JPH0614782A - コリネホルム細菌由来の反復ｄｎａ配列 - Google Patents
コリネホルム細菌由来の反復ｄｎａ配列Info
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- JPH0614782A JPH0614782A JP17844991A JP17844991A JPH0614782A JP H0614782 A JPH0614782 A JP H0614782A JP 17844991 A JP17844991 A JP 17844991A JP 17844991 A JP17844991 A JP 17844991A JP H0614782 A JPH0614782 A JP H0614782A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】コリネホルム細菌において、外来より導入する
有用遺伝子を染色体上に安定に保持させ、それによりコ
ンスタントにアミノ酸等の物質を生産する方法を提供す
ることである。 【構成】コリネホルム細菌の染色体ＤＮＡ中に存在する
反復配列を取得し、これとホモロガスリコビネーション
を起こさせることによって外来より導入するＤＮＡ配列
を染色体上に安定に保持させることに成功した。
有用遺伝子を染色体上に安定に保持させ、それによりコ
ンスタントにアミノ酸等の物質を生産する方法を提供す
ることである。 【構成】コリネホルム細菌の染色体ＤＮＡ中に存在する
反復配列を取得し、これとホモロガスリコビネーション
を起こさせることによって外来より導入するＤＮＡ配列
を染色体上に安定に保持させることに成功した。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はアミノ酸製造工業上有用
なコリネホルム細菌の染色体ＤＮＡ中に反復して存在す
る塩基配列（以下、反復配列と称する。）、該反復配列
を用いてホモロガスリコンビネ−ション法により有用遺
伝子をコリネホルム細菌の染色体ＤＮＡに組み込む方
法、及び当該方法により有用遺伝子が染色体ＤＮＡに組
み込まれたコリネホルム細菌に関するもので、アミノ酸
などの発酵生産等に有用な微生物の育種に利用可能なも
のである。
なコリネホルム細菌の染色体ＤＮＡ中に反復して存在す
る塩基配列（以下、反復配列と称する。）、該反復配列
を用いてホモロガスリコンビネ−ション法により有用遺
伝子をコリネホルム細菌の染色体ＤＮＡに組み込む方
法、及び当該方法により有用遺伝子が染色体ＤＮＡに組
み込まれたコリネホルム細菌に関するもので、アミノ酸
などの発酵生産等に有用な微生物の育種に利用可能なも
のである。
【０００２】
【従来技術】コリネホルム細菌に関する遺伝子操作技術
及び組換型コリネホルム細菌による各種アミノ酸生産に
関しては数多く報告されている。例えば、（１）プロト
プラストによるトランスフォ−メ−ション法に関する報
告（J.Bacteriol. 159(1984)304-311）、（２）各種ベ
クタ−の開発に関する報告（Agric.Biol.Chem.48(1984)
2901-2903, Bacteriol.159(1984)306-311, Gene 47(19
86)301-306）、（３）遺伝子発現制御法の開発に関する
報告（Bio/Technology 6(1988)428-430）、（４）各種
アミノ酸の収率増加に関する報告（Agric.Biol.Chem.51
(1987)597-599）等である。しかし、導入した外来遺伝
子の安定化及びコンスタントにアミノ酸等の物質を生産
する方法という面では十分な成果が得られていないのが
現状である。
及び組換型コリネホルム細菌による各種アミノ酸生産に
関しては数多く報告されている。例えば、（１）プロト
プラストによるトランスフォ−メ−ション法に関する報
告（J.Bacteriol. 159(1984)304-311）、（２）各種ベ
クタ−の開発に関する報告（Agric.Biol.Chem.48(1984)
2901-2903, Bacteriol.159(1984)306-311, Gene 47(19
86)301-306）、（３）遺伝子発現制御法の開発に関する
報告（Bio/Technology 6(1988)428-430）、（４）各種
アミノ酸の収率増加に関する報告（Agric.Biol.Chem.51
(1987)597-599）等である。しかし、導入した外来遺伝
子の安定化及びコンスタントにアミノ酸等の物質を生産
する方法という面では十分な成果が得られていないのが
現状である。
【０００３】
【本発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目
的は導入遺伝子の安定化及びコンスタントにアミノ酸等
の物質を生産する方法の提供である。
的は導入遺伝子の安定化及びコンスタントにアミノ酸等
の物質を生産する方法の提供である。
【０００４】
【課題を解決する為のの手段】本発明者等は上記課題を
解決する為に鋭意検討を重ねた結果、コリネホルム細菌
の染色体ＤＮＡ中に存在する反復配列に着目し、この反
復配列とホモロガスリコンビネ−ションを組み合わせて
利用することにより染色体ＤＮＡ中に目的遺伝子を安定
かつ多数導入できることを見い出し本発明を完成するに
至らしめた。
解決する為に鋭意検討を重ねた結果、コリネホルム細菌
の染色体ＤＮＡ中に存在する反復配列に着目し、この反
復配列とホモロガスリコンビネ−ションを組み合わせて
利用することにより染色体ＤＮＡ中に目的遺伝子を安定
かつ多数導入できることを見い出し本発明を完成するに
至らしめた。
【０００５】即ち、本発明はコリネホルム細菌の染色体
ＤＮＡ中に存在する配列表の配列番号１，２，３，４又
は５記載の反復配列、該配列を用いてコリネホルム細菌
のアミノ酸生合成系の遺伝子をコリネホルム型細菌の染
色体ＤＮＡ中に組み込む方法、及び該方法により得られ
たコリネホルム細菌である。尚、反復配列とは、染色体
ＤＮＡ中に繰り返し存在する塩基配列のことで相互に高
いホモロジ−を有するものをいう。この配列は染色体中
に多数存在する為に、この部分とのホモロガスリコンビ
ネ−ション（Saibo Kogaku 9(1990)269-279）を利用す
ることにより、染色体中に目的とする有用遺伝子（例、
アミノ酸生合成系の遺伝子等）を多コピ−挿入すること
が可能な有用な配列である。
ＤＮＡ中に存在する配列表の配列番号１，２，３，４又
は５記載の反復配列、該配列を用いてコリネホルム細菌
のアミノ酸生合成系の遺伝子をコリネホルム型細菌の染
色体ＤＮＡ中に組み込む方法、及び該方法により得られ
たコリネホルム細菌である。尚、反復配列とは、染色体
ＤＮＡ中に繰り返し存在する塩基配列のことで相互に高
いホモロジ−を有するものをいう。この配列は染色体中
に多数存在する為に、この部分とのホモロガスリコンビ
ネ−ション（Saibo Kogaku 9(1990)269-279）を利用す
ることにより、染色体中に目的とする有用遺伝子（例、
アミノ酸生合成系の遺伝子等）を多コピ−挿入すること
が可能な有用な配列である。
【０００６】本発明者等は各種コリネホルム細菌を培養
し、その染色体ＤＮＡを抽出した。そして染色体ＤＮＡ
をクロ−ニングしそのＤＮＡ配列を決定した結果、５種
類の反復配列を見い出し本発明を完成するに至らしめ
た。本発明を以下に詳細に説明する。
し、その染色体ＤＮＡを抽出した。そして染色体ＤＮＡ
をクロ−ニングしそのＤＮＡ配列を決定した結果、５種
類の反復配列を見い出し本発明を完成するに至らしめ
た。本発明を以下に詳細に説明する。
【０００７】まず、各種コリネホルム細菌から得られた
ＤＮＡ数百マイクログラムを含有する溶液をアルカリを
用いてpH12前後に調整する。その後、適当な酸を用いて
pHを中性付近にもどす。更に塩を加えて最終0.3M前後の
塩濃度に調整後、65℃付近で１分程度加熱後急冷する。
このようにして調製されたフラクションにＳ１ヌクレア
−ゼを反応させ１本鎖ＤＮＡ部分を除去する。この時用
いるヌクレア−ゼはＤＮＡの１本鎖に特異的な酵素であ
ればＳ１ヌクレア−ゼ以外でも用いることは可能であ
る。次に酵素反応後、電気泳動もしくはゲル濾過によ
り、分解されずに残ったＤＮＡ断片を検出し抽出する。
このようにして得られたＤＮＡ断片が染色体中に存在す
る反復配列である。
ＤＮＡ数百マイクログラムを含有する溶液をアルカリを
用いてpH12前後に調整する。その後、適当な酸を用いて
pHを中性付近にもどす。更に塩を加えて最終0.3M前後の
塩濃度に調整後、65℃付近で１分程度加熱後急冷する。
このようにして調製されたフラクションにＳ１ヌクレア
−ゼを反応させ１本鎖ＤＮＡ部分を除去する。この時用
いるヌクレア−ゼはＤＮＡの１本鎖に特異的な酵素であ
ればＳ１ヌクレア−ゼ以外でも用いることは可能であ
る。次に酵素反応後、電気泳動もしくはゲル濾過によ
り、分解されずに残ったＤＮＡ断片を検出し抽出する。
このようにして得られたＤＮＡ断片が染色体中に存在す
る反復配列である。
【０００８】次に抽出されたＤＮＡ断片をプラスミドベ
クタ−に挿入しクロ−ン化する。クロ−ン化されたＤＮ
Ａの構造解析はサンガー等の方法（Proc.Nat.Acad.Sci.
74(1977)5463-5467）に従って行った。このようにして
決定されたＤＮＡ配列は配列表の配列番号１，２，３，
４又は５に記載されている。本発明は配列表の配列番号
１，２，３，４又は５記載のＤＮＡ配列に限定されるも
のではなく、ＤＮＡ配列中の１又は複数個の塩基が他の
塩基に置換されたもの、及び上記配列の５´末端又は３
´末端に１又は複数個の塩基配列が付加されたものも、
呈する作用効果が同等であれば本発明の反復配列に含む
ものとする。
クタ−に挿入しクロ−ン化する。クロ−ン化されたＤＮ
Ａの構造解析はサンガー等の方法（Proc.Nat.Acad.Sci.
