JP3241464B2 - 抗体及びそれを産生するハイブリド−マ - Google Patents
抗体及びそれを産生するハイブリド−マInfo
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ヒトｃ−ｋｉｔ癌原遺
伝子産物に対して特異性を有し、２種類の異なる抗原決
定基（以下、エピト−プという）を認識するモノクロー
ナル抗体を産生するハイブリドーマ、それを用いる該モ
ノクローナル抗体の製造法、及びそれによって得られる
モノクローナル抗体に関するものである。
伝子産物に対して特異性を有し、２種類の異なる抗原決
定基（以下、エピト−プという）を認識するモノクロー
ナル抗体を産生するハイブリドーマ、それを用いる該モ
ノクローナル抗体の製造法、及びそれによって得られる
モノクローナル抗体に関するものである。
【０００２】ヒトｃ−ｋｉｔ癌原遺伝子産物は、そのｍ
ＲＮＡの有無を調べた研究等から、未分化な造血幹細胞
に多く発現することが知られており、ｃ−ｋｉｔ癌原遺
伝子産物の発現異常は、幹細胞レベルでの腫瘍化、造血
器腫瘍に影響を及ぼすと考えられている。よって、本抗
体は白血病等の造血器腫瘍等の診断薬、および治療薬と
して有用である。
ＲＮＡの有無を調べた研究等から、未分化な造血幹細胞
に多く発現することが知られており、ｃ−ｋｉｔ癌原遺
伝子産物の発現異常は、幹細胞レベルでの腫瘍化、造血
器腫瘍に影響を及ぼすと考えられている。よって、本抗
体は白血病等の造血器腫瘍等の診断薬、および治療薬と
して有用である。
【０００３】
【従来の技術】ｖ−ｋｉｔはネコの繊維肉腫から得られ
たレトロウイルスの癌遺伝子である。ｖ−ｋｉｔに対応
する、ｃ−ｋｉｔのコードするタンパク質（ｃ−ｋｉｔ
癌原遺伝子産物）は受容体型のチロシンキナーゼで最近
そのリガンド分子が同定され、ステムセルファクター
（ＳＣＦ）などと呼ばれている。このｃ−ｋｉｔ癌原遺
伝子に異常のあるＷマウスは貧血、色素異常のモデルと
して古くより研究されていたが、最近の研究によりこの
異常がｃ−ｋｉｔ癌原遺伝子産物とステムセルファクタ
ーによるシグナル伝達に関わる異常であることが明らか
にされている。これまでマウスｃ−ｋｉｔ癌原遺伝子産
物に対する抗体であるＡＣＫ２（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅ
ｄ．，ｖｏｌ．１７４，ｐ．６３，１９９１）を用いて
ヒトｃ−ｋｉｔ癌原遺伝子産物を白血病細胞上に検出し
た例が報告されているが、ヒト生体試料（たとえばヒト
骨髄細胞）上の該産物を直接に検出することはできなか
った。
たレトロウイルスの癌遺伝子である。ｖ−ｋｉｔに対応
する、ｃ−ｋｉｔのコードするタンパク質（ｃ−ｋｉｔ
癌原遺伝子産物）は受容体型のチロシンキナーゼで最近
そのリガンド分子が同定され、ステムセルファクター
（ＳＣＦ）などと呼ばれている。このｃ−ｋｉｔ癌原遺
伝子に異常のあるＷマウスは貧血、色素異常のモデルと
して古くより研究されていたが、最近の研究によりこの
異常がｃ−ｋｉｔ癌原遺伝子産物とステムセルファクタ
ーによるシグナル伝達に関わる異常であることが明らか
にされている。これまでマウスｃ−ｋｉｔ癌原遺伝子産
物に対する抗体であるＡＣＫ２（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅ
ｄ．，ｖｏｌ．１７４，ｐ．６３，１９９１）を用いて
ヒトｃ−ｋｉｔ癌原遺伝子産物を白血病細胞上に検出し
た例が報告されているが、ヒト生体試料（たとえばヒト
骨髄細胞）上の該産物を直接に検出することはできなか
った。
【０００４】また、造血器腫瘍である白血病やリンパ腫
は、未分化な段階の細胞が腫瘍化した疾患であると言え
るが、その腫瘍化した血球の増殖にもいくつかのサイト
カインが関与していることが明らかになっている。ｃ−
ｋｉｔ癌原遺伝子産物のリガンドであるステムセルファ
クターも一部の急性骨髄性白血病の細胞の増殖を刺激す
ることが報告されている。
は、未分化な段階の細胞が腫瘍化した疾患であると言え
るが、その腫瘍化した血球の増殖にもいくつかのサイト
カインが関与していることが明らかになっている。ｃ−
ｋｉｔ癌原遺伝子産物のリガンドであるステムセルファ
クターも一部の急性骨髄性白血病の細胞の増殖を刺激す
ることが報告されている。
【０００５】このように造血機構においてｃ−ｋｉｔ癌
