JPH06148195A - ヒトｃ−ｋｉｔ癌原遺伝子産物の測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 ヒトｃ−ｋｉｔ癌原遺伝子産物に特異性を有
するモノクローナル抗体を用いる体液中の可溶性該産物
の測定。 【効果】 簡便にしてしかも正確に測定が行われ、造血
器腫瘍等の診断に利用できる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ヒトｃ−ｋｉｔ癌原遺
伝子産物に対して特異性を有するモノクローナル抗体を
用いる測定法に関する。さらに詳しくは、本発明はヒト
ｃ−ｋｉｔ癌原遺伝子産物に対して特異性を有し２種類
の異なる抗原決定基（以下、エピト−プという）を認識
するモノクローナル抗体を用いて、未標識のモノクロー
ナル抗体を一次抗体とし、ヒトｃ−ｋｉｔ癌原遺伝子産
物の異なるエピト−プを認識する抗体を標識した後これ
を二次抗体として、体液中の可溶性ｃ−ｋｉｔ癌原遺伝
子産物を検出定量することを特徴とする測定法に関す
る。さらに、本発明は、白血病細胞株の細胞培養上清中
に可溶性ｃ−ｋｉｔ癌原遺伝子産物が存在することを新
たに見いだし、これを標準物質として使用することを特
徴とする体液中の可溶性ｃ−ｋｉｔ癌原遺伝子産物の測
定法に関する。

【０００２】ヒトｃ−ｋｉｔ癌原遺伝子産物は、そのｍ
ＲＮＡの有無を調べた研究等から、未分化な造血幹細胞
に多く発現することが知られており、ｃ−ｋｉｔ癌原遺
伝子産物の発現異常は、造血幹細胞レベルでの腫瘍化、
造血器腫瘍に影響を及ぼすと考えられている。また、各
種の造血サイトカインの受容体は血清中に可溶性型で存
在することが知られており、これらを検出定量すること
は各種造血系疾患の診断、および治療に有用である。よ
って、本測定法は白血病等の造血器腫瘍、その他の造血
系疾患等の診断薬としての用途を有する。

【０００３】

【従来の技術】ｖ−ｋｉｔはネコの線維肉腫から得られ
たレトロウイルスの癌遺伝子である。ｖ−ｋｉｔに対応
するｃ−ｋｉｔのコードするタンパク質（ｃ−ｋｉｔ癌
原遺伝子産物）は受容体型のチロシンキナーゼで最近そ
のリガンド分子が固定され、ステムセルファクター（Ｓ
ＣＦ）などと呼ばれている。このｃ−ｋｉｔ癌原遺伝子
に異常のあるＷマウスは貧血、色素異常のモデルとして
古くより研究されていたが、最近の研究によりこの異常
がｃ−ｋｉｔ癌原遺伝子産物とステムセルファクターに
よるシグナル伝達に関わる異常であることが明らかにさ
れている。これまでマウスｃ−ｋｉｔ癌原遺伝子産物に
対する抗体であるＡＣＫ２（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，ｖ
ｏｌ．１７４，ｐ．６３，１９９１）を用いて、ヒトｃ
−ｋｉｔ癌原遺伝子産物を白血細胞株上に検出した例が
報告されているが、ヒト生体試料（たとえばヒト骨髄細
胞）上の該産物を直接に検出することはできなかった。

【０００４】また、造血器腫瘍である白血病やリンパ腫
は、未分化な段階の細胞が腫瘍化した疾患であると言え
るが、その腫瘍化した血球の増殖にもいくつかのサイト
カインが関与していることが明かになっている。ｃ−ｋ
ｉｔ癌原遺伝子産物のリガンドであるステムセルファク
ターも一部の急性骨髄性白血病の細胞の増殖を刺激する
ことが報告されている。