74(1977)5463-5467）に従って行った。このようにして
決定されたＤＮＡ配列は配列表の配列番号１，２，３，
４又は５に記載されている。本発明は配列表の配列番号
１，２，３，４又は５記載のＤＮＡ配列に限定されるも
のではなく、ＤＮＡ配列中の１又は複数個の塩基が他の
塩基に置換されたもの、及び上記配列の５´末端又は３
´末端に１又は複数個の塩基配列が付加されたものも、
呈する作用効果が同等であれば本発明の反復配列に含む
ものとする。
【０００９】このようにして得られた配列表の配列番号
１，２又は３記載の反復配列をコリネホルム型細菌内で
複製機能が温度感受性になった変異型プラスミド pHSC
4（このプラスミドを保持するエシェリヒアコリAJ12571
の寄託番号はFERM-P11763である。）に挿入し、コリネ
ホルム細菌に形質転換したところ、高頻度にプラスミド
が染色体中に挿入され、安定に保持されることが観察さ
れた。 このことからも本発明の反復配列はアミノ酸生
産等に関する有用遺伝子を多数染色体中に安定的に導入
でき、又各種アミノ等の有用物質を大量に生産できる有
用なものであることを裏付けている
１，２又は３記載の反復配列をコリネホルム型細菌内で
複製機能が温度感受性になった変異型プラスミド pHSC
4（このプラスミドを保持するエシェリヒアコリAJ12571
の寄託番号はFERM-P11763である。）に挿入し、コリネ
ホルム細菌に形質転換したところ、高頻度にプラスミド
が染色体中に挿入され、安定に保持されることが観察さ
れた。 このことからも本発明の反復配列はアミノ酸生
産等に関する有用遺伝子を多数染色体中に安定的に導入
でき、又各種アミノ等の有用物質を大量に生産できる有
用なものであることを裏付けている
【００１０】本発明に言うコリネホルム細菌とはバ−ヂ
−ズ・マニアル・オブ・デタ−ミネイティブバクテリオ
ロジ−第８版５９９ペ−ジ（１９７４年）に記載されて
いるように好気性のグラム陽性菌桿菌である。
−ズ・マニアル・オブ・デタ−ミネイティブバクテリオ
ロジ−第８版５９９ペ−ジ（１９７４年）に記載されて
いるように好気性のグラム陽性菌桿菌である。
【００１１】本発明において宿主菌として使用できるコ
リネホルム細菌としては、たとえばブレビバクテリウム
・サッカロリティクム ＡＴＣＣ１４０６６、ブレビバ
クテリウム・インマリオフィルム ＡＴＣＣ１４０６
８、ブレビバクテリウム・ラクトファ−メンタム ＡＴ
ＣＣ１３８６９、ブレビバクテリウム・ロゼウム ＡＴ
ＣＣ１３８２５、ブレビバクテリウム・フラバム ＡＴ
ＣＣ１３８２６、コリネバクテリウム・アセトアシドフ
ィルム ＡＴＣＣ１３８７０、コリネバクテリウム・グ
ルタミクム ＡＴＣＣ１３０３２、１３０６０、コリネ
バクテリウム・リリウム ＡＴＣＣ１５９９０等の野生
株、及び上記グルタミン酸生産菌より誘導され、グルタ
ミン酸生産性を失った変異株、更にはリジン等のアミノ
酸、イノシン等の核酸などの他の生産物を生産する変異
株も含まれる。
リネホルム細菌としては、たとえばブレビバクテリウム
・サッカロリティクム ＡＴＣＣ１４０６６、ブレビバ
クテリウム・インマリオフィルム ＡＴＣＣ１４０６
８、ブレビバクテリウム・ラクトファ−メンタム ＡＴ
ＣＣ１３８６９、ブレビバクテリウム・ロゼウム ＡＴ
ＣＣ１３８２５、ブレビバクテリウム・フラバム ＡＴ
ＣＣ１３８２６、コリネバクテリウム・アセトアシドフ
ィルム ＡＴＣＣ１３８７０、コリネバクテリウム・グ
ルタミクム ＡＴＣＣ１３０３２、１３０６０、コリネ
バクテリウム・リリウム ＡＴＣＣ１５９９０等の野生
株、及び上記グルタミン酸生産菌より誘導され、グルタ
ミン酸生産性を失った変異株、更にはリジン等のアミノ
酸、イノシン等の核酸などの他の生産物を生産する変異
株も含まれる。
【００１２】さて、反復配列を用いて染色体中に導入で
きる有用遺伝子としてはインタ−ロイキン２、６等の生
理活性物質をコ−ドする遺伝子でも良いが、通常コリネ
ホルム型細菌における各種アミノ酸（リジン、スレオニ
ン、イソロイシン、グルタミン酸等）の生合成系のキ−
エンザイムに関する遺伝子、具体的にはホモセリン脱水
素酵素、スレオニン・デアミナ−ゼ、アスパラギン酸キ
ナ−ゼ、ホスホエノ−ルピルビン酸カルボキシラ−ゼ等
の遺伝子を用いるのが好ましい。もちろん、上記以外の
遺伝子を用いても良い。
きる有用遺伝子としてはインタ−ロイキン２、６等の生
理活性物質をコ−ドする遺伝子でも良いが、通常コリネ
ホルム型細菌における各種アミノ酸（リジン、スレオニ
ン、イソロイシン、グルタミン酸等）の生合成系のキ−
エンザイムに関する遺伝子、具体的にはホモセリン脱水
素酵素、スレオニン・デアミナ−ゼ、アスパラギン酸キ
ナ−ゼ、ホスホエノ−ルピルビン酸カルボキシラ−ゼ等
の遺伝子を用いるのが好ましい。もちろん、上記以外の
遺伝子を用いても良い。
【００１３】反復配列、及び上記有用遺伝子をのせるプ
ラスミドとしては特に制限はないが通常コリネホルム細
菌由来のプラスミドを用いれば良い。具体的にはpHM151
9(Agric.Biol.Chem.48(1984)2901-2903),pAM330(Agric.
Biol.Chem.48(1984)2901-2903),及びこれらをベースと
した薬剤耐性プラスミド等である．
ラスミドとしては特に制限はないが通常コリネホルム細
菌由来のプラスミドを用いれば良い。具体的にはpHM151
9(Agric.Biol.Chem.48(1984)2901-2903),pAM330(Agric.
Biol.Chem.48(1984)2901-2903),及びこれらをベースと
した薬剤耐性プラスミド等である．
【００１４】反復配列及び目的とする有用遺伝子を有す
る組換プラスミドを上述したコリネホルム細菌に形質転
換する。形質転換法としては通常よく用いられるプロト
プラスト法（Gene,39(1985)281-286）、エレクトロポレ
ーション法（Bio/Technology,7(1989)1067-1070)等の方
法を用いれば良い。また、得られた形質転換体は通常よ
く用いられている方法、条件に従って培養すれば良い。
そうすると有用物質が菌体内又は外に蓄積される。
る組換プラスミドを上述したコリネホルム細菌に形質転
換する。形質転換法としては通常よく用いられるプロト
プラスト法（Gene,39(1985)281-286）、エレクトロポレ
ーション法（Bio/Technology,7(1989)1067-1070)等の方
法を用いれば良い。また、得られた形質転換体は通常よ
く用いられている方法、条件に従って培養すれば良い。
そうすると有用物質が菌体内又は外に蓄積される。
【００１５】
【実施例】以下に、本発明を実施例に基づいて具体的に
説明する。
説明する。
【００１６】（反復配列の検出）ブレビバクテリウムラ
クトフェルメンタム及びブレビバクテリウムフラバムよ
り、Saito-Miuraの方法(BBA,8278,619-629(1963))によ
ってクロモゾームDNAを調製し、それらの300-600μg相
当を1mlのTEバッファー(10mM Tris-HCl,1mMEDTA,pH8.0)
に溶かした。それを0.2規定のNaOHでpHを12.3にあわ
せ、室温で15分放置した後、0.2規定のHClでpHを6.75-
7.10に戻した。4MNaClでNa+濃度を0.3Mにあわせ、65℃,
1分間加熱した後、すばやく冷やし、10倍濃度のS1バッ
ファー(4.5mM ZnCl2,40mMSodiumAcetateBuffer(pH4.6))
を0.1ml加えたのち3本に分け、以後のS1ヌクレアーゼ反
応に供した。S1ヌクレアーゼの反応は、0.1u/μgDNA,1u
/μgDNA,10u/μgDNAの3段階で37℃ 1時間行った。反応
停止はフェノール処理によって行い、そのフェノールは
クロロフォルムで除去した。エタノール沈澱によってDN
Aを回収し、それぞれをアガロースゲル電気泳動にかけ
た。その結果ブレビバクテリウムラクトフェルメンタム
からは9本ブレビバクテリウムフラバムからは3本の、S1
ヌクレアーゼ反応以前には見られなかったバンドが確認
され、それぞれをゲルより回収した。
クトフェルメンタム及びブレビバクテリウムフラバムよ
り、Saito-Miuraの方法(BBA,8278,619-629(1963))によ
ってクロモゾームDNAを調製し、それらの300-600μg相
当を1mlのTEバッファー(10mM Tris-HCl,1mMEDTA,pH8.0)
に溶かした。それを0.2規定のNaOHでpHを12.3にあわ
せ、室温で15分放置した後、0.2規定のHClでpHを6.75-
7.10に戻した。4MNaClでNa+濃度を0.3Mにあわせ、65℃,
1分間加熱した後、すばやく冷やし、10倍濃度のS1バッ
ファー(4.5mM ZnCl2,40mMSodiumAcetateBuffer(pH4.6))
を0.1ml加えたのち3本に分け、以後のS1ヌクレアーゼ反
応に供した。S1ヌクレアーゼの反応は、0.1u/μgDNA,1u
/μgDNA,10u/μgDNAの3段階で37℃ 1時間行った。反応
停止はフェノール処理によって行い、そのフェノールは
クロロフォルムで除去した。エタノール沈澱によってDN
Aを回収し、それぞれをアガロースゲル電気泳動にかけ
た。その結果ブレビバクテリウムラクトフェルメンタム
からは9本ブレビバクテリウムフラバムからは3本の、S1
ヌクレアーゼ反応以前には見られなかったバンドが確認
され、それぞれをゲルより回収した。
【００１７】（反復配列のクローニング）回収したDNA
をT4DNAポリメラーゼによって処理し、両端を平滑末端
にした。一方ベクターpUC18(Yanish-Perron,C.,Vieira,
J. and Messing,J.,Gene 33(1985)103-119)をSmaＩで切
断し、両者をT4DNAライゲースで接続した。エシェリヒ
アコリJM109にトランスフォメーションし、X-gal(5-bro
mo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside )を含
むL-brothプレートで白いコロニーを形成するものを選
び、それらの中から５種類のインサートDNAを持つクロ
ーンを取得した。それらをプローブとして、起源である
クロモゾームDNAに対しサザンハイブリダイゼーション
を行ったところ、３種類について(RS410,RS479,RS656)
(なお、RS410を含むpUC18を持つエシェルヒアコリをAJ1
2620(FERM P-12330),RS479を含むpUC18を持つエシェル
ヒアコリをAJ12621(FERM P-12331),RS656を含むpUC18を
持つエシェルヒアコリをAJ12622(FERM P-12332)として
寄託した。)、それらがクロモゾーム中に１０コピー程
度存在することが確認された。この３種類についてダイ
デオキシ法でシークエンスを決定した。結果を配列表の
配列番号１,２,３に示す。
をT4DNAポリメラーゼによって処理し、両端を平滑末端
にした。一方ベクターpUC18(Yanish-Perron,C.,Vieira,
J. and Messing,J.,Gene 33(1985)103-119)をSmaＩで切
断し、両者をT4DNAライゲースで接続した。エシェリヒ
アコリJM109にトランスフォメーションし、X-gal(5-bro
mo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside )を含
