JPH06219962A - 花粉症予防・治療剤 - Google Patents
花粉症予防・治療剤Info
- Publication number
- JPH06219962A JPH06219962A JP5251605A JP25160593A JPH06219962A JP H06219962 A JPH06219962 A JP H06219962A JP 5251605 A JP5251605 A JP 5251605A JP 25160593 A JP25160593 A JP 25160593A JP H06219962 A JPH06219962 A JP H06219962A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- human
- ige
- sfcεriα
- chain
- pollinosis
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Medicinal Preparation (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【構成】 ヒトＩｇＥとの結合が可能なペプチド、具体
的には高親和性免疫グロブリンＥ受容体α鎖やヒトＩｇ
Ｅとの結合が可能な高親和性グロブリンＥ受容体α鎖可
溶性断片を有効成分とする花粉症予防・治療剤。 【効果】 花粉アレルギーをその根源において遮断する
臨床上有用な花粉症予防・治療剤が提供される。
的には高親和性免疫グロブリンＥ受容体α鎖やヒトＩｇ
Ｅとの結合が可能な高親和性グロブリンＥ受容体α鎖可
溶性断片を有効成分とする花粉症予防・治療剤。 【効果】 花粉アレルギーをその根源において遮断する
臨床上有用な花粉症予防・治療剤が提供される。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ヒトＩｇＥとの結合が
可能なペプチドの新規用途に関する。より詳細には高親
和性免疫グロブリンＥ受容体α鎖（ＦｃεＲＩα）やヒ
トＩｇＥとの結合が可能な高親和性免疫グロブリンＥ受
容体α鎖可溶性断片（ｓＦｃεＲＩα）からなる花粉ア
レルギーによる花粉症の予防・治療剤に関する。
可能なペプチドの新規用途に関する。より詳細には高親
和性免疫グロブリンＥ受容体α鎖（ＦｃεＲＩα）やヒ
トＩｇＥとの結合が可能な高親和性免疫グロブリンＥ受
容体α鎖可溶性断片（ｓＦｃεＲＩα）からなる花粉ア
レルギーによる花粉症の予防・治療剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】近年、杉等の植物による花粉アレルギー
による、アレルギー性結膜炎やアレルギー性鼻炎（鼻
水、鼻づまり、くしゃみ）のいわゆる花粉症の症状を訴
える患者が急増する傾向にある。花粉アレルギーは外来
性因子、即ち花粉の侵入によってマスト細胞や好塩基球
からヒスタミンやロイコトリエン等の化学伝達物質や種
々の酵素が遊離し、特に鼻や目にその症状が現れる。
による、アレルギー性結膜炎やアレルギー性鼻炎（鼻
水、鼻づまり、くしゃみ）のいわゆる花粉症の症状を訴
える患者が急増する傾向にある。花粉アレルギーは外来
性因子、即ち花粉の侵入によってマスト細胞や好塩基球
からヒスタミンやロイコトリエン等の化学伝達物質や種
々の酵素が遊離し、特に鼻や目にその症状が現れる。
【０００３】花粉症の治療対策としては、抗アレルギー
薬による予防的治療、抗ヒスタミン剤やステロイド製剤
による対症療法、減感作療法などが行われている。しか
しながら、予防的治療として満足のいく効果を有する抗
アレルギー薬は未だ出現しておらず、また、対症療法に
用いられる抗ヒスタミン剤やステロイド製剤もその副作
用がしばしば問題となっている。
薬による予防的治療、抗ヒスタミン剤やステロイド製剤
による対症療法、減感作療法などが行われている。しか
しながら、予防的治療として満足のいく効果を有する抗
アレルギー薬は未だ出現しておらず、また、対症療法に
用いられる抗ヒスタミン剤やステロイド製剤もその副作
用がしばしば問題となっている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、花粉
アレルギーをその根源において遮断する臨床上有用な花
粉症予防・治療剤を提供することにある。
アレルギーをその根源において遮断する臨床上有用な花
粉症予防・治療剤を提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を達成するために鋭意研究を重ねた結果、ヒトＩｇＥと
の結合が可能なペプチドを、予防的に投与することによ
り花粉症の発症を抑制することができ、又、花粉症が発
症してからでもヒトＩｇＥとの結合が可能なペプチドを
投与すればその症状が改善されることを見い出し、本発
明を完成した。
を達成するために鋭意研究を重ねた結果、ヒトＩｇＥと
の結合が可能なペプチドを、予防的に投与することによ
り花粉症の発症を抑制することができ、又、花粉症が発
症してからでもヒトＩｇＥとの結合が可能なペプチドを
投与すればその症状が改善されることを見い出し、本発
