可
能なペプチドとは、ヒトＩｇＥに特異的に結合し、その
機能を阻害するペプチドをいう。具体的には、高親和性
免疫グロブリンＥ受容体α鎖（ＦｃεＲＩα）やヒトＩ
ｇＥとの結合が可能な高親和性免疫グロブリンＥ受容体
α鎖可溶性断片（ｓＦｃεＲＩα）を含むペプチドが挙
げられる。
能なペプチドとは、ヒトＩｇＥに特異的に結合し、その
機能を阻害するペプチドをいう。具体的には、高親和性
免疫グロブリンＥ受容体α鎖（ＦｃεＲＩα）やヒトＩ
ｇＥとの結合が可能な高親和性免疫グロブリンＥ受容体
α鎖可溶性断片（ｓＦｃεＲＩα）を含むペプチドが挙
げられる。
【０００９】これらはＩ型アレルギー反応の発現機序の
発端である、肥満細胞や好塩基球の細胞膜上で高親和性
をもってＩｇＥのＦｃ部分と特異的に結合する高親和性
免疫グロブリンＥ受容体（ＦｃεＲＩ）へのＩｇＥの結
合を阻害するので、アレルギー反応をその根源において
遮断する。
発端である、肥満細胞や好塩基球の細胞膜上で高親和性
をもってＩｇＥのＦｃ部分と特異的に結合する高親和性
免疫グロブリンＥ受容体（ＦｃεＲＩ）へのＩｇＥの結
合を阻害するので、アレルギー反応をその根源において
遮断する。
【００１０】ＦｃεＲＩはα鎖、β鎖及びジスルフィド
結合した２個のγ鎖のサブユニットから成る４量体構造
をした糖蛋白質であり、ＩｇＥとの高親和性結合にはα
鎖の細胞外領域のみが関与していることが明らかにされ
ている [Blank. U et al., J. Biol. Chem., 266, 2639
(1991)]。
結合した２個のγ鎖のサブユニットから成る４量体構造
をした糖蛋白質であり、ＩｇＥとの高親和性結合にはα
鎖の細胞外領域のみが関与していることが明らかにされ
ている [Blank. U et al., J. Biol. Chem., 266, 2639
(1991)]。
【００１１】ＦｃεＲＩαは上記ＦｃεＲＩのα鎖のこ
とであり、ｓＦｃεＲＩαはα鎖の細胞外領域に相当す
る。
とであり、ｓＦｃεＲＩαはα鎖の細胞外領域に相当す
る。
【００１２】本発明に用いられるヒトＩｇＥとの結合が
可能なペプチドは、少なくともα鎖の細胞外領域、即ち
ｓＦｃεＲＩαを含んでいればよいのであって、Ｆｃε
ＲＩαを用いても、ＦｃεＲＩ自体を用いてもなんら問
題はない。また、遺伝子工学的手法により人工的に改変
された変異体やＤＤＳ化された誘導体、例えばアルブミ
ンのコンジュゲートであっても、ヒトＩｇＥとの結合が
可能なものであれば用い得るが、特にｓＦｃεＲＩαが
好ましい。また、これらはヒト由来のものが好ましい。
可能なペプチドは、少なくともα鎖の細胞外領域、即ち
ｓＦｃεＲＩαを含んでいればよいのであって、Ｆｃε
ＲＩαを用いても、ＦｃεＲＩ自体を用いてもなんら問
題はない。また、遺伝子工学的手法により人工的に改変
された変異体やＤＤＳ化された誘導体、例えばアルブミ
ンのコンジュゲートであっても、ヒトＩｇＥとの結合が
可能なものであれば用い得るが、特にｓＦｃεＲＩαが
好ましい。また、これらはヒト由来のものが好ましい。
【００１３】ｓＦｃεＲＩαは細胞培養手法や遺伝子工
学的手法により製造が可能である。Ｂｌａｎｋ．Ｕらは
ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）欠損ＣＨＯ細胞を用
いてｓＦｃεＲＩαを発現することに成功している（上
記文献）。
学的手法により製造が可能である。Ｂｌａｎｋ．Ｕらは
ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）欠損ＣＨＯ細胞を用
いてｓＦｃεＲＩαを発現することに成功している（上
記文献）。
【００１４】本発明者らも、（１）動物細胞での発現を
制御できるプロモーターを上流部に付加したｓＦｃεＲ
Ｉα遺伝子及びウロキナーゼ（ＵＫ）プロモーターを付
加したＤＨＦＲ遺伝子を組み込んでなるプラスミドを用
いて形質転換させた動物細胞、（２）動物細胞での発現
を制御できるプロモーターを上流部に付加したｓＦｃε
ＲＩα遺伝子をコードするＤＮＡを担持させたプラスミ
ド及びＵＫプロモーターを上流部に付加したＤＨＦＲを
コードするＤＮＡを担持させたプラスミドを同時に用い
て形質転換させた動物細胞、（３）上記（１）または
（２）の動物細胞を培養することによるｓＦｃεＲＩα