むL-brothプレートで白いコロニーを形成するものを選
び、それらの中から５種類のインサートDNAを持つクロ
ーンを取得した。それらをプローブとして、起源である
クロモゾームDNAに対しサザンハイブリダイゼーション
を行ったところ、３種類について(RS410,RS479,RS656)
(なお、RS410を含むpUC18を持つエシェルヒアコリをAJ1
2620(FERM P-12330),RS479を含むpUC18を持つエシェル
ヒアコリをAJ12621(FERM P-12331),RS656を含むpUC18を
持つエシェルヒアコリをAJ12622(FERM P-12332)として
寄託した。)、それらがクロモゾーム中に１０コピー程
度存在することが確認された。この３種類についてダイ
デオキシ法でシークエンスを決定した。結果を配列表の
配列番号１,２,３に示す。
【００１８】（得られたシークエンスとDNAデーターベ
ースとのホモロジー検索）得られたシークエンスとDNA
データーベース(GENBANK)とでプログラムideasを用いホ
モロジー検索を行った。RS410についてエシェリヒアコ
リのIS15deltaと強いホモロジーがあることが分かっ
た。さらに両者のアラインメントにより、このRS410
は、本来クロモゾーム上で両端にインバーティッドリピ
ートを持つIS配列（ insertion sequence，挿入配
列）の一部と考えられ、さらにこのRS410をプローブと
して、ブレビバクテリウムラクトフェルメンタムのライ
ブラリーからスクリーニングを行った。得られたクロー
ンについてダイデオキシ法でシークエンスを決定したと
ころ、このクローンは、配列表の配列番号４に示す、両
端にインバーティッドリピートを保持するIS様配列を含
むことが分かった。また、得られたクローンは、配列番
号４に示す配列の他に、配列番号１と約８０％のホモロ
ジーのある配列が発見された。この配列を配列番号５に
示す。配列番号４と配列番号５の配列を含むＤＮＡ断片
が挿入されたプラスミドを保持するエシェルヒアコリを
AJ12623(FERM P-12333）として寄託した。
ースとのホモロジー検索）得られたシークエンスとDNA
データーベース(GENBANK)とでプログラムideasを用いホ
モロジー検索を行った。RS410についてエシェリヒアコ
リのIS15deltaと強いホモロジーがあることが分かっ
た。さらに両者のアラインメントにより、このRS410
は、本来クロモゾーム上で両端にインバーティッドリピ
ートを持つIS配列（ insertion sequence，挿入配
列）の一部と考えられ、さらにこのRS410をプローブと
して、ブレビバクテリウムラクトフェルメンタムのライ
ブラリーからスクリーニングを行った。得られたクロー
ンについてダイデオキシ法でシークエンスを決定したと
ころ、このクローンは、配列表の配列番号４に示す、両
端にインバーティッドリピートを保持するIS様配列を含
むことが分かった。また、得られたクローンは、配列番
号４に示す配列の他に、配列番号１と約８０％のホモロ
ジーのある配列が発見された。この配列を配列番号５に
示す。配列番号４と配列番号５の配列を含むＤＮＡ断片
が挿入されたプラスミドを保持するエシェルヒアコリを
AJ12623(FERM P-12333）として寄託した。
【００１９】（反復配列を利用したクロモゾーム内への
遺伝子組み込み）複製機能が温度感受性になった変異型
プラスミドpHSC4の、複製とは関係ない位置に存在する
制限酵素PstＩ部位にRS410を両者ともDNAポリメラーゼ
処理による平滑末端ライゲーションによって挿入した。
詳細を図１に示す。ここで作成したpHRS410をエレクト
ロポレーションによってブレビバクテリウムラクトファ
ーメンタムならびにコリネバクテリウムグルタミカムに
導入した。得られた株を25℃ で培養し、その後34℃ に
上げることによってプラスミドキュアリング（保持して
いるプラスミドを脱落させること。）したところ、pHSC
410を保持する株は、ベクターであるpHSC4を保持する株
に比べて有意に多数のクロラムフェニコール耐性株が出
現した（表１）。これはRS410がクロモゾームとホモロ
ガスレコンビネーションを起こすことによって、クロラ
ムフェニコール耐性遺伝子がクロモゾーム内に入り込ん
だためと考えられる。出現したクロラムフェニコール耐
性菌からクロモゾームDNAを抽出し、サザンハイブリダ
イゼーションによってクロラムフェニコール耐性遺伝子
の挿入を調べたところ、遺伝子の挿入があることが確認
された。
遺伝子組み込み）複製機能が温度感受性になった変異型
プラスミドpHSC4の、複製とは関係ない位置に存在する
制限酵素PstＩ部位にRS410を両者ともDNAポリメラーゼ
処理による平滑末端ライゲーションによって挿入した。
詳細を図１に示す。ここで作成したpHRS410をエレクト
ロポレーションによってブレビバクテリウムラクトファ
ーメンタムならびにコリネバクテリウムグルタミカムに
導入した。得られた株を25℃ で培養し、その後34℃ に
上げることによってプラスミドキュアリング（保持して
いるプラスミドを脱落させること。）したところ、pHSC
410を保持する株は、ベクターであるpHSC4を保持する株
に比べて有意に多数のクロラムフェニコール耐性株が出
現した（表１）。これはRS410がクロモゾームとホモロ
ガスレコンビネーションを起こすことによって、クロラ
ムフェニコール耐性遺伝子がクロモゾーム内に入り込ん
だためと考えられる。出現したクロラムフェニコール耐
性菌からクロモゾームDNAを抽出し、サザンハイブリダ
イゼーションによってクロラムフェニコール耐性遺伝子
の挿入を調べたところ、遺伝子の挿入があることが確認
された。
【００２０】
【表１】
【００２１】
【発明の効果】以上のように本発明では、コリネホルム
細菌の染色体ＤＮＡ中に存在する反復配列を用いて、ホ
モロガスリコンビネーションを生じさせることにより、
外来より導入する有用遺伝子等をコリネホルム細菌の染
色体ＤＮＡ中に、安定に保持させることができる。又本
発明は上記方法により育種されたコリネホルム細菌を用
いることでコンスタントにアミノ酸等の物質を生産する
方法を提供するものである。
細菌の染色体ＤＮＡ中に存在する反復配列を用いて、ホ
モロガスリコンビネーションを生じさせることにより、
外来より導入する有用遺伝子等をコリネホルム細菌の染
色体ＤＮＡ中に、安定に保持させることができる。又本
発明は上記方法により育種されたコリネホルム細菌を用
いることでコンスタントにアミノ酸等の物質を生産する
方法を提供するものである。
【図１】 図１には、反復配列RS410を、温度感受性複
製起点を有する変異型プラスミドpHSC4のPstＩ部位に導
入した手順を示した。なおRS410の両端にはpUC18由来の
Multiple Clonig Siteの配列が付着している。
製起点を有する変異型プラスミドpHSC4のPstＩ部位に導
入した手順を示した。なおRS410の両端にはpUC18由来の
Multiple Clonig Siteの配列が付着している。
配列番号：１ 配列の長さ：410 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：フ゛レヒ゛ハ゛クテリウムラクトファーメンタム(Brevibacterium l
actofermentum) 株名：BP-734 配列の特徴 特徴を表す記号：insertion-seq 特徴を決定した方法：Ｓ 配列： GCAGCGTCTT GGCCAGGAAA CGCTTGGCCG CCGCGACGTT GCGCTTCGGG GAGAGGTAAA 60 AGTCCAGGGT CTGGCCGCGG TGATTGCCGA TAGAGTAGCA CACTGCGCGA CCGGATATAG 120 GACTGTCCAC CGCAGGACCG GGCCTCCAGT CAGGAACTTG CCGATACCAC CGGGTCTGCT 180 TGTCCAGTTC GGGAGCATAT TTCTGCACCC AGCGGTAGAT CGTGGTGTGA TCAACCGGCA 240 CACCACGCTC GGTCATCATT TCCTCCAGGT CGCGGTAGCT CACAAGTACG GCCAGTACCA 300 CCGCACTGCC CACAGAATGA TGTCACGGGG GAAATGACGA CCGGAGAAGA TACCCATGGC 360 CCTGATTATT TCACGCCGGT CTTCCTACTG CCCCAACTTT GCAACAGCAC 420 配列番号：２ 配列の長さ:479 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：フ゛レヒ゛ハ゛クテリウムフラハ゛ム(Brevibacterium flavu
m) 株名：ATCC 14067 配列： GTGTAAATTA ATTCCAGTCA GCGCGACCAA CAACGCCCCA ACACATAAGA GATTATGTGG 60 ACAGTGAGGC GGATCTAGGA AAACAAACGC TCGACAAACC AACAACACTT CATCGAAGTC 120 AACCAAACAC CGATTTCGTA AGTAAAGATG AAGTAACGTT GAACAAGCTG CCAACAAGAC 180 ACCAACAAAC AAATGTTGAT GATCTTATGG TGTGCGTATG TTGTTTGAGA ACTCAATAGT 240 GTGCCATTTA TTATTTTTGT CACTACCACT CTTAACCCCT TGAGGGTTTT GGTGGTGGGT 300 CATGCCGGGT GGTGGATCGC CAATATTTAT CCATCACTGT AAACAATAAC CAATATTTGT 360 TGGCATGATT TGTGGTCTCT TGTTCCCGTC AAGGATCAGG CCCACATGAA AGACACGATG 420 AATCCTTATG TGGGTTGTGG TGTTTTTTTA AATCATTATT TTTTGATAAT GCCAGTAAC 479 配列番号：３ 配列の長さ:656 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：フ゛レヒ゛ハ゛クテリウムラクトファーメンタム
（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍ
ｅｎｔｕｍ） 株名：ＢＰ−７３４ 配列： TAGGGTTGCG CGGATCATGC GTGAACTCAA ACTGTTTGGC TACACCAAGA AACGCAAGGT 60 CACCACCACC GTGTCAGATC AGAAGAAACC AGTTGTCCCT GACCTTGTCG GTCCGTAAAT 120 TATCCGACAG CCGAACCAGG TTACGTCGTG ACATTACCTA TCTGCCGATT GCAGATGGGT 180 CGAATATGTA CTTGGCTACG GTCATTGATT GCTATTCCCG GCGGCTGGTT GGCTTCGCGA 240 TCGCCGATCA CATGCGCACA TCACTGGTGC AGGCATGCGC TGGTGATGGC CAAAGCGCGA 300 GGGAGCATGA AGGAAGCAAT TTTCCACTCG AACCACGGCA GTGTGTACAC ATCGAATGCG 360 TTCCAGGACA CCTGCACCCA GTTCCCCATC AGGCAGTCGA TGGATCAATT GGACCAGTCG 420 ANNNTTGNGG AGTCGTTCAA CGCGGCCTGA AGAGGGAAGT CCTTCAAGAT TCCAAGACCT 480 TTGCCAACCA GATGATCTGC CGGCGGGATG TTTTCCGCTG GTGTACNCGC GTTACAACAC 540 GGTCGCCGAC ATTCCAGATG TAAATATCTG CTCCTNTGTN TTTAGACNTG TCCTGCTATC 600 CTAAGATCTG CTTCTTGATT AAATCCTCCT GTCCACTTCC CGGGGGTCGG GCCCTT 656 配列番号：４ 配列の長さ:589 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：フ゛レヒ゛ハ゛クテリウムラクトファーメンタム(Brevibacterium l
actofermentum) 株名：BP-734 配列： GGATCCGTTT CAGCCGCCCA TGATCTCCTT CAATGACGTT ATTGAGGTAT TTCACCTGCC 60 GGTGTTCCAC GGTCTGCGGC AGATTCCCTC TGACTTCAAC TCGGCGATTG CCTGGCAGGA 120 GGGTGCTTTA TCGGTGTTGA TCACCGCGGG GACCCGGTTA TCGTGTTCGA CCTCAGGTCT 180 TGGCCAGGAA ACGCTTCGCT GCGGCGACGT TACGCTTTGG GGACAGGTAA AAATCCAGGG 240 TATTGCCCGC CCGCTGTGAT GGCCCGATAG AGGTAGCACC ACTTTCCCGA TCCGATATAG 300 GTCTCATCCA CCCGCAGGAA GTGGCCTGCC AATCCGGGAC TTGTCGGTAC CACCGGGTCT 360 GCTTGTCCAG CTCAGGAGCA TATTTCTGGA CCAGCGGTAG ATGGTGCTGT GATCGACGGT 420 ACGCAGCGTT CGGTCATTTC TTCCAGATCG CGGTAGCTGA GCNCCGTAGC GGCAGTACCA 480 CCGACCGCCC ACAGGATGAT TTCACGGGGG AAATGACGAC CGGAGAAGAT GCCCATGGCT 540 GTGATTATTT CACGCAGGTC TTCCTGTCGC CCGAACTTTG CAACAGCAC 589 配列番号：５ 配列の長さ:656 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：フ゛レヒ゛ハ゛クテリウムラクトファーメンタム(Brevibacterium l
actofermentum) 株名：BP-734 配列の特徴 配列を表す記号：insertion-seq 特徴を決定した方法：Ｓ 配列： GTGCTGTTGC AAAGTTGGGC GGAGAGCAGC GAAGACTCAG TTCTCATCCT GATCGCGCTG 60 CGTGTGCGTG TAGCGTCTCG AAGACCGGTT GACGATCACG TGTCGGTTCG TTGCCCGTGA 120 GGTCAAACAT CGTGCCTTGC CCTTTCCGCA ATGAGTGCAT CGCCTCCATC CCTTTCAACG 180 TCCGATATGC AGATGTCTAA GTTCTTAAAC GCCTTTCGGC CCGAGGATCC GCTTCAGCCG 240 ACCATGGTGC CTTCCAGGAT GTTGTTGAGG TATTTCACCT GCCGGTGTTC CACTGTTAGC 300 GAGCAGATTC CCTCTGACTT CAACTCGGCG ATTGCCTGGC TAGAGACGGT GCTTATCGGT 360 GTTGATCACN CTGGGATACC CGGCTGACGC ATTGGATCTG AGGGCCTTGG CAGGAAAGCG 420 TTCGCTGCGG CCACGTTCCG TTTTGGTGAG AGGTAAAGTC CAGGGTCTTG GCCACCGGCG 480 GTATCGCAGA TCAGAGGTAG CACCACCTGC ATGCCGACCC GATATACTCT CATCACCTCA 540 GAACTTAGCT GCAGTCAGTA CTGCGTACAC GTGTTTGCTT GTCAGCTCAG ATCGCATTCT 600 GACCAGCGGT GAGATCGTGG TGTGATCAAC GGTACGCCAG CTGAAGTCAT CATTCTCAAG 660 TCGCGGTAGC TCACCGTAGC GCGAGTGACC TGACGCACGG CCACAGAATG ATGTCACGGG 720 AAACGACGAC GGAGACGATA CCCATGGCTG TGATTATTTC ACGTCGCTCT TCCTACTGCC 780 CCAACTTTGC AACAACAC 798
actofermentum) 株名：BP-734 配列の特徴 特徴を表す記号：insertion-seq 特徴を決定した方法：Ｓ 配列： GCAGCGTCTT GGCCAGGAAA CGCTTGGCCG CCGCGACGTT GCGCTTCGGG GAGAGGTAAA 60 AGTCCAGGGT CTGGCCGCGG TGATTGCCGA TAGAGTAGCA CACTGCGCGA CCGGATATAG 120 GACTGTCCAC CGCAGGACCG GGCCTCCAGT CAGGAACTTG CCGATACCAC CGGGTCTGCT 180 TGTCCAGTTC GGGAGCATAT TTCTGCACCC AGCGGTAGAT CGTGGTGTGA TCAACCGGCA 240 CACCACGCTC GGTCATCATT TCCTCCAGGT CGCGGTAGCT CACAAGTACG GCCAGTACCA 300 CCGCACTGCC CACAGAATGA TGTCACGGGG GAAATGACGA CCGGAGAAGA TACCCATGGC 360 CCTGATTATT TCACGCCGGT CTTCCTACTG CCCCAACTTT GCAACAGCAC 420 配列番号：２ 配列の長さ:479 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：フ゛レヒ゛ハ゛クテリウムフラハ゛ム(Brevibacterium flavu
m) 株名：ATCC 14067 配列： GTGTAAATTA ATTCCAGTCA GCGCGACCAA CAACGCCCCA ACACATAAGA GATTATGTGG 60 ACAGTGAGGC GGATCTAGGA AAACAAACGC TCGACAAACC AACAACACTT CATCGAAGTC 120 AACCAAACAC CGATTTCGTA AGTAAAGATG AAGTAACGTT GAACAAGCTG CCAACAAGAC 180 ACCAACAAAC AAATGTTGAT GATCTTATGG TGTGCGTATG TTGTTTGAGA ACTCAATAGT 240 GTGCCATTTA TTATTTTTGT CACTACCACT CTTAACCCCT TGAGGGTTTT GGTGGTGGGT 300 CATGCCGGGT GGTGGATCGC CAATATTTAT CCATCACTGT AAACAATAAC CAATATTTGT 360 TGGCATGATT TGTGGTCTCT TGTTCCCGTC AAGGATCAGG CCCACATGAA AGACACGATG 420 AATCCTTATG TGGGTTGTGG TGTTTTTTTA AATCATTATT TTTTGATAAT GCCAGTAAC 479 配列番号：３ 配列の長さ:656 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：フ゛レヒ゛ハ゛クテリウムラクトファーメンタム
（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍ
ｅｎｔｕｍ） 株名：ＢＰ−７３４ 配列： TAGGGTTGCG CGGATCATGC GTGAACTCAA ACTGTTTGGC TACACCAAGA AACGCAAGGT 60 CACCACCACC GTGTCAGATC AGAAGAAACC AGTTGTCCCT GACCTTGTCG GTCCGTAAAT 120 TATCCGACAG CCGAACCAGG TTACGTCGTG ACATTACCTA TCTGCCGATT GCAGATGGGT 180 CGAATATGTA CTTGGCTACG GTCATTGATT GCTATTCCCG GCGGCTGGTT GGCTTCGCGA 240 TCGCCGATCA CATGCGCACA TCACTGGTGC AGGCATGCGC TGGTGATGGC CAAAGCGCGA 300 GGGAGCATGA AGGAAGCAAT TTTCCACTCG AACCACGGCA GTGTGTACAC ATCGAATGCG 360 TTCCAGGACA CCTGCACCCA GTTCCCCATC AGGCAGTCGA TGGATCAATT GGACCAGTCG 420 ANNNTTGNGG AGTCGTTCAA CGCGGCCTGA AGAGGGAAGT CCTTCAAGAT TCCAAGACCT 480 TTGCCAACCA GATGATCTGC CGGCGGGATG TTTTCCGCTG GTGTACNCGC GTTACAACAC 540 GGTCGCCGAC ATTCCAGATG TAAATATCTG CTCCTNTGTN TTTAGACNTG TCCTGCTATC 600 CTAAGATCTG CTTCTTGATT AAATCCTCCT GTCCACTTCC CGGGGGTCGG GCCCTT 656 配列番号：４ 配列の長さ:589 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：フ゛レヒ゛ハ゛クテリウムラクトファーメンタム(Brevibacterium l
actofermentum) 株名：BP-734 配列： GGATCCGTTT CAGCCGCCCA TGATCTCCTT CAATGACGTT ATTGAGGTAT TTCACCTGCC 60 GGTGTTCCAC GGTCTGCGGC AGATTCCCTC TGACTTCAAC TCGGCGATTG CCTGGCAGGA 120 GGGTGCTTTA TCGGTGTTGA TCACCGCGGG GACCCGGTTA TCGTGTTCGA CCTCAGGTCT 180 TGGCCAGGAA ACGCTTCGCT GCGGCGACGT TACGCTTTGG GGACAGGTAA AAATCCAGGG 240 TATTGCCCGC CCGCTGTGAT GGCCCGATAG AGGTAGCACC ACTTTCCCGA TCCGATATAG 300 GTCTCATCCA CCCGCAGGAA GTGGCCTGCC AATCCGGGAC TTGTCGGTAC CACCGGGTCT 360 GCTTGTCCAG CTCAGGAGCA TATTTCTGGA CCAGCGGTAG ATGGTGCTGT GATCGACGGT 420 ACGCAGCGTT CGGTCATTTC TTCCAGATCG CGGTAGCTGA GCNCCGTAGC GGCAGTACCA 480 CCGACCGCCC ACAGGATGAT TTCACGGGGG AAATGACGAC CGGAGAAGAT GCCCATGGCT 540 GTGATTATTT CACGCAGGTC TTCCTGTCGC CCGAACTTTG CAACAGCAC 589 配列番号：５ 配列の長さ:656 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：フ゛レヒ゛ハ゛クテリウムラクトファーメンタム(Brevibacterium l
