JPH0551278B2 - - Google Patents
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- JPH0551278B2 JPH0551278B2 JP18843284A JP18843284A JPH0551278B2 JP H0551278 B2 JPH0551278 B2 JP H0551278B2 JP 18843284 A JP18843284 A JP 18843284A JP 18843284 A JP18843284 A JP 18843284A JP H0551278 B2 JPH0551278 B2 JP H0551278B2
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- nicotinamide adenine
- dehydrogenase
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Landscapes
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は、体液中の成分濃度および酵素活性の
定量方法および定量試薬に関する。
定量方法および定量試薬に関する。
従来より臨床検査の分野では、体液中の目的成
分、例えば胆汁酸、アミノ酸、クレアチン、また
はアルコール等の濃度や酵素活性の測定方法とし
て、種々の酵素反応を共役させて還元型ニコチン
アミドアデニンジヌクレオチド（NADH）を生
成させ、その生成量から目的とする生成濃度や酵
素活性を求める方法が日常頻繁に用いられてい
る。その定量法には、生成したNADHの特性吸
収帯である340nmでの吸光度の変化から目的成分
の濃度や酵素活性値を算出する方法、あるいは生
成したNADHにジアホラーゼやフエナジンメト
サルフエート等のような電子伝達系を共役させて
テトラゾリウム塩を生成させ、これを有色のホル
マザン（還元型テトラゾリウム）に変換し、比色
法により目的成分の濃度や酵素活性値を求める方
法等がある。
分、例えば胆汁酸、アミノ酸、クレアチン、また
はアルコール等の濃度や酵素活性の測定方法とし
て、種々の酵素反応を共役させて還元型ニコチン
アミドアデニンジヌクレオチド（NADH）を生
成させ、その生成量から目的とする生成濃度や酵
素活性を求める方法が日常頻繁に用いられてい
る。その定量法には、生成したNADHの特性吸
収帯である340nmでの吸光度の変化から目的成分
の濃度や酵素活性値を算出する方法、あるいは生
成したNADHにジアホラーゼやフエナジンメト
サルフエート等のような電子伝達系を共役させて
テトラゾリウム塩を生成させ、これを有色のホル
マザン（還元型テトラゾリウム）に変換し、比色
法により目的成分の濃度や酵素活性値を求める方
法等がある。
しかし、これらの方法は、極微量のNADHを
測定する方法としては良い方法ではない。すなわ
ち、NADHの340nmにおける分子吸光係数は小
さく感度が悪いうえ、内因性の乳酸の影響を受
け、微量のNADHを定量する場合には大きな誤
差が生じるので、検体ブランクでの補正が必要で
あり、そのために一般的な自動分析装置には適用
することができない。一方、ホルマザンを生成さ
せ比色法により測定する系では、感度の点で若干
の改善は認められるものの、なお十分ではなく、
また上記NADH測定系と同様に検体ブランクで
の補正を必要とし、そのうえ生成するホルマザン
は難溶性であるため、自動分析装置のセルや反応
系路の寿命を極端に短くする等の問題が有り、従
つてこの方法も自動分析装置により行うことはで
きない。
測定する方法としては良い方法ではない。すなわ
ち、NADHの340nmにおける分子吸光係数は小
さく感度が悪いうえ、内因性の乳酸の影響を受
け、微量のNADHを定量する場合には大きな誤
差が生じるので、検体ブランクでの補正が必要で
あり、そのために一般的な自動分析装置には適用
することができない。一方、ホルマザンを生成さ
せ比色法により測定する系では、感度の点で若干
の改善は認められるものの、なお十分ではなく、
また上記NADH測定系と同様に検体ブランクで
の補正を必要とし、そのうえ生成するホルマザン
は難溶性であるため、自動分析装置のセルや反応
系路の寿命を極端に短くする等の問題が有り、従
つてこの方法も自動分析装置により行うことはで
きない。
本発明は、従来のNADH測定系に比し感度が
高く、また自動分析装置に容易に適用することが
できる体液中の物質の定量方法および定量試薬を
提供する。
高く、また自動分析装置に容易に適用することが