の大量製造方法を確立している（製造例参照）。
制御できるプロモーターを上流部に付加したｓＦｃεＲ
Ｉα遺伝子及びウロキナーゼ（ＵＫ）プロモーターを付
加したＤＨＦＲ遺伝子を組み込んでなるプラスミドを用
いて形質転換させた動物細胞、（２）動物細胞での発現
を制御できるプロモーターを上流部に付加したｓＦｃε
ＲＩα遺伝子をコードするＤＮＡを担持させたプラスミ
ド及びＵＫプロモーターを上流部に付加したＤＨＦＲを
コードするＤＮＡを担持させたプラスミドを同時に用い
て形質転換させた動物細胞、（３）上記（１）または
（２）の動物細胞を培養することによるｓＦｃεＲＩα
の大量製造方法を確立している（製造例参照）。
【００１５】ｓＦｃεＲＩαの遺伝子工学的手法による
製造は上記動物細胞を用いる方法のほか大腸菌や酵母を
用いる方法で製造してもよい。
製造は上記動物細胞を用いる方法のほか大腸菌や酵母を
用いる方法で製造してもよい。
【００１６】本発明に用いられるヒトＩｇＥとの結合が
可能なペプチドは、全身療法、局所療法いずれにおいて
も適用可能である。全身療法における投与方法として
は、例えば、注射用生理食塩水や注射用蒸留水に溶解し
て非経口投与、好ましくは静脈内投与される。剤型とし
ては、液状製剤や凍結乾燥製剤が挙げられ、これらは公
知の方法で調製できる。局所療法における投与方法とし
ては、皮膚や粘膜などの局所に投与できる剤型、即ち外
用剤としての投与方法が挙げられる。外用剤としては、
クリーム剤、ゲル軟膏剤、ローション剤等が例示され
る。これらの製剤は当該ヒトＩｇＥとの結合が可能なペ
プチドと、水溶性高分子化合物、油、白色ワセリン、低
級アルコール等と適宜組み合わせ、また必要に応じ助剤
として、緩衝剤、等張化剤、増粘剤、保存剤、安定剤、
界面活性剤、潤滑剤、防腐剤等を加えることにより公知
の方法によって調製可能である。
可能なペプチドは、全身療法、局所療法いずれにおいて
も適用可能である。全身療法における投与方法として
は、例えば、注射用生理食塩水や注射用蒸留水に溶解し
て非経口投与、好ましくは静脈内投与される。剤型とし
ては、液状製剤や凍結乾燥製剤が挙げられ、これらは公
知の方法で調製できる。局所療法における投与方法とし
ては、皮膚や粘膜などの局所に投与できる剤型、即ち外
用剤としての投与方法が挙げられる。外用剤としては、
クリーム剤、ゲル軟膏剤、ローション剤等が例示され
る。これらの製剤は当該ヒトＩｇＥとの結合が可能なペ
プチドと、水溶性高分子化合物、油、白色ワセリン、低
級アルコール等と適宜組み合わせ、また必要に応じ助剤
として、緩衝剤、等張化剤、増粘剤、保存剤、安定剤、
界面活性剤、潤滑剤、防腐剤等を加えることにより公知
の方法によって調製可能である。
【００１７】本剤は予防的にも、対症療法的にも用いる
ことができる。投与量は疾患の種類や、患者の状態等に
より異なるが、予防的には外来性因子に対するＩｇＥ量
の２倍以上の投与、対症療法的には外来性因子に対する
ＩｇＥ量の１０倍以上投与するのが望ましい。他剤との
併用も可能である。
ことができる。投与量は疾患の種類や、患者の状態等に
より異なるが、予防的には外来性因子に対するＩｇＥ量
の２倍以上の投与、対症療法的には外来性因子に対する
ＩｇＥ量の１０倍以上投与するのが望ましい。他剤との
併用も可能である。
【００１８】
【発明の効果】本発明により、アレルギー反応をその根
源において遮断する臨床上有用なアトピー性皮膚炎予防
・治療剤が提供される。
源において遮断する臨床上有用なアトピー性皮膚炎予防
・治療剤が提供される。
【００１９】
【実施例】本発明をより詳細に説明するために参考例、
実施例、試験例を挙げるが、本発明はこれらによって何
ら制限されるものではない。
実施例、試験例を挙げるが、本発明はこれらによって何
ら制限されるものではない。
【００２０】参考例 ヒトｓＦｃεＲＩαの製造 [Ｉ] ＦｃεＲＩ／ｐＭＴ１の構築 [動物細胞での発現を制御できるプロモーター（ＳＶ４
０）を上流部に付加したヒトｓＦｃεＲＩαをコードす
るＤＮＡを組み込んで構成されるプラスミドの構築]Bla
nk らの報告[Blank. U et al., J. Biol. Chem. 266,
2639 (1991)] に従い、プラスミドｐｋｏ[Doren, K.V.
