JPH05508073A - 触媒抗体成分 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 触媒抗体成分 発明の分野 本発明は一般に、触媒的に化学反応速度を上昇させることができる抗体成分に関 する。さらに詳しくは本発明は、触媒的に化学反応速度を上昇させることができ る触媒抗体の成分（例えば重鎮や軽鎖）に関する。本発明はまた、この触媒性成 分を得るための方法に関する。 本発明に関する技術の現状を充分に説明し、また本発明自身をさらに詳しく説明 するために、本明細書ではいくつかの文献か括弧内にアラビア数字で引用されて いる。 これらの文献の完全な引用は、本説明の最後の請求の範囲の直前にある。 発明の背景 抗体が抗原に結合することは公知であり、抗体の抗原結合部分は重鎮（Ｈ）と軽 鎖（Ｌ）の可変部分よりなることは一般に認識されている。これらの鎖の両方と も抗原に高い親和性で結合するバラトープ（ｐａｒａｔｏｐｅ）構造を規定する のに重要である。抗体が化学反応速度を触媒的に上昇させることができることは 最近知られるようになってきた。米国特許第４．４８８．２８１号では、触媒抗 体が基質に結合し、それを１つまたはそれ以上の生成物に変換し、その生成物を 放出することができることが記載されている。この触媒抗体は、米国特許第４． ８８８．２８１号に記載されているように免疫学的方法（ここで抗体は抗原に導 き出される）で調製される。 抗体のＦａｂ断片はアミド結合の加水分解を触媒する（＋）。抗体の会合した軽 鎖と重鎮の可変領域よりなるヘテロダイマーであるＦｖ断片は、エステル加水分 解を触媒することが証明されている（２）。これらの抗体は、エネルギー的によ り厳しいクラスの反応であるペプチド結合の切断または形成を触媒することは知 られていない。 イバーソンどラーナー（Ｉｖｅｒｓｏｎ　ａｎｄ　Ｌｅｒｎｅｒ）　（３）は、 ペプチド結合切断はエネルギー的に非常に厳しいか、触媒抗体によるペプチド結 合の切断は、金属トリエンコファクター（ｍｅｔａｌ　ｔｒｉｅｎ　ｅｏｆａｅ ｔｏｒ）の存在により可能になり、そして、−のようなコファクターの存在なし には起きないことを報告している。Ｚｎ　（Ｉ［）　、Ｇａ　（Ｉｎ）、Ｆｅ（ ＴＩＥ）、Ｉｎ（ＩＩＩ）、Ｃｕ（Ｈ）、Ｎｉ　（ＩＩ）、Ｌｕ　（ＩＩＩ）　 、Ｍｇ　（ＩＩ）　、またはＭｎ（ＩＩ）のトリエン錯体か最も好まし７い。し かし、金属コファクターの存在なし、て神経伝達物質の血管作動性小腸ベブチＦ （ＶＩＰ）のアミノ酸残基１６と１７の間のペプチド結合の切断を選択的に触媒 する天然の自己抗体が、ボール（Ｐａｕｌ）により報告さねている（４．５）。 抗体結合は完全なＨ鎖とＬ鎖の存在によりエネルギー的に最も好ましくなること はよく知られている（６）。 抗リゾチーム抗体のＶ。断片は、抗体全分子の親和性のわずか１０％の親和性で 抗原に結合する（７）。多くの研究では抗原結合相互作用へのＬｊｌの寄与はＨ 鎖より小さいことを示唆しているが、Ｌ鎖もまた抗原結合相互作用に参加する（ ８−１０）。触媒抗体全分子より小さい抗体分子か触媒抗体全分子の与えるよう な好ましい立体構造を有して、ラーナーとイバーソン（Ｌｅｒｎｅｒ　ａｎｄ　 Ｉｖｅｒｓｏｎ）の記載する金属トリエンコファクターの助けなしでペプチド結 合の触媒をすることは考えにくい。 ＦｖとＦａｂによるエステル結合とアミド結合の触媒の報告は、必ずしも他のタ イプのへテロダイマーが化学反応を触媒することを意味しない（８−１０）。化 学反応を触媒することは知られていないが予想されるヘテロダイマーは、少なく とも１つのジスルフィド結合で結合されているインタクトのＨ鎖とインタクトの Ｌ′鎖よりなるヘテロダイマーである。化学反応を触媒することは知られていな いが予想される他のへテロダイマーは、Ｆａｂに類似であるか、少なくとも１つ のジスルフィド結合によりＬ鎖に結合しているＦｄ断片よりなるＦａｂに対して 、非共存結合（例えば水素結合、電荷による相互作用または類似の会合）により インタクトのし鎖に結合または会合しているＦｄ−断片（Ｆｃ部分が除去された Ｈ鎖）よりなる。 重鎮ホモダイマーや軽鎖ホモダイマーはこれまでのところ、化学反応を触媒する ことは証明されていない。抗体の占典的な結合機能は軽鎖と重鎮の両方の可変領 域の組合せ、または少なくとも重鎮が必要であると考えられているため、これら のホモダイマーか触媒活性を存しているとは考えにくい（８，１ｌ−１３）。ホ モダイマーは同じかまたは類似の成分よりなり、標準的抗体やヘテロダイマーよ りより少ない労力で製造できるため、触媒性ホモダイマーがあれば有利であろう 。 １本鎖蛋白は多鎖蛋白（抗体）に対して、構造−機能解析の点からもまた薬理学 的および治療上の安定性の点からも、明白な利点かある。抗体上の結合性および 触媒性ドメインが同じであるかまたはお互いに近いところに存在して、触媒活性 の利点が多鎖蛋白ではなく１本鎖蛋白により達成されれば、有利であろう。こむ までのところ当該技術は、触媒性を目的に抗体のこのような成分を用いることの 可能性を証明してはいない。軽鎖と重鎮のいくつかの組合せより形成されるダイ マーによっても同様の利点か与えられる。 プロ薬剤を薬剤に変換するのに触媒抗体を使用することは公知である（１４）。 しかし特に触媒性成分か、薬剤や毒素に接触することが好ましい細胞や組織に結 合できる生物性結合剤で、融合蛋白またはキメラ蛋白に取り込まれる場合、プロ 薬剤を薬剤にまたはプロ毒素を毒素に変換することができる触媒性成分は特別な 利点を存する。 従って本発明の一般的な目的は、化学反応速度を上昇させる抗体の成分を提供す ることである。 本発明のさらなる目的は、化学反応速度を上昇させ、それらが得られる触媒抗体 またはこれまで触媒として使用されてきた触媒抗体より構造か簡単な触媒抗体の 成分を同定することである。 本発明のさらに別の目的は、親杭体の触媒活性を保持し化学反応速度を上昇させ るのに使用することができる触媒抗体の成分を得る方法を提供することである。 本発明のさらに別の目的は、触媒抗体の触媒性成分を得るための種々の方法を与 えることである。 本発明のさらに別の目的は、触媒抗体の触媒性成分を用いて、化学反応を実施す ることである。 発明の要約 本発明は広くは、化学反応速度を上昇させる抗体の成分に関する。触媒性である ことが見いだされた抗体の成分には、抗体のＦａｂ部分、そのＦｖ細部分軽鎖、 重鎮、会合していない軽鎖と重鎮の混合物、軽鎖と重鎮の種々の組合せから作成 されるダイマー、軽鎖の種々の断片、重鎮の種々の断片、軽鎖の触媒性ドメイン 、および重鎮の触媒性ドメインがある。これらの成分は高代謝回転でそれ自身反 応に入らず反応を触媒し、全触媒抗体より有利である。 触媒性成分は種々の異なる方法で得られる。成分は、当該分野の種々の技術（抗 体を誘導するための遷移状態類似化合物を用いる免疫学的方法を含む）により、 触媒抗体または自己抗体より得られる。触媒性成分（例えば触媒抗体の軽鎖また は重鎮）は、精製抗体をいくつかの画分に切断し、次にこれらの画分を還元およ びアルキル化して軽鎖と重鎮をつなぐ結合を切断することにより調製される。さ らに別の方法では、触媒抗体の可変領域の配列を決め、その触媒抗体の可変領域 をコードする遺伝子を細胞に挿入し、次に細胞中で可変領域を発現させる。 図面の簡単な説明 図１゜１ｇ０分子の原型の模式図。 図２゜モ／　（１！’Ｉ−ＴＹＲ”）　−ＶＩ　Ｐの逆ｍＨＰＬＣ？ｌＪ製。 図３゜ＶＩＰ加水分解活性はＦａｂ断片中にある。 図４゜ＩｇＧにより産生されるＶＩＰ断片の同定と、触媒性ＩｇＧと非触媒性１ ｇＧの比較。 図５゜Ｆｄ−およびＬｗＬを産生ずるための分解の証明。 図６゜ＩｇＧ、ＦａｂおよびＦｄ／Ｌ２５の濃度上昇の関数としての、インタク トのＩｇＧ、Ｆａｂおよび抗体１本鎖によるＶＩＰ加水分解。抗体の連続的分解 により加水分解活性か上昇することを示している。 図７゜ＶＩＰ特異的抗体の触媒性分解されたし鎖の好運な調製。 図８゜培養したＥＢＶ形質転換リンパ球によるＶＩＰ加水分解性抗体の合成。 図９゜ＦＶ−１１−２融合蛋白の発現プラスミドと発現融合蛋白の模式図。 図１０−１２゜プロＡＲＡ−Ｃの産生の化学反応経路。 化学反応とは、少なくとも１つの反応物質か少なくとも１つの生成物に変換され る反応を意味する。このような化学反応には、酵素（例えばオキシドリダクター ゼ、トランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼおよびリガー ゼ）に触媒される化学反応、そして触媒酵素の知られていない化学反応（例えば 酸化、還元、付加、縮合、脱離、置換、切断および転位）がある。 本発明において「動物」という用語は、免疫系を有する任意の生物を意味し、哺 乳動物および非哺乳動物を含む。［基質Ｊという用語は、化学反応における反応 物質と同意であり、蛋白、リン脂質、炭水化物（例えばグリコーゲン、グルコー スなど）、薬剤（外来性の濫用物質や濫用薬剤を含む）などの多くの分子および 生体分子の任意のものであるが、これらに限定されるものではない。 抗体と免疫グロブリンとは、動物の免疫応答の一部として機能する構造の関連す る蛋白のいくつかのクラスの任意のものを意味しており、この蛋白にはＩｇＧ、 ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＡおよびＩｇＭやこれらに関連する蛋白かある。