actofermentum) 株名：BP-734 配列の特徴 配列を表す記号：insertion-seq 特徴を決定した方法：Ｓ 配列： GTGCTGTTGC AAAGTTGGGC GGAGAGCAGC GAAGACTCAG TTCTCATCCT GATCGCGCTG 60 CGTGTGCGTG TAGCGTCTCG AAGACCGGTT GACGATCACG TGTCGGTTCG TTGCCCGTGA 120 GGTCAAACAT CGTGCCTTGC CCTTTCCGCA ATGAGTGCAT CGCCTCCATC CCTTTCAACG 180 TCCGATATGC AGATGTCTAA GTTCTTAAAC GCCTTTCGGC CCGAGGATCC GCTTCAGCCG 240 ACCATGGTGC CTTCCAGGAT GTTGTTGAGG TATTTCACCT GCCGGTGTTC CACTGTTAGC 300 GAGCAGATTC CCTCTGACTT CAACTCGGCG ATTGCCTGGC TAGAGACGGT GCTTATCGGT 360 GTTGATCACN CTGGGATACC CGGCTGACGC ATTGGATCTG AGGGCCTTGG CAGGAAAGCG 420 TTCGCTGCGG CCACGTTCCG TTTTGGTGAG AGGTAAAGTC CAGGGTCTTG GCCACCGGCG 480 GTATCGCAGA TCAGAGGTAG CACCACCTGC ATGCCGACCC GATATACTCT CATCACCTCA 540 GAACTTAGCT GCAGTCAGTA CTGCGTACAC GTGTTTGCTT GTCAGCTCAG ATCGCATTCT 600 GACCAGCGGT GAGATCGTGG TGTGATCAAC GGTACGCCAG CTGAAGTCAT CATTCTCAAG 660 TCGCGGTAGC TCACCGTAGC GCGAGTGACC TGACGCACGG CCACAGAATG ATGTCACGGG 720 AAACGACGAC GGAGACGATA CCCATGGCTG TGATTATTTC ACGTCGCTCT TCCTACTGCC 780 CCAACTTTGC AACAACAC 798
【手続補正書】
【提出日】平成５年７月２０日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】発明の詳細な説明
【補正方法】変更
【補正内容】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はアミノ酸製造工業上有用
なコリネホルム細菌の染色体ＤＮＡ中に反復して存在す
る塩基配列（以下、反復配列と称する。）、該反復配列
を用いてホモロガスリコンビネ−ション法により有用遺
伝子をコリネホルム細菌の染色体ＤＮＡに組み込む方
法、及び当該方法により有用遺伝子が染色体ＤＮＡに組
み込まれたコリネホルム細菌に関するもので、アミノ酸
などの発酵生産等に有用な微生物の育種に利用可能なも
のである。
なコリネホルム細菌の染色体ＤＮＡ中に反復して存在す
る塩基配列（以下、反復配列と称する。）、該反復配列
を用いてホモロガスリコンビネ−ション法により有用遺
伝子をコリネホルム細菌の染色体ＤＮＡに組み込む方
法、及び当該方法により有用遺伝子が染色体ＤＮＡに組
み込まれたコリネホルム細菌に関するもので、アミノ酸
などの発酵生産等に有用な微生物の育種に利用可能なも
のである。
【０００２】
【従来技術】コリネホルム細菌に関する遺伝子操作技術
及び組換型コリネホルム細菌による各種アミノ酸生産に
関しては数多く報告されている。例えば、（１）プロト
プラストによるトランスフォ−メ−ション法に関する報
告（J.Bacteriol. 159(1984)304-311）、（２）各種ベ
クタ−の開発に関する報告（Agric.Biol.Chem.48(1984)
2901-2903, Bacteriol.159(1984)306-311, Gene 47(19
86)301-306）、（３）遺伝子発現制御法の開発に関する
報告（Bio/Technology 6(1988)428-430）、（４）各種
アミノ酸の収率増加に関する報告（Agric.Biol.Chem.51
(1987)597-599）等である。しかし、導入した外来遺伝
子の安定化及びコンスタントにアミノ酸等の物質を生産
する方法という面では十分な成果が得られていないのが
現状である。
及び組換型コリネホルム細菌による各種アミノ酸生産に
関しては数多く報告されている。例えば、（１）プロト
プラストによるトランスフォ−メ−ション法に関する報
告（J.Bacteriol. 159(1984)304-311）、（２）各種ベ
クタ−の開発に関する報告（Agric.Biol.Chem.48(1984)
2901-2903, Bacteriol.159(1984)306-311, Gene 47(19
86)301-306）、（３）遺伝子発現制御法の開発に関する
報告（Bio/Technology 6(1988)428-430）、（４）各種
アミノ酸の収率増加に関する報告（Agric.Biol.Chem.51
(1987)597-599）等である。しかし、導入した外来遺伝
子の安定化及びコンスタントにアミノ酸等の物質を生産
する方法という面では十分な成果が得られていないのが
現状である。
【０００３】
【本発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目
的は導入遺伝子の安定化及びコンスタントにアミノ酸等
の物質を生産する方法の提供である。
的は導入遺伝子の安定化及びコンスタントにアミノ酸等
の物質を生産する方法の提供である。
【０００４】
【課題を解決する為のの手段】本発明者等は上記課題を
解決する為に鋭意検討を重ねた結果、コリネホルム細菌
の染色体ＤＮＡ中に存在する反復配列に着目し、この反
復配列とホモロガスリコンビネ−ションを組み合わせて
利用することにより染色体ＤＮＡ中に目的遺伝子を安定
かつ多数導入できることを見い出し本発明を完成するに
至らしめた。
解決する為に鋭意検討を重ねた結果、コリネホルム細菌
の染色体ＤＮＡ中に存在する反復配列に着目し、この反
復配列とホモロガスリコンビネ−ションを組み合わせて
利用することにより染色体ＤＮＡ中に目的遺伝子を安定
かつ多数導入できることを見い出し本発明を完成するに
至らしめた。
【０００５】即ち、本発明はコリネホルム細菌の染色体
ＤＮＡ中に存在する配列表の配列番号１，２，３，４又
は５記載の反復配列、該配列を用いてコリネホルム細菌
のアミノ酸生合成系の遺伝子をコリネホルム型細菌の染
色体ＤＮＡ中に組み込む方法、及び該方法により得られ
たコリネホルム細菌である。尚、反復配列とは、染色体
ＤＮＡ中に繰り返し存在する塩基配列のことで相互に高
いホモロジ−を有するものをいう。この配列は染色体中
に多数存在する為に、この部分とのホモロガスリコンビ
ネ−ション（Saibo Kogaku 9(1990)269-279）を利用す
ることにより、染色体中に目的とする有用遺伝子（例、
アミノ酸生合成系の遺伝子等）を多コピ−挿入すること
が可能な有用な配列である。
ＤＮＡ中に存在する配列表の配列番号１，２，３，４又
は５記載の反復配列、該配列を用いてコリネホルム細菌
のアミノ酸生合成系の遺伝子をコリネホルム型細菌の染
色体ＤＮＡ中に組み込む方法、及び該方法により得られ
たコリネホルム細菌である。尚、反復配列とは、染色体
ＤＮＡ中に繰り返し存在する塩基配列のことで相互に高
いホモロジ−を有するものをいう。この配列は染色体中
に多数存在する為に、この部分とのホモロガスリコンビ
ネ−ション（Saibo Kogaku 9(1990)269-279）を利用す
ることにより、染色体中に目的とする有用遺伝子（例、
アミノ酸生合成系の遺伝子等）を多コピ−挿入すること
が可能な有用な配列である。
【０００６】本発明者等は各種コリネホルム細菌を培養
し、その染色体ＤＮＡを抽出した。そして染色体ＤＮＡ
をクロ−ニングしそのＤＮＡ配列を決定した結果、５種
類の反復配列を見い出し本発明を完成するに至らしめ
た。本発明を以下に詳細に説明する。
し、その染色体ＤＮＡを抽出した。そして染色体ＤＮＡ
をクロ−ニングしそのＤＮＡ配列を決定した結果、５種
類の反復配列を見い出し本発明を完成するに至らしめ
た。本発明を以下に詳細に説明する。
【０００７】まず、各種コリネホルム細菌から得られた
ＤＮＡ数百マイクログラムを含有する溶液をアルカリを
用いてpH12前後に調整する。その後、適当な酸を用いて
pHを中性付近にもどす。更に塩を加えて最終0.3M前後の
塩濃度に調整後、65℃付近で１分程度加熱後急冷する。
このようにして調製されたフラクションにＳ１ヌクレア
−ゼを反応させ１本鎖ＤＮＡ部分を除去する。この時用
いるヌクレア−ゼはＤＮＡの１本鎖に特異的な酵素であ
ればＳ１ヌクレア−ゼ以外でも用いることは可能であ
る。次に酵素反応後、電気泳動もしくはゲル濾過によ
り、分解されずに残ったＤＮＡ断片を検出し抽出する。
このようにして得られたＤＮＡ断片が染色体中に存在す
る反復配列である。
ＤＮＡ数百マイクログラムを含有する溶液をアルカリを
用いてpH12前後に調整する。その後、適当な酸を用いて
pHを中性付近にもどす。更に塩を加えて最終0.3M前後の
塩濃度に調整後、65℃付近で１分程度加熱後急冷する。
このようにして調製されたフラクションにＳ１ヌクレア
−ゼを反応させ１本鎖ＤＮＡ部分を除去する。この時用
いるヌクレア−ゼはＤＮＡの１本鎖に特異的な酵素であ
ればＳ１ヌクレア−ゼ以外でも用いることは可能であ
る。次に酵素反応後、電気泳動もしくはゲル濾過によ
り、分解されずに残ったＤＮＡ断片を検出し抽出する。
このようにして得られたＤＮＡ断片が染色体中に存在す
る反復配列である。
【０００８】次に抽出されたＤＮＡ断片をプラスミドベ
クタ−に挿入しクロ−ン化する。クロ−ン化されたＤＮ
Ａの構造解析はサンガー等の方法（Proc.Nat.Acad.Sci.
74(1977)5463-5467）に従って行った。このようにして
決定されたＤＮＡ配列は配列表の配列番号１，２，３，
４又は５に記載されている。本発明は配列表の配列番号
１，２，３，４又は５記載のＤＮＡ配列に限定されるも
のではなく、ＤＮＡ配列中の１又は複数個の塩基が他の
塩基に置換されたもの、及び上記配列の５´末端又は３
´末端に１又は複数個の塩基配列が付加されたものも、
呈する作用効果が同等であれば本発明の反復配列に含む
ものとする。
クタ−に挿入しクロ−ン化する。クロ−ン化されたＤＮ
Ａの構造解析はサンガー等の方法（Proc.Nat.Acad.Sci.