et al., J. Virol, 50, 606, (1984)] にヒトＦｃεＲ
Ｉαのリーダー配列−ヒトｓＦｃεＲＩα遺伝子を組み
込んだプラスミドＦｃεＲＩ／ｐＭＴ１（図１）を構築
した。尚、ヒトｓＦｃεＲＩα遺伝子をコードするＤＮ
Ａ配列およびそれから演繹されるアミノ酸配列はNuclei
c Acids Research, Volume 16 Number 8, 3584 (1988)
に開示されている。
０）を上流部に付加したヒトｓＦｃεＲＩαをコードす
るＤＮＡを組み込んで構成されるプラスミドの構築]Bla
nk らの報告[Blank. U et al., J. Biol. Chem. 266,
2639 (1991)] に従い、プラスミドｐｋｏ[Doren, K.V.
et al., J. Virol, 50, 606, (1984)] にヒトＦｃεＲ
Ｉαのリーダー配列−ヒトｓＦｃεＲＩα遺伝子を組み
込んだプラスミドＦｃεＲＩ／ｐＭＴ１（図１）を構築
した。尚、ヒトｓＦｃεＲＩα遺伝子をコードするＤＮ
Ａ配列およびそれから演繹されるアミノ酸配列はNuclei
c Acids Research, Volume 16 Number 8, 3584 (1988)
に開示されている。
【００２１】[II] ｐＴＴ０６の構築 [ＵＫプロモーターを上流部に付加したＤＨＦＲをコー
ドするＤＮＡを組み込んで構成されるなるプラスミドの
構築]Biosci. Biotech. Biochem., 56 (4), 600-604, 1
992に従い、ＵＫプロモーター，DHFRｃＤＮＡ, ＳＶ４
０ポリＡ付加シグナルを含むプラスミドｐＴＴ０６を構
築した（図２参照）。
ドするＤＮＡを組み込んで構成されるなるプラスミドの
構築]Biosci. Biotech. Biochem., 56 (4), 600-604, 1
992に従い、ＵＫプロモーター，DHFRｃＤＮＡ, ＳＶ４
０ポリＡ付加シグナルを含むプラスミドｐＴＴ０６を構
築した（図２参照）。
【００２２】[III] 動物細胞への導入および高産生細
胞の樹立 (i) 材料； ・プラスミドＤＮＡ ＦｃεＲＩ／ｐＭＴ１：ｐｋｏにヒトＦｃεＲＩαのリ
ーダー配列−ヒトｓＦｃεＲＩα遺伝子を組み込んだプ
ラスミド。 ｐＴＴ０６：ＵＫプロモーター（ウロキナーゼ遺伝子転
写開始点を含む上流約８００ｂｐの５’調節領域）に支
配されるＤＨＦＲ遺伝子発現ユニットからなるプラスミ
ド。 ・細胞； ＣＨＯ ＤＸＢ−１１細胞株（ＤＨＦＲ欠損株） G. Urlaub et al., Proc, Natl. Acad. Sci. USA, 77,
4216-4220 (1980)に記載の方法で調製、増殖させた。 ・メトトレキセート（ＭＴＸ）；Sigma 社製（＋）Amet
hopterinを0.14 M NaCl, 0.02 M HEPES （ナカライテス
ク）に溶解し、２mMストック液を調製した。これを培地
に、目的の濃度になるように添加し使用した。
胞の樹立 (i) 材料； ・プラスミドＤＮＡ ＦｃεＲＩ／ｐＭＴ１：ｐｋｏにヒトＦｃεＲＩαのリ
ーダー配列−ヒトｓＦｃεＲＩα遺伝子を組み込んだプ
ラスミド。 ｐＴＴ０６：ＵＫプロモーター（ウロキナーゼ遺伝子転
写開始点を含む上流約８００ｂｐの５’調節領域）に支
配されるＤＨＦＲ遺伝子発現ユニットからなるプラスミ
ド。 ・細胞； ＣＨＯ ＤＸＢ−１１細胞株（ＤＨＦＲ欠損株） G. Urlaub et al., Proc, Natl. Acad. Sci. USA, 77,
4216-4220 (1980)に記載の方法で調製、増殖させた。 ・メトトレキセート（ＭＴＸ）；Sigma 社製（＋）Amet
hopterinを0.14 M NaCl, 0.02 M HEPES （ナカライテス
ク）に溶解し、２mMストック液を調製した。これを培地
に、目的の濃度になるように添加し使用した。
【００２３】(ii) 方法 ＤＮＡ導入およびトランスフェクタント上清のアッ
セイ α変法イーグルＭＥＭ，10％FCS で継代しているDHFR欠