抗体は血 漿中や他の体液そしである種の細胞の膜に存在している。通常の生理的条件下（ 例えば免疫機能異常やヒトの介入がない場合）では抗体は、動物か免疫的に寛容 でない蛋白または他の化学物質の動物の組織または体液中への侵入に反応して、 動物のＢ細胞（または機能的に類似しているもの）により産生される。 本発明の好適なａ様の例は、一般的にＩｇＧに関する。 しかし本明細書中で使用される抗体および免疫グロブリンという用語は、ＩｇＤ 、ＩｇＥ、ＴｇＡ、ＴｇＭやこれらに関連するクラスまたはサブクラスを含む、 任意のクラスの抗体を意味する。本発明の抗体成分から、動物に普通に産生され るインタクトの抗体を明確に区別するために、前記の抗体は「生理的抗体」と呼 ぶこともてきる。 本発明の自己抗体は、動物自身の細胞成分に対して結合し、標的抗原に対する特 異的免疫によっては誘導されない、動物の免疫系により産生される天然に存在す る抗体である。自己抗体は自己抗原（すなわち生体が自身の遺伝コードを用いて 作る抗原）を認識する。すなわち自己抗原は外来抗原（例えば細菌性、ウィルス 性抗原）から区別される。本明細書で規定される「基質」という用語は、自己抗 原と同しであるかまたは異なる。 本明細書におけるペプチド結合は、２つの隣接するアミノ酸配列を結合するアミ ド結合を意味し、一般的に以下の式で表されるニ アミノ酸はアミノ基の結合した炭素原子、カルボキシル基、水素原子および「側 鎖」と呼ばれる特徴的な基（上記の式のＲ１やＲ２）よりなる。本明細書におけ るアミノ酸とは、蛋白の構成要素である、２０個の天然に存在するアミノ酸を含 む。隣接するアミノ酸のいずれがかプロリンのとき、各側鎖のＲ１とＲ２は隣接 する窒素原子に結合して特徴的な５員環のプロリン環を形成することは、当業者 には理解されるであろう。 ペプチド結合または切断されるべき結合を含む基質は、任意の蛋白性分子であり 、例えば制御蛋白または構造蛋白かあり、ペプチドホルモン（例えばインシュリ ン、成長ホルモン、セクレチンなど）、ペプチド神経伝達物質（Ｖ　Ｉ　Ｐ）や 神経修飾物質（ｎｅｕｒｏｍｏｄｕｌａｔａｒ）　（ｇｑえば血管作動性小腸ペ プチド、エンドルフィン、エンケファリン、ブラジキニン、物質Ｐなど）、腫瘍 蛋白（例えば腫瘍遺伝子生成物、癌胎児性抗原など）、細菌性蛋白やウィルス性 蛋白（例えばヒト免疫不全症ウィルス（ＨＩＶ）ｇｐ１２０、インフルエンザ糖 蛋白なと）があるが、これらに限定されるものではない。 本発明の抗体成分により達成される速度の上昇は、触媒性であるかまたは化学量 論的である。すなわち触媒的に反応速度を上昇させる成分は「触媒性成分」であ り、化学量論的に化学反応速度を上昇させる成分は「化学量論性成分」である。 本発明の抗体の触媒性成分は、他のすべての条件（例えば温度、反応物質／基質 濃度なと）か同じ場合に、化学反応速度を変えることができる物質であり、化学 反応中にははいらず、従って反応で消費されない。これはまた、触媒性成分１モ ル当り複数モルの反応物質／基質を変換することかでき、これは機構的な面から 、反応物質／基質に結合して反応物質／基質の生成物への変換を加速し、次に生 成物を放出し、平衡点を変化させずに化学反応速度を変化させることかできる物 質でもある。前記の定義は理想的な触媒に特徴的なものである。しかし実際には 、最も素晴らしい触媒でさえも反応系中の汚染物質により不活性化されるか、反 応中の化学的または物理的破壊の結果として不活性化される。当業者に公知の理 由に４より、触媒の実際の操作は、反応系の成分や反応の環境条件などにより複 雑になる。 本発明の化学量論性成分は化学量論的に化学反応速度を上昇させる。これは化学 反応速度を上昇させるか、触媒性成分と異なり、反応中に化学量論的に消費され る。 すなわち「化学量論的上昇」とは、観察される反応速度の上昇を引き起こす成分 は、反応物質として反応中に入り、反応過程で消費されることを意味する。 本発明では触媒活性を表すのにいくつかの、作業用定義を導入した。これらの式 は、［ｌ］ＫｃＡ７、すなわち「回転率Ｊ　（”ｔｕｒｎｏｖｅｒ”）および［ ２］ＫｃＡＴ／にいＣＡＴ　、すなわち［速度上昇率Ｊである。回転率とは、単 位時間に１モルの触媒性成分について、生成物に変換される反応物質／基質分子 の数を表す。例えば１つの分子が１分間当り１０３分子の基質の回転率を示す場 合に、この分子がその最適ｐＨで室温で２４時間触媒活性を維持すると、各触媒 は全部で１．４Ｘ１０″の変換を示し、その触媒活性を示す。この総変換は化学 量論反応における総変換から区別されるべきであり、化学量論反応での総変換は 、いくら長時間反応を行っても決して１．０を越えることはない。この速度上昇 率は無名数であり、他のすべての条件（例えば反応物質の濃度、温度など）が同 じ場合に、触媒の存在しない場合の反応速度に対する、触媒か存在する場合の反 応速度を示す。 次に抗体の成分について記載する。これらの成分は正確には、断片または抗体断 片と呼ばれる。これらの成分を例としてＩｇＧの場合について記載するが、これ らの成分は他の任意の抗体クラス（ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＭおよび関連 するクラスまたはサブクラス）由来でもよいことは当業者には理解できるであろ う。１ｇ０分子は、ジスルフィド結合により結合した４つのポリペプチド鎖より なるｒＹ］ＹＪの蛋白であるということができる（図１）。「Ｙ」の一番上はＩ ｇＧテトラマーを構成する蛋白のＮ−末端である。２つの同一の重鎮（ガンマ鎖 としても知られており、以後はＨＭＩと呼ぶ）「Ｙ」の幹から腕（ａｒｍ）に延 びている；２つの同一の軽鎖（その抗原構造によりカッパ鎖またはラムダ鎖とし ても知られており、以後ＬＭ１と呼ぶ）は腕に閉じ込められている。各ポリペプ チドは定常領域（Ｃ領域）と可変領域（Ｖ領域）を有する。■領域はＨＭＩとＬ ｊｌのＮ−末端トメインに存在している。■領域では最も構造の変化が大きい３ つの領域があり、高度可変領域または相補性決定領域じＣＤＲ”）として知られ ている。Ｈ鎖とＬ鎖の抗体結合が一緒になって抗原結合部位を形成する。 ＣＤＲＨの配列の可変性が、免疫系における抗体の特異性の範囲の基礎となって いる。各腕の末端ではＬ鎖とＨ鎖がたたまれて、前記のＣＤＲよりなる抗原結合 部位を形成する。ＨＭのサイズは約５０ｋＤであり、ＬＨは約２５ｋＤである。 「ＹＪの上部を形成するためにＨ鎖が分岐する点は、この分野でヒンジ領域と呼 ばれている。ＩｇＧはパパイン酵素によりヒンジ領域の上で切断され（ＩＩ）、 ２つのＦａｂ断片と１つのＦｃ断片になる。前述したように「Ｙ」の上部は可変 領域を含み、これは抗体の特異的結合機能を示す。Ｆｃ断片はｒＹ」の下部であ り、補体の結合と他の非結合機能を示す。Ｆａｂ断片は「Ｙ」の上部の各サイド から切断されるヘテロダイマーであり、インタクトのＬＭと、約２５ｋＤの部分 Ｈ鎖（当該分野でＦｄ断片として知られている）よりなる。 Ｆｖ断片は、前記のＦａｂ断片に構造の類似した２５ｋＤのへテロダイマーであ るが、「Ｙ」の上部の各Ｈ１とＬ鎖のＮ−末端配列のより短い画分よりなる（１ ５）。 Ｆｖは構成性Ｈ鎖とＬＭ断片の可変領域を含む。 このＦｖ断片は、約１２．５ｋＤの２つの１木調断片、すなわちＨ鎖の可変断片 （ｖＨ）とＬ鎖の可変断片（Ｖ、）と呼ばれる成分に分離される（１５）。 ＨａおよびＬ鎖成分はインタクトの抗体から完全な非会合鎖として分離されるか 、またはＬ鎖またはＨ鎖をコードする遺伝子から当該分野で公知の組換え遺伝子 技術の１つにより完全な非会合鎖として新規に産生されるか、または非会合Ｌｆ ｆｌまたはＨ鎖を産生ずる性質で選択されたＢ細胞またはハイブリドーマ細胞に より産生される。 次にこれらの非会合Ｈ鎖およびＬ鎖は本発明に従い非会合触媒性鎖として使用さ れるか、または当該分野で公知の方法で会合させられてＨ／Ｌへテロダイマー、 Ｈ／Ｈホモダイマー、またはＬ／Ｌホモダイマーを産生させる。 Ｈ鎖またはＬ鎖の可変断片は可変領域を含むペプチド配列であり、アミノ酸配列 に固有の結合性を保持する可変ドメインを規定する最小のペプチド配列まで縮小 することができる。 触媒性ドメインは、そのアミノ酸配列に固有の触媒性を保持する最小のペプチド 配列である。 これらの各成分は当該分野で公知の組換え法により配列され発現される。組換え 技術により触媒性ドメインは他の有用な遺伝的配列と可動に組合されて触媒性を 存するキメラ蛋白が産生される。触媒性成分は、可変ドメインの遺伝子配列か宿 主細胞中に挿入された後に、当該分野で公知の突然変異誘発法を抗体Ｈ鎖または Ｌ鎖可変ドメインの遺伝子配列に応用して、新規に産生ずることかできる。 触媒性成分は、成分とは異なる機能を有する分子に会合しているか、または互い に会合している。ここで成分間または他の分子との関係を説明するのに使用する 「会合している」または「会合」という用語は、成分または他の分子が共有結合 （例えばジスルフィド結合または当該分野で公知の他の化学結合）または非共有 結合（例えば水素結合、電荷相互作用または当該分野で公知の他の非共有結合） を意味する。会合しているまたは会合という用語は限定することができる。