明を完成した。
【０００６】本発明は、かかる新知見に基づいて完成さ
れたものであり、ヒトＩｇＥとの結合が可能なペプチド
を用いた花粉症予防・治療剤に関する。
れたものであり、ヒトＩｇＥとの結合が可能なペプチド
を用いた花粉症予防・治療剤に関する。
【０００７】本発明において、ヒトＩｇＥとの結合が可
能なペプチドとは、ヒトＩｇＥに特異的に結合し、その
機能を阻害するペプチドをいう。具体的には、高親和性
免疫グロブリンＥ受容体α鎖（ＦｃεＲＩα）やヒトＩ
ｇＥとの結合が可能な高親和性免疫グロブリンＥ受容体
α鎖可溶性断片（ｓＦｃεＲＩα）を含むペプチドが挙
げられる。
能なペプチドとは、ヒトＩｇＥに特異的に結合し、その
機能を阻害するペプチドをいう。具体的には、高親和性
免疫グロブリンＥ受容体α鎖（ＦｃεＲＩα）やヒトＩ
ｇＥとの結合が可能な高親和性免疫グロブリンＥ受容体
α鎖可溶性断片（ｓＦｃεＲＩα）を含むペプチドが挙
げられる。
【０００８】これらは花粉アレルギーの発現機序の発端
である、肥満細胞や好塩基球などの細胞膜上で高親和性
をもってＩｇＥのＦｃ部分と特異的に結合する高親和性
免疫グロブリンＥ受容体（ＦｃεＲＩ）へのＩｇＥの結
合を阻害するので、花粉アレルギーをその根源において
遮断する。
である、肥満細胞や好塩基球などの細胞膜上で高親和性
をもってＩｇＥのＦｃ部分と特異的に結合する高親和性
免疫グロブリンＥ受容体（ＦｃεＲＩ）へのＩｇＥの結
合を阻害するので、花粉アレルギーをその根源において
遮断する。
【０００９】ＦｃεＲＩはα鎖、β鎖及びジスルフィド
結合した２個のγ鎖のサブユニットから成る４量体構造
をした糖蛋白質であり、ＩｇＥとの高親和性結合にはα
鎖の細胞外領域のみが関与していることが明らかにされ
ている [Blank. U et al., J. Biol. Chem., 266, 2639
(1991)]。
結合した２個のγ鎖のサブユニットから成る４量体構造
をした糖蛋白質であり、ＩｇＥとの高親和性結合にはα
鎖の細胞外領域のみが関与していることが明らかにされ
ている [Blank. U et al., J. Biol. Chem., 266, 2639
(1991)]。
【００１０】ＦｃεＲＩαは上記ＦｃεＲＩのα鎖のこ
とであり、ｓＦｃεＲＩαはα鎖の細胞外領域に相当す
る。
とであり、ｓＦｃεＲＩαはα鎖の細胞外領域に相当す
る。
【００１１】本発明に用いられるヒトＩｇＥとの結合が
可能なペプチドは、少なくともα鎖の細胞外領域、即ち
ｓＦｃεＲＩαを含んでいればよいのであって、Ｆｃε
ＲＩαを用いても、ＦｃεＲＩ自体を用いてもなんら問
題はない。また、遺伝子工学的手法により人工的に改変
された変異体やＤＤＳ化された誘導体、例えばアルブミ
ンのコンジュゲートであっても、ヒトＩｇＥとの結合が
可能なものであれば用い得るが、特にｓＦｃεＲＩαが
好ましい。また、これらはヒト由来のものが好ましい。
可能なペプチドは、少なくともα鎖の細胞外領域、即ち
ｓＦｃεＲＩαを含んでいればよいのであって、Ｆｃε
ＲＩαを用いても、ＦｃεＲＩ自体を用いてもなんら問
題はない。また、遺伝子工学的手法により人工的に改変
された変異体やＤＤＳ化された誘導体、例えばアルブミ
ンのコンジュゲートであっても、ヒトＩｇＥとの結合が
可能なものであれば用い得るが、特にｓＦｃεＲＩαが
好ましい。また、これらはヒト由来のものが好ましい。
【００１２】ｓＦｃεＲＩαは細胞培養手法や遺伝子工
学的手法により製造が可能である。Ｂｌａｎｋ．Ｕらは
ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）欠損ＣＨＯ細胞を用
いてｓＦｃεＲＩαを発現することに成功している（上
記文献）。
学的手法により製造が可能である。Ｂｌａｎｋ．Ｕらは
ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）欠損ＣＨＯ細胞を用
いてｓＦｃεＲＩαを発現することに成功している（上
記文献）。
【００１３】本発明者らも、（１）動物細胞での発現を
制御できるプロモーターを上流部に付加したｓＦｃεＲ
Ｉα遺伝子及びウロキナーゼ（ＵＫ）プロモーターを付
加したＤＨＦＲ遺伝子を組み込んでなるプラスミドを用
いて形質転換させた動物細胞、（２）動物細胞での発現
を制御できるプロモーターを上流部に付加したｓＦｃε
ＲＩα遺伝子をコードするＤＮＡを担持させたプラスミ
ド及びＵＫプロモーターを上流部に付加したＤＨＦＲを
コードするＤＮＡを担持させたプラスミドを同時に用い
て形質転換させた動物細胞、（３）上記（１）または
（２）の動物細胞を培養することによるｓＦｃεＲＩα
の大量製造方法を確立している（後記参考例参照）。
制御できるプロモーターを上流部に付加したｓＦｃεＲ
Ｉα遺伝子及びウロキナーゼ（ＵＫ）プロモーターを付
加したＤＨＦＲ遺伝子を組み込んでなるプラスミドを用
いて形質転換させた動物細胞、（２）動物細胞での発現
を制御できるプロモーターを上流部に付加したｓＦｃε
ＲＩα遺伝子をコードするＤＮＡを担持させたプラスミ
ド及びＵＫプロモーターを上流部に付加したＤＨＦＲを