損CHO DXB-11細胞をトリプシン(0.25%) 処理によりディ
ッシュからはがし、107 cell/ml となるよう Hanks液に
懸濁した。この懸濁液0.5 ml，５×106 個の細胞にプラ
スミドＤＮＡ（１μｇのｐＴＴ０６と４０μｇのＦｃε
ＲＩ／ｐＭＴ１）を同時にエレクトロポレーション法に
より導入した。α変法イーグルＭＥＭ（リボ核酸・デオ
キシリボ核酸含まず），10％ＦＣＳで培養後、生じたコ
ロニーを拾いあげて順次拡大し、これらトランスフェク
タントの培養上清中のヒトｓＦｃεＲＩα活性を以下の
に記載の方法に従い測定し、高い活性が見られた株に
ついてＭＴＸによるＤＮＡ増幅を行った。
セイ α変法イーグルＭＥＭ，10％FCS で継代しているDHFR欠
損CHO DXB-11細胞をトリプシン(0.25%) 処理によりディ
ッシュからはがし、107 cell/ml となるよう Hanks液に
懸濁した。この懸濁液0.5 ml，５×106 個の細胞にプラ
スミドＤＮＡ（１μｇのｐＴＴ０６と４０μｇのＦｃε
ＲＩ／ｐＭＴ１）を同時にエレクトロポレーション法に
より導入した。α変法イーグルＭＥＭ（リボ核酸・デオ
キシリボ核酸含まず），10％ＦＣＳで培養後、生じたコ
ロニーを拾いあげて順次拡大し、これらトランスフェク
タントの培養上清中のヒトｓＦｃεＲＩα活性を以下の
に記載の方法に従い測定し、高い活性が見られた株に
ついてＭＴＸによるＤＮＡ増幅を行った。
【００２４】 ヒトｓＦｃεＲＩαの定量 ヒトｓＦｃεＲＩαの濃度は、ラット好塩基球細胞株上
に存在するＦｃεＲＩへの 125Ｉ標識マウスＩｇＥの結
合阻害で測定した。以下にその材料と方法を示す。 （材料） ・細胞；ラット好塩基球細胞株ＲＢＬ−２Ｈ３は、10％
ＦＣＳ、100U/ml ペニシリンおよび100 μg/mlストレプ
トマイシンを含むイーグルＭＥＭ中で培養した。 ・ＩｇＥ；抗ジニトロフェニルマウスモノクローナルＩ
ｇＥ(Hi-DNP-E-26-82)、または抗トリニトロフェニル
（ＴＮＰ）マウスモノクローナルＩｇＥを用いた。抗Ｔ
ＮＰマウスモノクローナルＩｇＥは、マウスハイブリド
ーマＩＧＥＬｂ４（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＴＩＢ１４１）の
培養上清またはマウス腹水より精製した。 ・ＩｇＥのヨード標識；バイオラッド社製Enzymobeads
法を用いた。0.2 Ｍリン酸緩衝液 (pH7.2) 50 μｌ、マ
ウスモノクローナルＩｇＥ（2.14mg/ml) 10 μｌ、Enzy
mobeads 試薬50μｌ、Na 125Ｉ25μｌ（95MBq)、１％β
−Ｄグルコース水溶液25μｌを混和し、室温で15〜20分
間反応させた。150 μｌの10mg／ml チロシン、10％グ
リセリンおよび0.1 ％キシレンシアノールを含むリン酸
緩衝生理的食塩水と混和した後、ＰＤ−１０カラム（フ
ァルマシア製）を用いたゲル濾過法にて蛋白を回収し
た。 （方法） ＩｇＥ結合アッセイ； (1) ＣＨＯ細胞は、10％FCS 添加α変法イーグルＭＥ
Ｍ（リボ核酸・デオキシリボ核酸含まず）で維持するの
で、この培養液で希釈したサンプルを調製した（125-25
0 μｌ) 。 (2) ３％牛血清アルブミンおよび0.1 ％ NaN3 添加ダ
ルベッコリン酸緩衝生理的食塩水（ＰＢＳ／３％ ＢＳ
Ａ）で希釈した125 Ｉ標識ＩｇＥを(1) のサンプルに添
加した。総体積は500 μｌで、125 Ｉ標識ＩｇＥの濃度
は100ng/mlである。この混合物を室温で３〜６時間イン
キュベートした。 (3) ＰＢＳ／３％ ＢＳＡ中に懸濁したＲＢＬ−２Ｈ
３細胞（３〜８×107 /ml)50 μｌを添加し、氷中で１
〜２時間インキュベートした。また、標識ＩｇＥの細胞
への非特異的吸着を調べるための非標識ＩｇＥ添加群で
は、前もって150μｌのＲＢＬ−２Ｈ３細胞懸濁液と15
μｌの2.1mg/ml非標識ＩｇＥを混和しておき、この混合
液55μｌを(2) の混合液に添加した。 (4) 1000rpm, ５分間遠心により細胞を沈澱させ、上清