できる体液中の物質の定量方法および定量試薬を
提供する。
本発明の体液中の物質の定量方法は、
体液中の定量すべき物質の脱水素酵素反応にニ
コチンアミドアデニンジヌクレオチドを共役させ
て還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
を生成させ、生成した還元型ニコチンアミドアデ
ニンジヌクレオチドに、ラクテートデヒドロゲナ
ーゼによるケト酸の脱水素酵素反応およびラクテ
ートオキシダーゼによるα−ハイドロキシ酸の酸
化酵素反応を共役させて過酸化水素を生成させ、
その過酸化水素生成量を測定することを特徴とし
ている。
コチンアミドアデニンジヌクレオチドを共役させ
て還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
を生成させ、生成した還元型ニコチンアミドアデ
ニンジヌクレオチドに、ラクテートデヒドロゲナ
ーゼによるケト酸の脱水素酵素反応およびラクテ
ートオキシダーゼによるα−ハイドロキシ酸の酸
化酵素反応を共役させて過酸化水素を生成させ、
その過酸化水素生成量を測定することを特徴とし
ている。
本発明の定量法は、ケト酸の脱水素酵素とし
て、ラクテートデヒドロゲナーザ（LDH）、α−
ハイドロキシ酸々化酵素として、ラクテートオキ
シダーゼ（LOX）を用いて行われる。
て、ラクテートデヒドロゲナーザ（LDH）、α−
ハイドロキシ酸々化酵素として、ラクテートオキ
シダーゼ（LOX）を用いて行われる。
本発明方法は、過酸化水素測定系を使用するの
で、従来のNADH測定系に比し、感度は２〜５
倍と非常に良好である。
で、従来のNADH測定系に比し、感度は２〜５
倍と非常に良好である。
また、本発明方法による体液中の成分または酵
素活性の定量に当たり、その前処理として、α−
ハイドロキシ酸酸化酵素とカタラーゼの酵素反応
の共役下に、干渉物質である内因性乳酸を水に変
換することにより、干渉物質としての影響を解消
することができる。α−ハイドロキシ酸酸化酵素
としてラクテートオキシダーゼ（LOX）を用い
た場合の反応を〔〕および〔〕式に示す。
素活性の定量に当たり、その前処理として、α−
ハイドロキシ酸酸化酵素とカタラーゼの酵素反応
の共役下に、干渉物質である内因性乳酸を水に変
換することにより、干渉物質としての影響を解消
することができる。α−ハイドロキシ酸酸化酵素
としてラクテートオキシダーゼ（LOX）を用い
た場合の反応を〔〕および〔〕式に示す。
なお、残存するカタラーゼは窒化ナトリウム
（NaN3）で阻害すればよい。
（NaN3）で阻害すればよい。
乳酸LOX
――――→
ピルビン酸＋H2O2 ……〔〕
H2O2カタラーゼ
――――――→
H2H2Ｏ ……〔〕
本発明の測定方法の反応原理につき、血清中の
胆汁酸を測定対象とし、ケト酸の脱水素酵素とし
てLDH、α−ハイドロキシ酸酸化酵素として
LOXを用い、胆汁酸をNADHに変換し、最終的
に水溶性色素を生成させる場合を例に挙げて説明
すると、下式〔〕〜〔〕に示すように、まず
胆汁酸とニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
（NAD）とを3α−ハイドロキシステロイド−デ
ヒドロゲナーゼ（3α−HSD）の酵素反応共役下
に反応させて、ケトステロイドとNADHとを生
成させ、生成したNADHを、LDHの存在下にピ
ルビン酸と反応させて乳酸とNADとに変換し、
更にその乳酸にLOXの酸化酵素を共役させてピ
ルビン酸と過酸化水素とに変換したのち、過酸化
水素を、パーオキシターゼ（POX）の存在下に、
４−アミノアンチピリン（４−AA）およびソジ
ウム−Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ハイドロオキシ−
３−スルホプロピル）−メタトルイジン（TOOS）
と反応させて色素を生成せしめる。この色素は
546nmにおいて吸収を示す。
胆汁酸を測定対象とし、ケト酸の脱水素酵素とし
てLDH、α−ハイドロキシ酸酸化酵素として
LOXを用い、胆汁酸をNADHに変換し、最終的
に水溶性色素を生成させる場合を例に挙げて説明
すると、下式〔〕〜〔〕に示すように、まず
胆汁酸とニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
（NAD）とを3α−ハイドロキシステロイド−デ
ヒドロゲナーゼ（3α−HSD）の酵素反応共役下
に反応させて、ケトステロイドとNADHとを生
成させ、生成したNADHを、LDHの存在下にピ
ルビン酸と反応させて乳酸とNADとに変換し、
更にその乳酸にLOXの酸化酵素を共役させてピ