コードするＤＮＡを担持させたプラスミドを同時に用い
て形質転換させた動物細胞、（３）上記（１）または
（２）の動物細胞を培養することによるｓＦｃεＲＩα
の大量製造方法を確立している（後記参考例参照）。
【００１４】ｓＦｃεＲＩαの遺伝子工学的手法による
製造は上記動物細胞を用いる方法のほか大腸菌や酵母を
用いる方法で製造してもよい。
製造は上記動物細胞を用いる方法のほか大腸菌や酵母を
用いる方法で製造してもよい。
【００１５】本発明に用いられるヒトＩｇＥとの結合が
可能なペプチドは、全身療法、局所療法いずれにおいて
も適用可能であるが、好ましくは眼粘膜や鼻粘膜などの
局所に投与できる剤型がよい。具体的には点眼剤、点鼻
剤、軟膏剤等が挙げられる。これらは公知の方法によっ
て調製可能である。点眼剤、点鼻剤は、注射用蒸留水に
有効成分としてヒトＩｇＥとの結合が可能なペプチドを
溶解し、必要に応じ助剤として、緩衝液、等張化剤、増
粘剤、保存剤、安定剤、界面活性剤、防腐剤等を加え、
ｐＨを４〜９に調整することにより得られる。噴霧用点
鼻剤は例えば特開昭６３−１０１３１８号公報に記載の
方法で調製できる。軟膏剤としては、ゲル軟膏剤が好ま
しく、例えばカルボキシビニルポリマーをゲル化剤と
し、水酸化ナトリウム等の塩基性増粘化剤を用いて増粘
させて得られるゲル基材に有効成分としてヒトＩｇＥと
の結合が可能なペプチドを混合し、必要に応じて助剤を
加え、ｐＨを４〜９に調整することにより得られる。
可能なペプチドは、全身療法、局所療法いずれにおいて
も適用可能であるが、好ましくは眼粘膜や鼻粘膜などの
局所に投与できる剤型がよい。具体的には点眼剤、点鼻
剤、軟膏剤等が挙げられる。これらは公知の方法によっ
て調製可能である。点眼剤、点鼻剤は、注射用蒸留水に
有効成分としてヒトＩｇＥとの結合が可能なペプチドを
溶解し、必要に応じ助剤として、緩衝液、等張化剤、増
粘剤、保存剤、安定剤、界面活性剤、防腐剤等を加え、
ｐＨを４〜９に調整することにより得られる。噴霧用点
鼻剤は例えば特開昭６３−１０１３１８号公報に記載の
方法で調製できる。軟膏剤としては、ゲル軟膏剤が好ま
しく、例えばカルボキシビニルポリマーをゲル化剤と
し、水酸化ナトリウム等の塩基性増粘化剤を用いて増粘
させて得られるゲル基材に有効成分としてヒトＩｇＥと
の結合が可能なペプチドを混合し、必要に応じて助剤を
加え、ｐＨを４〜９に調整することにより得られる。
【００１６】本剤は、花粉の飛散する時期以前から予防
的に用いることにより、その発症を抑制することがで
き、発症してからでも適宜用いることによりその症状を
改善することができる。従来より用いられている抗アレ
ルギー剤等との併用も可能である。予防的に用いる際に
は、外来性因子に対するＩｇＥ量の２倍以上投与するの
が望ましい。治療剤としての使用の際には、発症後でき
るだけ早い時期に大量投与、好ましくは外来性因子に対
するＩｇＥ量の１０倍以上投与するのが望ましい。
的に用いることにより、その発症を抑制することがで
き、発症してからでも適宜用いることによりその症状を
改善することができる。従来より用いられている抗アレ
ルギー剤等との併用も可能である。予防的に用いる際に
は、外来性因子に対するＩｇＥ量の２倍以上投与するの
が望ましい。治療剤としての使用の際には、発症後でき
るだけ早い時期に大量投与、好ましくは外来性因子に対
するＩｇＥ量の１０倍以上投与するのが望ましい。
【００１７】
【発明の効果】本発明により、花粉アレルギーをその根
源において遮断する臨床上有用な花粉症予防・治療剤が
提供される。
源において遮断する臨床上有用な花粉症予防・治療剤が
提供される。
【００１８】
【実施例】本発明をより詳細に説明するために参考例、
実施例、試験例を挙げるが、本発明はこれらによって何
ら制限されるものではない。
実施例、試験例を挙げるが、本発明はこれらによって何
ら制限されるものではない。
【００１９】参考例 ヒトｓＦｃεＲＩαの製造 [Ｉ] ＦｃεＲＩ／ｐＭＴ１の構築 [動物細胞での発現を制御できるプロモーター（ＳＶ４
０）を上流部に付加したヒトｓＦｃεＲＩαをコードす
るＤＮＡを組み込んで構成されるプラスミドの構築]Bla
nk らの報告[Blank. U et al., J. Biol. Chem. 266,
2639 (1991)] に従い、プラスミドｐｋｏ[Doren, K.V.
et al., J. Virol, 50, 606, (1984)] にヒトＦｃεＲ
Ｉαのリーダー配列−ヒトｓＦｃεＲＩα遺伝子を組み
込んだプラスミドＦｃεＲＩ／ｐＭＴ１（図１）を構築
した。尚、ヒトｓＦｃεＲＩα遺伝子をコードするＤＮ
Ａ配列およびそれから演繹されるアミノ酸配列はNuclei
c Acids Research, Volume 16 Number 8, 3584 (1988)
に開示されている。
０）を上流部に付加したヒトｓＦｃεＲＩαをコードす
るＤＮＡを組み込んで構成されるプラスミドの構築]Bla
nk らの報告[Blank. U et al., J. Biol. Chem. 266,
2639 (1991)] に従い、プラスミドｐｋｏ[Doren, K.V.