を捨てた。 (5) 細胞を、ＰＢＳ／３％ ＢＳＡにて一度洗浄した
のち、結合した放射活性をガンマカウンターにて測定し
た。 (6) 添加物なしの放射活性として10% FCS 添加α変法
イーグルＭＥＭ（リボ核酸・デオキシリボ核酸含まず）
を加えた際のcpm を用い、以下の式に従い結合阻害率を
測定した。
に存在するＦｃεＲＩへの 125Ｉ標識マウスＩｇＥの結
合阻害で測定した。以下にその材料と方法を示す。 （材料） ・細胞；ラット好塩基球細胞株ＲＢＬ−２Ｈ３は、10％
ＦＣＳ、100U/ml ペニシリンおよび100 μg/mlストレプ
トマイシンを含むイーグルＭＥＭ中で培養した。 ・ＩｇＥ；抗ジニトロフェニルマウスモノクローナルＩ
ｇＥ(Hi-DNP-E-26-82)、または抗トリニトロフェニル
（ＴＮＰ）マウスモノクローナルＩｇＥを用いた。抗Ｔ
ＮＰマウスモノクローナルＩｇＥは、マウスハイブリド
ーマＩＧＥＬｂ４（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＴＩＢ１４１）の
培養上清またはマウス腹水より精製した。 ・ＩｇＥのヨード標識；バイオラッド社製Enzymobeads
法を用いた。0.2 Ｍリン酸緩衝液 (pH7.2) 50 μｌ、マ
ウスモノクローナルＩｇＥ（2.14mg/ml) 10 μｌ、Enzy
mobeads 試薬50μｌ、Na 125Ｉ25μｌ（95MBq)、１％β
−Ｄグルコース水溶液25μｌを混和し、室温で15〜20分
間反応させた。150 μｌの10mg／ml チロシン、10％グ
リセリンおよび0.1 ％キシレンシアノールを含むリン酸
緩衝生理的食塩水と混和した後、ＰＤ−１０カラム（フ
ァルマシア製）を用いたゲル濾過法にて蛋白を回収し
た。 （方法） ＩｇＥ結合アッセイ； (1) ＣＨＯ細胞は、10％FCS 添加α変法イーグルＭＥ
Ｍ（リボ核酸・デオキシリボ核酸含まず）で維持するの
で、この培養液で希釈したサンプルを調製した（125-25
0 μｌ) 。 (2) ３％牛血清アルブミンおよび0.1 ％ NaN3 添加ダ
ルベッコリン酸緩衝生理的食塩水（ＰＢＳ／３％ ＢＳ
Ａ）で希釈した125 Ｉ標識ＩｇＥを(1) のサンプルに添
加した。総体積は500 μｌで、125 Ｉ標識ＩｇＥの濃度
は100ng/mlである。この混合物を室温で３〜６時間イン
キュベートした。 (3) ＰＢＳ／３％ ＢＳＡ中に懸濁したＲＢＬ−２Ｈ
３細胞（３〜８×107 /ml)50 μｌを添加し、氷中で１
〜２時間インキュベートした。また、標識ＩｇＥの細胞
への非特異的吸着を調べるための非標識ＩｇＥ添加群で
は、前もって150μｌのＲＢＬ−２Ｈ３細胞懸濁液と15
μｌの2.1mg/ml非標識ＩｇＥを混和しておき、この混合
液55μｌを(2) の混合液に添加した。 (4) 1000rpm, ５分間遠心により細胞を沈澱させ、上清
を捨てた。 (5) 細胞を、ＰＢＳ／３％ ＢＳＡにて一度洗浄した
のち、結合した放射活性をガンマカウンターにて測定し
た。 (6) 添加物なしの放射活性として10% FCS 添加α変法
イーグルＭＥＭ（リボ核酸・デオキシリボ核酸含まず）
を加えた際のcpm を用い、以下の式に従い結合阻害率を
測定した。
【００２５】
【数１】
【００２６】 ＭＴＸによる導入遺伝子の増幅 で得られたヒトｓＦｃεＲＩα産生株を、５〜10×10
5 cells/dishとなるように10nM MTX含有選択培地８〜10
ml入り10cmディッシュに植え込んだ。約３日毎に培地交
換を行い、２〜４週間培養を続けていると充分な細胞数
の10nM MTX耐性細胞が得られるので、次の段階のＭＴＸ
濃度の培地に継代した。このように10nMMTX濃度からス
タートして50nM, 100nM, 200nM, 500nM,１μＭ，２μ
Ｍ，４μＭ，10μＭと順次ＭＴＸ濃度を上げて遺伝子増
幅を行った。
5 cells/dishとなるように10nM MTX含有選択培地８〜10
ml入り10cmディッシュに植え込んだ。約３日毎に培地交