ルビン酸と過酸化水素とに変換したのち、過酸化
水素を、パーオキシターゼ（POX）の存在下に、
４−アミノアンチピリン（４−AA）およびソジ
ウム−Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ハイドロオキシ−
３−スルホプロピル）−メタトルイジン（TOOS）
と反応させて色素を生成せしめる。この色素は
546nmにおいて吸収を示す。
（胆汁酸） （ケトステロイド）
H2O2＋4AA＋TOOSPOX
――――→
色素 ……〔〕
（546nm）
上記測定は、LOXなどのα−ハイドロキシ酸
酸化酵素30〜360U／、およびカタラーゼ200〜
2000U／を含むPH6.0〜8.0の緩衝溶液である第
１試薬と、POX20〜100U／、LDH等のケト酸
脱水素酵素20〜1000U／、3α−HSD3〜35U／
、NAD10〜900mg／、ピルビン酸等のケト酸
１〜400mg／、４−AA0.3〜30mg／、TOOS5
〜1000mg／、および窒化ナトリウム（NaN3）
８〜400mg／を含むPH6.0〜8.0の緩衝溶液であ
る第１試薬とを用いて行うことができる。検体体
液に、前処理として第２試薬を加えて前記〔〕、
〔〕式の反応により干渉物質である内因性乳酸
を消去し、ついで第２試薬により〔〕〜〔〕
式の反応を生起させ、生成する色素を吸光分析す
ることにより、目的とする体液中の成分濃度また
は酸素活性が求められる。この定量操作は、用手
法はむろん、通常の自動分析装置により行うこと
ができる。
酸化酵素30〜360U／、およびカタラーゼ200〜
2000U／を含むPH6.0〜8.0の緩衝溶液である第
１試薬と、POX20〜100U／、LDH等のケト酸
脱水素酵素20〜1000U／、3α−HSD3〜35U／
、NAD10〜900mg／、ピルビン酸等のケト酸
１〜400mg／、４−AA0.3〜30mg／、TOOS5
〜1000mg／、および窒化ナトリウム（NaN3）
８〜400mg／を含むPH6.0〜8.0の緩衝溶液であ
る第１試薬とを用いて行うことができる。検体体
液に、前処理として第２試薬を加えて前記〔〕、
〔〕式の反応により干渉物質である内因性乳酸
を消去し、ついで第２試薬により〔〕〜〔〕
式の反応を生起させ、生成する色素を吸光分析す
ることにより、目的とする体液中の成分濃度また
は酸素活性が求められる。この定量操作は、用手
法はむろん、通常の自動分析装置により行うこと
ができる。
（血清胆汁酸の自動分析）
〔〕 試薬処方（20ml スケールの調製）
(1) 第１試薬（R1）：
LOX 72U、カタラーゼ 400Uを含むPH7.0の
燐酸緩衝溶液 (2) 第２試薬（R2）： パーオキシターゼ（POX） 20U、LDH
20U、3α−HSD 7U、NAD 10mg、ピルビン酸
10mg、４−AA 0.1mg、TOOS ４mg、NaN3 ８
mgを含むPH7.0燐酸緩衝溶液。
燐酸緩衝溶液 (2) 第２試薬（R2）： パーオキシターゼ（POX） 20U、LDH
20U、3α−HSD 7U、NAD 10mg、ピルビン酸
10mg、４−AA 0.1mg、TOOS ４mg、NaN3 ８
mgを含むPH7.0燐酸緩衝溶液。
〔〕 測定操作
自動分析装置として日立705型自動分析機使用。
第１試薬（R1）350μに検体血清10μを加え、
５分間を要して前処理（反応式〔〕、〔〕）し
たのち、第２試薬（R2）50μを加えて処理し
（反応式〔〕〜〔〕）、エンドポイント法によ
り胆汁酸を定量する。
第１試薬（R1）350μに検体血清10μを加え、
５分間を要して前処理（反応式〔〕、〔〕）し
たのち、第２試薬（R2）50μを加えて処理し
（反応式〔〕〜〔〕）、エンドポイント法によ
り胆汁酸を定量する。
〔〕 測定結果
(1) 直線性
120μMの胆汁酸を含む血清を倍々希釈して測
定した結果、第１図に示すように良好な直線関係
を認めた。
定した結果、第１図に示すように良好な直線関係
を認めた。
(2) 内因性乳酸の影響
血清に乳酸を10mg／dl、20mg／dl、40mg／dl、
および80mg／dlの各割合で加えて測定した結果、
第２図に示すように乳酸の影響は全く認められな
かつた。
および80mg／dlの各割合で加えて測定した結果、
第２図に示すように乳酸の影響は全く認められな
かつた。
(3) 従来法（用手法）との相関性
市販の胆汁酸測定キツト（用手法用）〔(株)第一
製薬製）を用いて得られた血清胆汁酸測定結果と
上記の自動分析による測定結果の相関関係を第３
図に示す。但し、Ｙ＝0.973、Ｘ−0.711、ｒ＝
0.988、ｎ＝60である。
製薬製）を用いて得られた血清胆汁酸測定結果と