et al., J. Virol, 50, 606, (1984)] にヒトＦｃεＲ
Ｉαのリーダー配列−ヒトｓＦｃεＲＩα遺伝子を組み
込んだプラスミドＦｃεＲＩ／ｐＭＴ１（図１）を構築
した。尚、ヒトｓＦｃεＲＩα遺伝子をコードするＤＮ
Ａ配列およびそれから演繹されるアミノ酸配列はNuclei
c Acids Research, Volume 16 Number 8, 3584 (1988)
に開示されている。
【００２０】[II] ｐＴＴ０６の構築 [ＵＫプロモーターを上流部に付加したＤＨＦＲをコー
ドするＤＮＡを組み込んで構成されるなるプラスミドの
構築]Biosci. Biotech. Biochem., 56 (4), 600-604, 1
992に従い、ＵＫプロモーター，DHFRｃＤＮＡ, ＳＶ４
０ポリＡ付加シグナルを含むプラスミドｐＴＴ０６を構
築した（図２参照）。
ドするＤＮＡを組み込んで構成されるなるプラスミドの
構築]Biosci. Biotech. Biochem., 56 (4), 600-604, 1
992に従い、ＵＫプロモーター，DHFRｃＤＮＡ, ＳＶ４
０ポリＡ付加シグナルを含むプラスミドｐＴＴ０６を構
築した（図２参照）。
【００２１】 [III] 動物細胞への導入および高産生細胞の樹立 (i) 材料； ・プラスミドＤＮＡ ＦｃεＲＩ／ｐＭＴ１：ｐｋｏにヒトＦｃεＲＩαのリ
ーダー配列−ヒトｓＦｃεＲＩα遺伝子を組み込んだプ
ラスミド。 ｐＴＴ０６：ＵＫプロモーター（ウロキナーゼ遺伝子転
写開始点を含む上流約８００ｂｐの５’調節領域）に支
配されるＤＨＦＲ遺伝子発現ユニットからなるプラスミ
ド。 ・細胞； ＣＨＯ ＤＸＢ−１１細胞株（ＤＨＦＲ欠損株） G. Urlaub et al., Proc, Natl. Acad. Sci. USA, 77,
4216-4220 (1980)に記載の方法で調製、増殖させた。 ・メトトレキセート（ＭＴＸ）；Sigma 社製（＋）Amet
hopterinを0.14 M NaCl, 0.02 M HEPES （ナカライテス
ク）に溶解し、２mMストック液を調製した。これを培地
に、目的の濃度になるように添加し使用した。
ーダー配列−ヒトｓＦｃεＲＩα遺伝子を組み込んだプ
ラスミド。 ｐＴＴ０６：ＵＫプロモーター（ウロキナーゼ遺伝子転
写開始点を含む上流約８００ｂｐの５’調節領域）に支
配されるＤＨＦＲ遺伝子発現ユニットからなるプラスミ
ド。 ・細胞； ＣＨＯ ＤＸＢ−１１細胞株（ＤＨＦＲ欠損株） G. Urlaub et al., Proc, Natl. Acad. Sci. USA, 77,
4216-4220 (1980)に記載の方法で調製、増殖させた。 ・メトトレキセート（ＭＴＸ）；Sigma 社製（＋）Amet
hopterinを0.14 M NaCl, 0.02 M HEPES （ナカライテス
ク）に溶解し、２mMストック液を調製した。これを培地
に、目的の濃度になるように添加し使用した。
【００２２】(ii) 方法 ＤＮＡ導入およびトランスフェクタント上清のアッ
セイ α変法イーグルＭＥＭ，10％FCS で継代しているDHFR欠
損CHO DXB-11細胞をトリプシン(0.25%) 処理によりディ
ッシュからはがし、107 cell/ml となるよう Hanks液に
懸濁した。この懸濁液0.5 ml，５×106 個の細胞にプラ
スミドＤＮＡ（１μｇのｐＴＴ０６と４０μｇのＦｃε
ＲＩ／ｐＭＴ１）を同時にエレクトロポレーション法に
より導入した。α変法イーグルＭＥＭ（リボ核酸・デオ
キシリボ核酸含まず），10％ＦＣＳで培養後、生じたコ
ロニーを拾いあげて順次拡大し、これらトランスフェク
タントの培養上清中のヒトｓＦｃεＲＩα活性を以下の
に記載の方法に従い測定し、高い活性が見られた株に
ついてＭＴＸによるＤＮＡ増幅を行った。
セイ α変法イーグルＭＥＭ，10％FCS で継代しているDHFR欠
損CHO DXB-11細胞をトリプシン(0.25%) 処理によりディ
ッシュからはがし、107 cell/ml となるよう Hanks液に
懸濁した。この懸濁液0.5 ml，５×106 個の細胞にプラ
スミドＤＮＡ（１μｇのｐＴＴ０６と４０μｇのＦｃε
ＲＩ／ｐＭＴ１）を同時にエレクトロポレーション法に
より導入した。α変法イーグルＭＥＭ（リボ核酸・デオ
キシリボ核酸含まず），10％ＦＣＳで培養後、生じたコ
ロニーを拾いあげて順次拡大し、これらトランスフェク
タントの培養上清中のヒトｓＦｃεＲＩα活性を以下の
に記載の方法に従い測定し、高い活性が見られた株に
ついてＭＴＸによるＤＮＡ増幅を行った。
【００２３】 ヒトｓＦｃεＲＩαの定量 ヒトｓＦｃεＲＩαの濃度は、ラット好塩基球細胞株上
に存在するＦｃεＲＩへの 125Ｉ標識マウスＩｇＥの結
合阻害で測定した。以下にその材料と方法を示す。 （材料） ・細胞；ラット好塩基球細胞株ＲＢＬ−２Ｈ３は、10％
ＦＣＳ、100U/ml ペニシリンおよび100 μg/mlストレプ
トマイシンを含むイーグルＭＥＭ中で培養した。 ・ＩｇＥ；抗ジニトロフェニルマウスモノクローナルＩ
ｇＥ(Hi-DNP-E-26-82)、または抗トリニトロフェニル
（ＴＮＰ）マウスモノクローナルＩｇＥを用いた。抗Ｔ
ＮＰマウスモノクローナルＩｇＥは、マウスハイブリド
ーマＩＧＥＬｂ４（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＴＩＢ１４１）の
培養上清またはマウス腹水より精製した。 ・ＩｇＥのヨード標識；バイオラッド社製Enzymobeads
法を用いた。0.2 Ｍリン酸緩衝液 (pH7.2) 50 μｌ、マ
ウスモノクローナルＩｇＥ（2.14mg/ml) 10 μｌ、Enzy
mobeads 試薬50μｌ、Na 125Ｉ25μｌ（95MBq)、１％β
−Ｄグルコース水溶液25μｌを混和し、室温で15〜20分
間反応させた。150 μｌの10mg／ml チロシン、10％グ