換を行い、２〜４週間培養を続けていると充分な細胞数
の10nM MTX耐性細胞が得られるので、次の段階のＭＴＸ
濃度の培地に継代した。このように10nMMTX濃度からス
タートして50nM, 100nM, 200nM, 500nM,１μＭ，２μ
Ｍ，４μＭ，10μＭと順次ＭＴＸ濃度を上げて遺伝子増
幅を行った。
【００２７】 ヒトｓＦｃεＲＩα産生株のクローニ
ング でMTX の増幅を行ったヒトｓＦｃεＲＩα産生株のう
ちの幾つかについて限界希釈法によるクローニングを行
った。すなわち、各濃度のMTX 耐性細胞を10%FCSおよび
２〜10μM MTX を含むα変法イーグルＭＥＭ（リボ核酸
・デオキシリボ核酸含まず）中で培養し、96ウェルプレ
ートに播種した。増殖が観察されたウェルより細胞を回
収して24ウェルプレート、さらに10cmディッシュへ順次
拡大し、コンフルエントになった段階での上清中のヒト
ｓＦｃεＲＩα産生量を調べた。
ング でMTX の増幅を行ったヒトｓＦｃεＲＩα産生株のう
ちの幾つかについて限界希釈法によるクローニングを行
った。すなわち、各濃度のMTX 耐性細胞を10%FCSおよび
２〜10μM MTX を含むα変法イーグルＭＥＭ（リボ核酸
・デオキシリボ核酸含まず）中で培養し、96ウェルプレ
ートに播種した。増殖が観察されたウェルより細胞を回
収して24ウェルプレート、さらに10cmディッシュへ順次
拡大し、コンフルエントになった段階での上清中のヒト
ｓＦｃεＲＩα産生量を調べた。
【００２８】[IV] ヒトｓＦｃεＲＩαの精製 ヒトｓＦｃεＲＩαを比較的高く産生していたクローン
細胞株の培養上清983ml に、1/20容積の1mM Tris, pH8.
0 および10mMベンザミジン、10mMエチレンジアミン４酢
酸、0.02％アジ化ナトリウムを添加し、0.22μm のフィ
ルターで濾過した試料をＩｇＥ Sepharose 4Bカラム
〔マウスハイブリドーマIGELb4（ATCC No.TIB141)培養
上清から精製した抗トリニトロフェニルＩｇＥ10mgを0.
1M炭酸水素ナトリウム中で活性化CH Sepharose (Pharma
cia) 1g に結合させたもの〕を用いて精製した。カラム
を0.02％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳで洗浄後、カラ
ムに結合した蛋白を0.2M酢酸、0.2M塩化ナトリウム、0.
02％アジ化ナトリウム、pH2.8 で溶出した。得られた精
製ヒトｓＦｃεＲＩαを10mM重炭酸アンモニウムに対し
て透析した後、200 μｌをSpeedVacで乾燥させ、ＳＤＳ
電気泳動で調べると、クーマジーブルー染色で還元およ
び非還元両方の条件下で分子量５０ｋＤａ付近に明確な
バンドが検出され、このバンド以外の蛋白は検出されな
かった。この蛋白はラジオイムノアッセイで放射性標識
ＩｇＥの好塩基球細胞（ＲＢＬ−２Ｈ３細胞；前出）へ
の結合を阻害する活性を有していた。かかる精製ヒトＦ
ｃεＲＩαの濃度は、Bradford法 [Bradford, M.M., An
al. Biochem. 72, 248(1976)] によって定量した。
細胞株の培養上清983ml に、1/20容積の1mM Tris, pH8.
0 および10mMベンザミジン、10mMエチレンジアミン４酢
酸、0.02％アジ化ナトリウムを添加し、0.22μm のフィ
ルターで濾過した試料をＩｇＥ Sepharose 4Bカラム
〔マウスハイブリドーマIGELb4（ATCC No.TIB141)培養
上清から精製した抗トリニトロフェニルＩｇＥ10mgを0.
1M炭酸水素ナトリウム中で活性化CH Sepharose (Pharma
cia) 1g に結合させたもの〕を用いて精製した。カラム
を0.02％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳで洗浄後、カラ
ムに結合した蛋白を0.2M酢酸、0.2M塩化ナトリウム、0.