例え ば「非共有結合で会合している」は、非共有結合で結合している成分のみを意味 する。「会合していないノとう用語は、共有結合でもまたは非共存結合でも結合 していない成分または分子を意味する。 図面の簡単な説明 図１゜１ｇ０分子の原型の模式図。Ｃ０ＯＨ末端は抗体のＦｃ部分を含むことに 注目されたい。「Ｙ」の結合部はヒンジ領域である。ＮＨ，末端は、抗原特異的 結合に重要な可変領域である。 図２゜モ／　（””Ｉ−ＴＹＲ”）−Ｖｒ　Ｐの？ｘｍＨＰＬＣ精製。 図３゜ｖＩＰ加水分解活性はＦａｂ断片中にある。 図４゜ＩｇＧにより産生されるＶＩＰ断片の同定であり、Ｇｉｎ−Ｍｅｔ結合で の切断を示す：そして触媒性ＩｇＧと非触媒性ＩｇＧの比較。ＶＩＰを免疫性ま たは非免疫性ＩｇＧで処理し、Ｃ−１８カートリツジ上で抽出し、逆相ＨＰＬＣ にかけた。ＶＩＰを抗体で処理した後に見られたＡ、□吸収性物質のほとんどは 、インタクトのＶＩＰの保持時間に近い保持時間のピーク中にあった（２１．３ 分）。緩衝液中または非免疫性１ｇＧで処理した後はペプチドＡとＢは消失して いた。これらのペプチドは再度クロマトグラフィーで精製しくそれぞれ４Ａと４ Ｂ）、アミノ酸配列解析で同定した。 図４Ａ、ＨＩＳ−３ＥＲ−ＡＳＰ−ＡＬＡ−ＶＡＬ−ＰＨＥ−ＴＨＲ−ＡＳＰ− ＡＳＮ−ＴＹＲ−ＴＨＲ−ＡＲＧ−ＬＥＵ−ＡＲＧ−ＬＹＳ−ＧＬＮ。 図４８．ＭＥＴ−ＡＬＡ−ＶＡＬ−ＬＹＳ−ＬＹＳ−ＴＹＲ−ＬＥＵ−ＡＳＢ− ３ＥＲ−Ｉ　ＬＥ−ＬＥＵ−ＡＳＮ。 図５゜Ｆｄ−およびＬ鎖を産生ずるための分解の証明。 ｆｆ１５Ａ０還元、アルキル化抗体の１本鎖の分離。還元、アルキル化Ｆａｂの ゲル濾過プロフィール（Ｓｕｐｅｒｏｓｅ１２）。小さな初期に溶出するピーク と大きなピーク（保持時間３１分）が明白である。 図５８．５ＤＳ−ＰＡＧＥと銀染色により小さなピークに５９ｋＤのバンド（レ ーン２）と大きなピークに２４ｋＤのバンド（レーン３）が現れた。ＳＤＳは分 解を引き起こすため、分解か試料の前処理に起因することを証明するために、以 下の５（Ｃ）のように試料を本来の条件下で操作することが必要である。 図５Ｃ，還元、アルキル化Ｆｄ−１Ｌ鎖混合物（レーン２）およびマーカー蛋白 （レーン１）の本来のＰＡＧＥ　（分離法に誘導される分解がない）。あらかじ め還元しアルキル化するとＦｄ−とＬｊｌが分離することを示している。 図６゜ＩｇＧ、ＦａｂおよびＦｄ／Ｌ２５の濃度上昇の関数としての、インタク トのＩｇＧ、Ｐａｂおよび抗体１本鎖によるＶＩＰ加水分解であり、抗体の連続 的分解により加水分解活性か上昇することを示している。このデータは触媒性成 分は非触媒性抗体から連続的分解により産生されるという理論を支持している。 図７゜ＶＩＰ特異的抗体の触媒性分解されたし鎖の好運な調製。　図７ＡｏＶＩ Ｐ抗体り鎖の精製。 図７８０クロマトフオーカシング（保持時間２６分）により精製された蛋白ピー クの還元５ＤＳ−ＰＡＧＥ、銀で染色（レーン２）、抗ＬＭ抗体（レーン３）お よび抗Ｈ鎖抗体（レーン４）。レーンｌは銀染色したマーカー蛋白を示す。抗Ｈ １抗体では染色がなくなっていること（こ注目されたい。 図７Ｃ，対照のインタクトＩｇＧ調製物の還元５ＤＳ−ＰＡＧＥ　（対象８０か らアフィニティ精製した抗体）。 レーンの位置は（Ｂ）と同じである。 図７Ｄ、精製された抗体り鎖によるＶＩＰ加水分解。 ＶＩＰ自己抗体の精製したし鎖によるＶＩＰ加水分解の飽和動力学（測定チュー ブ当り４　ｎｇ）。データはミバエリス−メンテン式に当てはめてめた。 図８゜培養したＥＢＶ形質転換リンパ球によるＶＩＰ加水分解性抗体の合成。 図９゜Ｆｖ−１１−２融合蛋白の発現プラスミドと発現融合蛋白の模式図。１本 鎖組換えプラスミドを作成するために、触媒性ｍＡＢ由来のＶＨをコードするＤ ＮＡ画分を４５−ｂｐリニアーにより、ｖＬをコードするＤＮＡ画分に結合させ 一次に図に示すようにＶ、をインターロイキン２をコードするＤＮＡ画分に結合 させた。 作成した遺伝子はＴ７プロモーターの制御下にある。 図１０−１２゜プロＡＲＡ−Ｃの産生の化学反応経路１．２、および３゜ 具体的な実施態様 抗体のいくつかの異なる成分が化学反応を触媒することができる。これらの成分 は、それ自身がある反応で触媒活性を有する触媒抗体の触媒性成分であるか、ま たはそれ自身は触媒活性を存さない抗体の成分である。 このいくつかの触媒性成分には、抗体のＦａｂ部分、Ｈｆ１ｊｌのＦｄ断片、会 合していない（すなわち遊離モノマ−）Ｌ鎖とＨ鎖の混合物、ヘテロダイマーで あるかまたはホモダイマーであるダイマー、Ｌ鎖の可変断片、ＨＭの可変断片、 Ｌ鎖の触媒性ドメイン、モしてＨ鎖の触媒性ドメインなとがある。ＦｖやＦａｂ 成分は前述したようにペプチド結合の切断や形成を促進することは知られていな いが、アミドやエステル加水分解のようにエネルギー的にはより厳しくない反応 を触媒することが知られている。 ペプチド結合の切断と形成を促進することかできる抗体の触媒活性は、ＩｇＧ以 舛にそのＦａｂ成分にも存在し、解離したＨ鎖とＬｍ（それぞれ分子量は２５ｋ Ｄ）の調製物中にも存在することが、今や明らかになっている。 ＩｇＧ、Ｆａｂ、および解離したＦｄとＬ鎖はそれぞれ、血管作動性小腸ペプチ ド（ＶＩＰ）を触媒的に加水分解した。 抗体または触媒抗体のいくつかの成分は異なる方法により得られる。いくつかの 成分の触媒性は、一方では元元の抗体または触媒抗体に存在し切断過程で保持さ れ、他方ではこれらの性質は成分を産生ずる過程で形成される。生理的抗体の完 全な構造に拘束されない抗体成分を産生する方法は、例えば非触媒抗体から直接 または間接に（組換え法により）産生される成分のように、触媒性を存する成分 を産生する。 触媒自己抗体 触媒自己抗体の触媒性成分は、まず動物の自己抗原に対すｇ自己抗体を有する動 物を同定し、複数の抗体を含む血清画分を単離し、血清画分をスクリーニングし て、自己免疫疾患に重要な化学反応速度を上昇させる自己抗体を同定し、その自 己抗体の触媒性成分を得ることにより調製される。 動物の自己抗原に対する自己抗体を存する動物は、動物の血漿試料または精製し たＩｇＧ中の、動物自身の自己抗原、動物の自己抗原と同じであるかまたは実質 的に同じである異なる動物の自己抗原、または動物の自己抗原と同じであるか実 質的に同じである合成自己抗原に対する自己抗体の飽和結合を、当業者に公知の 方法で測定することにより同定される。触媒性成分自己抗体は、目的の化学結合 の触媒性切断と形成を促進するものについて自己抗体をスクリーニングすること により同定される。 自己抗体候補を、動物自身の自己抗原、動物の自己抗原と同じであるか実質的に 同じである異なる動物種の自己抗原を接触させ、自己抗原または実質的に同じで ある自己抗原の目的の化学結合の切断または形成の生成物を、当業者に公知の方 法で検出する。 本発明の別の実施態様において、単離された自己抗体は標準的方法で精製された 後限外濾過される。ここで「限外濾過Ｊという用語は、平均カットオフ分子量が ｌ。 ０００からｉｏ、　ｏｏｏダルトンの孔を有する膜を用いて濾過することを意味 する。例えば平均カットオフ分子量が１Ｏ９０００ダルトンの孔を有する膜を用 いて免疫グロブリンを限外濾過すると、分子量か１０，０００ダルトンより小さ い分子は膜を通過し、免疫グロブリンは膜上に残る。この方法は抗体の触媒活性 を活性化し、小分子量インヒビターは限外濾過物から精製される。 次に単離した自己抗体の速度上昇活性についてスクリーニングする。反応物質／ 基質の標準溶液を自己抗体を含有する媒体の一部で処理して、通常の機器法によ り目的の生成物の存在を測定することにより、スクリーニングか便利に実施でき る。この測定は例えば分光学的方法、または気液クロマトグラフィーまたは高速 液体クロマトグラフィーにより、容易に実施できる。目的の生成物または反応物 質／基質の標準試料と比較することにより、反応速度が定量できる。 合理的にデザインされた抗体 合理的にデザインされた触媒抗体の触媒性成分は、米国特許第４．８８８．２８ １号に記載の方法で開始することにより得られる。この方法によれば、（１）反 応物質、（２）ペプチドまたは他の担体分子に結合した反応物質、（３）反応中 間体、（４）反応物質の類似物、（５）産生したモノクローナル抗体が反応物質 または反応中間体に結合することができるモノクローナル抗体の類似物、または （６）反応中間体の類似物よりなる群から選択される抗原に対する複数のモノク ローナル抗体が調製される。こうして産生された複数のモノクローナル抗体はス クリーニングして、目的の反応を触媒するモノクローナル抗体や、いくつかの成 分に分離され、それらの成分は触媒性成分か得られるように活性がスクリーニン グされている、目的の触媒活性を有することか好ましいモノクローナル抗体か同 定される。 さらに別の関連する方法において、動物を（１）反応物質、（２）ペプチドまた は他の担体分子に結合した反応物質、（３）反応中間体、（４）反応物質の類似 物、（５）産生したモノクローナル抗体が反応物質または反応中間体に結合する ことができるモノクローナル抗体の類似物、または（６）反応中間体の類似物よ りなる群から選択される抗原で免疫して、動物中で抗体産生リンパ球を産生させ 、抗体産生リンパ球を動物から取り出し、これらのリンパ球をミエローマ細胞と 融合させて、それぞれがモノクローナル抗体を産生ずる複数のハイブリドーマ細 胞を産生じ、この複数のモノクローナル抗体をスクリーニングして反応を触媒す るモノクローナル抗体を同定し、このモノクローナル抗体の触媒性成分を以下に 記載するようにして得る。 