リセリンおよび0.1 ％キシレンシアノールを含むリン酸
緩衝生理的食塩水と混和した後、ＰＤ−１０カラム（フ
ァルマシア製）を用いたゲル濾過法にて蛋白を回収し
た。 （方法） ＩｇＥ結合アッセイ； (1) ＣＨＯ細胞は、10％FCS 添加α変法イーグルＭＥ
Ｍ（リボ核酸・デオキシリボ核酸含まず）で維持するの
で、この培養液で希釈したサンプルを調製した（125-25
0 μｌ) 。 (2) ３％牛血清アルブミンおよび0.1 ％ NaN3 添加ダ
ルベッコリン酸緩衝生理的食塩水（ＰＢＳ／３％ ＢＳ
Ａ）で希釈した125 Ｉ標識ＩｇＥを(1) のサンプルに添
加した。総体積は500 μｌで、125 Ｉ標識ＩｇＥの濃度
は100ng/mlである。この混合物を室温で３〜６時間イン
キュベートした。 (3) ＰＢＳ／３％ ＢＳＡ中に懸濁したＲＢＬ−２Ｈ
３細胞（３〜８×107 /ml)50 μｌを添加し、氷中で１
〜２時間インキュベートした。また、標識ＩｇＥの細胞
への非特異的吸着を調べるための非標識ＩｇＥ添加群で
は、前もって150μｌのＲＢＬ−２Ｈ３細胞懸濁液と15
μｌの2.1mg/ml非標識ＩｇＥを混和しておき、この混合
液55μｌを(2) の混合液に添加した。 (4) 1000rpm, ５分間遠心により細胞を沈澱させ、上清
を捨てた。 (5) 細胞を、ＰＢＳ／３％ ＢＳＡにて一度洗浄した
のち、結合した放射活性をガンマカウンターにて測定し
た。 (6) 添加物なしの放射活性として10% FCS 添加α変法
イーグルＭＥＭ（リボ核酸・デオキシリボ核酸含まず）
を加えた際のcpm を用い、以下の式に従い結合阻害率を
測定した。
に存在するＦｃεＲＩへの 125Ｉ標識マウスＩｇＥの結
合阻害で測定した。以下にその材料と方法を示す。 （材料） ・細胞；ラット好塩基球細胞株ＲＢＬ−２Ｈ３は、10％
ＦＣＳ、100U/ml ペニシリンおよび100 μg/mlストレプ
トマイシンを含むイーグルＭＥＭ中で培養した。 ・ＩｇＥ；抗ジニトロフェニルマウスモノクローナルＩ
ｇＥ(Hi-DNP-E-26-82)、または抗トリニトロフェニル
（ＴＮＰ）マウスモノクローナルＩｇＥを用いた。抗Ｔ
ＮＰマウスモノクローナルＩｇＥは、マウスハイブリド
ーマＩＧＥＬｂ４（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＴＩＢ１４１）の
培養上清またはマウス腹水より精製した。 ・ＩｇＥのヨード標識；バイオラッド社製Enzymobeads
法を用いた。0.2 Ｍリン酸緩衝液 (pH7.2) 50 μｌ、マ
ウスモノクローナルＩｇＥ（2.14mg/ml) 10 μｌ、Enzy
mobeads 試薬50μｌ、Na 125Ｉ25μｌ（95MBq)、１％β
−Ｄグルコース水溶液25μｌを混和し、室温で15〜20分
間反応させた。150 μｌの10mg／ml チロシン、10％グ
リセリンおよび0.1 ％キシレンシアノールを含むリン酸
緩衝生理的食塩水と混和した後、ＰＤ−１０カラム（フ
ァルマシア製）を用いたゲル濾過法にて蛋白を回収し
た。 （方法） ＩｇＥ結合アッセイ； (1) ＣＨＯ細胞は、10％FCS 添加α変法イーグルＭＥ
Ｍ（リボ核酸・デオキシリボ核酸含まず）で維持するの
で、この培養液で希釈したサンプルを調製した（125-25
0 μｌ) 。 (2) ３％牛血清アルブミンおよび0.1 ％ NaN3 添加ダ
ルベッコリン酸緩衝生理的食塩水（ＰＢＳ／３％ ＢＳ
Ａ）で希釈した125 Ｉ標識ＩｇＥを(1) のサンプルに添
加した。総体積は500 μｌで、125 Ｉ標識ＩｇＥの濃度
は100ng/mlである。この混合物を室温で３〜６時間イン
キュベートした。 (3) ＰＢＳ／３％ ＢＳＡ中に懸濁したＲＢＬ−２Ｈ
３細胞（３〜８×107 /ml)50 μｌを添加し、氷中で１
〜２時間インキュベートした。また、標識ＩｇＥの細胞
への非特異的吸着を調べるための非標識ＩｇＥ添加群で
は、前もって150μｌのＲＢＬ−２Ｈ３細胞懸濁液と15
μｌの2.1mg/ml非標識ＩｇＥを混和しておき、この混合
液55μｌを(2) の混合液に添加した。 (4) 1000rpm, ５分間遠心により細胞を沈澱させ、上清
を捨てた。 (5) 細胞を、ＰＢＳ／３％ ＢＳＡにて一度洗浄した
のち、結合した放射活性をガンマカウンターにて測定し
た。 (6) 添加物なしの放射活性として10% FCS 添加α変法
イーグルＭＥＭ（リボ核酸・デオキシリボ核酸含まず）
を加えた際のcpm を用い、以下の式に従い結合阻害率を
測定した。
【００２４】
【数１】
【００２５】 ＭＴＸによる導入遺伝子の増幅 で得られたヒトｓＦｃεＲＩα産生株を、５〜10×10
5 cells/dishとなるように10nM MTX含有選択培地８〜10
ml入り10cmディッシュに植え込んだ。約３日毎に培地交
換を行い、２〜４週間培養を続けていると充分な細胞数
の10nM MTX耐性細胞が得られるので、次の段階のＭＴＸ
濃度の培地に継代した。このように10nMMTX濃度からス
タートして50nM, 100nM, 200nM, 500nM,１μＭ，２μ
Ｍ，４μＭ，10μＭと順次ＭＴＸ濃度を上げて遺伝子増
幅を行った。
5 cells/dishとなるように10nM MTX含有選択培地８〜10
ml入り10cmディッシュに植え込んだ。約３日毎に培地交
換を行い、２〜４週間培養を続けていると充分な細胞数
の10nM MTX耐性細胞が得られるので、次の段階のＭＴＸ
濃度の培地に継代した。このように10nMMTX濃度からス
タートして50nM, 100nM, 200nM, 500nM,１μＭ，２μ
Ｍ，４μＭ，10μＭと順次ＭＴＸ濃度を上げて遺伝子増
幅を行った。
【００２６】 ヒトｓＦｃεＲＩα産生株のクローニング でMTX の増幅を行ったヒトｓＦｃεＲＩα産生株のう
ちの幾つかについて限界希釈法によるクローニングを行
った。すなわち、各濃度のMTX 耐性細胞を10%FCSおよび
２〜10μM MTX を含むα変法イーグルＭＥＭ（リボ核酸