【０００５】このように造血機構においてｃ−ｋｉｔ癌
原遺伝子産物とそのリガンドであるステムセルファクタ
ーは重要な役割を果たしており、そのシグナル伝達系に
関わる異常は少なからず正常な造血機構に影響するもの
と考えられる。しかるに現在までに、造血器腫瘍におけ
るｃ−ｋｉｔ癌原遺伝子産物の発現とその病態との相
関、あるいは血清中あるいは体液中に存在するｃ−ｋｉ
ｔ癌原遺伝子産物の測定、定量と疾患との相関等につい
て詳細に検討されることはなかった。わずかに造血器腫
瘍細胞におけるｃ−ｋｉｔ癌原遺伝子ｍＲＮＡの有無を
調ベた研究等があるのみである。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、簡便に血清
あるいは体液中の可溶性ｃ−ｋｉｔ癌原遺伝子産物を再
現性よく測定する方法を提供することを目的としたもの
である。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明は、上記目的を達
成するためになされたものであって、各方面から検討の
結果、ヒトｃ−ｋｉｔ癌原遺伝子産物に特異性を有する
抗体、特にモノクローナル抗体にはじめて着目するに至
った。そして更に検討を行い、該モノクローナル抗体を
産生することのできる融合細胞（ハイブリドーマ）の創
製に成功しただけでなく、効率的に該モノクローナル抗
体を産生せしめ、そして該モノクローナル抗体を用いる
ことによって、体液中に可溶性の該産物が存在すること
を新に発見し、この新知見を利用して可溶性の該産物の
簡便にして正測な測定法を開発するのに成功し、遂に本
発明の完成に至ったものである。

【０００８】すなわち、本発明は、抗ｃ−ｋｉｔ癌原遺
伝子産物抗体を用いて生体試料中の可溶性ｃ−ｋｉｔ癌
原遺伝子産物を測定する方法に関するものである。

【０００９】本発明を実施するには、目的とする新規な
モノクローナル抗体を創製する必要がある。そして目的
とするモノクローナル抗体を新たに創製するには、該抗
体産生能を有するハイブリドーマの創製が不可欠であ
る。

【００１０】このような観点から、目的とするモノクロ
ーナル抗体を産生する能力を有するハイブリドーマを創
製することとし、そのため、本発明においては、免疫原
としてヒト巨核芽球性細胞株（ＵＴ−７）に着目しただ
けでなく、更に効率化を図るためにドナーのｃＤＮＡか
ら目的とする遺伝子のｃＤＮＡを単離し、これをレシピ
エントに形質導入してなる形質導入株を使用することと
した。すなわち、本発明者らは先ず、ヒトｃ−ｋｉｔ癌
原遺伝子産物を高発現する白血病細胞株ＵＴ−７のｃＤ
ＮＡライブラリーより単離したｃ−ｋｉｔ癌原遺伝子の
ｃＤＮＡをマウス繊維芽細胞Ｌ−ｃｅｌｌ、およびＢａ
ｌｂ／３Ｔ３ｃｅｌｌに、それぞれ、形質導入した形質
導入細胞（トランスフェクタント）を作製した（ＨＣＫ
／Ｌ，ＨＣＫ／３Ｔ３）。

【００１１】次いで、このようにして得た安定発現株
を、それぞれ、免疫原として例えばマウスに免疫し、そ
の脾細胞、リンパ節細胞あるいは、Ｂリンパ球を抗体産
生細胞として得る。この抗体産生細胞はマウス、ヒトあ
るいはラットの骨髄腫細胞をいわゆる細胞融合法を用い
て融合細胞（ハイブリドーマ）を形成させ、上記Ｌ−ｃ
ｅｌｌと同様にｃ−ｋｉｔ癌原遺伝子を導入したマウス
由来繊維芽細胞株Ｂａｌｂ／３Ｔ３ｃｅｌｌに特異的に
反応する抗体をそれぞれ産生するクローンを選択する。
このようにして得られた抗体産生細胞（ハイブリドー
マ）を、Ｌ６、Ｌ１５と命名した。これらは、いずれ
も、工業技術院微生物工業技術研究所に寄託されている
（Ｌ−６：微工研菌寄第１３２２４号；Ｌ−１５：微工
研菌寄第１３２２５号）。