原遺伝子産物とそのリガンドであるステムセルファクタ
ーは重要な役割を果たしており、そのシグナル伝達系に
関わる異常は少なからず正常な造血機構に影響するもの
と考えられる。しかるに現在までに、造血器腫瘍におけ
るｃ−ｋｉｔ癌原遺伝子産物の発現とその病態との相
関、等について詳細に検討されることはなかった。わず
かに造血器腫瘍細胞におけるｃ−ｋｉｔ癌原遺伝子ｍＲ
ＮＡの有無を調べた研究等があるのみである。
原遺伝子産物とそのリガンドであるステムセルファクタ
ーは重要な役割を果たしており、そのシグナル伝達系に
関わる異常は少なからず正常な造血機構に影響するもの
と考えられる。しかるに現在までに、造血器腫瘍におけ
るｃ−ｋｉｔ癌原遺伝子産物の発現とその病態との相
関、等について詳細に検討されることはなかった。わず
かに造血器腫瘍細胞におけるｃ−ｋｉｔ癌原遺伝子ｍＲ
ＮＡの有無を調べた研究等があるのみである。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、簡便に造血
系腫瘍におけるヒトｃ−ｋｉｔ癌原遺伝子産物の存在あ
るいはその量を測定する必要があること、あるいはヒト
ｃ−ｋｉｔ癌原遺伝子産物自体を分離、精製する必要が
あること、といった当業界のニーズに応える目的でなさ
れたものである。
系腫瘍におけるヒトｃ−ｋｉｔ癌原遺伝子産物の存在あ
るいはその量を測定する必要があること、あるいはヒト
ｃ−ｋｉｔ癌原遺伝子産物自体を分離、精製する必要が
あること、といった当業界のニーズに応える目的でなさ
れたものである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明は、上記目的を達
成するためになされたものであって、各方面から検討の
結果、ヒトｃ−ｋｉｔ癌原遺伝子産物に特異性を有する
抗体、特にモノクローナル抗体に着目するに至った。そ
して更に検討を行い、該モノクローナル抗体を産生する
ことのできる融合細胞（ハイブリドーマ）の創製に成功
し、本発明の完成に至ったものである。
成するためになされたものであって、各方面から検討の
結果、ヒトｃ−ｋｉｔ癌原遺伝子産物に特異性を有する
抗体、特にモノクローナル抗体に着目するに至った。そ
して更に検討を行い、該モノクローナル抗体を産生する
ことのできる融合細胞（ハイブリドーマ）の創製に成功
し、本発明の完成に至ったものである。
【０００８】すなわち、本発明は、生体試料中のヒトｃ
−ｋｉｔ癌原遺伝子産物と特異的に反応するモノクロー
ナル抗体及びその産生システムに関するものである。
−ｋｉｔ癌原遺伝子産物と特異的に反応するモノクロー
ナル抗体及びその産生システムに関するものである。
【０００９】目的とするモノクローナル抗体を産生する
ためのハイブリドーマを創製するため、本発明において
は、免疫原としてヒト巨核芽球性細胞株（ＵＴ−７）に
着目しただけでなく、更に効率化を図るためにドナーの
ｃＤＮＡから目的とする遺伝子のｃＤＮＡを単離し、こ
れをレシピエントに形質導入してなる形質導入株を使用
することとした。すなわち、本発明者らは先ず、ヒトｃ
−ｋｉｔ癌原遺伝子産物を高発現する白血病細胞株ＵＴ
−７のｃＤＮＡライブラリーより単離したｃ−ｋｉｔ癌
原遺伝子のｃＤＮＡをマウス繊維芽細胞Ｌ−ｃｅｌｌ、
およびＢａｌｂ／３Ｔ３ｃｅｌｌに、それぞれ、形質導
入した形質導入細胞（トランスフェクタント）を作製し
た（ＨＣＫ／Ｌ、ＨＣＫ／３Ｔ３）。
ためのハイブリドーマを創製するため、本発明において
は、免疫原としてヒト巨核芽球性細胞株（ＵＴ−７）に
着目しただけでなく、更に効率化を図るためにドナーの
ｃＤＮＡから目的とする遺伝子のｃＤＮＡを単離し、こ
れをレシピエントに形質導入してなる形質導入株を使用
することとした。すなわち、本発明者らは先ず、ヒトｃ
−ｋｉｔ癌原遺伝子産物を高発現する白血病細胞株ＵＴ
−７のｃＤＮＡライブラリーより単離したｃ−ｋｉｔ癌
原遺伝子のｃＤＮＡをマウス繊維芽細胞Ｌ−ｃｅｌｌ、
およびＢａｌｂ／３Ｔ３ｃｅｌｌに、それぞれ、形質導
入した形質導入細胞（トランスフェクタント）を作製し
た（ＨＣＫ／Ｌ、ＨＣＫ／３Ｔ３）。
【００１０】次いで、このようにして得た安定発現株
を、それぞれ、免疫原として例えばマウスに免疫し、そ
の脾細胞、リンパ節細胞あるいは、Ｂリンパ球を抗体産
生細胞として得る。この抗体産生細胞とマウス、ヒトあ