さらに別の関連する方法において、酵素により触媒されることが公知の化学反応 の触媒性抗体がまず得られ、次にその成分をスクリーニングして触媒性成分を同 定する。この方法では酵素に対して複数のモノクローナル抗体が産生され、この 複数のモノクローナル抗体をスクリーニングして反応物質の酵素に対する結合を 阻害するモノクローナル抗体を同定し、最初のモノクローナル抗体を回収する。 次に最初の抗体に対する複数の抗イデイオタイプモノクローナル抗体を産生させ 、これらをスクリーニングして、反応物質に結合し反応速度を触媒的に上昇させ る第２のモノクローナル抗体を同定し、モノクローナル抗体を小さくしてその成 分にし、これらをスクリーニングしてモノクローナル抗体の触媒性成分を得る。 上記の各方法において、触媒性成分が公知の場合成分のスクリーニングを省略し て、抗体の目的の触媒性成分を直接得ることもできる。 触媒性成分が触媒抗体のＬ鎖またはＨ鎖の場合、これらの鎖は触媒抗体が精製さ れ次にＦａｂやＦｃ画分に切断される方法で調製される。次にＦａｂ画分を還元 アルキル化してＬ鎖とＨａＩをつないている結合を切断し、Ｌ鎖とＨ鎖を分離す る。 触媒性成分が触媒抗体の１本鎖である場合、これらの鎖は触媒抗体をそのＬ鎖と Ｈ鎖に解離させ、次にこれらをＬ鎖とＨ４ｉを分離することにより調製される。 分子量または電荷に対して選択的なカラムに抗体を通すことにより分離できる。 この工程である割合の抗体蛋白績は自然に解離し、別の１本鎖ピークとして現れ る。これは、抗体を界面活性剤中でアルカリ性ｐＨで５μｇ／ｍ　ｌ以下の濃度 に希釈した後に分離することにより促進されるようである。 あるいはＬＨとＨａは、メルカプトエタノール、ジチオスレイトール、およびメ ルカプトエチルアミンよりなる群から選択される還元剤で抗体を還元し、次に還 元抗体のＳＨ基を、ヨードアセトアミドやヨード酢酸よりなる群から選択される アルキル化剤でアルキル化する方法により、解離させることができる。 触媒抗体の触媒性成分を得るためのさらに別の方法では、触媒抗体を精製し、精 製した抗体をＦａｂとＦｃ画分に切断し、Ｆａｂ画分を還元して次にアルキル化 してＬ鎖とＨａＩのＦｄ断片をつないでいる結合を切断し、Ｌ鎖とＨａのＦｄ断 片を、結合誘導性の条件下で上記り鎖とＨ鎖のいずれかに結合することができる リガンドまたは他の結合性分子に接触させ、そして結合したＬ鎖または結合した Ｈ鎖のＦｄ断片を非結合の成分から分離することにより、ＬＭまたはＨ鎖のＦｄ 断片を調製することができる。 触媒性成分は、触媒抗体またはそのＨ鎖またはＬＨの可変領域の一部であり、触 媒活性を存するポリペプチドよりなる触媒性ドメインでもよい。触媒性成分は、 触媒性成分からコピーされた核酸遺伝子配列を非ハイブリドーマ細胞中で発現す ることにより複製することができる。 例えば成分をコードする遺伝子の一部を細胞中に挿入することにより、その成分 を複製することができる。 あるいは触媒性成分は、触媒抗体の可変領域を一連のペプチド配列に切断して、 これらのペプチドをスクリーニングして触媒活性を有するペプチドを同定し、次 に同定された触媒性ドメインをｍ製することによりｗＲ製される、触媒性ドメイ ンでもよい。好適な実施態様において触媒性ドメインは、順に小さいペプチド配 列を産生させ、これらの切断された配列をスクリーニングして触媒活性を有する ものを同定する追加のステップを含む方法で、調製することもできる。次にこの ステップを切断生成物中に触媒活性が認められなくなるまで繰り返す。次に同定 した触媒性ドメインを精製する。ペプチド配列の測定により触媒性ドメインが同 定されれば、コピーを合成することかできる。 触媒性ドメインは、触媒抗体のＶ、またはＶ□のペプチド配列を測定し、次に可 変領域のペプチド配列を示す同種ペプチドの重複するシリーズを合成し、重複す る同種ペプチドのシリーズをスクリーニングして好ましい触媒性を有するものを 選択し、選択したペプチド配列を合成することにより、調製することもできる。 触媒抗体のＶＬまたはＶＨの核酸配列を測定し、この核酸配列を断片に切断し、 重複するオリゴ核酸サブ配列を合成し、次に公知の方法でこれらのＶＬまたはＶ 。サブ配列を細胞株中で発現させることにより、同様の結果を得ることかできる 。次に得られたサブ配列ペプチドのシリーズを、前記のように好ましい触媒性に ついてスクリーニングする。 さらに別の方法では、触媒性ドメインは、触媒抗体の可変領域の配列を決定し、 触媒抗体の可変領域をコートする遺伝子を任意の細胞（原核または真核）中に挿 入し、細胞中で可変領域を発現させることにより、調製することができる。挿入 された遺伝子は可変領域の断片をコードする。細胞は動物細胞（例えば哺乳動物 細胞）、植物細胞、または微生物（例えば細菌、酵母、カビ、原生動物、および 菌類）でもよい。必要な場合には、遺伝子を細胞に挿入する前に突然変異誘発を させてもよい。 本発明のさらに別の方法においては、触媒抗体の触媒性成分は、抗体の可変領域 をコードする少なくとも１つの核酸配列を任意の細胞中に挿入し、挿入の前また は後に核酸配列に突然変異誘発をさせ、細胞とその子孫を目的の触媒活性を示す 抗体の突然変異した可変領域の存在についてスクリーニングし、細胞を複製し、 そして突然変異した核酸配列を発現させて目的の触媒活性を存する翻訳生成物を 産生させることよりなる方法により、産生される。 追加の方法において、抗体を産生する細胞の集団（例えばハイブリドーマ）は、 インタクトの生理的抗体の産生のすべてまたは一部の代わりに、Ｌ鎖やＨ鎖のよ うな抗体の生成物を産生ずる細胞について選択される。 本発明の触媒性成分は、互いに、または他の非触媒性、化学的、生物学的、また は機械的機能を有する分子に結合または会合させることが有用である。会合は非 共有結合（例えば水素結合または電荷相互作用または関連するタイプの会合）で もよい。会合は共存結合でもよく、当業者に公知の任意の方法を用いて生成物と 結合した分子の目的の機能を保持しながら生成物を互いにまたは他の分子に結合 させる。 キメラ生成物は、触媒抗体の成分と少なくとも１つの他の蛋白を含有する連続的 ポリペプチド配列をコードする核酸を発現させることにより調製できる。すなわ ちこの核酸配列は、抗体の触媒性成分をコードする最初の核酸配列、そして同じ 触媒性成分、異なる触媒性成分、または触媒性成分とは異なる生物学的機能を有 する少なくとも１つの追加の蛋白をコードする少なくとも１つの追加の核酸配列 よりなる。追加の蛋白はりガントのような生物学的結合性蛋白（例えばアビジン 、ストレプトアビジン、蛋白Ａおよび蛋白Ｇ）でもよい。追加の蛋白は、目的の 抗原に結合する抗体のＨ鎖またはＬＭでもよい。 あるいは追加の蛋白は目的の抗原に結合することかできる抗体の可変領域でもよ い。 治療、鈴断または産業用の目的に、本発明の触媒性成分、蛋白またはペプチドを 、インビボで発現し分泌する細胞を作成することかできる。好ましい触媒性成分 、または１つまたはそれ以上の成分を取り込んでいるキメラ蛋白を発現するよう に（蛋白は公知の方法で細胞内、または細胞表面に留まるように、または細胞か ら分泌されるようにデザインされる）遺伝子操作した動物または植物から取られ 、次に細胞は動物または植物に再導入され、ここで触媒性成分は目的の機能（例 えば治療、代謝、免疫的、または診断機能）を果たす。 本発明を以下の例でさらに説明する。 気エ アフィニティクロマトグラフィーによるヒトの血液からのＶＩＰ特異的触媒自己 抗体の精製 ＶＩＰ加水分解性自己抗体を含有するＩｇＧ画分は、ＶＩＰの比較的強固な結合 を示す。この性質は、ＶＩＰセファロースカラムで特異的触媒自己抗体を精製す るのニ使用すレル。約２０，０ＯＯＣＰＭ（Ｄ　（Ｔ　ｙ　ｒ　ｌｏ−”’　Ｉ 　）−ＶＩＰと混合物下合成ＶＩＰ　（１０■）を、製造業者の方法に従い（１ ６）５ｇのＣＮＢｒ−セファロースに共有結合させた。結合効率は、固定化され た放射能がら判断すると約９０％であった。ＶＩＰ−セファロース（４゜５ｍｌ ゲル）は、３．５ｍｌの１００ｍＭグリシン、５０ｍＭ）リス−塩酸、ｐＨ８， ０中で４℃で２時間、１５■のＩｇＧとインキュベートさせた。この混合物をカ ラムに注ぎ、Ａ、。がバースラインに戻るまでゲルを緩衝液で洗浄し、結合した ＩｇＧをＯ，１Ｍグリシ：／−ＨＣｌ、ｐＨ２，７で溶出し、ＩＭ）リス−塩酸 、ｐ）（９，０で中和した。この抗体調製物をＰＨＡＳＴゲルで分析的等電点） オーカシング（ｐＨ勾配３−１０）した後、銀染色すると、ｐ７６．５から３． ５の近接して存在する一連のバンドが現れた。 還元条件下で（５％メルカプトエタノール）の５ＤＳ−ゲル電気泳動の後銀染色 およびイムノブロッティングすると、抗体は５０ｋＤのＨ鎖と２５ｋＤのし鎖よ りなることか明らかになった。アフィニティ精製した抗体を３８°Ｃで３時間２ １０　ｐｇｃ７）（Ｔｙｒ”−”’　Ｉ）−ＶＩＰとインキュベートし、保存の 混合物を七パック（Ｓ　ｅ　ｐ　ｐ　ａ　ｋ）Ｃ−１８カートリツジで抽出し、 逆相ＨＰＬＣにかけた（図２）。