【００１２】これらのクローンをそれぞれ常法にしたが
って培養し、モノクローナル抗体Ｌ６及びＬ１５を分離
採取する。得られたモノクローナル抗体は、免疫沈降
法、ウエスタン−ブロッティング法等により目的とする
抗ｃ−ｋｉｔ蛋白抗体であることが確認された。

【００１３】こうして得られる抗ヒトｃ−ｋｉｔ癌原遺
伝子産物モノクローナル抗体は、これらを直接蛍光色素
標識する方法あるいは、あらかじめ蛍光色素標識された
二次抗体を用いる方法などによって、フローサイトメト
リーを用いた細胞表面に発現されたｃ−ｋｉｔ癌原遺伝
子産物の測定に用いることができる。また、本モノクロ
ーナル抗体は、標識としてＦＩＴＣやローダミンといっ
た蛍光物質を用いて直接法、間接法、サンドイッチ法等
によって該産物を測定するのに使用できるほか、フェリ
チン抗体法、酵素を標識として用いるエンザイムイムノ
アッセイ（ＥＩＡ）、ラジオアイソトープでラベルした
抗原ないし抗体を用いるラジオイムノアッセイ（ＲＩ
Ａ）等、各種のイムノアッセイに本モノクローナル抗体
は広範に使用することができ、効率的に該産物の測定、
検出をすることができる。

【００１４】さらにエピトープの異なる２種のモノクロ
ーナル抗体を用いてサンドイッチエライザ（ＥＬＩＳ
Ａ）法等を適用することによって血清中あるいは体液中
の可溶性ｃ−ｋｉｔ癌原遺伝子産物を測定することがで
きる。また、白血病細胞株の細胞培養上清中に可溶性ｃ
−ｋｉｔ癌原遺伝子産物が存在することを新たに見いだ
し、これを標準物質として使用することにより、安定的
にｃ−ｋｉｔ癌原遺伝子産物を検出することが可能とな
り、このことによって、検体の測定値の再現性を高める
ことができる。

【００１５】

【実施例】以下に実施例を示し、本発明をより具体的に
説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるもので
はない。

【００１６】

【実施例１ モノクローナル抗体の作製】

【００１７】（１）免疫原の作製 ｃ−ｋｉｔ癌原遺伝子産物を高発現することが知られて
いる白血病細胞株ＵＴ−７のｃＤＮＡライブラリーより
単離したｃ−ｋｉｔ癌原遺伝子のｃＤＮＡを動物細胞発
現用ベクターＢＣＭＧＳＮｅｏに組み込んだ後、マウス
繊維芽細胞Ｌ−ｃｅｌｌ、およびＢａｌｂ／３Ｔ３ ｃ
ｅｌｌに、それぞれ、形質導入した形質導入細胞（トラ
ンスフェクタント）を作製し（ＨＣＫ／Ｌ、ＨＣＫ／３
Ｔ３）、これを免疫原とした。

【００１８】（２）融合細胞の作製

【００１９】（ａ）免疫 ８週令のＢａｌｂ／ｃマウス（雌）３匹に、ＨＣＫ／３
Ｔ３、ＨＣＫ／Ｌ、ＣＤ３４／Ｌトランスフェクタント
をそれぞれ２週間隔で腹腔内投与した。免疫終了後、マ
ウス尾静脈より採血した血清を用いてＨＣＫ／３Ｔ３、
ＨＣＫ／Ｌ、ＣＤ３４／Ｌトランスフェクタント、白血
病細胞株ＵＴ−７ｃｅｌｌに対する反応性をチェックし
た。免疫原とは異なるトランスフェクタントとの反応性
に有意差が得られたことを確認し、最終免疫、細胞融合
を行った。

【００２０】（ｂ）細胞融合 最終免疫から４日後、ＨＣＫ／３Ｔ３、ＨＣＫ／Ｌトラ
ンスフェクタントを免疫したマウスの脾臓細胞と、マウ
ス骨髄腫由来細胞Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８−Ｕ１（Ｐ３Ｕ
１）細胞を用いて、常法に従って細胞融合を行った。