るいはラットの骨髄腫細胞をいわゆる細胞融合法を用い
て融合細胞（ハイブリドーマ）を形成させ、上記ｃ−ｋ
ｉｔ癌原遺伝子を導入したトランスフェクタントに特異
的に反応する抗体を産生するクローンを選択する。この
ようにして得られた抗体産生細胞（ハイブリドーマ）
を、Ｌ６、Ｌ１５と命名した。これらは、いずれも、工
業技術院微生物工業技術研究所に寄託されている（Ｌ−
６：微工研菌寄第１３２２４号；Ｌ−１５：微工研菌寄
第１３２２５号）。
を、それぞれ、免疫原として例えばマウスに免疫し、そ
の脾細胞、リンパ節細胞あるいは、Ｂリンパ球を抗体産
生細胞として得る。この抗体産生細胞とマウス、ヒトあ
るいはラットの骨髄腫細胞をいわゆる細胞融合法を用い
て融合細胞（ハイブリドーマ）を形成させ、上記ｃ−ｋ
ｉｔ癌原遺伝子を導入したトランスフェクタントに特異
的に反応する抗体を産生するクローンを選択する。この
ようにして得られた抗体産生細胞（ハイブリドーマ）
を、Ｌ６、Ｌ１５と命名した。これらは、いずれも、工
業技術院微生物工業技術研究所に寄託されている（Ｌ−
６：微工研菌寄第１３２２４号；Ｌ−１５：微工研菌寄
第１３２２５号）。
【００１１】これらのクローンをそれぞれ常法にしたが
って培養し、モノクローナル抗体Ｌ６及びＬ１５を分離
採取する。得られたモノクローナル抗体は、免疫沈降
法、ウエスタン−ブロッティング法等により目的とする
抗ｃ−ｋｉｔ蛋白抗体であることが確認された。
って培養し、モノクローナル抗体Ｌ６及びＬ１５を分離
採取する。得られたモノクローナル抗体は、免疫沈降
法、ウエスタン−ブロッティング法等により目的とする
抗ｃ−ｋｉｔ蛋白抗体であることが確認された。
【００１２】こうして得られる抗ｃ−ｋｉｔ癌原遺伝子
産物モノクローナル抗体は、これらを直接蛍光色素標識
する方法あるいは、あらかじめ蛍光色素標識された二次
抗体を用いる方法などによって、フローサイトメトリー
を用いた細胞表面に発現されたｃ−ｋｉｔ癌原遺伝子産
物の測定、その他の用途に用いることができる。
産物モノクローナル抗体は、これらを直接蛍光色素標識
する方法あるいは、あらかじめ蛍光色素標識された二次
抗体を用いる方法などによって、フローサイトメトリー
を用いた細胞表面に発現されたｃ−ｋｉｔ癌原遺伝子産
物の測定、その他の用途に用いることができる。
【００１３】
【実施例】以下に実施例を示し、本発明をより具体的に
説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるもので
はない。
説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるもので
はない。
【００１４】
【実施例１ モノクローナル抗体の作製】
【００１５】（１）免疫原の作製 ｃ−ｋｉｔ癌原遺伝子産物を高発現することが知られて
いる白血病細胞株ＵＴ−７のｃＤＮＡライブラリーより
単離したｃ−ｋｉｔ癌原遺伝子のｃＤＮＡを動物細胞発
現用ベクターＢＣＭＧＳＮｅｏに組み込んだ後、マウス
繊維芽細胞Ｌ−ｃｅｌｌ、およびＢａｌｂ／３Ｔ３ｃｅ
ｌｌに、それぞれ、形質導入した形質導入細胞（トラン
スフェクタント）を作製し（ＨＣＫ／Ｌ、ＨＣＫ／３Ｔ
３）、これを免疫原とした。
いる白血病細胞株ＵＴ−７のｃＤＮＡライブラリーより
単離したｃ−ｋｉｔ癌原遺伝子のｃＤＮＡを動物細胞発
現用ベクターＢＣＭＧＳＮｅｏに組み込んだ後、マウス
繊維芽細胞Ｌ−ｃｅｌｌ、およびＢａｌｂ／３Ｔ３ｃｅ
ｌｌに、それぞれ、形質導入した形質導入細胞（トラン
スフェクタント）を作製し（ＨＣＫ／Ｌ、ＨＣＫ／３Ｔ
３）、これを免疫原とした。
【００１６】（２）融合細胞の作製
【００１７】（ａ）免疫 ８週令のＢａｌｂ／ｃマウス（雌）３匹に、ＨＣＫ／３
Ｔ３、ＨＣＫ／Ｌ、ＣＤ３４／Ｌトランスフェクタント
をそれぞれ２週間隔で腹腔内投与した。免疫終了後、マ
ウス尾静脈より採血した血清を用いてＨＣＫ／３Ｔ３、
ＨＣＫ／Ｌ、ＣＤ３４／Ｌトランスフェクタント、白血
病細胞株ＵＴ−７ｃｅｌｌに対する反応性をチェックし
た。免疫原とは異なるトランスフェクタントとの反応性
に有意差が得られたことを確認し、最終免疫、細胞融合
を行った。
Ｔ３、ＨＣＫ／Ｌ、ＣＤ３４／Ｌトランスフェクタント
をそれぞれ２週間隔で腹腔内投与した。免疫終了後、マ
ウス尾静脈より採血した血清を用いてＨＣＫ／３Ｔ３、
ＨＣＫ／Ｌ、ＣＤ３４／Ｌトランスフェクタント、白血