インタクトのの１５　■−標識ＶＩＰ　（保持 時間２１．０分）とは明らかに異なる、速く溶出する放射能のピーク（保持時間 １０分）に注目した。この速く溶出する放射能のピークの保持時間は、１！５　 Ｉて標識した合成ＶＩＰ　（１−１６）と同じであった。非分画化ＩｇＧは、残 基１６と１７の間のペプチド結合でＶＩＰを切断することはすでに証明されてい る（１７）。ここに示したデータは、アフィニティ精製した物質はＶＩＰを同じ 結合（Ｇ　Ｉ　ｎ　”−Ｍｅ　ｔ　１７）で切断することを示していたＡ、＋２ Ｊ−標識ＶＩＰ基質の調製 （Ｔｙｒ”−”’　Ｉ）−ＶＩＰを公知の方法で調製した（２９．１）。精製し たブタのＶＩＰのヨード化は、リン酸ナトリウム緩衝液中でクロラミンＴ法で行 った。 Ｃ１８カートリッジで予備的に分画した後、反応混合物をツババック（Ｎｏｖａ ｐａｋ）ＣＩ　８カラムの逆相ＨＰＬＣで、溶出にアセトニトリル中トリフルオ ロ酢酸の濃度勾配を用いてさらに精製した。アミノ酸配列決定では、速く溶出す る放射能のピーク（保持時間２５．３分）は（Ｔｙｒ”−＋２’　り−ＶＩＰに 相当し、第２の放射能のピーク（保持時間２７．８分）はジ（Ｔｙｒ’０１１６ Ｉ）−ＶＩＰ、Ｔｙｒ２ｆ）ＶＩＰに相当することを示していた（図２）。ペプ チドのモノヨード化型は、非標識ＶＩＰに構造か最も対応するから、好ましい。 Ｂ、ｌ！Ｊ−標識ＶＩＰ基質の加水分解ＶＩＰ加水分解の動力学を評価するため に、約３０ｐＭの（Ｔｙ　ｒ　１０−”’　Ｉ　）　−Ｖ　Ｉ　Ｐの存在下で、 ６６．３ｎｇの精製した抗体を増加する濃度のＶＩＰとインキュベートした。反 応を１０％のトリクロロ酢酸で停止させた。これは未分解のＶＩＰを沈澱させ、 抗体媒介加水分解により産生された放射性断片（Ｖ　Ｉ　Ｐ　１−１６）を上澄 液中に残す方法である。ＶＩＰ加水分解速度の逆数とＶＩＰ濃度のプロットは直 線であり、これはミバエリス−メンテン式動力学に一致することを示唆していた 。プログラムＥＮＺＦ　Ｉ　ＴＴＥＲ（ｆｆ−ルセビア（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ）） を用いて、データから計算したに、とＫ　６　ｍ　ｌは１１０．４ｎＭと０．１ １分−１であった。 以前の研究は、ＶＩＰ結合実験で検出された自己抗体はペプチドの加水分解に関 与していると仮定する（１７）と、自己抗体の複数回の回転を示していた。ここ に示したデータは、自己抗体による効率的な触媒の直接的証拠加水分解の存在を 測定するための標準的プロトコール。 最終測定量は２００μｌとしたが、各成分の量は実験の目的により変わる。 希釈はすべて分解緩衝液（０，１Ｍグリシン−ＨＣｌ１．５０ｍＭトリス−塩酸 、ｐ　Ｈ８，０，０，０２５％ツイーンを含む）。試料１ｇＧは、典型的には最 初の試験用に開始濃度を１■／［１１１と０．５■／ｍｌとした。ＶＩＰ特異的 抗体はさらに低い濃度で使用した（約ｌμｇ／ｍｌ）。 ”’Ｉ−ＶＩＰは５０μｍ当り１５．０００　ｃ　ｐ　ｍに希釈した。 ＢＳＡ　（４％保存液）は、最終測定濃度が０．１％になるように希釈した。普 通０．２％ＢＳＡの１００μｍを測定に加えた。 測定用試験管には、０．２％Ｂ　Ｓ　Ａ　１００μｌ、＋２５１−ＶＩＰ５０μ ？　（１５，０００ｃｐｍ）そしてＩｇＧ試料５０μｍを加えた。抗体の変わり に緩衝液を含む１セツトの試験管を対照として取っておいた。 すべての試験管にキャップをして、すべての成分を加えてからポルテックスした 。 インキュベーションは振盪水浴中で３８°Ｃて３時間行った。各試験管のキャッ プを取り、ＴＣ以外のすへての試験管にｌ［Ｉｌｌの１２％冷ＴＣＡを加え、ポ ルテックスした。 遠心分離は５８００ｒｐｍて２０分行った。ＴＣ以外のすへての試験管を吸引し た。ペレットをガンマカウンター中で計測した。（図４）。 血漿からのＩｇＧの蛋白Ｇ−セファロース精製蛋白Ｇ−セファロース（ファルマ シア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　）　）を焼結ガラス製ロー）　（＃３６０６０　、 パイレックス（Ｐｙｒｒｅｘ）　）またはカラム中で水で洗浄した。洗浄には、 ゲル１ｍｌ当り少なくとも３ｍｌの水を使用した。焼結ガラス製ロートまたはカ ラム中にゲルを少なくとも３回懸濁した。次にゲルを０．０５ｍのトリス−塩酸 、ｐＨ７，３（開始緩衝液）に再懸濁し、適当なサイズのカラムに充填した（す でに注ぎ込まれているカラムでは自然に充填させた）。ヒト血漿各１ｍｌに蛋白 Ｇ−セファロース１ｍｌを使用した。次にカラムをカラムの２−３倍量の開始緩 衝液で平衡化させ、直径０．７ｃｍのカラムには０．４ｍｌ　／分で、直径ｆａ ｎのカラムには０．８ｍｌ　／分で流した。試料を遠心分離しく５，０００　ｒ 　ｐｍ、１０分）、ミリスーＧＳフィルター（０，２２μＭ）で濾過し、　カラ ムにかけ（透析した血漿に硫酸アンモニウム沈澱物）、ゲルペッドに流した。 開始緩衝液を加え、Ａ２８０がベースラインに戻るまで流した。（ピークが現れ なかった場合は１５ｍ１の開始緩衝液を流した。） 次に緩衝液を０．１Ｍグリシン−ＨＣｌ、ｐＨ２，７に変え、同じ流速で溶出さ せた。酸誘導性の変性を最小にするため画分（１ｍｌ）をＩＭ）リス−塩酸、ｐ Ｈ９を５０μＩ含む試験管中に集めた（これでｐＨが７．８になる）。 カラムを開始緩衝液で再度平衡化させ（２倍量）、４５°Ｃて２０％のエタノー ルに保存した。 汽盈 ＶＩＰ自己抗体の触媒性鎖の精製 ヒトのＩｇＧ（コード＃３９）をＶＩＰ−セファロースのアフィニティクロマト グラフイーにかけた。次にアフ・　イニティ精製した抗体をモノーＰカラム上で ３段階でクロマトグラフィーした（１８）。これら３つのクロマトフオーカシン グで使用したｐＨ１１度勾配は、７．０から４゜０　、９．０から６．０、最後 に１０．５から７．０である。最初の２回のタロマドフォーカシングで保持され なかった画分中に、ＶＩＰ加水分解性抗体を回収した。３回目のクロマトフオー カシングでｐＨ８，３と７．８の間に溶出する蛋白かＶＩＰ加水分解活性を有し ていた（図７Ａ）。分析的等電点電気泳動の後に銀染色することにより、この調 製物のｐ１９．６のところに単一の蛋白バンドが現れた。 ５ＤＳ−ＰＡＣ；Ｅ　（非還元）により２つの蛋白ノくンドが現れた。大きなバ ンドの分子量は２５ｋＤであり、イムノブロッティングで抗ヒトＬＭ抗血清で染 色可能であった。 小さいバンドの分子量は５５ｋＤであり、これも抗り鎖抗血清で染色可能であり 、これがＬ鎖ダイマーであることを示唆していた。これらのデータは、この調製 物は主にＶＩＰ−自己抗体由来のＬｆｆｌよりなることを示唆している。５ＤＳ ｉ気泳動の別の方法によっても同様の結果か得られた。還元条件下で電気泳動さ れたＩｇＧ抗体の精製は２６ｋＤの抗Ｌｆｆｌ染色バンドと６１ｋＤの抗Ｈ鎖染 色バンドを示していた（図７Ｂ）。 このデータは、クロマトフオーカシングした調製物は検出てきる量のＨ鎖を含ま ないＬｉＪｌよりなるという結論を支持している。このＬ鎖両分はｋｃＡｔ　９ ２．４分−１とＫ。 ４．９μＭでＶＩＰを加水分解した（図７Ｄ）。ＬＭに対）　するこのに、値は 、開始１ｇＧより約４５倍太き（、結合親和性が低下していることを示唆してい る。 例６ 精製されたＬｉｉによるＶＩＰ加水分解ＶＩＰ加水分解の動力学を評価するため 、約３０ｐＭ（（Ｔｙ　ｒ　”−”’　Ｉ　）　−Ｖ　Ｉ　Ｐｃ７）存在下で非 標識ＶＩＰの濃度を上昇させて約３．７μｇの精製し鎖とインキュベートした。 反応を１０％のトリクロロ酢酸で停止させた。 この操作により未分解のＶＩＰを沈澱させ、加水分解されたＶＩＰの放射性断片 をスーパーマーケット中に残る。 ＶＩＰ加水分解速度の逆数とＶＩＰ濃度のプロットは直線であり、ミバエリス− メンテン動力学に一致することを示唆している。プログラムＥＮＺＦ　ＩＴＴＥ Ｒ（エルった。 単離されたＬ鎖は、抗体調製物を非常に薄い濃度（５１１ｇ／ｒｎ１未ＮＲ）で 扱い極端なｐＨ値（ｐＨ１０，５まテ）ニ接触させた結果、Ｈ鎖とＬ鎖の間のジ スルフィド結合の自然の還元により出てきた可能性がある。このデータは、を明 白に示している。 ５０中にシスティン（シグマ（Ｓｉｇｍａ　）　）を２０ｍ　Ｍになるように加 え、消化緩衝液を作成した。次に固定化パパインアガロースゲル（ピアス（Ｐｉ ｅｒｃｅ）　）　（０，５ｍｌ、沈降したゲル容積０．２５ｍ１に相当）スラリ ーを１３ｘ１００ｍＭガラス試験管に加えた。次に沈降したゲル０．７５ｍ１を 用いて１７．５■のＩｇＧを消化した。次に４ｍｌの消化緩衝液を加え、混合し た。この混合物を１１０００ｒｐで５分間遠心分離した。緩衝液を捨て操作を繰 り返した。パパインゲルを０．５ｍｌの消化緩衝液中に懸濁し、２５ｍ　ｌのフ ラスコに移した。ＩｇＧ（１０■まで、通常２−７．５■）をパパインケルに加 えた。消化緩衝液を加えて総インキュベーション容量を１．５ｍｌ　とした。 インキュベーションは３８°Ｃて撹拌（振盪水浴の最高スピード）しなから５時 間または一晩行った。インキュベーション後１．５ｍｌの１０ｍＭ１−リス−塩 酸ｐＨ７，５を加え、ゲルと溶液を１３Ｘ１００ｍＭのガラス試験管に移した。 これを１１００Ｏｒｐで５分遠心分離した。 次に上澄液を、平衡化させた蛋白Ａアガロースカラム（２０■までのパパイン消 化１ｇＧに対してゲル２．