02％アジ化ナトリウム、pH2.8 で溶出した。得られた精
製ヒトｓＦｃεＲＩαを10mM重炭酸アンモニウムに対し
て透析した後、200 μｌをSpeedVacで乾燥させ、ＳＤＳ
電気泳動で調べると、クーマジーブルー染色で還元およ
び非還元両方の条件下で分子量５０ｋＤａ付近に明確な
バンドが検出され、このバンド以外の蛋白は検出されな
かった。この蛋白はラジオイムノアッセイで放射性標識
ＩｇＥの好塩基球細胞（ＲＢＬ−２Ｈ３細胞；前出）へ
の結合を阻害する活性を有していた。かかる精製ヒトＦ
ｃεＲＩαの濃度は、Bradford法 [Bradford, M.M., An
al. Biochem. 72, 248(1976)] によって定量した。
【００２９】実施例１ 注射剤 精製ヒトｓＦｃεＲＩα 100mg及びブドウ糖100mg を注
射用蒸留水に溶解し、ヒトｓＦｃεＲＩα濃度が 2 mg/
mlになるように調製した。これを0.45μm のメンブラン
フィルターで濾過後、濾液を無菌的に5ml バイアルに分
注し、窒素ガスを充填した後、密封して静脈内注射剤と
した。
射用蒸留水に溶解し、ヒトｓＦｃεＲＩα濃度が 2 mg/
mlになるように調製した。これを0.45μm のメンブラン
フィルターで濾過後、濾液を無菌的に5ml バイアルに分
注し、窒素ガスを充填した後、密封して静脈内注射剤と
した。
【００３０】実施例２ 軟膏 白色ワセリン６０重量部、ポリオキシエチレンセチルエ
ーテル１重量部、ステアリン酸アルミニウム１重量部を
加熱して溶解、混和し、約７５℃に保ちながら、これに
モノステアリン酸ソルビタン５重量部、及び精製水１０
重量部を加えてかき混ぜた。その後、約４５℃に冷却
し、精製ヒトｓＦｃεＲＩα５重量部を適量の精製水に
溶かして加え、かき混ぜて軟膏とした。
ーテル１重量部、ステアリン酸アルミニウム１重量部を
加熱して溶解、混和し、約７５℃に保ちながら、これに
モノステアリン酸ソルビタン５重量部、及び精製水１０
重量部を加えてかき混ぜた。その後、約４５℃に冷却
し、精製ヒトｓＦｃεＲＩα５重量部を適量の精製水に
溶かして加え、かき混ぜて軟膏とした。
【００３１】試験例１ アトピー性皮膚炎に対する作用 上記実施例２で得られた軟膏を小児のアトピー性皮膚炎
患者の荒れた肌に１日１回毎日適用した。その結果、数
週間後から荒れが回復し、掻痒感もおさまった。また本
剤の塗布によりかぶれなどの皮膚刺激性は認められなか
った。
患者の荒れた肌に１日１回毎日適用した。その結果、数
週間後から荒れが回復し、掻痒感もおさまった。また本
剤の塗布によりかぶれなどの皮膚刺激性は認められなか
った。
【００３２】試験例２ マウスを用いた２次的アレルギ
ー反応の抑制作用 （方法）雌ＢＡＬＢ／Ｃマウス（８週令以上）の背部皮
下に、抗−ＴＮＰ・ＩｇＥ産生ハイブリドーマＩＧＥＬ
ａ２（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＴＩＢ１４２）を１０6 移植
し、モデル動物を作成した。移植８日目に０．４％塩化
ピクリルのアセトン溶液１０μｌをマウスの左耳に塗布
して第１次抗原チャレンジを行い、１４日目に同様の方
法にて第２次抗原チャレンジを行った。一方、ヒトｓＦ
ｃεＲＩαは、移植後７、８日目に２５μｇ／匹、移植
後９、１１、１３、１５日目に１００μｇ／匹静脈内投
与した。ヒトｓＦｃεＲＩαの効果は、抗原チャレンジ
２時間後の耳の厚さを指標とした。測定はダイヤゲージ
（ＰＥＡＣＯＣＫ、尾崎製作所製）を用いた。尚、本試
験では、マウスはコントロール群、ヒトｓＦｃεＲＩα
投与群それぞれ８匹ずつ用いた。
ー反応の抑制作用 （方法）雌ＢＡＬＢ／Ｃマウス（８週令以上）の背部皮
下に、抗−ＴＮＰ・ＩｇＥ産生ハイブリドーマＩＧＥＬ
ａ２（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＴＩＢ１４２）を１０6 移植
し、モデル動物を作成した。移植８日目に０．４％塩化
ピクリルのアセトン溶液１０μｌをマウスの左耳に塗布
して第１次抗原チャレンジを行い、１４日目に同様の方
法にて第２次抗原チャレンジを行った。一方、ヒトｓＦ
ｃεＲＩαは、移植後７、８日目に２５μｇ／匹、移植
後９、１１、１３、１５日目に１００μｇ／匹静脈内投
与した。ヒトｓＦｃεＲＩαの効果は、抗原チャレンジ
２時間後の耳の厚さを指標とした。測定はダイヤゲージ
（ＰＥＡＣＯＣＫ、尾崎製作所製）を用いた。尚、本試
験では、マウスはコントロール群、ヒトｓＦｃεＲＩα
投与群それぞれ８匹ずつ用いた。
【００３３】（結果）第１次抗原チャレンジ２時間後に
ついては、コントロール群とヒトｓＦｃεＲＩα投与群
との間に差異はなかった。しかしながら、第２次抗原チ