病細胞株ＵＴ−７ｃｅｌｌに対する反応性をチェックし
た。免疫原とは異なるトランスフェクタントとの反応性
に有意差が得られたことを確認し、最終免疫、細胞融合
を行った。
【００１８】（ｂ）細胞融合 最終免疫から、４日後、ＨＣＫ／３Ｔ３、ＨＣＫ／Ｌト
ランスフェクタントを免疫したマウスの脾臓細胞と、マ
ウス骨髄腫由来細胞Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８−Ｕ１（Ｐ３
Ｕ１）細胞を用いて、常法に従って細胞融合を行った。
ランスフェクタントを免疫したマウスの脾臓細胞と、マ
ウス骨髄腫由来細胞Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８−Ｕ１（Ｐ３
Ｕ１）細胞を用いて、常法に従って細胞融合を行った。
【００１９】（ｃ）ハイブリドーマのスクリーニング
【００２０】白血病細胞株との反応性 ハイブリドーマの１次スクリーニングとして、白血病細
胞株ＵＴ−７ｃｅｌｌを抗原とした間接蛍光抗体法によ
って、ハイブリドーマ培養上清の反応性により陽性クロ
ーンを選択した。ハイブリドーマ培養上清とＵＴ−７細
胞浮遊液を氷冷で３０分反応、洗浄後、ＦＩＴＣ標識マ
ウスＩｇＧ抗体溶液を添加した（氷冷、３０分）。洗浄
後、フローサイトメーターによって蛍光強度の測定を行
った。
胞株ＵＴ−７ｃｅｌｌを抗原とした間接蛍光抗体法によ
って、ハイブリドーマ培養上清の反応性により陽性クロ
ーンを選択した。ハイブリドーマ培養上清とＵＴ−７細
胞浮遊液を氷冷で３０分反応、洗浄後、ＦＩＴＣ標識マ
ウスＩｇＧ抗体溶液を添加した（氷冷、３０分）。洗浄
後、フローサイトメーターによって蛍光強度の測定を行
った。
【００２１】形質導入細胞との反応性 ２次スクリーニングとして、生細胞を抗原とした間接蛍
光抗体法を用い、形質導入細胞（トランスフェクタン
ト）に対するハイブリドーマ培養上清の反応性により陽
性クローンを選択した。
光抗体法を用い、形質導入細胞（トランスフェクタン
ト）に対するハイブリドーマ培養上清の反応性により陽
性クローンを選択した。
【００２２】ＨＣＫ／３Ｔ３トランスフェクタントで免
疫して得られたハイブリドーマ培養上清は、ＨＣＫ／
Ｌ、ＣＤ３４／Ｌトランスフェクタントを用いてスクリ
ーニングし、ＨＣＫ／Ｌトランスフェクタントで免疫し
て得られたハイブリドーマ培養上清は、ＨＣＫ／３Ｔ３
トランスフェクタント、Ｂａｌｂ／３Ｔ３を用いてスク
リーニングした。ハイブリドーマ培養上清のスクリーニ
ングは、ＨＣＫ／３Ｔ３、ＨＣＫ／Ｌトランスフェクタ
ントを免疫したものそれぞれ９４５ｗｅｌｌ、７０７ｗ
ｅｌｌについて行った。判定は、ＨＣＫ／Ｌ、ＣＤ３４
／Ｌに対する反応性がそれぞれ陽性、陰性のクローン
を、また、ＨＣＫ／３Ｔ３、Ｂａｌｂ／３Ｔ３に対する
反応性がそれぞれ陽性、陰性のクローンを選択した。
疫して得られたハイブリドーマ培養上清は、ＨＣＫ／
Ｌ、ＣＤ３４／Ｌトランスフェクタントを用いてスクリ
ーニングし、ＨＣＫ／Ｌトランスフェクタントで免疫し
て得られたハイブリドーマ培養上清は、ＨＣＫ／３Ｔ３
トランスフェクタント、Ｂａｌｂ／３Ｔ３を用いてスク
リーニングした。ハイブリドーマ培養上清のスクリーニ
ングは、ＨＣＫ／３Ｔ３、ＨＣＫ／Ｌトランスフェクタ
ントを免疫したものそれぞれ９４５ｗｅｌｌ、７０７ｗ
ｅｌｌについて行った。判定は、ＨＣＫ／Ｌ、ＣＤ３４
／Ｌに対する反応性がそれぞれ陽性、陰性のクローン
を、また、ＨＣＫ／３Ｔ３、Ｂａｌｂ／３Ｔ３に対する
反応性がそれぞれ陽性、陰性のクローンを選択した。
【００２３】スクリーニングの結果、２クローン（Ｌ
６、Ｌ１５）を得た（図１）。これらのハイブリドーマ
は、それぞれ微生物工業技術研究所に寄託されている
（Ｌ−６：ＦＥＲＭ Ｐ−１３２２４；Ｌ−１５：ＦＥ
ＲＭ Ｐ−１３２２５）。
６、Ｌ１５）を得た（図１）。これらのハイブリドーマ
は、それぞれ微生物工業技術研究所に寄託されている
（Ｌ−６：ＦＥＲＭ Ｐ−１３２２４；Ｌ−１５：ＦＥ
ＲＭ Ｐ−１３２２５）。
【００２４】（ｄ）抗体の精製 培養上清を限外ろ過濃縮した後、結合緩衝液（Ｂｉｏｒ
ａｄ，ＰｒｏｔｅｉｎＡ ＭＡＰＳII Ｂｕｆｆｅｒ）
と等量混合しサンプルとする。ＰｒｏｔｅｉｎＡ−Ｓｅ
ｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−４Ｂカラム（ファルマシア）を