【００２１】（ｃ）ハイブリドーマのスクリーニング

【００２２】白血病細胞株との反応性 ハイブリドーマの１次スクリーニングとして、白血病細
胞株ＵＴ−７ｃｅｌｌを抗原とした間接蛍光抗体法によ
って、ハイブリドーマ培養上清の反応性により陽性クロ
ーンを選択した。ハイブリドーマ培養上清とＵＴ−７細
胞浮遊液を氷冷で３０分反応、洗浄後、ＦＩＴＣ標識抗
マウスＩｇＧ抗体溶液を添加した（氷冷、３０分）。洗
浄後、フローサイトメーターによって蛍光強度の測定を
行った。

【００２３】形質導入細胞との反応性 ２次スクリーニングとして、生細胞を抗原とした間接蛍
光抗体法を用い、形質導入細胞（トランスフェクタン
ト）に対するハイブリドーマ培養上清の反応性により陽
性クローンを選択した。

【００２４】ＨＣＫ／３Ｔ３トランスフェクタントで免
疫して得られたハイブリドーマ培養上清は、ＨＣＫ／
Ｌ、ＣＤ３４／Ｌトランスフェクタントを用いてスクリ
ーニングし、ＨＣＫ／Ｌトランスフェクタントで免疫し
て得られたハイブリドーマ培養上清は、ＨＣＫ／３Ｔ３
トランスフェクタント、Ｂａｌｂ／３Ｔ３を用いてスク
リーニングした。ハイブリドーマ培養上清のスクリーニ
ングは、ＨＣＫ／３Ｔ３、ＨＣＫ／Ｌトランスフェクタ
ントを免疫したものそれぞれ９４５ｗｅｌｌ、７０７ｗ
ｅｌｌについて行った。判定は、ＨＣＫ／Ｌ、ＣＤ３４
／Ｌに対する反応性がそれぞれ陽性、陰性のクローン
を、また、ＨＣＫ／３Ｔ３、Ｂａｌｂ／３Ｔ３に対する
反応性がそれぞれ陽性、陰性のクローンを選択した。

【００２５】スクリーニングの結果、２クローン（Ｌ
６、Ｌ１５）を得た。これらのハイブリドーマは、それ
ぞれ微生物工業技術研究所に寄託されている（Ｌ−６：
ＦＥＲＭ Ｐ−１３２２４；Ｌ−１５：ＦＥＲＭ Ｐ−
１３２２５）。

【００２６】（ｄ）抗体の精製 培養上清を限外ろ過濃縮した後、結合緩衝液（Ｂｉｏｒ
ａｄ、ＰｒｏｔｅｉｎＡ ＭＡＰＳII Ｂｕｆｆｅｒ）
と等量混合しサンプルとする。ＰｒｏｔｅｉｎＡ−Ｓｅ
ｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−４Ｂカラム（ファルマシア）を
結合緩衝液で平衡化し、サンプルをカラムに流して抗体
を結合させた後、結合緩衝液でカラムを洗浄した。０．
２Ｍ Ｇｌｙ−ＨＣｌ（ｐＨ３．０）で溶出し、モノク
ローナル抗体Ｌ６及びモノクローナル抗体Ｌ１５の分画
をそれぞれ得た。

【００２７】（ｅ）抗体の標識 精製した各抗体について、ビオチン標識及びＦＩＴＣ
（フルオレッセイン イソチアシアナート アイソマ
ー）標識を行った。

【００２８】ビオチン標識（ＢｉｏｒａｄのＢｉｏｔｉ
ｎｙｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔを使用） 抗体溶液を０．０５Ｍほう酸バッファー（ｐＨ８．６）
に交換し１ｍｇ／ｍｌに調製後、ビオチン化試薬（アマ
シャム、Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ）を加
え、室温で１時間攪拌した。反応液をＳｅｐｈａｄｅｘ
Ｇ−２５カラムにかけ、未反応ビオチンを除去した
後、ビオチン化抗体をそれぞれ得た。

