JPH0570608B2

JPH0570608B2 -

Info

Publication number: JPH0570608B2
Application number: JP17675783A
Authority: JP
Inventors: Mitsuru Hashida; Hitoshi Sezaki
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1983-09-24
Filing date: 1983-09-24
Publication date: 1993-10-05
Also published as: JPS6067433A

Description

【発明の詳細な説明】

本発明はマイトマイシン類、多糖類及び抗体を
結合させて得られる複合体に関する。さらに詳し
くは本発明はマイトマイシン類と多糖類との結合
体と、抗体とが一般式

【化】

【化】もしくは

【化】（式中、ｎは３〜７の整数を、Ｒは低級アルキ
ル基を表わす。又各左端のＯは多糖類の水酸基の
Ｏを、右端のNHは抗体のアミノ基のNHを示
す。）で表わされる基、一般式

【化】（式中、ｎ，Ｒ、左端のＯ、右端のNHは前記
と同義である）で表わされる基、又は上記，
の一般式中の（CH₂）_oで表わされるメチレン鎖
のいずれかの水素が低級アルキル基で置換した基
により結合した、マイトマイシン類、多糖類及び
抗体とからなる抗腫瘍用複合体に関する。ただし、上記でマイトマイシン類と多糖類との
結合体とはマイトマイシン類と多糖類とが′一
般式

【式】

【式】もしくは

【式】（式中、ｎは前記と同様であり、左端のＮはマ
イトマイシン類のイミノ基のＮを右端のＯは多糖
類の水酸基のＯを示す）で表わされる基、′一
般式Ｎ−CO−（CH₂）_o−Ｏ− （式中、ｎ、左端のＮ、右端のＯは前記と同義
である）で表わされる基、又は′上記′，′
の一般式中の（CH₂）_oで表わされるメチレン鎖の
いずれかの水素が低級アルキル基で置換した基に
より結合した結合体をいうものとする。本発明の複合体においてはマイトマイシン類と
多糖類との結合体にさらに抗体が結合している点
に特徴を有する。抗体として例えば抗α−フエト
プロテイン抗体などの抗腫瘍抗体を用いる場合、
いわゆるミサイル療法を適用できるメリツトがあ
る。従来、多糖類の水酸基に結合させたスペーサー
にマイトマイシン類を結合させた結合体について
は本出願人による出願がある。（特開昭54−
97691）。該特開昭ではスペーサー部は

【式】

【式】等であると考えられる。また上記でスペーサー部がＮ−CO−（CH₂）_o−Ｏ− である結合体については本出願と同日付の本出願
人による出願（特開昭60−67503）がある（発明
の名称：マイトマイシン類と多糖類との結合体）。次に本発明をさらに詳しく説明する。本発明で使用するマイトマイシン類としてはイ
ミノ基（アジリジン環イミノ基）を有するもので
あればいずれでもよく、マイトマイシンＡ、マイ
トマイシンＣ、これらのアジリジンＨ以外の部位
の誘導体が用いられる。多糖類としてはデキストラン、セルロース、ア
ガロース、アルギン酸等が用いられる。マイトマイシン類と多糖類との結合体の製造は
特開昭54−97691、前記同日付別出願に記載され
ている。次に抗体としては生体内に相対する抗原が存在
し、かつそれ自身又は抗原との相互作用により重
篤な症状をおこすものでないならばいずれでもよ
いが、本発明の目的から特に抗腫瘍抗体が好まし
い。抗腫瘍抗体としては公知の種々のもの、例え
ば抗α−フエトプロテイン、CEA（カルチノエン
ブリオテイツクアンチジエン）、HCG（ヒユーマ
ンコリオジエニツクゴナドトロピン）などが使用
可能である。本発明の複合体は次の方法によつて得ることが
できる。 (1) マイトマイシン類と多糖類との結合体に−
SH基の導入 (1)−１結合体にアミノ基の導入結合体中にはマイトマイシン類との結合に使用
されていないスペーサー部分、すなわち一般式