５ｍｌ　）にかけた。蛋白Ａアガロースカラムで残存 するインタクトのＩｇＧからＦａｂを分離した。開始緩衝液は１０ｍ　Ｍのトリ ス−塩酸ｐＨ７，５であり、カラムを０．１Ｍクエン酸、ｐＨ３で再生し、保存 は０．２％アジ化ナトリウム中で行った以外は、例４の蛋白Ｇ−セファロースカ ラムと同じ方法で、蛋白Ａカラム精製を行った。パパイン消化物質をカラム（あ らかじめクロマトグラフィー緩衝液で平衡化させておいた）にかけた。保持され なかった部分を、電気泳動でＦａｂの純度について試験した（図３Ａ）。保持さ れた部分は消化されなかったＩｇＧ１Ｆｃ断片およびＦｃ部を有する他の断片の 混合物であった。 Ｆａｂは例７（図３Ｂ）の方法を用いて、　＋２Ｊ−標識ＶＩＰを触媒的に加水 分解することか可能であった。 例８ Ｈ鎖とＬ鎖（Ｆｄ／Ｌ　２５ｋＤ）の解離した混合物の調製 約２■のＦａｂ　（例５）に、ＮａＣ１を０．１５Ｍに加え、最終容量５ｍｌの ５０ｒｎ　Ｍのトリス−塩酸、ｐＨ７，３にメルカプトエタノールを加えた。こ の混合物を２４°Ｃで３時間撹拌しながらインキュベートした。次に２ｍｌの０ ．５Ｍヨードアセトアミドを加え、その後ＩＭのトリス−塩酸（９００μｌ）を 添加してｐＨを７．５とした。この混合物を２４℃で１５分間撹拌しながらイン キュベートした。次に］ＯｋＤのウルトラフィルター（ＹＭＩＯ）で試料を濃縮 して容量を約１ｍｌに減少させた。 得られた濃縮試料を５ｕｐｅｒｏｓｅ−１２上で緩衝液（０，１Ｍグリシン−Ｈ Ｃｌ、０．０５Ｍ　）リス−塩酸、ｐ　Ｈ８，０，０，０２５％ツイーン２０を 含む）中でクロマトグラフィーした。Ｓ　ｕ　ｐ　ｅ　ｒ　ｏ　ｓ　ｅ　−１， ２の蛋白ピークを５ＤＳ−ＰＡＧＥで分析した（図５Ｂ）。プールした機能は５ ＤＳ−ＰＡＧＥ分析で分子量２５−３０　ｋ　Ｄを示した。 これはＦｄ／Ｌ２５画分である。図１０のレーン２の小さなピークは非解離のＦ ａｂてあり、大きなピークは会合していないの２５ｋＤのＦｄ／Ｌであることに 注目されたい。Ｆｄ／Ｌ鎖混合物は図６に示すようにＶＩＰの切断を触媒するこ とかできた。 例９ Ｈ鎖と１７鎖の解離した混合物の精製されたＦｄ−とＬ鎖を、解離したＦｄ、解 離したし鎖、およびダイマーに分画するために、さらに分離操作を行った。最初 の分離操作は、適宜１０．５−７．０．９．０−６．０　、または７．０−４． ０のｐＨ濃度勾配を用いる、モノーＰカラムによるクロマトフす一カシングであ る。溶出液の吸光度（２８０ｎｍ）とｐＨを追跡した。蛋白ピーク中のＶＩＰ加 水分解活性を測定する。ＶＩＰ触媒活性を有する蛋白ピークを集めさらに分析す る。ＶＩＰ触媒活性を有する蛋白ピークは分子量約２５−２６ｋＤと約５Ｏ−６ ０ｋＤを有する。蛋白の正体をＰｈａｓｔゲル（ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃ ｉａ　）　、８−２５％）上の５ＤＳ−ゲル電気泳動に続き銀染色とイムノブロ ッティングにより、確認する。 Ａ、標準化イムノブロッティング法 以下の標準法を用いてＦｄ、Ｈ鎖、Ｌ鎖および高感受性を有する抗体の他の成分 を検出した。ゲルをニトロセルロース膜上にプロットし、抗ヒトＬ鎖（カッパ／ ラムダーゼの結合した抗ウサギＩｇＧとインキュベートし、洗浄し、次にジアミ ノベンジジンとＨ２Ｏ２で染色した。 Ｂ、イムノブロッティング解釈 抗り鎖および抗Ｈ鎖抗体による２６ｋＤバンドの染色は、それぞれＨ鎖とＦＤ− の存在を示している。２６ｋＤのバンドが１つのタイプの抗血清では染色される か他のタイプの抗血清では染色されないことは、この調製物が純粋なＦＤ−また はＬ鎖よりなることを示している。５Ｏ−６０ｋＤのバンドの染色は、これらが 存在するときホモダイマーまたはへテロダイマーを示している。イムノブロッテ ィング中で１つの抗血清でこのバンドが染色されないことは、Ｆｄ−Ｌへテロダ イマーば存在しないことを示別の方法では、固体支持体に固定された特異的抗Ｈ 鎖（例えば抗Ｆｄ）または抗Ｌｆｄｌを用いてアフィニティクロマトグラフィー を行う。 これらの抗血清（または腹水）からのＩｇＧを、蛋白Ｇ−セファロースでクロマ トグラフィーして精製し、次にＣＮＢｒ−セファロース（ファルマシア（Ｐｈａ ｒｍａｃｉａ　）　）に共有結合（１６）させる。 会合していない混合物から解離したＦｄ−とＬ鎖を分画するために、これらの固 定化抗体で調製したカラムを用いてアフィニティクロマトグラフィーを行い、酸 ショック（ｐＨ２，７）を用いて保持された蛋白を溶出させる。 分画した物質の正体をＦＤ−とＬＨのイムノブロッティングで確認する。ＰＨＡ ＳＴゲルで本来のポリアクリルアミドゲル電気泳動と銀染色を行って、精製した ＦＤ−とＬ鎖がモノマーであることを確認する（図５のように）。抗体と抗体断 片は非常に塩基性であるため、必要な場合は本来のＰＡＧＥに逆極性電極を使用 する。 例９から得られたインタクトのＦａｂ成分と、精製された解離したＦｄ酸成分よ びＬ鎖の触媒性成分と動力学を測定した。約３．０００ＣＰＭの加水分解を与え るのに充分な抗体濃度を、順に濃度を増加させた非標識ＶＩＰの存在下テ（Ｔｙ ｒ　”−”’Ｉ）　Ｖ　Ｉ　Ｐトコ８°ｃで３時間インキュベートさせた。抗体 により可溶性にされた１０％ＴＣＡ中の放射能の量から、加水分解されたＶＩＰ の量を計算した。ＴＣＡ沈降法はＶＩＰ加水分解の作動な指標であることを確認 するために、抗体処理（Ｔｙ　ｒ　ｌｏ″′”Ｉ）　Ｖ　Ｉ　Ｐ（７）逆相ＨＰ ＬＣを行った。抗体がＶＩＰの残基７と２２に存在するペプチド結合を切断する 場合、インタクトの（Ｔｙｒ””’Ｉ）ＶＩＰ　（保持時間２５分）の放射能量 の減少は、ＴＣＡ可溶性になった放射能量に等しい。プログラムＥＮＺＦ　ＩＴ ＴＥＲ（エルセピア（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ））によりデータを解析し、基質濃度に 対して加水分解速度をプロットした。 反応動力学は基質濃度に対して１次であった。データを式Ｖ＝Ｖ　［Ｓ］　／に 、＋　［Ｓ］に当てはめた（ここでＶは最大反応速度であり、Ｋ、はＶ／Ｗでの ＶＩＰ濃度であり、■は初期反応速度であり、［３］はＶＩＰａ度である）。Ｋ 　ｅ　ａ　ｌは［抗体または抗体１本鎖１ピコモル当り１分間に加水分解された ＶＩＰのピコモル；結合価（インタクトのＩ　ｇＧ＝２　；　Ｆａｂ＝ｌ、Ｈ鎖 およびＬ鎖＝１）と分子量（Ｆ　ａ　ｂ６０ｋＤ　；　Ｆ　ｄ−およびＬ鎖、２ ５ｋＤ）に対して標準化されているコとして得られる。 触媒効率はに、、、／に、として計算される。解離した鎖に対してに、値が増加 していることは、結合親和性が減少していることを示している。Ｋ、値の増加は 、結合段階か律速段階てないかぎり、触媒速度に対して有害で各成分によりどの ＶＩＰペプチド結合が切断されるかをめるために、試験した各タイプの成分によ り標識ＶＩＰを切断した。（Ｔｙ　ｒ　”−１２””）　Ｖ　Ｉ　Ｐ　（５０μ ｇ　）または（Ｉ４Ｃ−Ｈｉ　ｓ、　”Ｈ−Ａｓ　ｎ”）　Ｖ　Ｉ　Ｐ　（５０ μｇ）を、ＩｇＧ、Ｆａｂ、１木調ＦｄおよびＬＨ（動力学解析により、少なく とも５％のペプチドを加水分解するのに充分な量）、非免疫ＩｇＧまたは測定希 釈液で、３８°Ｃで３−６時間処理する。反応混合液をＣ−１８カートリツジ（ オールチク（Ａｌｌｔｅｃｈ　）　）上で抽出し、溶出液を真空下で乾燥し、ト リフルオロ酢酸中のアセトニトリルの濃度勾配を用いてツバパック（Ｎｏｖａｐ ａｃｋ’）　Ｃ−１８カラムの逆相ＨＰＬＣにかけた。２１４ｎｍでの溶出液の 吸光度を追跡した。免疫ＩｇＧで処理したＶＩＰの反応混合物中にはＡ１□４吸 収性放射性ペプチドが存在したか、当量の非免疫ＩｇＧで処理したＶＩＰ中には 存在せず、測定希釈液をプールし、最初のＨＰＬＣての溶出挙動に基づき２回目 の逆相ＨＰＬＣでさらに精製した。精製したペプチドは、オンラインＰＴＨ−ア ミノ酸検出装置がついたアブライトバイオシステムズ（ＡｐｐｐｌｉｅｄＢｉｏ ｓｙｓｔｅｍｓ　）のパルストリキッドフエーズシークネーター（ｐｕｌｓｅｄ 　１ｉｑｕｉｄ　ｐｈａｓｅ　５ｅｑｕｅｎａｔｏｒ）を用いて配列を決定した 。切断した結合を、切断断片のサイズと本体から同定した。 Ｃ，ＶＩＰに関係のないペプチドを切断する触媒抗体と１本鎖成分の能力の測定 １本鎖触媒性成分による切断の配列特異性をめるために、触媒抗体と１本鎖触媒 性成分の加水分解活性を比較した。基質は、上記例９で同定された切断されやす い結合を存するかＶＩＰとはほとんど配列の同一性のないＩｔｓ　ｌ標識ペプチ ドである。これは触媒抗体との基質相互作用における、基質中の切断されやすい 結合から遠い残基の役割を最小にする。Ｇ　１　ｎ”−Ｍｅ　ｔ　”切断性触媒 抗体にとって、適切な基質はすい臓性ポリペプチド（ＰＰ）である。ＰＰはＶＩ Ｐとは３つの配列のみか同一であり、そのうち２つは切断されやすい可能性のあ る結合であるＣＧ１ｎ目−Ｍｅｔ”）。他のタイプの抗体の基質は市販の１２′ Ｉ標識ペプチド（例えばＡＮＰ、インスリン、ソマトスタチンおよびエンドセリ ン）から選択される。これらのペプチド（約１００．０００　ＣＰ　Ｍ）を、例 ２に記載したようにＶＩＰの切断速度を試験するのに用いた実験条件を用いて、 インタクトのまたは１本鎖抗体の基質として試験する。