結合緩衝液で平衡化し、サンプルをカラムに流して抗体
を結合させた後、結合緩衝液でカラムを洗浄した。０．
２Ｍ Ｇｌｙ−ＨＣＩ（ｐＨ３．０）で溶出し、モノク
ローナル抗体Ｌ６及びモノクローナル抗体Ｌ１５の分画
をそれぞれ得た。
ａｄ，ＰｒｏｔｅｉｎＡ ＭＡＰＳII Ｂｕｆｆｅｒ）
と等量混合しサンプルとする。ＰｒｏｔｅｉｎＡ−Ｓｅ
ｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−４Ｂカラム（ファルマシア）を
結合緩衝液で平衡化し、サンプルをカラムに流して抗体
を結合させた後、結合緩衝液でカラムを洗浄した。０．
２Ｍ Ｇｌｙ−ＨＣＩ（ｐＨ３．０）で溶出し、モノク
ローナル抗体Ｌ６及びモノクローナル抗体Ｌ１５の分画
をそれぞれ得た。
【００２５】（ｅ）抗体の標識 精製した各抗体について、ビオチン標識及びＦＩＴＣ
（フルオレッセイン イソチアシアナート アイソマ
ー）標識を行った。
（フルオレッセイン イソチアシアナート アイソマ
ー）標識を行った。
【００２６】ビオチン標識（ＢｉｏｒａｄのＢｉｏｔｉ
ｎｙｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔを使用） 抗体溶液を０．０５Ｍほう酸バッファー（ｐＨ８．６）
に交換し１ｍｇ／ｍｌに調製後、ビオチン化試薬（アマ
シャム、Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ）を加
え、室温で１時間攪拌した。反応液をＳｅｐｈａｄｅｘ
Ｇ−２５カラムにかけ、未反応ビオチンを除去した
後、ビオチン化抗体をそれぞれ得た。
ｎｙｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔを使用） 抗体溶液を０．０５Ｍほう酸バッファー（ｐＨ８．６）
に交換し１ｍｇ／ｍｌに調製後、ビオチン化試薬（アマ
シャム、Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ）を加
え、室温で１時間攪拌した。反応液をＳｅｐｈａｄｅｘ
Ｇ−２５カラムにかけ、未反応ビオチンを除去した
後、ビオチン化抗体をそれぞれ得た。
【００２７】ＦＩＴＣ標識 抗体溶液を０．０５Ｍ炭酸バッファー（ｐＨ９．５）に
交換し１ｍｇ／ｍｌに調製後、ＦＩＴＣ（Ｂｅｃｔｏｎ
Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ Ｉｓ
ｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ Ｉｓｏｍｅｒ）をＤＭＳＯ
に溶解（１〜２ｍｇ／ｍｌ）し、抗体溶液にゆるやかに
攪拌しながら添加した。４℃で１晩攪拌（遮光下）した
後、反応液をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５カラムにかけ
未反応ＦＩＴＣを除去し、ＦＩＴＣ標識抗体をそれぞれ
得た。
交換し１ｍｇ／ｍｌに調製後、ＦＩＴＣ（Ｂｅｃｔｏｎ
Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ Ｉｓ
ｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ Ｉｓｏｍｅｒ）をＤＭＳＯ
に溶解（１〜２ｍｇ／ｍｌ）し、抗体溶液にゆるやかに
攪拌しながら添加した。４℃で１晩攪拌（遮光下）した
後、反応液をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５カラムにかけ
未反応ＦＩＴＣを除去し、ＦＩＴＣ標識抗体をそれぞれ
得た。
【００２８】
【実施例２ 抗体の性質】
【００２９】（１）ヒト骨髄細胞との反応性 ヒト骨髄細胞を抗原とした蛍光抗体法により、骨髄細胞
に対する反応性を調べた。健常人骨髄を採取し、１７０
ｍＭ ＮＨ4Ｃｌを加え溶血後、洗浄した。この溶液に
ＦＩＴＣ標識抗ｃ−ｋｉｔ抗体を加え、氷冷で３０分放
置後、洗浄、フローサイトメーターによって蛍光強度の
測定を行った。
に対する反応性を調べた。健常人骨髄を採取し、１７０
ｍＭ ＮＨ4Ｃｌを加え溶血後、洗浄した。この溶液に
ＦＩＴＣ標識抗ｃ−ｋｉｔ抗体を加え、氷冷で３０分放
置後、洗浄、フローサイトメーターによって蛍光強度の
測定を行った。