ャレンジ２時間後については、コントロール群では第１
次抗原チャレンジによる耳の腫大と同様の腫大が見られ
たのに対し、ヒトｓＦｃεＲＩα投与群では耳の腫大は
抑制された（図３）。上記事実により、ヒトｓＦｃεＲ
Ｉαは、ＩｇＥ抗体の関与するＩ型アレルギー（アナフ
ィラキシー反応）、例えばアトピー性皮膚炎に対して２
次的発症を抑制するので優れた予防剤となりえる。
ついては、コントロール群とヒトｓＦｃεＲＩα投与群
との間に差異はなかった。しかしながら、第２次抗原チ
ャレンジ２時間後については、コントロール群では第１
次抗原チャレンジによる耳の腫大と同様の腫大が見られ
たのに対し、ヒトｓＦｃεＲＩα投与群では耳の腫大は
抑制された（図３）。上記事実により、ヒトｓＦｃεＲ
Ｉαは、ＩｇＥ抗体の関与するＩ型アレルギー（アナフ
ィラキシー反応）、例えばアトピー性皮膚炎に対して２
次的発症を抑制するので優れた予防剤となりえる。
【図１】プラスミドＦｃεＲＩ／ｐＭＴ１の構造を示
す。
す。
【図２】プラスミドｐＴＴ０６の調製工程を示す。
【図３】抗原チャレンジ（第１次、第２次）２時間後の
コントロール群とヒトｓＦｃεＲＩα投与群の耳の腫大
を測定した図である。
コントロール群とヒトｓＦｃεＲＩα投与群の耳の腫大
を測定した図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ 8214−4Ｂ (Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 平間 稔 大阪府枚方市招提大谷２丁目25番１号 株 式会社ミドリ十字中央研究所内 (72)発明者 奥村 康 千葉県千葉市中央区松波１−14−９
Claims (6)
- 【請求項１】 ヒトＩｇＥとの結合が可能なペプチドを
有効成分として含有することを特徴とするアトピー性皮
膚炎予防・治療剤。 - 【請求項２】 ヒトＩｇＥとの結合が可能なペプチドが
高親和性免疫グロブリンＥ受容体α鎖を含むペプチドで
ある請求項１記載のアトピー性皮膚炎予防・治療剤。 - 【請求項３】 高親和性免疫グロブリンＥ受容体α鎖が
ヒト由来である請求項２記載のアトピー性皮膚炎予防・
治療剤。 - 【請求項４】 ヒトＩｇＥとの結合が可能なペプチドが
高親和性免疫グロブリンＥ受容体α鎖の可溶性断片を含
むペプチドである請求項１記載のアトピー性皮膚炎予防
・治療剤。 - 【請求項５】 高親和性免疫グロブリンＥ受容体α鎖の
可溶性断片がヒト由来である請求項４記載のアトピー性
皮膚炎予防・治療剤。 - 【請求項６】 剤型が外用剤である請求項１〜５記載の
アトピー性皮膚炎予防・治療剤。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5251606A JPH06206828A (ja) | 1992-10-08 | 1993-10-07 | アトピー性皮膚炎予防・治療剤 |
| US08/238,027 US5874404A (en) | 1992-08-04 | 1994-05-03 | Immunoglobulin E receptor α-chain inhibits IgE production and secondary allergic responses |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP27051492 | 1992-10-08 | ||
| JP4-270514 | 1992-10-08 | ||
| JP5251606A JPH06206828A (ja) | 1992-10-08 | 1993-10-07 | アトピー性皮膚炎予防・治療剤 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06206828A true JPH06206828A (ja) | 1994-07-26 |
Family
ID=26540271
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5251606A Pending JPH06206828A (ja) | 1992-08-04 | 1993-10-07 | アトピー性皮膚炎予防・治療剤 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH06206828A (ja) |
-
1993
- 1993-10-07 JP JP5251606A patent/JPH06206828A/ja active Pending
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