【００２９】ＦＩＴＣ標識 抗体溶液を０．０５Ｍ炭酸バッファー（ｐＨ９．５）に
交換し１ｍｇ／ｍｌに調製後、ＦＩＴＣ（Ｂｅｃｔｏｎ
Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ Ｉｓ
ｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ Ｉｓｏｍｅｒ）をＤＭＳＯ
に溶解（１〜２ｍｇ／ｍｌ）し、抗体溶液にゆるやかに
攪拌しながら添加した。４℃で１晩攪拌（遮光下）した
後、反応液をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５カラムにかけ
未反応ＦＩＴＣを除去し、ＦＩＴＣ標識抗体をそれぞれ
得た。これらの点から、そしてまた後記するところから
も明らかなように、本モノクローナル抗体は、いずれ
も、化学物質、蛍光物質、酵素その他各種の標識と容易
に結合できるだけでなく、正確にして簡便且つ迅速な測
定を可能にするものである。

【００３０】

【実施例２ 白血病細胞株培養上清中のｃ−ｋｉｔ癌原
遺伝子産物の検出】白血病細胞株培養上清、及び培養細
胞溶解物をＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動で分離
し、ナイロンメンブレンに転写した後、実施例１で製造
したヒトｃ−ｋｉｔ癌原遺伝子産物に対するモノクロー
ナル抗体Ｌ６を用いたウエスタンブロッティング法によ
って検出したところ、白血病細胞株培養上清中には培養
細胞の１２０〜１４０ＫＤａより分子量の小さい可溶性
ヒトｃ−ｋｉｔ癌原遺伝子産物に対応する分子量９５Ｋ
Ｄａのバンドが検出された（図１）。

【００３１】上記のことから、白血病細胞株培養上清中
にｃ−ｋｉｔ癌原遺伝子産物が存在することが明らかに
なった。

【００３２】

【実施例３ モノクローナル抗体を用いたサンドイッチ
エライザ法による白血病細胞株培養上清中のｃ−ｋｉｔ
癌原遺伝子産物の測定】

【００３３】抗体固相化マイクロプレートの調製 実施例１で製造したヒトｃ−ｋｉｔ癌原遺伝子産物に対
するモノクローナル抗体Ｌ６を９６ウェルマイクロプレ
ートにまき、４℃で一晩放置し、固定後、洗浄し、ウシ
血清アルブミン溶液でブロッキングし、抗体固相化マイ
クロプレートとした。

【００３４】標識抗体の調製 精製した抗体のアルカリフォスファターゼ標識を行っ
た。すなわち、５０ｍＭカリウム一リン酸緩衝液、アル
カリフォスファターゼ溶液、グルタールジアルデヒド溶
液を混合し反応後、ヒトｃ−ｋｉｔ癌原遺伝子産物に対
するモノクローナル抗体Ｌ１５（Ｌ６とはエピトープが
異なる）を加えさらに反応後、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−
２５にかけた後、標識抗体を得た。

【００３５】測 定 白血病細胞株の培養上清から、上記ヒトｃ−ｋｉｔ癌原
遺伝子産物に対するモノクローナル抗体Ｌ１５を固定化
したアフィニティーカラムによって精製したｃ−ｋｉｔ
癌原遺伝子産物を連続希釈したものを標準溶液として使
用した。

【００３６】上記、抗体固相化マイクロプレートにこの
標準溶液を加え室温で２時間反応させた。プレートを洗
浄後、上記、アルカリホスファターゼ標識した抗ｃ−ｋ
ｉｔ抗体Ｌ１５を加え室温で２時間反応させた。プレー
トを洗浄後、発色基質剤（０．１ｍＭ ４−メチル−ウ
ンベリフェリルホスフェート）を加え正確に３０分後、
反応停止剤（１０ｍＭエチレンジアミン四酢酸を含むカ
リウム一リン酸緩衝液）を加えた。タイターテック フ
ルオロスキャンIIで励起波長３５５ｎｍ、発色蛍光波長
４６０ｎｍで蛍光強度を測定した。