【００３０】その結果、モノクローナル抗体Ｌ６、Ｌ１
５はいずれもヒト骨髄細胞に対し陽性であった（図
２）。
５はいずれもヒト骨髄細胞に対し陽性であった（図
２）。
【００３１】（２）種々の白血病細胞株との反応性 種々の白血病細胞株を抗原とした間接蛍光抗体法によっ
て、各抗体の反応性を調べた。得られた結果を、下記表
１に示す。
て、各抗体の反応性を調べた。得られた結果を、下記表
１に示す。
【００３２】
【表１】
【００３３】（３）免疫沈降 得られた抗体について免疫沈降を行った。
【００３４】その方法を、以下に述べる。ＨＣＫ／３Ｔ
３トランスフェクタント（陽性細胞）、Ｂａｌｂ／３Ｔ
３（陰性細胞）をプレートにまき込み、細胞が接着する
まで３７℃で培養する。メチオニン、システイン不含培
地（ＤＭＥ（−Ｍｅｔ、−Ｃｙｓ）で洗浄後、35Ｓ放射
線標識用培地（Ｔｒａｎｓ−35Ｓ）を加え、３７℃で１
６〜１８時間培養した。細胞を洗浄後、Ｌｙｓｉｓ Ｂ
ｕｆｆｅｒを加え、よく溶解する。氷冷で３０分放置
後、Ｔｕｂｅに移し、遠心（８００ｒｐｍ、５ｍｉ
ｎ）、上清を分取しＬｙｓａｔｅとした。Ｌｙｓａｔｅ
中の非特異結合物質をＰｒｏｔｅｉｎＧ−Ｓｅｐｈａｒ
ｏｓｅ ４Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（ファルマシア）を用い
て除去した後（４℃、３０分間）、遠心（１５０００ｒ
ｐｍ、１ｍｉｎ）し上清を分取した。抗体との反応（４
℃、３０分間）後、ＰｒｏｔｅｉｎＧ−Ｓｅｐｈａｒｏ
ｓｅを加え、４℃で３０分間、ゆっくり回転させた。Ｐ
ｒｏｔｅｉｎＧ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを洗浄後、ＳＤＳ
サンプルバッファーを加え、３分間煮沸、遠心（１５０
００ｒｐｍ、１ｍｉｎ）し、電気泳動用のサンプルとし
た。これをＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動後、２５％ＥｔＯＨ
で固定（２０分間、振とう）、ゲル乾燥後、オートラジ
オグラフィーを行い検出した。その結果、本抗体はｃ−
ｋｉｔ癌原遺伝子産物である分子量１２０〜１４０ＫＤ
のタンパク質と特異的に結合した（図３）。図中、Ｍｏ
Ａｂ（モノクローナル抗体）の内、Ｎｅｇａｔｉｖｅは
ネガティブ抗体つまり異なるものに反応する抗体を指
し、またＡＣＫ２はマウスｃ−ｋｉｔ癌原遺伝子産物に
対する抗体である。
３トランスフェクタント（陽性細胞）、Ｂａｌｂ／３Ｔ
３（陰性細胞）をプレートにまき込み、細胞が接着する
まで３７℃で培養する。メチオニン、システイン不含培
地（ＤＭＥ（−Ｍｅｔ、−Ｃｙｓ）で洗浄後、35Ｓ放射
線標識用培地（Ｔｒａｎｓ−35Ｓ）を加え、３７℃で１
６〜１８時間培養した。細胞を洗浄後、Ｌｙｓｉｓ Ｂ
ｕｆｆｅｒを加え、よく溶解する。氷冷で３０分放置
後、Ｔｕｂｅに移し、遠心（８００ｒｐｍ、５ｍｉ
ｎ）、上清を分取しＬｙｓａｔｅとした。Ｌｙｓａｔｅ
中の非特異結合物質をＰｒｏｔｅｉｎＧ−Ｓｅｐｈａｒ
ｏｓｅ ４Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（ファルマシア）を用い
て除去した後（４℃、３０分間）、遠心（１５０００ｒ
ｐｍ、１ｍｉｎ）し上清を分取した。抗体との反応（４
℃、３０分間）後、ＰｒｏｔｅｉｎＧ−Ｓｅｐｈａｒｏ
ｓｅを加え、４℃で３０分間、ゆっくり回転させた。Ｐ
ｒｏｔｅｉｎＧ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを洗浄後、ＳＤＳ
サンプルバッファーを加え、３分間煮沸、遠心（１５０
００ｒｐｍ、１ｍｉｎ）し、電気泳動用のサンプルとし
た。これをＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動後、２５％ＥｔＯＨ
で固定（２０分間、振とう）、ゲル乾燥後、オートラジ
オグラフィーを行い検出した。その結果、本抗体はｃ−
ｋｉｔ癌原遺伝子産物である分子量１２０〜１４０ＫＤ
のタンパク質と特異的に結合した（図３）。図中、Ｍｏ
Ａｂ（モノクローナル抗体）の内、Ｎｅｇａｔｉｖｅは
ネガティブ抗体つまり異なるものに反応する抗体を指
し、またＡＣＫ２はマウスｃ−ｋｉｔ癌原遺伝子産物に
対する抗体である。
【００３５】（４）ブロッキング試験 得られた抗体とＡＣＫ２とのブロッキング試験を行っ