【式】

【式】もしくは

【式】（式中、ｎ、左端のＯは前記と同義である）で
表わされる基、又は一般式 −Ｏ−（CH₂）_o−CO₂Ｈ（式中、ｎ、左端のＯは前記と同義である）で
表わされる基、又は上記，の一般式中の
（CH₂）_oで表わされるメチレン鎖のいずれかの水
素が低級アルキル基で置換した基が存在する。し
たがつて、まずこの基に低級アルキレンジアミン
を作用させて上記各式右端末端のカルボキシル基
を−CONH−Ｒ−NH₂（式中、Ｒは前記と同義で
ある）にする。マイトマイシン類と多糖類との結合体を P₁
−CO₂Ｈ（ただしCO₂Ｈはスペーサー部末端のCO₂
Ｈを示す）で表わすなら上記反応は次にごとく表
わされる。 P₁ −CO₂Ｈ＋Ｒ（NH₂）₂→ P₁ −CONH−Ｒ
−NH₂ 低級アルキレンジアミンにおける低級アルキレ
ンとしては炭素数２〜６の直鎖もしくは分枝状の
ものが好適に用いられる。例えばエチレンジアミ
ン、プロピレンジアミン、テトラメチレンジアミ
ン、ヘキサメチレンジアミン等が用いられる。上記反応は水系媒体中、適当な縮合剤の存在下
に通常室温、PH６〜８で５〜50時間行う。水系媒体とは水又は水とメタノール、エタノー
ル等の低級アルコール、アセトン、テトラヒドロ
フラン等との混合溶媒、又緩衝溶液を意味する。
縮合剤としては例えば１−エチル−３−（３−ジ
メチルアミノプロピル）カルボジイミド等が用い
られる。上記反応は又結合体製造の中間体たる多糖類と
スペーサーとの結合したものにマイトマイシン類
を結合させるに際し、低級アルキレンジアミンを
共存させることにより一段階で行つてもよい。こ
の場合の反応条件も上記と同様でよい。反応終了後限外過で未反応物を除去する。 (1)−２ −Ｓ−Ｓ−基の導入

【化】アミノ化結合体に３−（２−ピリジルジチオ）
プロピオン酸Ｎ−サクシミジル（以下SPDPとい
う）を反応させて結合体に−Ｓ−Ｓ−基を導入す
る。該反応は水系媒体中、通常室温、PH６〜８で
10分〜３時間行う。水系媒体としては前記のもの
が用いられる。反応終了後透析等により生成物を精製する。 (1)−３ −Ｓ−Ｓ−→−SH

【化】ジスルフイド化結合体を還元してメルカプト結
合体とする。−Ｓ−Ｓ−を−SHとする公知の還元
手法を適用するが、ジチオスレイトール
（dithiothreitol）による還元が特に好適である。
ジチオスレイトールを用いる場合、反応はジスル
フイド結合体とジチオスレイトールとを水系媒体
中、通常室温下、PH６〜８で５分〜３時間反応さ
せることにより行う。 (1)−２で透析後の溶液にジチオスレイトール水
溶液を添加して反応を行つてもよい。反応終了後透析等によりメルカプト結合体を精
製する。 (2) 抗体に−Ｓ−Ｓ−基の導入

【化】（式中、P₂−NH₂は抗体を示す）抗体にSPDPを反応させて−Ｓ−Ｓ−基を導入
する。反応条件は前記(1)−２の場合と同様でよ
い。反応終了後透析等により精製する。 (3) メルカプト結合体とジスルフイド抗体との反
応（目的複合体の生成）