74(1977)5463-5467）に従って行った。このようにして
決定されたＤＮＡ配列は配列表の配列番号１，２，３，
４又は５に記載されている。本発明は配列表の配列番号
１，２，３，４又は５記載のＤＮＡ配列に限定されるも
のではなく、ＤＮＡ配列中の１又は複数個の塩基が他の
塩基に置換されたもの、及び上記配列の５´末端又は３
´末端に１又は複数個の塩基配列が付加されたものも、
呈する作用効果が同等であれば本発明の反復配列に含む
ものとする。
【０００９】このようにして得られた配列表の配列番号
１，２又は３記載の反復配列をコリネホルム型細菌内で
複製機能が温度感受性になった変異型プラスミド pHSC
4（このプラスミドを保持するエシェリヒアコリAJ12571
の寄託番号はFERM-P11763である。）に挿入し、コリネ
ホルム細菌に形質転換したところ、高頻度にプラスミド
が染色体中に挿入され、安定に保持されることが観察さ
れた。 このことからも本発明の反復配列はアミノ酸生
産等に関する有用遺伝子を多数染色体中に安定的に導入
でき、又各種アミノ等の有用物質を大量に生産できる有
用なものであることを裏付けている
１，２又は３記載の反復配列をコリネホルム型細菌内で
複製機能が温度感受性になった変異型プラスミド pHSC
4（このプラスミドを保持するエシェリヒアコリAJ12571
の寄託番号はFERM-P11763である。）に挿入し、コリネ
ホルム細菌に形質転換したところ、高頻度にプラスミド
が染色体中に挿入され、安定に保持されることが観察さ
れた。 このことからも本発明の反復配列はアミノ酸生
産等に関する有用遺伝子を多数染色体中に安定的に導入
でき、又各種アミノ等の有用物質を大量に生産できる有
用なものであることを裏付けている
【００１０】本発明に言うコリネホルム細菌とはバ−ヂ
−ズ・マニアル・オブ・デタ−ミネイティブバクテリオ
ロジ−第８版５９９ペ−ジ（１９７４年）に記載されて
いるように好気性のグラム陽性菌桿菌である。
−ズ・マニアル・オブ・デタ−ミネイティブバクテリオ
ロジ−第８版５９９ペ−ジ（１９７４年）に記載されて
いるように好気性のグラム陽性菌桿菌である。
【００１１】本発明において宿主菌として使用できるコ
リネホルム細菌としては、たとえばブレビバクテリウム
・サッカロリティクム ＡＴＣＣ１４０６６、ブレビバ
クテリウム・インマリオフィルム ＡＴＣＣ１４０６
８、ブレビバクテリウム・ラクトファ−メンタム ＡＴ
ＣＣ１３８６９、ブレビバクテリウム・ロゼウム ＡＴ
ＣＣ１３８２５、ブレビバクテリウム・フラバム ＡＴ
ＣＣ１３８２６、コリネバクテリウム・アセトアシドフ
ィルム ＡＴＣＣ１３８７０、コリネバクテリウム・グ
ルタミクム ＡＴＣＣ１３０３２、１３０６０、コリネ
バクテリウム・リリウム ＡＴＣＣ１５９９０等の野生
株、及び上記グルタミン酸生産菌より誘導され、グルタ
ミン酸生産性を失った変異株、更にはリジン等のアミノ
酸、イノシン等の核酸などの他の生産物を生産する変異
株も含まれる。
リネホルム細菌としては、たとえばブレビバクテリウム
・サッカロリティクム ＡＴＣＣ１４０６６、ブレビバ
クテリウム・インマリオフィルム ＡＴＣＣ１４０６
８、ブレビバクテリウム・ラクトファ−メンタム ＡＴ
ＣＣ１３８６９、ブレビバクテリウム・ロゼウム ＡＴ
ＣＣ１３８２５、ブレビバクテリウム・フラバム ＡＴ
ＣＣ１３８２６、コリネバクテリウム・アセトアシドフ
ィルム ＡＴＣＣ１３８７０、コリネバクテリウム・グ
ルタミクム ＡＴＣＣ１３０３２、１３０６０、コリネ
バクテリウム・リリウム ＡＴＣＣ１５９９０等の野生
株、及び上記グルタミン酸生産菌より誘導され、グルタ
ミン酸生産性を失った変異株、更にはリジン等のアミノ
酸、イノシン等の核酸などの他の生産物を生産する変異
株も含まれる。
【００１２】さて、反復配列を用いて染色体中に導入で
きる有用遺伝子としてはインタ−ロイキン２、６等の生
理活性物質をコ−ドする遺伝子でも良いが、通常コリネ
ホルム型細菌における各種アミノ酸（リジン、スレオニ
ン、イソロイシン、グルタミン酸等）の生合成系のキ−
エンザイムに関する遺伝子、具体的にはホモセリン脱水
素酵素、スレオニン・デアミナ−ゼ、アスパラギン酸キ
ナ−ゼ、ホスホエノ−ルピルビン酸カルボキシラ−ゼ等
の遺伝子を用いるのが好ましい。もちろん、上記以外の
遺伝子を用いても良い。
きる有用遺伝子としてはインタ−ロイキン２、６等の生
理活性物質をコ−ドする遺伝子でも良いが、通常コリネ
ホルム型細菌における各種アミノ酸（リジン、スレオニ
ン、イソロイシン、グルタミン酸等）の生合成系のキ−
エンザイムに関する遺伝子、具体的にはホモセリン脱水
素酵素、スレオニン・デアミナ−ゼ、アスパラギン酸キ
ナ−ゼ、ホスホエノ−ルピルビン酸カルボキシラ−ゼ等
の遺伝子を用いるのが好ましい。もちろん、上記以外の
遺伝子を用いても良い。
【００１３】反復配列、及び上記有用遺伝子をのせるプ
ラスミドとしては特に制限はないが通常コリネホルム細
菌由来のプラスミドを用いれば良い。具体的にはpHM151
9(Agric.Biol.Chem.48(1984)2901-2903),pAM330(Agric.
Biol.Chem.48(1984)2901-2903),及びこれらをベースと
した薬剤耐性プラスミド等である．
ラスミドとしては特に制限はないが通常コリネホルム細
菌由来のプラスミドを用いれば良い。具体的にはpHM151
9(Agric.Biol.Chem.48(1984)2901-2903),pAM330(Agric.
Biol.Chem.48(1984)2901-2903),及びこれらをベースと
した薬剤耐性プラスミド等である．
【００１４】反復配列及び目的とする有用遺伝子を有す
る組換プラスミドを上述したコリネホルム細菌に形質転
換する。形質転換法としては通常よく用いられるプロト
プラスト法（Gene,39(1985)281-286）、エレクトロポレ
ーション法（Bio/Technology,7(1989)1067-1070)等の方
法を用いれば良い。また、得られた形質転換体は通常よ
く用いられている方法、条件に従って培養すれば良い。
そうすると有用物質が菌体内又は外に蓄積される。
る組換プラスミドを上述したコリネホルム細菌に形質転
換する。形質転換法としては通常よく用いられるプロト
プラスト法（Gene,39(1985)281-286）、エレクトロポレ
ーション法（Bio/Technology,7(1989)1067-1070)等の方
法を用いれば良い。また、得られた形質転換体は通常よ
く用いられている方法、条件に従って培養すれば良い。
そうすると有用物質が菌体内又は外に蓄積される。
【００１５】
【実施例】以下に、本発明を実施例に基づいて具体的に
説明する。
説明する。
【００１６】（反復配列の検出）ブレビバクテリウムラ
クトフェルメンタム及びブレビバクテリウムフラバムよ
り、Saito-Miuraの方法(BBA,8278,619-629(1963))によ
ってクロモゾームDNAを調製し、それらの300-600μg相
当を1mlのTEバッファー(10mM Tris-HCl,1mMEDTA,pH8.0)
に溶かした。それを0.2規定のNaOHでpHを12.3にあわ
せ、室温で15分放置した後、0.2規定のHClでpHを6.75-
7.10に戻した。4MNaClでNa+濃度を0.3Mにあわせ、65℃,
1分間加熱した後、すばやく冷やし、10倍濃度のS1バッ
ファー(4.5mM ZnCl2,40mMSodiumAcetateBuffer(pH4.6))
を0.1ml加えたのち3本に分け、以後のS1ヌクレアーゼ反
応に供した。S1ヌクレアーゼの反応は、0.1u/μgDNA,1u
/μgDNA,10u/μgDNAの3段階で37℃ 1時間行った。反応
停止はフェノール処理によって行い、そのフェノールは
クロロフォルムで除去した。エタノール沈澱によってDN
Aを回収し、それぞれをアガロースゲル電気泳動にかけ
た。その結果ブレビバクテリウムラクトフェルメンタム
からは9本ブレビバクテリウムフラバムからは3本の、S1
ヌクレアーゼ反応以前には見られなかったバンドが確認
され、それぞれをゲルより回収した。
クトフェルメンタム及びブレビバクテリウムフラバムよ
り、Saito-Miuraの方法(BBA,8278,619-629(1963))によ
ってクロモゾームDNAを調製し、それらの300-600μg相
当を1mlのTEバッファー(10mM Tris-HCl,1mMEDTA,pH8.0)
に溶かした。それを0.2規定のNaOHでpHを12.3にあわ
せ、室温で15分放置した後、0.2規定のHClでpHを6.75-
7.10に戻した。4MNaClでNa+濃度を0.3Mにあわせ、65℃,
1分間加熱した後、すばやく冷やし、10倍濃度のS1バッ
ファー(4.5mM ZnCl2,40mMSodiumAcetateBuffer(pH4.6))
を0.1ml加えたのち3本に分け、以後のS1ヌクレアーゼ反
応に供した。S1ヌクレアーゼの反応は、0.1u/μgDNA,1u
/μgDNA,10u/μgDNAの3段階で37℃ 1時間行った。反応
停止はフェノール処理によって行い、そのフェノールは
クロロフォルムで除去した。エタノール沈澱によってDN
Aを回収し、それぞれをアガロースゲル電気泳動にかけ
た。その結果ブレビバクテリウムラクトフェルメンタム
からは9本ブレビバクテリウムフラバムからは3本の、S1
ヌクレアーゼ反応以前には見られなかったバンドが確認
され、それぞれをゲルより回収した。
【００１７】（反復配列のクローニング）回収したDNA
をT4DNAポリメラーゼによって処理し、両端を平滑末端
にした。一方ベクターpUC18(Yanish-Perron,C.,Vieira,
J. and Messing,J.,Gene 33(1985)103-119)をSmaＩで切
断し、両者をT4DNAライゲースで接続した。エシェリヒ
アコリJM109にトランスフォメーションし、X-gal(5-bro
mo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside )を含
むL-brothプレートで白いコロニーを形成するものを選
び、それらの中から５種類のインサートDNAを持つクロ
ーンを取得した。それらをプローブとして、起源である
クロモゾームDNAに対しサザンハイブリダイゼーション
を行ったところ、３種類について(RS410,RS479,RS656)
(なお、RS410を含むpUC18を持つエシェルヒアコリをAJ1
2620(FERM P-12330),RS479を含むpUC18を持つエシェル
ヒアコリをAJ12621(FERM P-12331),RS656を含むpUC18を
持つエシェルヒアコリをAJ12622(FERM P-12332)として
寄託した。)、それらがクロモゾーム中に１０コピー程
度存在することが確認された。この３種類についてダイ
デオキシ法でシークエンスを決定した。結果を配列表の
配列番号１,２,３に示す。
をT4DNAポリメラーゼによって処理し、両端を平滑末端
にした。一方ベクターpUC18(Yanish-Perron,C.,Vieira,
J. and Messing,J.,Gene 33(1985)103-119)をSmaＩで切
断し、両者をT4DNAライゲースで接続した。エシェリヒ
アコリJM109にトランスフォメーションし、X-gal(5-bro
mo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside )を含
むL-brothプレートで白いコロニーを形成するものを選
び、それらの中から５種類のインサートDNAを持つクロ
ーンを取得した。それらをプローブとして、起源である
クロモゾームDNAに対しサザンハイブリダイゼーション
を行ったところ、３種類について(RS410,RS479,RS656)
(なお、RS410を含むpUC18を持つエシェルヒアコリをAJ1
2620(FERM P-12330),RS479を含むpUC18を持つエシェル
ヒアコリをAJ12621(FERM P-12331),RS656を含むpUC18を
持つエシェルヒアコリをAJ12622(FERM P-12332)として
寄託した。)、それらがクロモゾーム中に１０コピー程
度存在することが確認された。この３種類についてダイ
デオキシ法でシークエンスを決定した。結果を配列表の
配列番号１,２,３に示す。
【００１８】（得られたシークエンスとDNAデーターベ
ースとのホモロジー検索）得られたシークエンスとDNA
データーベース(GENBANK)とでプログラムideasを用いホ
モロジー検索を行った。RS410についてエシェリヒアコ
リのIS15deltaと強いホモロジーがあることが分かっ
た。さらに両者のアラインメントにより、このRS410
は、本来クロモゾーム上で両端にインバーティッドリピ
ートを持つIS配列（ insertion sequence，挿入配
列）の一部と考えられ、さらにこのRS410をプローブと
して、ブレビバクテリウムラクトフェルメンタムのライ
ブラリーからスクリーニングを行った。得られたクロー
ンについてダイデオキシ法でシークエンスを決定したと
ころ、このクローンは、配列表の配列番号４に示す、両
端にインバーティッドリピートを保持するIS様配列を含
むことが分かった。また、得られたクローンは、配列番
号４に示す配列の他に、配列番号１と約８０％のホモロ
ジーのある配列が発見された。この配列を配列番号５に
示す。配列番号４と配列番号５の配列を含むＤＮＡ断片
が挿入されたプラスミドを保持するエシェルヒアコリを