た。
た。
【００３６】ＨＣＫ／３Ｔ３トランスフェクタント細胞
浮遊液と、種々の未標識抗体と小試験管内で、氷冷で３
０分反応させ、抗原をブロックした後、洗浄し遠心（１
４００ｒｐｍ、３ｍｉｎ）した後、上清を除去した。Ｆ
ＩＴＣ標識した種々の抗体を添加し氷冷で３０分反応、
洗浄後、フローサイトメーターにより蛍光強度を測定し
た。
浮遊液と、種々の未標識抗体と小試験管内で、氷冷で３
０分反応させ、抗原をブロックした後、洗浄し遠心（１
４００ｒｐｍ、３ｍｉｎ）した後、上清を除去した。Ｆ
ＩＴＣ標識した種々の抗体を添加し氷冷で３０分反応、
洗浄後、フローサイトメーターにより蛍光強度を測定し
た。
【００３７】ブロッキング試験の結果より、モノクロー
ナル抗体Ｌ６、Ｌ１５はＡＣＫ２とは異なるエピト−プ
を認識し、また、Ｌ６と１５の認識するエピト−プも異
なっていた。
ナル抗体Ｌ６、Ｌ１５はＡＣＫ２とは異なるエピト−プ
を認識し、また、Ｌ６と１５の認識するエピト−プも異
なっていた。
【００３８】（５）サブクラスの決定 マウスモノクローナルタイビングキット（ＴＨＥ ＢＩ
ＮＤＩＮＧ ＳＩＴＥ社製）を用いて行った。抗体のサ
ブクラスは、Ｌ６とＬ１５ともにＩｇＧ1であった。
ＮＤＩＮＧ ＳＩＴＥ社製）を用いて行った。抗体のサ
ブクラスは、Ｌ６とＬ１５ともにＩｇＧ1であった。
【００３９】
【発明の効果】本発明によってはじめて、ヒトｃ−ｋｉ
ｔ癌原遺伝子産物に特異的に反応するモノクローナル抗
体が作製された。本モノクローナル抗体は、特異性が高
くしかもヒト骨髄細胞等に存在するヒトｃ−ｋｉｔ癌原
遺伝子産物に特異性を有するため、これを測定すること
により、白血病等の造血器腫瘍等の診断薬として有用で
あるばかりでなく、それらの治療薬としても利用でき、
また、ヒトｃ−ｋｉｔ癌原遺伝子産物の分離、精製にも
利用できる。
ｔ癌原遺伝子産物に特異的に反応するモノクローナル抗
体が作製された。本モノクローナル抗体は、特異性が高
くしかもヒト骨髄細胞等に存在するヒトｃ−ｋｉｔ癌原
遺伝子産物に特異性を有するため、これを測定すること
により、白血病等の造血器腫瘍等の診断薬として有用で
あるばかりでなく、それらの治療薬としても利用でき、
また、ヒトｃ−ｋｉｔ癌原遺伝子産物の分離、精製にも
利用できる。
【００４０】更にまた本発明によれば、形質導入法を採
用したことにより、すぐれたハイブリドーマが得られ、
目的とするモノクローナル抗体を効率的に生産できると
いう著効も奏される。
用したことにより、すぐれたハイブリドーマが得られ、
目的とするモノクローナル抗体を効率的に生産できると
いう著効も奏される。
【図１】ハイブリドーマＬ６、Ｌ１５のＨＣＫ／３Ｔ３
トランスフェクタントとの反応性を示した図面である。
トランスフェクタントとの反応性を示した図面である。
【図２】モノクローナル抗体Ｌ６，Ｌ１５のヒト骨髄細
胞との反応性を示した図面である。なおＢ１１２はネガ
ティブ抗体である。
胞との反応性を示した図面である。なおＢ１１２はネガ
ティブ抗体である。
【図３】４種のモノクローナル抗体（Ｎｅｇａｔｉｖｅ
抗体、マウスｃ−ｋｉｔ癌原遺伝子産物に対する抗体で
あるＡＣＫ２、本発明に係る抗体Ｌ６及び同Ｌ１５）の
オートラジオグラフィーによる免疫沈降の結果を示す図
面である。
抗体、マウスｃ−ｋｉｔ癌原遺伝子産物に対する抗体で
あるＡＣＫ２、本発明に係る抗体Ｌ６及び同Ｌ１５）の
オートラジオグラフィーによる免疫沈降の結果を示す図
面である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/574 (Ｃ１２Ｐ 21/08 33/577 Ｃ１２Ｒ 1:91） //(Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ Ｃ１２Ｒ 1:91） 15/00 Ｃ (72)発明者 中 村 充 熊本県熊本市近見町3599−１ 日高ハイ ツ102号 (72)発明者 早 川 佳 代 子 埼玉県越谷市南越谷３−27−31 (56)参考文献 Ｂｌｏｏｄ，ｖｏｌ．79，Ｎｏ．２ （1992．Ｊａｎ）ｐ338−346 Ｂｌｏｏｄ，ｖｏｌ．77，Ｎｏ．９ （1991）ｐ1876−1883 Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｃｈ, Ｖｏｌ．39，Ｎｏ．２（1991）ｐ210Ａ Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓｕ ｐｐｌ．15Ｆ（1991）ｐ89 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/00 C07K 16/28 C12P 21/08 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＥＰＡＴ（ＱＵＥＳＴＥＬ) ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (3)