・デオキシリボ核酸含まず）中で培養し、96ウェルプレ
ートに播種した。増殖が観察されたウェルより細胞を回
収して24ウェルプレート、さらに10cmディッシュへ順次
拡大し、コンフルエントになった段階での上清中のヒト
ｓＦｃεＲＩα産生量を調べた。
ちの幾つかについて限界希釈法によるクローニングを行
った。すなわち、各濃度のMTX 耐性細胞を10%FCSおよび
２〜10μM MTX を含むα変法イーグルＭＥＭ（リボ核酸
・デオキシリボ核酸含まず）中で培養し、96ウェルプレ
ートに播種した。増殖が観察されたウェルより細胞を回
収して24ウェルプレート、さらに10cmディッシュへ順次
拡大し、コンフルエントになった段階での上清中のヒト
ｓＦｃεＲＩα産生量を調べた。
【００２７】[IV] ヒトｓＦｃεＲＩαの精製 ヒトｓＦｃεＲＩαを比較的高く産生していたクローン
細胞株の培養上清983ml に、1/20容積の1mM Tris, pH8.
0 および10mMベンザミジン、10mMエチレンジアミン４酢
酸、0.02％アジ化ナトリウムを添加し、0.22μm のフィ
ルターで濾過した試料をＩｇＥ Sepharose 4Bカラム
〔マウスハイブリドーマIGELb4（ATCC No.TIB141)培養
上清から精製した抗トリニトロフェニルＩｇＥ10mgを0.
1M炭酸水素ナトリウム中で活性化CH Sepharose (Pharma
cia) 1g に結合させたもの〕を用いて精製した。カラム
を0.02％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳで洗浄後、カラ
ムに結合した蛋白を0.2M酢酸、0.2M塩化ナトリウム、0.
02％アジ化ナトリウム、pH2.8 で溶出した。得られた精
製ヒトｓＦｃεＲＩαを10mM重炭酸アンモニウムに対し
て透析した後、200 μｌをSpeedVacで乾燥させ、ＳＤＳ
電気泳動で調べると、クーマジーブルー染色で還元およ
び非還元両方の条件下で分子量５０ｋＤａ付近に明確な
バンドが検出され、このバンド以外の蛋白は検出されな
かった。この蛋白はラジオイムノアッセイで放射性標識
ＩｇＥの好塩基球細胞（ＲＢＬ−２Ｈ３細胞；前出）へ
の結合を阻害する活性を有していた。かかる精製ヒトＦ
ｃεＲＩαの濃度は、Bradford法 [Bradford, M.M., An
al. Biochem. 72, 248(1976)] によって定量した。
細胞株の培養上清983ml に、1/20容積の1mM Tris, pH8.
0 および10mMベンザミジン、10mMエチレンジアミン４酢
酸、0.02％アジ化ナトリウムを添加し、0.22μm のフィ
ルターで濾過した試料をＩｇＥ Sepharose 4Bカラム
〔マウスハイブリドーマIGELb4（ATCC No.TIB141)培養
上清から精製した抗トリニトロフェニルＩｇＥ10mgを0.
1M炭酸水素ナトリウム中で活性化CH Sepharose (Pharma
cia) 1g に結合させたもの〕を用いて精製した。カラム
を0.02％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳで洗浄後、カラ
ムに結合した蛋白を0.2M酢酸、0.2M塩化ナトリウム、0.
02％アジ化ナトリウム、pH2.8 で溶出した。得られた精
製ヒトｓＦｃεＲＩαを10mM重炭酸アンモニウムに対し
て透析した後、200 μｌをSpeedVacで乾燥させ、ＳＤＳ
電気泳動で調べると、クーマジーブルー染色で還元およ
び非還元両方の条件下で分子量５０ｋＤａ付近に明確な
バンドが検出され、このバンド以外の蛋白は検出されな
かった。この蛋白はラジオイムノアッセイで放射性標識
ＩｇＥの好塩基球細胞（ＲＢＬ−２Ｈ３細胞；前出）へ
の結合を阻害する活性を有していた。かかる精製ヒトＦ
ｃεＲＩαの濃度は、Bradford法 [Bradford, M.M., An
al. Biochem. 72, 248(1976)] によって定量した。
【００２８】実施例１ 注射剤 精製ヒトｓＦｃεＲＩα 100mg及びブドウ糖100mg を注
射用蒸留水に溶解し、ヒトｓＦｃεＲＩα濃度が 2 mg/
mlになるように調製した。これを0.45μm のメンブラン
フィルターで濾過後、濾液を無菌的に5ml バイアルに分
注し、窒素ガスを充填した後、密封して静脈内注射剤と
した。
射用蒸留水に溶解し、ヒトｓＦｃεＲＩα濃度が 2 mg/
mlになるように調製した。これを0.45μm のメンブラン
フィルターで濾過後、濾液を無菌的に5ml バイアルに分
注し、窒素ガスを充填した後、密封して静脈内注射剤と
した。
【００２９】実施例２ 点眼剤 精製ヒトｓＦｃεＲＩα５００ｍｇ、ソルビトール５０
ｇおよびパラオキシ安息香酸メチル２０ｍｇを注射用蒸
留水に溶解し、リン酸緩衝液にてｐＨを６．５に調整
し、全量を１０００ｍｌとした。これを０．４５μｍの
メンブランフィルターで濾過後、濾液を無菌的に点眼び
んに分注し、点眼剤とした。
ｇおよびパラオキシ安息香酸メチル２０ｍｇを注射用蒸
留水に溶解し、リン酸緩衝液にてｐＨを６．５に調整
し、全量を１０００ｍｌとした。これを０．４５μｍの
メンブランフィルターで濾過後、濾液を無菌的に点眼び
んに分注し、点眼剤とした。
【００３０】実施例３ 点鼻剤 実施例２と同様にして点鼻剤を調製した。
【００３１】実施例４ 軟膏剤 カルボキシビニルポリマー（グッドリッチ社製、カーボ
ポール９４０）２％水溶液２５．０重量部に水酸化ナト
リウム２％水溶液２５重量部を攪拌しながら徐々に加
え、さらに攪拌してゲル状とした。これに精製ヒトｓＦ
ｃεＲＩα２重量部を適当量の精製水に溶かして加え、
さらに精製水を加え全量を１００重量部とし、均一に攪
拌して軟膏剤とした。
ポール９４０）２％水溶液２５．０重量部に水酸化ナト
リウム２％水溶液２５重量部を攪拌しながら徐々に加
え、さらに攪拌してゲル状とした。これに精製ヒトｓＦ