AJ12623(FERM P-12333）として寄託した。
ースとのホモロジー検索）得られたシークエンスとDNA
データーベース(GENBANK)とでプログラムideasを用いホ
モロジー検索を行った。RS410についてエシェリヒアコ
リのIS15deltaと強いホモロジーがあることが分かっ
た。さらに両者のアラインメントにより、このRS410
は、本来クロモゾーム上で両端にインバーティッドリピ
ートを持つIS配列（ insertion sequence，挿入配
列）の一部と考えられ、さらにこのRS410をプローブと
して、ブレビバクテリウムラクトフェルメンタムのライ
ブラリーからスクリーニングを行った。得られたクロー
ンについてダイデオキシ法でシークエンスを決定したと
ころ、このクローンは、配列表の配列番号４に示す、両
端にインバーティッドリピートを保持するIS様配列を含
むことが分かった。また、得られたクローンは、配列番
号４に示す配列の他に、配列番号１と約８０％のホモロ
ジーのある配列が発見された。この配列を配列番号５に
示す。配列番号４と配列番号５の配列を含むＤＮＡ断片
が挿入されたプラスミドを保持するエシェルヒアコリを
AJ12623(FERM P-12333）として寄託した。
【００１９】（反復配列を利用したクロモゾーム内への
遺伝子組み込み）複製機能が温度感受性になった変異型
プラスミドpHSC4の、複製とは関係ない位置に存在する
制限酵素PstＩ部位にRS410を両者ともDNAポリメラーゼ
処理による平滑末端ライゲーションによって挿入した。
詳細を図１に示す。ここで作成したpHRS410をエレクト
ロポレーションによってブレビバクテリウムラクトファ
ーメンタムならびにコリネバクテリウムグルタミカムに
導入した。得られた株を25℃ で培養し、その後34℃ に
上げることによってプラスミドキュアリング（保持して
いるプラスミドを脱落させること。）したところ、pHSC
410を保持する株は、ベクターであるpHSC4を保持する株
に比べて有意に多数のクロラムフェニコール耐性株が出
現した（表１）。これはRS410がクロモゾームとホモロ
ガスレコンビネーションを起こすことによって、クロラ
ムフェニコール耐性遺伝子がクロモゾーム内に入り込ん
だためと考えられる。出現したクロラムフェニコール耐
性菌からクロモゾームDNAを抽出し、サザンハイブリダ
イゼーションによってクロラムフェニコール耐性遺伝子
の挿入を調べたところ、遺伝子の挿入があることが確認
された。
遺伝子組み込み）複製機能が温度感受性になった変異型
プラスミドpHSC4の、複製とは関係ない位置に存在する
制限酵素PstＩ部位にRS410を両者ともDNAポリメラーゼ
処理による平滑末端ライゲーションによって挿入した。
詳細を図１に示す。ここで作成したpHRS410をエレクト
ロポレーションによってブレビバクテリウムラクトファ
ーメンタムならびにコリネバクテリウムグルタミカムに
導入した。得られた株を25℃ で培養し、その後34℃ に
上げることによってプラスミドキュアリング（保持して
いるプラスミドを脱落させること。）したところ、pHSC
410を保持する株は、ベクターであるpHSC4を保持する株
に比べて有意に多数のクロラムフェニコール耐性株が出
現した（表１）。これはRS410がクロモゾームとホモロ
ガスレコンビネーションを起こすことによって、クロラ
ムフェニコール耐性遺伝子がクロモゾーム内に入り込ん
だためと考えられる。出現したクロラムフェニコール耐
性菌からクロモゾームDNAを抽出し、サザンハイブリダ
イゼーションによってクロラムフェニコール耐性遺伝子
の挿入を調べたところ、遺伝子の挿入があることが確認
された。
【００２０】
【表１】
【００２１】
【発明の効果】以上のように本発明では、コリネホルム
細菌の染色体ＤＮＡ中に存在する反復配列を用いて、ホ
モロガスリコンビネーションを生じさせることにより、
外来より導入する有用遺伝子等をコリネホルム細菌の染
色体ＤＮＡ中に、安定に保持させることができる。又本
発明は上記方法により育種されたコリネホルム細菌を用
いることでコンスタントにアミノ酸等の物質を生産する
方法を提供するものである。
細菌の染色体ＤＮＡ中に存在する反復配列を用いて、ホ
モロガスリコンビネーションを生じさせることにより、
外来より導入する有用遺伝子等をコリネホルム細菌の染
色体ＤＮＡ中に、安定に保持させることができる。又本
発明は上記方法により育種されたコリネホルム細菌を用
いることでコンスタントにアミノ酸等の物質を生産する
方法を提供するものである。
【００２２】
【配列表】 配列番号：１ 配列の長さ：410 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：フ゛レヒ゛ハ゛クテリウムラクトファーメンタム
（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍ
ｅｎｔｕｍ） 株名：ＢＰ−７３４ 配列の特徴 特徴を表す記号：insertion-seq 特徴を決定した方法：Ｓ 配列： GCAGCGTCTT GGCCAGGAAA CGCTTGGCCG CCGCGACGTT GCGCTTCGGG GAGAGGTAAA 60 AGTCCAGGGT CTGGCCGCGG TGATTGCCGA TAGAGTAGCA CACTGCGCGA CCGGATATAG 120 GACTGTCCAC CGCAGGACCG GGCCTCCAGT CAGGAACTTG CCGATACCAC CGGGTCTGCT 180 TGTCCAGTTC GGGAGCATAT TTCTGCACCC AGCGGTAGAT CGTGGTGTGA TCAACCGGCA 240 CACCACGCTC GGTCATCATT TCCTCCAGGT CGCGGTAGCT CACAAGTACG GCCAGTACCA 300 CCGCACTGCC CACAGAATGA TGTCACGGGG GAAATGACGA CCGGAGAAGA TACCCATGGC 360 CCTGATTATT TCACGCCGGT CTTCCTACTG CCCCAACTTT GCAACAGCAC 420
（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍ
ｅｎｔｕｍ） 株名：ＢＰ−７３４ 配列の特徴 特徴を表す記号：insertion-seq 特徴を決定した方法：Ｓ 配列： GCAGCGTCTT GGCCAGGAAA CGCTTGGCCG CCGCGACGTT GCGCTTCGGG GAGAGGTAAA 60 AGTCCAGGGT CTGGCCGCGG TGATTGCCGA TAGAGTAGCA CACTGCGCGA CCGGATATAG 120 GACTGTCCAC CGCAGGACCG GGCCTCCAGT CAGGAACTTG CCGATACCAC CGGGTCTGCT 180 TGTCCAGTTC GGGAGCATAT TTCTGCACCC AGCGGTAGAT CGTGGTGTGA TCAACCGGCA 240 CACCACGCTC GGTCATCATT TCCTCCAGGT CGCGGTAGCT CACAAGTACG GCCAGTACCA 300 CCGCACTGCC CACAGAATGA TGTCACGGGG GAAATGACGA CCGGAGAAGA TACCCATGGC 360 CCTGATTATT TCACGCCGGT CTTCCTACTG CCCCAACTTT GCAACAGCAC 420
【００２３】配列番号：２ 配列の長さ:479 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：フ゛レヒ゛ハ゛クテリウムフラハ゛ム(Brevibacterium flavu
m) 株名：ATCC 14067 配列： GTGTAAATTA ATTCCAGTCA GCGCGACCAA CAACGCCCCA ACACATAAGA GATTATGTGG 60 ACAGTGAGGC GGATCTAGGA AAACAAACGC TCGACAAACC AACAACACTT CATCGAAGTC 120 AACCAAACAC CGATTTCGTA AGTAAAGATG AAGTAACGTT GAACAAGCTG CCAACAAGAC 180 ACCAACAAAC AAATGTTGAT GATCTTATGG TGTGCGTATG TTGTTTGAGA ACTCAATAGT 240 GTGCCATTTA TTATTTTTGT CACTACCACT CTTAACCCCT TGAGGGTTTT GGTGGTGGGT 300 CATGCCGGGT GGTGGATCGC CAATATTTAT CCATCACTGT AAACAATAAC CAATATTTGT 360 TGGCATGATT TGTGGTCTCT TGTTCCCGTC AAGGATCAGG CCCACATGAA AGACACGATG 420 AATCCTTATG TGGGTTGTGG TGTTTTTTTA AATCATTATT TTTTGATAAT GCCAGTAAC 479
m) 株名：ATCC 14067 配列： GTGTAAATTA ATTCCAGTCA GCGCGACCAA CAACGCCCCA ACACATAAGA GATTATGTGG 60 ACAGTGAGGC GGATCTAGGA AAACAAACGC TCGACAAACC AACAACACTT CATCGAAGTC 120 AACCAAACAC CGATTTCGTA AGTAAAGATG AAGTAACGTT GAACAAGCTG CCAACAAGAC 180 ACCAACAAAC AAATGTTGAT GATCTTATGG TGTGCGTATG TTGTTTGAGA ACTCAATAGT 240 GTGCCATTTA TTATTTTTGT CACTACCACT CTTAACCCCT TGAGGGTTTT GGTGGTGGGT 300 CATGCCGGGT GGTGGATCGC CAATATTTAT CCATCACTGT AAACAATAAC CAATATTTGT 360 TGGCATGATT TGTGGTCTCT TGTTCCCGTC AAGGATCAGG CCCACATGAA AGACACGATG 420 AATCCTTATG TGGGTTGTGG TGTTTTTTTA AATCATTATT TTTTGATAAT GCCAGTAAC 479
【００２４】配列番号：３ 配列の長さ:656 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：フ゛レヒ゛ハ゛クテリウムラクトファーメンタム(Brevibacterium l
actofermentum) 株名：BP-734 配列： TAGGGTTGCG CGGATCATGC GTGAACTCAA ACTGTTTGGC TACACCAAGA AACGCAAGGT 60 CACCACCACC GTGTCAGATC AGAAGAAACC AGTTGTCCCT GACCTTGTCG GTCCGTAAAT 120 TATCCGACAG CCGAACCAGG TTACGTCGTG ACATTACCTA TCTGCCGATT GCAGATGGGT 180 CGAATATGTA CTTGGCTACG GTCATTGATT GCTATTCCCG GCGGCTGGTT GGCTTCGCGA 240 TCGCCGATCA CATGCGCACA TCACTGGTGC AGGCATGCGC TGGTGATGGC CAAAGCGCGA 300 GGGAGCATGA AGGAAGCAAT TTTCCACTCG AACCACGGCA GTGTGTACAC ATCGAATGCG 360 TTCCAGGACA CCTGCACCCA GTTCCCCATC AGGCAGTCGA TGGATCAATT GGACCAGTCG 420 ANNNTTGNGG AGTCGTTCAA CGCGGCCTGA AGAGGGAAGT CCTTCAAGAT TCCAAGACCT 480 TTGCCAACCA GATGATCTGC CGGCGGGATG TTTTCCGCTG GTGTACNCGC GTTACAACAC 540 GGTCGCCGAC ATTCCAGATG TAAATATCTG CTCCTNTGTN TTTAGACNTG TCCTGCTATC 600 CTAAGATCTG CTTCTTGATT AAATCCTCCT GTCCACTTCC CGGGGGTCGG GCCCTT 656
actofermentum) 株名：BP-734 配列： TAGGGTTGCG CGGATCATGC GTGAACTCAA ACTGTTTGGC TACACCAAGA AACGCAAGGT 60 CACCACCACC GTGTCAGATC AGAAGAAACC AGTTGTCCCT GACCTTGTCG GTCCGTAAAT 120 TATCCGACAG CCGAACCAGG TTACGTCGTG ACATTACCTA TCTGCCGATT GCAGATGGGT 180 CGAATATGTA CTTGGCTACG GTCATTGATT GCTATTCCCG GCGGCTGGTT GGCTTCGCGA 240 TCGCCGATCA CATGCGCACA TCACTGGTGC AGGCATGCGC TGGTGATGGC CAAAGCGCGA 300 GGGAGCATGA AGGAAGCAAT TTTCCACTCG AACCACGGCA GTGTGTACAC ATCGAATGCG 360 TTCCAGGACA CCTGCACCCA GTTCCCCATC AGGCAGTCGA TGGATCAATT GGACCAGTCG 420 ANNNTTGNGG AGTCGTTCAA CGCGGCCTGA AGAGGGAAGT CCTTCAAGAT TCCAAGACCT 480 TTGCCAACCA GATGATCTGC CGGCGGGATG TTTTCCGCTG GTGTACNCGC GTTACAACAC 540 GGTCGCCGAC ATTCCAGATG TAAATATCTG CTCCTNTGTN TTTAGACNTG TCCTGCTATC 600 CTAAGATCTG CTTCTTGATT AAATCCTCCT GTCCACTTCC CGGGGGTCGG GCCCTT 656