- 【請求項１】 ヒトから直接得られた生体試料中のヒト
ｃ−ｋｉｔ癌原遺伝子産物と陽性に反応することを特徴
とするモノクローナル抗体を産生することができるハイ
ブリドーマＬ６又はハイブリドーマＬ１５。 - 【請求項２】 請求項１に記載のハイブリドーマを使用
することを特徴とする、ヒトｃ−ｋｉｔ癌原遺伝子産物
に対する特異的モノクローナル抗体Ｌ６又は同Ｌ１５の
製造方法。 - 【請求項３】 請求項２に記載の方法によって製造され
た、ヒトｃ−ｋｉｔ癌原遺伝子産物に対する特異的モノ
クローナル抗体Ｌ６又は同Ｌ１５。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP31429492A JP3241464B2 (ja) | 1992-10-30 | 1992-10-30 | 抗体及びそれを産生するハイブリド−マ |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP31429492A JP3241464B2 (ja) | 1992-10-30 | 1992-10-30 | 抗体及びそれを産生するハイブリド−マ |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06141852A JPH06141852A (ja) | 1994-05-24 |
| JP3241464B2 true JP3241464B2 (ja) | 2001-12-25 |
Family
ID=18051635
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP31429492A Expired - Fee Related JP3241464B2 (ja) | 1992-10-30 | 1992-10-30 | 抗体及びそれを産生するハイブリド−マ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3241464B2 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH10221334A (ja) * | 1997-02-07 | 1998-08-21 | Shima Kenkyusho:Kk | 溶血式測定方法及びそれに使用する微量採血管並びに 試薬キット |
| CN110818794B (zh) * | 2019-11-27 | 2021-08-31 | 河南赛诺特生物技术有限公司 | 一种用于检测人cd117蛋白的单克隆抗体、偶联蛋白、抗原表位肽以及杂交瘤细胞株 |
-
1992
- 1992-10-30 JP JP31429492A patent/JP3241464B2/ja not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| Ｂｌｏｏｄ，ｖｏｌ．７７，Ｎｏ．９（１９９１）ｐ１８７６−１８８３ |
| Ｂｌｏｏｄ，ｖｏｌ．７９，Ｎｏ．２（１９９２．Ｊａｎ）ｐ３３８−３４６ |
| Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｃｈ，Ｖｏｌ．３９，Ｎｏ．２（１９９１）ｐ２１０Ａ |
| Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓｕｐｐｌ．１５Ｆ（１９９１）ｐ８９ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH06141852A (ja) | 1994-05-24 |
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