ｃεＲＩα２重量部を適当量の精製水に溶かして加え、
さらに精製水を加え全量を１００重量部とし、均一に攪
拌して軟膏剤とした。
【００３２】 試験例１ マウスのアレルギー性結膜炎に対する作用 2 mg Al(OH)3 gel/ml に10μg のDNP-Ascaris を溶解
し、BALB/Cマウスに腹腔内投与して感作を行った。感作
４週間後から上記実施例２で製造したヒトｓＦｃεＲＩ
αの点眼剤０．１ｍｌを１日１回づつ１週間点眼した。
翌日、0.5 ％DNP-ovalbumin 溶液０．１ｍｌを点眼し
た。その結果、対照群のマウスには結膜炎の症状である
眼球結膜の浮腫等が観察されたが、ヒトｓＦｃεＲＩα
投与群のマウスにはこれらの症状は観察されなかった。
また、上記のような症状を示した対照群のマウスに対し
て、上記点眼剤を点眼したところ、症状が改善された。
し、BALB/Cマウスに腹腔内投与して感作を行った。感作
４週間後から上記実施例２で製造したヒトｓＦｃεＲＩ
αの点眼剤０．１ｍｌを１日１回づつ１週間点眼した。
翌日、0.5 ％DNP-ovalbumin 溶液０．１ｍｌを点眼し
た。その結果、対照群のマウスには結膜炎の症状である
眼球結膜の浮腫等が観察されたが、ヒトｓＦｃεＲＩα
投与群のマウスにはこれらの症状は観察されなかった。
また、上記のような症状を示した対照群のマウスに対し
て、上記点眼剤を点眼したところ、症状が改善された。
【００３３】試験例２ マウスを用いた２次的アレルギ
ー反応の抑制作用 （方法）雌ＢＡＬＢ／Ｃマウス（８週令以上）の背部皮
下に、抗−ＴＮＰ・ＩｇＥ産生ハイブリドーマＩＧＥＬ
ａ２（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＴＩＢ１４２）を１０6 移植
し、モデル動物を作成した。移植８日目に０．４％塩化
ピクリルのアセトン溶液１０μｌをマウスの左耳に塗布
して第１次抗原チャレンジを行い、１４日目に同様の方
法にて第２次抗原チャレンジを行った。一方、ヒトｓＦ
ｃεＲＩαは、移植後７、８日目に２５μｇ／匹、移植
後９、１１、１３、１５日目に１００μｇ／匹静脈内投
与した。ヒトｓＦｃεＲＩαの効果は、抗原チャレンジ
２時間後の耳の厚さを指標とした。測定はダイヤゲージ
（ＰＥＡＣＯＣＫ、尾崎製作所製）を用いた。尚、本試
験では、マウスはコントロール群、ヒトｓＦｃεＲＩα
投与群それぞれ８匹ずつ用いた。
ー反応の抑制作用 （方法）雌ＢＡＬＢ／Ｃマウス（８週令以上）の背部皮
下に、抗−ＴＮＰ・ＩｇＥ産生ハイブリドーマＩＧＥＬ
ａ２（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＴＩＢ１４２）を１０6 移植
し、モデル動物を作成した。移植８日目に０．４％塩化
ピクリルのアセトン溶液１０μｌをマウスの左耳に塗布
して第１次抗原チャレンジを行い、１４日目に同様の方
法にて第２次抗原チャレンジを行った。一方、ヒトｓＦ
ｃεＲＩαは、移植後７、８日目に２５μｇ／匹、移植
後９、１１、１３、１５日目に１００μｇ／匹静脈内投
与した。ヒトｓＦｃεＲＩαの効果は、抗原チャレンジ
２時間後の耳の厚さを指標とした。測定はダイヤゲージ
（ＰＥＡＣＯＣＫ、尾崎製作所製）を用いた。尚、本試
験では、マウスはコントロール群、ヒトｓＦｃεＲＩα
投与群それぞれ８匹ずつ用いた。
【００３４】（結果）第１次抗原チャレンジ２時間後に
ついては、コントロール群とヒトｓＦｃεＲＩα投与群
との間に差異はなかった。しかしながら、第２次抗原チ
ャレンジ２時間後については、コントロール群では第１
次抗原チャレンジによる耳の腫大と同様の腫大が見られ
たのに対し、ヒトｓＦｃεＲＩα投与群では耳の腫大は
抑制された（図３）。上記事実により、ヒトｓＦｃεＲ
Ｉαは、ＩｇＥ抗体の関与するＩ型アレルギー（アナフ
ィラキシー反応）、例えば花粉症に対して２次的発症を
抑制するので優れた予防剤となりえる。
ついては、コントロール群とヒトｓＦｃεＲＩα投与群
との間に差異はなかった。しかしながら、第２次抗原チ
ャレンジ２時間後については、コントロール群では第１
次抗原チャレンジによる耳の腫大と同様の腫大が見られ
たのに対し、ヒトｓＦｃεＲＩα投与群では耳の腫大は
抑制された（図３）。上記事実により、ヒトｓＦｃεＲ
Ｉαは、ＩｇＥ抗体の関与するＩ型アレルギー（アナフ
ィラキシー反応）、例えば花粉症に対して２次的発症を
抑制するので優れた予防剤となりえる。
【図１】プラスミドＦｃεＲＩ／ｐＭＴ１の構造を示
す。
す。
【図２】プラスミドｐＴＴ０６の調製工程を示す。
【図３】抗原チャレンジ（第１次、第２次）２時間後の
コントロール群とヒトｓＦｃεＲＩα投与群の耳の腫大
を測定した図である。
コントロール群とヒトｓＦｃεＲＩα投与群の耳の腫大
を測定した図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ａ６１Ｋ 9/06 Ｖ 7329−4Ｃ 9/08 Ｖ 7329−4Ｃ Ｕ 7329−4Ｃ // Ｃ１２Ｎ 15/12 Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ 8214−4Ｂ (Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 平間 稔 大阪府枚方市招提大谷２丁目25番１号 株 式会社ミドリ十字中央研究所内 (72)発明者 奥村 康 千葉県千葉市中央区松波１−14−９
Claims (8)
- 【請求項１】 ヒトＩｇＥとの結合が可能なペプチドを
有効成分として含有することを特徴とする花粉症予防・
治療剤。 - 【請求項２】 ヒトＩｇＥとの結合が可能なペプチドが
高親和性免疫グロブリンＥ受容体α鎖を含むペプチドで
ある請求項１記載の花粉症予防・治療剤。 - 【請求項３】 高親和性免疫グロブリンＥ受容体α鎖が
ヒト由来である請求項２記載の花粉症予防・治療剤。 - 【請求項４】 ヒトＩｇＥとの結合が可能なペプチドが