【化】反応は水系媒体中、通常室温下PH６〜８で１〜
20時間行う。水系媒体としては前記と同様にもの
が使用できるが、特に緩衝溶液が好ましい。透析
終了後のメルカプト結合体溶液およびジスルフイ
ド抗体溶液を混合して反応を行つてもよい。反応終了後、ゲル過等により精製する。本発明のマイトマイシン類、多糖類及び抗体の
複合体の薬剤的、薬理的性質をスペーサーとして
６−アミノヘキサン酸を用いて得られるデキスト
ラン・マイトマイシンＣ結合体と抗体としても抗
ヒト赤血球Igg（フルオレツセンイソチオシアネー
トでラベル）とから得られる複合体（実施例１の
もの）の場合について以下に示す。 (1) 放出速度 37℃、PH7.4リン酸緩衝液中での複合体からの
マイトマイシンＣの放出は一次速度式に従つて放
出され（つまり直線関係）、半減期は約24時間で
ある。これは抗体結合のない場合とほぼ同様であ
る。 (2) 抗腫瘍活性マウス L1210 leukemiaを用いたin vitroで
の抗腫瘍活性を調べた結果は次の通りであり、マ
イトマイシンＣと同等である。薬物濃度生長阻害（μg／ml、マイトマイシンＣ当量）（％）複合体 0.05 31.1 0.5 85.1 マイトマイシンＣ 0.05 43.2 0.5 75.7 (3) 抗体活性抗原としてヒト赤血球、補体としてモルモツト
補体を用いて、溶血反応を指標に抗体価の検定を
行つた。50％溶血を起こす濃度で比較すると、複
合体はもとの抗体の85.6％の活性を保つており、
合成後も補体系関与の活性がほぼ維持されている
ことが明らかとなつた。次に本発明のマイトマイシン類、多糖類及び抗
体の複合体の製造を実施例により説明する。実施例１１−(1) スペーサーを６−アミノヘキサン酸とす
るマイトマイシンＣ、デキスラン結合体にメル
カプト基の導入デキストランと６−アミノヘキサン酸との反応
中間体（特開昭54−97691に製造例がある）100
mg、マイトマイシンC10mg、エチレンジアミン
0.43mg、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノ
プロピル）カルボジイミド塩酸塩300mgをPH7.5の
リン酸緩衝液10mlに溶解し、室温で24時間反応
後、PH９の炭酸ナトリウム水溶液で２万カツトの
限外過膜を用いて限外過して未反応物を除去
する。次に0.3mlエタノール中のSPDP4.46mgを加え23
℃で30分反応させる。反応終了後、0.1Mトリス塩酸緩衝液0.5mlを加
え、0.1MPH7.5リン酸緩衝液で透析する。次に40mMジチオスレイトールを添加し23℃で
20分反応させ、PH4.5のアセトン緩衝液で透析す
る。１−(2) 抗体に−Ｓ−Ｓ−基導入抗体としてFITCでラベルした抗ヒト赤血球
Iggを用いる。抗体150mgをリン酸緩衝液10mlに溶
解し、エタノール中のSPDP1.95mgを加え、23℃
で30分反応させる。ついで0.1Mトリス塩酸緩衝
液0.5mlを加え、0.1MPH7.5のリン酸緩衝液で透析
する。１−(3) 複合体の生成１−(1)，１−(2)の生成物をPH7.5のリン酸緩衝
液中室温で約10時間反応させる。１−(4) 精製（ゲル過）反応終了液をセフアデツクスＧ−200で分画し、
未反応抗体を分離し、複合体分画をvoidvolume
分画として得る（第１図）。さらにセフアデツク
ス4Bで再分画し、３つのピークを得る（第２図）
第１のピーク（void volume）はマイトマイシン
Ｃとデキストランとの結合体と、抗体との重合体
である。第２のピークは目的とする複合体であ
る。第３のピークは未反応のマイトマイシンＣと
デキストランとの結合体である。なお、上記でマ
イトマイシンＤとデキストランとの結合体は
OD₃₆₅で、抗体はOD₂₈₀で測定する。複合体の結合比率をゲル過チヤートの吸光度
よりマイトマイシン・デキストラン結合体を定量
し、Lowry法によりタンパク量を定量すること
により調べたところ、結合体：抗体＝１：２の比
で結合していることが明らかとなつた。

【図面の簡単な説明】

第１図は複合体生成反応終了液のセフアデツク
スＧ−200分画に際しての時間と吸光度との関係
を示す。第２図は複合体生成反応終了液のセフア
デツクス4B分画に際しての時間と吸光度との関
係を示す。

Claims

【特許請求の範囲】１マイトマイシン類と多糖類との結合体と、抗
体とが一般式【化】【化】もしくは【化】（式中、ｎは３〜７の整数を、Ｒは低級アルキ
レン基を表わす。又各左端のＯは多糖類の水酸基
のＯを、右端のNHは抗体のアミノ基のNHを示
す。）で表わされる基、一般式【式】（式中、ｎ，Ｒ，左端のＯ、右端のNHは前記
と同義である）で表わされる基、又は上記，
の一般式中の（CH₂）_oで表わされるメチレン鎖
のいずれかの水素が低級アルキル基で置換した基
により結合した、マイトマイシン類、多糖類及び
抗体とからなる抗腫瘍用複合体。ただし、上記でマイトマイシン類と多糖類との
結合体とはマイトマイシン類と多糖類とが′一
般式【式】【式】もしくは【式】（式中、ｎは前記と同義であり、左端のＮはマ
イトマイシン類のイミノ基のＮを、右端のＯは多
糖類の水酸基のＯを示す）で表わされる基、′
一般式Ｎ−CO−（CH₂）_o−Ｏ− （式中、ｎ、左端のＮ、右端のＯは前記と同義
である）で表わされる基、又は′上記′，′
の一般式中の（CH₂）_oで表わされるメチレン鎖の
いずれかの水素が低級アルキル基で置換した基に
より結合した結合体をいうものとする。２多糖類がデキストリン、アガロース、セルロ
ース又はアルギン酸である特許請求の範囲第１項
記載の複合体。