【００３７】その結果、白血病細胞株培養上清において
濃度依存的に可溶性ヒトｃ−ｋｉｔ癌原遺伝子産物を検
出することが可能であった（図２）。

【００３８】

【実施例４ 抗ｃ−ｋｉｔ抗体を用いた阻止試験】上記
標準溶液、およびヒト血清に対して、ヒトｃ−ｋｉｔ癌
原遺伝子産物に対するモノクローナル抗体Ｌ６による阻
止試験を行った。

【００３９】標準溶液、およびヒト血清に、それぞれ、
抗ｃ−ｋｉｔ抗体（Ｌ６）、もしくは抗ＥｒｂＢ−２抗
体（ニチレイ）を０〜１０μｇ／ｍｌ（終濃度）の範囲
で添加し、反応させた後、上記、実施例３で記載した方
法と同様に反応、測定を行った。

【００４０】その結果、抗ｃ−ｋｉｔ抗体（Ｌ６）を添
加すると検体中のｃ−ｋｉｔ癌原遺伝子産物の蛍光強度
が低下したことから、実施例３に記載されたモノクロー
ナル抗体を用いたサンドイッチエライザ法によって、検
体中のｃ−ｋｉｔ癌原遺伝子産物を特異的に検出するこ
とが可能であることが明らかになった（図３）。

【００４１】

【実施例５ ヒト血清中の可溶性ｃ−ｋｉｔ癌原遺伝子
産物の検出】実施例３に記載のモノクローナル抗体を用
いたサンドイッチエライザ法によって、２例のヒト血清
中の可溶性ヒトｃ−ｋｉｔ癌原遺伝子産物の検出を行っ
た。

【００４２】２例の血清検体を、ヒトプール血清を抗ｃ
−ｋｉｔ抗体（Ｌ１５）を固定化したアフィニティーカ
ラムによって吸収した吸収血清で希釈したところ、良好
な希釈直線が得られた。さらに、標準曲線より検体中の
ｃ−ｋｉｔ癌原遺伝子産物の定量測定が可能であった。

【００４３】その結果、ヒト血清においても濃度依存的
に可溶性ヒトｃ−ｋｉｔ癌原遺伝子産物を検出すること
が可能であった（図４）。

【００４４】

【発明の効果】本発明によれば新規なモノクローナル抗
体を使用することにより、体液中のｃ−ｋｉｔ癌原遺伝
子産物を簡便に且つ正確に測定することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】白血病細胞株培養上清、および細胞溶解物に対
する抗ｃ−ｋｉｔ抗体（Ｌ６）を用いたウエスタンブロ
ッティング法による分析結果を示す。

【図２】白血病細胞株の培養上清から、抗ｃ−ｋｉｔ抗
体Ｌ１５を固定化したアフィニティーカラムによって精
製し作製した標準溶液を連続希釈し、サンドイッチエラ
イザ法によって測定した標準曲線を示す。

【図３】抗ｃ−ｋｉｔ抗体によるヒト血清中ｃ−ｋｉｔ
癌原遺伝子産物の阻止試験の結果を示す。

【図４】ヒト血清を吸収血清で連続希釈したときの希釈
曲線を示す。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ヒトｃ−ｋｉｔ癌原遺伝子産物に対して
   特異性があるモノクローナル抗体を一次抗体とし、さら
   に異なる抗原決定基を認識することのできるモノクロー
   ナル抗体を標識しこれを二次抗体として用いて、可溶性
   ヒトｃ−ｋｉｔ癌原遺伝子産物を検出定量することを特
   徴とするヒトｃ−ｋｉｔ癌原遺伝子産物の測定法。
2. 【請求項２】 モノクローナル抗体がモノクローナル抗
   体Ｌ６又はモノクローナル抗体Ｌ１５であることを特徴
   とする請求項１に記載の測定法。
3. 【請求項３】 白血病細胞株の細胞培養上清中に存在す
   る可溶性ｃ−ｋｉｔ癌原遺伝子産物を標準物質として使
   用することを特徴とする請求項１又は請求項２に記載の
   測定法。