【００２５】配列番号：４ 配列の長さ:589 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：フ゛レヒ゛ハ゛クテリウムラクトファーメンタム(Brevibacterium l
actofermentum) 株名：BP-734 配列： GGATCCGTTT CAGCCGCCCA TGATCTCCTT CAATGACGTT ATTGAGGTAT TTCACCTGCC 60 GGTGTTCCAC GGTCTGCGGC AGATTCCCTC TGACTTCAAC TCGGCGATTG CCTGGCAGGA 120 GGGTGCTTTA TCGGTGTTGA TCACCGCGGG GACCCGGTTA TCGTGTTCGA CCTCAGGTCT 180 TGGCCAGGAA ACGCTTCGCT GCGGCGACGT TACGCTTTGG GGACAGGTAA AAATCCAGGG 240 TATTGCCCGC CCGCTGTGAT GGCCCGATAG AGGTAGCACC ACTTTCCCGA TCCGATATAG 300 GTCTCATCCA CCCGCAGGAA GTGGCCTGCC AATCCGGGAC TTGTCGGTAC CACCGGGTCT 360 GCTTGTCCAG CTCAGGAGCA TATTTCTGGA CCAGCGGTAG ATGGTGCTGT GATCGACGGT 420 ACGCAGCGTT CGGTCATTTC TTCCAGATCG CGGTAGCTGA GCNCCGTAGC GGCAGTACCA 480 CCGACCGCCC ACAGGATGAT TTCACGGGGG AAATGACGAC CGGAGAAGAT GCCCATGGCT 540 GTGATTATTT CACGCAGGTC TTCCTGTCGC CCGAACTTTG CAACAGCAC 589
actofermentum) 株名：BP-734 配列： GGATCCGTTT CAGCCGCCCA TGATCTCCTT CAATGACGTT ATTGAGGTAT TTCACCTGCC 60 GGTGTTCCAC GGTCTGCGGC AGATTCCCTC TGACTTCAAC TCGGCGATTG CCTGGCAGGA 120 GGGTGCTTTA TCGGTGTTGA TCACCGCGGG GACCCGGTTA TCGTGTTCGA CCTCAGGTCT 180 TGGCCAGGAA ACGCTTCGCT GCGGCGACGT TACGCTTTGG GGACAGGTAA AAATCCAGGG 240 TATTGCCCGC CCGCTGTGAT GGCCCGATAG AGGTAGCACC ACTTTCCCGA TCCGATATAG 300 GTCTCATCCA CCCGCAGGAA GTGGCCTGCC AATCCGGGAC TTGTCGGTAC CACCGGGTCT 360 GCTTGTCCAG CTCAGGAGCA TATTTCTGGA CCAGCGGTAG ATGGTGCTGT GATCGACGGT 420 ACGCAGCGTT CGGTCATTTC TTCCAGATCG CGGTAGCTGA GCNCCGTAGC GGCAGTACCA 480 CCGACCGCCC ACAGGATGAT TTCACGGGGG AAATGACGAC CGGAGAAGAT GCCCATGGCT 540 GTGATTATTT CACGCAGGTC TTCCTGTCGC CCGAACTTTG CAACAGCAC 589
【００２６】配列番号：５ 配列の長さ:656 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：フ゛レヒ゛ハ゛クテリウムラクトファーメンタム(Brevibacterium l
actofermentum) 株名：BP-734 配列の特徴 配列を表す記号：insertion-seq 特徴を決定した方法：Ｓ 配列： GTGCTGTTGC AAAGTTGGGC GGAGAGCAGC GAAGACTCAG TTCTCATCCT GATCGCGCTG 60 CGTGTGCGTG TAGCGTCTCG AAGACCGGTT GACGATCACG TGTCGGTTCG TTGCCCGTGA 120 GGTCAAACAT CGTGCCTTGC CCTTTCCGCA ATGAGTGCAT CGCCTCCATC CCTTTCAACG 180 TCCGATATGC AGATGTCTAA GTTCTTAAAC GCCTTTCGGC CCGAGGATCC GCTTCAGCCG 240 ACCATGGTGC CTTCCAGGAT GTTGTTGAGG TATTTCACCT GCCGGTGTTC CACTGTTAGC 300 GAGCAGATTC CCTCTGACTT CAACTCGGCG ATTGCCTGGC TAGAGACGGT GCTTATCGGT 360 GTTGATCACN CTGGGATACC CGGCTGACGC ATTGGATCTG AGGGCCTTGG CAGGAAAGCG 420 TTCGCTGCGG CCACGTTCCG TTTTGGTGAG AGGTAAAGTC CAGGGTCTTG GCCACCGGCG 480 GTATCGCAGA TCAGAGGTAG CACCACCTGC ATGCCGACCC GATATACTCT CATCACCTCA 540 GAACTTAGCT GCAGTCAGTA CTGCGTACAC GTGTTTGCTT GTCAGCTCAG ATCGCATTCT 600 GACCAGCGGT GAGATCGTGG TGTGATCAAC GGTACGCCAG CTGAAGTCAT CATTCTCAAG 660 TCGCGGTAGC TCACCGTAGC GCGAGTGACC TGACGCACGG CCACAGAATG ATGTCACGGG 720 AAACGACGAC GGAGACGATA CCCATGGCTG TGATTATTTC ACGTCGCTCT TCCTACTGCC 780 CCAACTTTGC AACAACAC 798
actofermentum) 株名：BP-734 配列の特徴 配列を表す記号：insertion-seq 特徴を決定した方法：Ｓ 配列： GTGCTGTTGC AAAGTTGGGC GGAGAGCAGC GAAGACTCAG TTCTCATCCT GATCGCGCTG 60 CGTGTGCGTG TAGCGTCTCG AAGACCGGTT GACGATCACG TGTCGGTTCG TTGCCCGTGA 120 GGTCAAACAT CGTGCCTTGC CCTTTCCGCA ATGAGTGCAT CGCCTCCATC CCTTTCAACG 180 TCCGATATGC AGATGTCTAA GTTCTTAAAC GCCTTTCGGC CCGAGGATCC GCTTCAGCCG 240 ACCATGGTGC CTTCCAGGAT GTTGTTGAGG TATTTCACCT GCCGGTGTTC CACTGTTAGC 300 GAGCAGATTC CCTCTGACTT CAACTCGGCG ATTGCCTGGC TAGAGACGGT GCTTATCGGT 360 GTTGATCACN CTGGGATACC CGGCTGACGC ATTGGATCTG AGGGCCTTGG CAGGAAAGCG 420 TTCGCTGCGG CCACGTTCCG TTTTGGTGAG AGGTAAAGTC CAGGGTCTTG GCCACCGGCG 480 GTATCGCAGA TCAGAGGTAG CACCACCTGC ATGCCGACCC GATATACTCT CATCACCTCA 540 GAACTTAGCT GCAGTCAGTA CTGCGTACAC GTGTTTGCTT GTCAGCTCAG ATCGCATTCT 600 GACCAGCGGT GAGATCGTGG TGTGATCAAC GGTACGCCAG CTGAAGTCAT CATTCTCAAG 660 TCGCGGTAGC TCACCGTAGC GCGAGTGACC TGACGCACGG CCACAGAATG ATGTCACGGG 720 AAACGACGAC GGAGACGATA CCCATGGCTG TGATTATTTC ACGTCGCTCT TCCTACTGCC 780 CCAACTTTGC AACAACAC 798
【提出日】平成５年７月２０日
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】変更
【補正内容】
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１には、反復配列ＲＳ４１０を、温度感受
性複製起点を有する変異型プラスミドpHSC4のPstＩ部位
に導入した手順を示した。なおRS410の両端にはpUC18由
来のMultiple Clonig Siteの配列が付着している。
性複製起点を有する変異型プラスミドpHSC4のPstＩ部位
に導入した手順を示した。なおRS410の両端にはpUC18由
来のMultiple Clonig Siteの配列が付着している。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:01）
Claims (7)
- 【請求項１】 コリネホルム細菌の染色体ＤＮＡ中に存
在する配列表の配列番号１記載の塩基配列。 - 【請求項２】 コリネホルム細菌の染色体ＤＮＡ中に存
在する配列表の配列番号２記載の塩基配列。 - 【請求項３】 コリネホルム細菌の染色体ＤＮＡ中に存
在する配列表の配列番号３記載の塩基配列。 - 【請求項４】 コリネホルム細菌の染色体ＤＮＡ中に存
在する配列表の配列番号４記載の塩基配列。 - 【請求項５】 コリネホルム細菌の染色体ＤＮＡ中に存
在する配列表の配列番号５記載の塩基配列。 - 【請求項６】 請求項１乃至５記載の塩基配列を用いて
コリネホルム細菌由来のアミノ酸生合成系の遺伝子をコ
リネホルム型細菌の染色体ＤＮＡに組み込む方法。 - 【請求項７】 請求項６記載の方法により得られたコリ
ネホルム細菌。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP17844991A JP3341286B2 (ja) | 1991-07-18 | 1991-07-18 | コリネホルム細菌由来の反復ｄｎａ配列 |
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP17844991A JP3341286B2 (ja) | 1991-07-18 | 1991-07-18 | コリネホルム細菌由来の反復ｄｎａ配列 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0614782A true JPH0614782A (ja) | 1994-01-25 |
| JP3341286B2 JP3341286B2 (ja) | 2002-11-05 |
Family
ID=16048717
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP17844991A Expired - Fee Related JP3341286B2 (ja) | 1991-07-18 | 1991-07-18 | コリネホルム細菌由来の反復ｄｎａ配列 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3341286B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2006008102A1 (de) * | 2004-07-20 | 2006-01-26 | Basf Aktiengesellschaft | P2-10-expressionseinheiten |
-
1991
- 1991-07-18 JP JP17844991A patent/JP3341286B2/ja not_active Expired - Fee Related
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2006008102A1 (de) * | 2004-07-20 | 2006-01-26 | Basf Aktiengesellschaft | P2-10-expressionseinheiten |
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| Publication number | Publication date |
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| JP3341286B2 (ja) | 2002-11-05 |
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