反応混合物をＣ−１８カ ートリツジで抽出し、逆相ＨＰＬＣにかける。インタクトのペプチドの保持時間 とは異なる保持時間を存する放射性ピークの出現は、抗体によるペプチドの加水 分解を示唆する。予備的スクリーニングで加水分解された基質を、さらに切断さ れやすい結合の同定について試験する。この方法はＶＩＰ中の切断されやすい結 合を同定するのに使用した方法と類似であり、すなわち比活性の小さいＩｔｓ　 ｌ標識基質の使用、分解力のある逆相ＨＰＬＣによるペプチドの精製、そしてア ミノ酸配列決定による断片の同定である。 Ｄ、ＶＩＰの類似物を切断するインタクトの抗体と１本鎖抗体の能力の測定 切断されやすい結合でアミノ酸置換を育するＶＩＰ類似物を、企図して使用する ために合成した。置換は元々の残基に似ていない残基によるか、または電荷また は形が似ている残基による。例えば、（Ａｓ　ｎ”、Ｎｌ　ｅ”）ＶＩＰと（Ａ 　１　ａ　”、Ａ　１　ａ　′７）を、Ｇｌｎ”−Ｍｅｔ”切断性触媒抗体の基 質として試験した。これらの基質を切断するインタクトの抗体と１本鎖抗体の能 力を、分解力のある逆相ＨＰＬＣで試験した。これらの基質を、例２で記載した ように’ｌ’　ｙ　ｒ　ｌ　ＯでＩｔｓ　１で標識する。例２で使用した方法と 類似の方法（これは当業者には公知である）で調製した’ｌ’　ｙ　ｒ　Ｉ　Ｏ で１２５Ｉで標識した合成ＶＩＰ（１−１６）、（Ａｓｎ”）ＶＩＰ　（１−１ ６）、（Ａｌａ”）ＶＩＰ　（１−１６）を標準物質として使用した。基質を抗 体で処理した後に産生された放射性ペプチドと一緒に合成標準物質が溶出すると いうことは、残基１６と１７の間で切断されている証拠と考えられる。これらの ペプチドが触媒抗体の基質として作用する相対的能力は、インタクトＶＩＰと分 画ＶＴＰを区別するトリクロロ酢酸を用いてに、とｋ　ｅ　ａ　＋を測定するこ とによりめ触媒性成分のｃＤＮＡのクローニングと発現触媒性成分ｃＤＮＡのク ローニングは３つの方法のうちの１つを用いて行う。好適な方法では、触媒性Ｖ ＩＰ抗体を産生ずるクローン性ヒトハイプリドーマ細胞株のｍＲＮＡを、出発物 質として用いる。細胞を集め、当業者に公知の標準的方法でｍ　ＲＮ　Ａを抽出 する。当該分野で公知の標準的方法で、ｍＲＮＡの逆転写によりｃＤＮＡを調製 する。Ｆｄ−とＬ鎖のｃＤＮＡを、以下に記載する適当なプライマーを用いてポ リメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で増幅する。増幅したｃＤＮＡを次に標準的方法 で発現ベクターに結合させ、大腸菌中で別々に発現させ、発現した１本鎖抗体の 性質を測定する。 第２の方法は、クローン性抗体産生細胞の利用に依存しない。出発物質はエプス タインバーウィルス（ＥＢＶ）形質転換抹消血リンパ球からのｍＲＮＡである。 ｃＤＮＡは前述したように調製、増幅され、ライブラリーは標準的方法で、ＶＩ Ｐ加水分解のバックグランドの少ない培養上澄液の好適な性質で選択された哺乳 動物の細胞株中で発現され、得られる組換え細胞は次に加水分解性ＶＩＰ抗体に ついて直接スクリーニングされる。哺乳動物中でＶＩＰ触媒活性が最も高いｃＤ ＮＡをさらに、発現された組換え蛋白の過剰産生について最適化された公知の技 術を用いて大腸菌中でクローン化される。 第３の方法は、ヒユーズ（Ｈｕｓｅ）らの方法（１９）を用いて、ランダムに作 成されたＦｄ−とＬ鎖組合せライブラリーを用いる組換えＦａｂの発現のスクリ ーニングである。 ＥＢＶ形質転換リンパ球の安定な抗体産生ハイブリドーマとマウス／ヒトへテロ ミエローマを、（２０，２１）の標準的方法により作成する。ハイブリッドを抗 生物質Ｇ−４１８中で増殖させてヒト染色体を安定化させる。 ウワバイン（０υａｂａｉｎ　）で処理すると親ＥＢＶリンパ芽球様細胞か除去 される。これらのへテロハイブリッドを次にＶ　Ｉ　Ｐ加水分解活性を有する抗 体についてスクリーニングする。　培養上澄液を（Ｔ　ｙ　ｒ　””’）　Ｖ　 Ｉ　Ｐと３時間インキュベートし、分解しなかったＶＩＰを１０％ＴＣＡで沈澱 させ、ケンブリッジハーベスタ−（Ｃａｍｂｒｄｇｅ　ｈａｒｖｅｓｔｅｒ）を 用いて沈澱物をＧＦ／Ｆフィルター上に捕捉し、フィルターの放射能を計測する 。培養液を遠心分離（５０００ｘ　ｇ　；細胞破片を除くため）し、測定前に希 釈すると、それらのバックグランドは無視できるものとなる。この方法は１回の 測定で多数のウェルの測定を可能にし、加水分解性抗体産生細胞のクローニング を促進するために特異的に使用されてきた。ＴＣＡ沈澱法はＶＩＰのＮ−末端ま たはＣ−末端に近いペプチド結合切断により産生される大量のＩｔｓ　ｌ標識ペ プチド断片を沈澱させる可能性があるため、ＶＩＰのＮ−末端またはＣ−末端に 近いペプチド結合切断を検出することはできない。 モノクローナル抗ＶＩＰ触媒抗体を産生ずるクローンを単離するために、フィー ダ一層（ｆｅｄｅｒ　１ａｙｅｒ　）の代わりにＩθ％オリゲン（Ｏｒｉｇｅｎ ）クローニング因子（イゲン（［ＧＥＮ）　）を存する０、３細胞／ウエルを用 いて、スクリーニングしたハイブリッドを限界希釈法によりクローニングする。 Ｃ，ＰＣＲのプライマーの誘導 モノクローナルハイブリドーマ細胞の培養上澄液がら、蛋白Ｇ−セファロースの クロマトグラフィーにより、触媒抗体を精製する。触媒性ＩｇＧ分子の充分量（ 約５０μｇ）を、還元、アルキル化および、６Ｍ尿素を含有する緩衝液中での変 性条件下での高性能ゲル濾過により、成分Ｈ鎖およびＬｍに解離させる。アブラ イドバイオシステムズ（Ａｐｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　）のリキッ ドフエーズシークネーター（ｐｕｌｓｅｄ　１ｉｑｕｉｄ　ｐｈａｓｅ　５ｅｑ ｕｅｎａｔｏｒ）を用いて、Ｈ鎖とＬ鎖両方の最小の１５個のＮ−末端残基を決 定した。このアミノ酸配列情報は、コドンの縮重を考慮して必要な代替配列を導 入して（縮重レベルが最も高いコドン中にイノシンを置き）、標準的方法により 合成オリゴヌクレオチドを誘導するのに使用する。これらのオリゴヌクレオチド は、Ｆｄ−およびＬ鎖ｃＤＮＡをクローニングするための５′可変領域プライマ ーとして働（。 抗体Ｎ−末端の配列決定の別の方法は、抗体可変領域のコンセンサス（ｃｏｎｓ ｅｎｓｕｓ　）配列プライマーの混合物を使用する方法である（２２．２３）。 定常領域のプライマーは、カバとウー（Ｋａｂａｔ　ａｎｄ　Ｗｕ）のデータベ ースからの、ＣＨＩとＣＬドメインの既知の配列に基づく（２４）。配列の選択 肢を狭めるために、ＥＬＩＳＩＩ定法でヒトＩｇＧサブクラス（ベーリンガー（ Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）　）に対するモノ特異的抗血清を用いて抗体のイソタイ プをめ、Ｈ鎖のタイプに基づきＣＨＩの３′オリゴヌクレオチドを合成する。同 様にＬ鎖のタイプ（カッパまたはラムダ）を決め、ＣＬのプライマーを設計する 。Ｎｏｔｌ制限部位で５′ｖ８とＬ−プライマーを作成し、翻訳停止コドンと以 下の強制クローニングのためのＮｏｔｌ制限部位で３°ＣＨＩとＣＬプライマー を作成する。Ｎｏｔ１部位の長さは８ｂｐであり、これが目的のｃＤＮＡクロー ン中に存在する可能性は低い。 Ｄ、ｃＤＮＡ調製、増幅および配列決定グアニジウムチオシアネート／塩化セシ ウム法の後にオリゴ（ｄＴ）−セルロースクロマトグラフィーを実施して、触媒 抗体産生ハイブリドーマ細胞株からポリ（Ａ十）ＲＮＡを調製する（２５）。ガ ラス品類やプラスチック品類のＲＮａｓｅの汚染を避けるためあらゆる注意を払 う。例１１に記載されているように、逆転写酵素、オリゴ（ｄＴ）プライマーお よびｄＮＴＰを用いて、ｍＲＮＡ　（５−１０ｕｇ　）からｃＤＮＡをコピーす る。次にポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を用いてＦｄ−およびＬ鎖ｃＤＮＡ を増幅する。ＰＣＲ増幅のために、ｄＮＴＰとＦｄ−およびＬ鎖の５′および３ ′プライマーをｃＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドに混合し、Ｔａｑポリメラーゼを 添加し、試料にパラフィン油を重層し、２５回またはそれ以上のサイクルを実施 する。各サイクルは変性（９２°Ｃ，を分）、アニーリング（５２°Ｃ１２分） および伸張（７２°Ｃ，１，５分）からなる。次に増幅されたｃＤＮＡをフェノ ール、そしてフェノール／クロロホルムで抽出し、エタノールで沈澱させ凍結さ せる。 Ｆｄ−およびＬｉＪｃＤＮＡの配列決定のために、ＰＣＲ成分を％アガロースゲ ルで精製し、Ｎｏｔ）で消化し、Ｉ）ＧＥＭシリーズの適当なベクター中に結合 させる。Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼを用いてジデオキシヌクレオチド鎖停止配列決 定法を行う（２６）。 Ｅ、増幅したＤＮＡのクローニングと発現標準的ＤＮＡ法を用いて、Ｆｄ−およ びＬ＃Ｉの増幅したｃＤＮＡのクローニングに適した発現ベクターを作成する。 ベクターを作成するのに使用するオリゴヌクレオチドの配列は、組換え蛋白の作 成の要素、発現および分泌を含む。既知の方法により高レベル発現のためにベク ターを修飾する。