上記の自動分析による測定結果の相関関係を第３
図に示す。但し、Ｙ＝0.973、Ｘ−0.711、ｒ＝
0.988、ｎ＝60である。
両測定法は良好な相関製を有していることがわ
かる。
かる。
本発明によれば、従来法に比し、より正確に体
液中物質を定量することができ、また従来不可能
であつた自動分析機による測定が可能であり、多
検体処理を要する臨床検査分野に貢献するもので
ある。
液中物質を定量することができ、また従来不可能
であつた自動分析機による測定が可能であり、多
検体処理を要する臨床検査分野に貢献するもので
ある。
第１図は本発明による測定値の直線性を示すグ
ラフ、第２図は本発明による測定値に及ぼす干渉
物質の影響を示すグラフ、第３図は本発明の測定
値を従来法の測定値の相関性を示すグラフであ
る。
ラフ、第２図は本発明による測定値に及ぼす干渉
物質の影響を示すグラフ、第３図は本発明の測定
値を従来法の測定値の相関性を示すグラフであ
る。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 体液中の定量すべき物質の脱水素酵素反応に
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを共役さ
せて還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチ
ドを生成させ、生成した還元型ニコチンアミドア
デニンジヌクレオチドに、ラクテートデヒドロゲ
ナーゼによるケト酸の脱水素酵素反応およびラク
テートオキシダーゼによるα−ハイドロキシ酸の
酸化酵素反応を共役させて過酸化水素を生成さ
せ、その過酸化水素生成量を測定することを特徴
とする体液中の物質の定量方法。 ２ 体液中の定量すべき物質に対する脱水素酵素
の酵素反応にニコチンアミドアデニンジヌクレオ
チドを共役させて還元型ニコチンアミドアデニン
ジヌクレオチドを生成させ、生成した還元型ニコ
チンアミドアデニンジヌクレオチドの量から定量
すべき物質量を求めるための、α−ハイドロキシ
酸々化酵素30〜360U／、カタラーゼ200〜
2000U／を含有するPH6.0〜8.0の緩衝液からな
る第１試薬と、パーオキシダーゼ20〜100U／、
ケト酸脱水素酵素20〜1000U／、ニコチンアミ
ドアデニンジヌクレオチド10〜900mg／、ケト
酸１〜400mg／、４−アミノアンチピリン0.3〜
30mg／、ソジウム−Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ハ
イドロオキシ−３−スルホプロピル）−メタトル
イジン５〜1000mg／、三窒化ナトリウム８〜
400mg／、を含有するPH6.0〜8.0の緩衝液から
なる第２試薬との組合せになる体液中の物質の定
量用試薬。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP18843284A JPS6167500A (ja) | 1984-09-07 | 1984-09-07 | 体液中の物質の定量方法および定量試薬 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP18843284A JPS6167500A (ja) | 1984-09-07 | 1984-09-07 | 体液中の物質の定量方法および定量試薬 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6167500A JPS6167500A (ja) | 1986-04-07 |
| JPH0551278B2 true JPH0551278B2 (ja) | 1993-08-02 |
Family
ID=16223567
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP18843284A Granted JPS6167500A (ja) | 1984-09-07 | 1984-09-07 | 体液中の物質の定量方法および定量試薬 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6167500A (ja) |
-
1984
- 1984-09-07 JP JP18843284A patent/JPS6167500A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS6167500A (ja) | 1986-04-07 |
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