高親和性免疫グロブリンＥ受容体α鎖の可溶性断片を含
むペプチドである請求項１記載の花粉症予防・治療剤。 - 【請求項５】 高親和性免疫グロブリンＥ受容体α鎖の
可溶性断片がヒト由来である請求項４記載の花粉症予防
・治療剤。 - 【請求項６】 剤型が点眼剤である請求項１〜５記載の
花粉症予防・治療剤。 - 【請求項７】 剤型が点鼻剤である請求項１〜５記載の
花粉症予防・治療剤。 - 【請求項８】 剤型が軟膏剤である請求項１〜５記載の
花粉症予防・治療剤。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5251605A JPH06219962A (ja) | 1992-10-08 | 1993-10-07 | 花粉症予防・治療剤 |
| US08/238,027 US5874404A (en) | 1992-08-04 | 1994-05-03 | Immunoglobulin E receptor α-chain inhibits IgE production and secondary allergic responses |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4-270513 | 1992-10-08 | ||
| JP27051392 | 1992-10-08 | ||
| JP5251605A JPH06219962A (ja) | 1992-10-08 | 1993-10-07 | 花粉症予防・治療剤 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06219962A true JPH06219962A (ja) | 1994-08-09 |
Family
ID=26540269
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5251605A Pending JPH06219962A (ja) | 1992-08-04 | 1993-10-07 | 花粉症予防・治療剤 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH06219962A (ja) |
-
1993
- 1993-10-07 JP JP5251605A patent/JPH06219962A/ja active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP1478394B1 (en) | Stabilized TNFR-Fc composition comprising arginine | |
| AU700819B2 (en) | Rheumatoid arthritis remedy containing IL-6 antagonist as effective component | |
| US6627195B1 (en) | Binding agents to CD23 | |
| US8057802B2 (en) | Treatment methods for fibrosis related disorders | |
| US9044436B2 (en) | Compositions and methods for the treatment of angiogenesis-related eye diseases | |
| RU2680096C2 (ru) | Липосомальные препараты | |
| CA2141685A1 (en) | Antiallergic composition | |
| CN104903349A (zh) | Il-6拮抗剂及其应用 | |
| CN103917563A (zh) | 丝氨酸蛋白酶抑制蛋白融合多肽及其使用方法 | |
| JP2021507690A (ja) | Ｉｌ−２ムテインおよびその使用 | |
| KR20180116359A (ko) | 인터루킨-6의 길항제 제제 및 이의 용도 | |
| JP2015504675A (ja) | アルファ−１アンチトリプシン融合分子の組成物、方法、及び使用 | |
| US20210246212A1 (en) | Anti-gpiib/iiia antibodies and uses thereof | |
| WO2018032639A1 (zh) | 活化的人凝血因子vii融合蛋白及其制备方法与用途 | |
| CA2449488C (en) | Compositions and methods for treating hyperimmune response in the eye | |
| JP2019513724A (ja) | コンジュゲートされたｃ１エステラーゼインヒビター及びその使用 | |
| JPH07118168A (ja) | ＩｇＥ産生抑制剤 | |
| JPH06219962A (ja) | 花粉症予防・治療剤 | |
| JPH06206828A (ja) | アトピー性皮膚炎予防・治療剤 | |
| US9617325B2 (en) | Treatment of IgE-mediated disease | |
| JPH06211685A (ja) | 気管支喘息予防・治療剤 | |
| JPH06107558A (ja) | アナフィラキシーショック予防・治療剤 | |
| US5874404A (en) | Immunoglobulin E receptor α-chain inhibits IgE production and secondary allergic responses | |
| JPH06510022A (ja) | ある種の腫瘍の治療のためのミュラー阻害物質の使用 | |
| JP2003171315A (ja) | 薬物−ポリエチレングリコール結合体を含有する眼組織内注入剤 |