ベクターは、適当な制限部位、ｖＸポリリンカー領域、アンピ シリン耐性遺伝子およびｌａｃオペレーターの制御下の強いｒｒｎプロモーター を含むｐＥＲベクターである。ｐＥＲベクター中のりポゾームＲＮＡプロモータ ーは細胞増殖中に高度に誘導されるが、Ｉａｃオペレーターは発現にラクトース またはイソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）誘導性を与える（２７）。誘 導された増幅されたｃＤＮＡは成熟したＦｄ−およびＬ＆ｌｌコード配列のみを 含む。大腸菌の周縁細胞質へのｖ８とＶＬの分泌を促進するために、細菌性ｐｅ ｌＢ遺伝子のリーダーペプチド配列をベクター中に導入する（２８．２９）。Ｐ ＣＲで増幅したｃＤＮＡをＮｏｔｌて消化し、断片をフェノール抽出し、２％ア ガロースゲルで精製し、挿入体を、Ｎｏｔｌで消化した発現ベクターに結合させ る。塩化カルシウムを用いて大腸菌を組換えプラスミドで形質転換し、コロニー をアンピシリンで増殖させてアンピシリン耐性遺伝子をうまく取り込んでいる組 換え体を選択し、耐性コロニーを楊子で取り上げてアンピシリンを含む培地に移 し、Ｉ　ＰＴＧ中で細胞を増幅させて発現を誘導する。２４時間後、細胞から上 澄液を分離し、細胞に低浸透圧ショックをかけて周縁細胞質内容物を放出させて 、溶解液の上澄液を集める。 Ｆｄ−およびＬ鎖は大腸菌周縁細胞質中に分泌されるため、ｌａｃオペレーター からの中程度の発現は”膜蛋白交通の渋滞”　（”ｊａｍｍｉｎｇ　ｏｆ　ｍｅ ｍｂｒａｎｅ　ｐｒｏｔｅｉｎｔｒａｆｆｉｃ”）により毒性を有することはな い（３０）。 Ｆｄ−およびＬ鎖は最初溶解液、特に培養上澄液から高性能ゲル濾過により分画 され、分子量２Ｏ−３０ｋＤの分画は例９に記載したように免疫アフイニテイク ロマトグラフィーによりさらに精製された。組換えＦｄ−およびＬ鎖ＣＨＩとＣ Ｌドメインを含むため、固定化モノクローナル抗ヒトＦｄ（ロドキー（Ｓ、　Ｒ ｏｄｋｅｙ　）博士より供与された）とウサギ抗ヒトＬ鎖抗体（アキュレット（ Ａｃｃｕｒａｔｅ）　）を免疫アフイニテイクロマトグラフイーに使用される。 抗体は蛋白Ｇ−セファロースのクロマトグラフィーにより精製され、標準的方法 を用いてＣＮＢｒ−セファロースに共存結合される。 例９に記載したように組換え蛋白の本体と純度を確認するために、ＰＨＡＳＴシ ステムを用いる５ＤＳ−ＰＡＧＥ銀染色と特異的抗Ｈ鎖と抗り鎖抗体による免疫 染色を行う。精製中のＦｄ−およびＬ鎖の回収を追跡するために、（Ｔｙ　ｒ　 ””’Ｉ　）　−Ｖ　Ｉ　Ｐ加水分解活性の測定を行う。 精製されたＦｄ−およびＬ鎖をＮ−末端アミノ酸配列決定を行う。組換え蛋白と 元々の抗体Ｈ鎖とＬ鎖のＮ−末端の本体か、正しい分子がクローン化されたこと を確認する。 別のクローニング法では、ＥＢＶ形質転換した患者のリンパ球からＦｄ−および Ｌ鎖のｃＤＮＡが調製され、適当なベクターに結合され、真核細胞中で発現され てＶＩＰ加水分解活性についてスクリーニングされる（３１−３４）。哺乳動物 の発現ライブラリーからｃ　ＤＮＡを単離することは面倒くさいことであるが、 Ｆｄ−およ輻されるため、この方法は有効である。さらに、発現べ液中に効率に ＶＩＰ加水分解のバックグランドが観察される（これらの方法の進行中に）ため 、哺乳動物の細胞株中での発現のスクリーニングをすることが必要である。 これに対して、関係のないミエローマ細胞、ハイブリドーマ細胞およびＥＢＶ形 質転換細胞からの培養上澄液は、はとんどバックグランドのＶＩＰ加水分解活性 を示さない（図８）。 Ａ、ＰＣＲのプライマー 多くの抗体分子をコードするｍ　ＲＮ　Ａ種は出発ＥＢＶ形質転換細胞中に存在 する可能性があるため、ロー（Ｌｏｈ）と共同研究音速が記載した［固定ＰＣＲ ］法（”ａｎｃｈｏｒｅｄ　ＰＣＲ”）　（３５）を用いてすべての可能性のあ るＦｄ−およびＬｆｆｌｃＤＮＡを増幅する。この方法は、ポリ（ｄＧ）テイル の最初のｃＤＮＡｉｉへの付着と、ＰＣＲによる第２の鎖の合成の相補的ポリ（ ｄＣ）プライマーの使用（下記参照）に基づく。この例のポリ（ｄＣ）プライマ ーは強制クローニング（ｆｏｒｃｅｄｅｌｏｎｉｎｇ　）のためのＮｏｔｌＮｏ ｔｌ制限部位を含む。 このプライマーは前記例ｔｉに記載のＶ領域プライマーの代替となり、Ｆｄ−お よびＬ鎖ｃＤＮＡの５′を増幅する。定常領域のプライマーは、カバとロー（Ｋ ａｂａｔａｎｄ　Ｗｕ）のデータベースからの、ＣＨＩとＣＬドメインの既知の 配列に基づ＜　（２４）。例１１に記載されたように、抗体のイソタイプを決定 することにより配列選択肢が狭められる。これは、ＥＢＶ形質転換リンパ球の培 養上澄液中に存在する加水分解活性を、ヒトＩｇＧのサブクラス（ベーリンガ− （Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）　）に対するモノ特異的抗血清で沈澱させることによ り、行われる。次に必要な縮重を導入してＨ鎖のタイプに基づきＣＨＩのオリゴ ヌクレオチドを合成される。同様にＬＭのタイプ（カッパまたはラムダ）も決定 され、ＣＬのプライマーも同様に設計される。３’　ＣＨＩおよびＣＬプライマ ーは翻訳停止コドンを含み、以下の強制クローニングのための便利なＮｏｔｌ制 限部位を含む。Ｎｏｔ１部位の長さは８ｂｐであるため、目的のｃＤＮＡクロー ン中に存在する可能性は低い。 Ｂ、ｃＤＮＡ調製と増幅 ポリ（Ａ＋）ＲＮＡは、ハイブリドーマ細胞について記載された方法により、Ｅ ＢＶ形質転換した患者のリンパ球産生触媒性抗体から調製される。最初のｃＤＮ Ａ鎖は、Ｆｄ−およびＬ鎖の適当な定常領域プライマーを用いて合成される。次 にｄＧＴＰ中で末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼで１時間処理する ことにより、ポリ（ｄＧ）ティルが最初のされるＤＮＡに加えられる。 この反応は７０″Ｃに加熱することにより停止され、エタノール沈澱によりＤＮ Ａが回収される。最初の鎖のポリ（ｄＧ）テイルは、Ｔａｑポリメラーゼで触媒 される第２の鎖の合成時のポリ（ｄＣ）５’　プライマーの相補的配列となる。 ２５回またはそれ以上のサイクルを繰り返して増幅させる。 Ｃ増幅したＤＮＡのクローニングと発現法に公知の方法てｃＤＮＡをＮｏｔｌを 介して、哺乳動物発現ベクターＨ３Ｍ中にクローン化する。π８３Ｍベクターは 、ＣＯ３細胞中で鋳型増幅を可能にするＳＶ４０複製開始点、クローン化配列の 発現を推進するＣＭＶ／ＨＩＶエンハンサ−プロモーター、そしてＳＶ４０小ｔ スプライスとポリアデニル化シグナルを含む。 π８３ＭベクターはπＶＸ／５ｕｐＦに基づいているため、得られる組換えＤＮ Ａは、その維持に適したＭＣ１０６１／Ｐ３株中に形質転換される。次に細菌を ｃＤＮＡライブラリーで形質転換する。ライブラリーを含む形質転換体はフィル ター上で維持される。形質転換体は、リン酸カルシウム法によりＣＯ３細胞中へ のトランスフェラーゼのために調製されたプールとミニブレツブに分けられる（ ３７）。トランスフェラーゼされた細胞からの培養上澄液を、次に（Ｔｙｒ”” ’Ｉ）ＶＩＰを基質として用いて触媒性について測定する。次に最適の触媒性抗 体のクローンが得られるまで、最も高い活性を示すＤＮＡプールをさらにスクリ ーニングする。一旦ｃＤＮＡか得られたら、例１２に記載の方法と類似の方法で 、（１）細菌中でＦｄ−およびＬＭを発現させる、（２）Ｆｄ−およびＬ鎖を精 製する、（３）１本鎖からＦａｂを復元する、そして（４）１本ＭＦｄ−および Ｌ鎖、そして復元したＦａｂの触媒活性をめる。 組換えＦｄ−およびＬ鎖をｐＨ８，５で１２時間混合し、Ｆａｂの自然復元をさ せる（１２．１４）。ゲル濾過および／または本来のゲル電気泳動および抗Ｈ＃ Ｉや抗し！ＪＩ抗血清によるイムノブロッティングにより分子量か増加している ことは、Ｆａｂが形成された証拠である。組換えＦｄ、ＬＭおよびＦｖの触媒性 （ｋｅ、、に、と特異性）は例１０のようにめられる。 Ｆａｂ’　はインバー（Ｉｎｂａｒ　）らの方法により調製される（３８）。　 例５から得られる、溶出緩衝液（０，１５ＭＮ　ａ　ＣＩ　、０．０１Ｍリン酸 ナトリウム緩衝液ｐＨ７，４）中の１ｇの触媒性抗体のｐＨを、０．５Ｍ酢酸ナ トリウム緩衝液、ｐＨ４，５を添加（総量の１０分の１）して４．７に調整し、 次にｌＯ■のペプシン（１ｍｔの０．００５　Ｍ酢酸すトリウム、ｐＨ４，５中 ）を加える。混合物を３７℃で６時間インキュベートし、次に遠心分離して沈澱 物を除去する。 上澄液のｐＨを８に調整し、ＶＩＰ−セファロースのカラム（３Ｘ１４ａｎ）に かける。溶出緩衝液中の０．０５ＭのＶＩＰ−グリシンで、カラムからＦａｂ’ 断片を溶出する。精製されたＦａｂ’　の活性を、例２のように標識ＶＩＰの切 断の動力学的解析により測定する。 Ｂ、Ｆｖ断片の調製 Ｆｖ断片は、例５の触媒性抗体または上記サブセフシコンＡのＦａｂ’断片から 調製される。抗体またはＦａｂ’　断片は、ホッチマン（ＨｏｃｈＩＩｌａｎ　 ）らの方法によりＦｖ断片に切断される（１５）。　Ｆａｂ’断片または抗体（ ０，１５ＭＮ　ａ　Ｃ１，０，０１Ｍリン酸ナトリウム緩衝整する。濁度のある 蛋白溶液に１、ペプシン（０，０１Ｍ酢酸ナトリウム中１０■／ｍｌ　、　ｐ　 Ｈ３，７）を加え酵素対Ｆａｂ’　の重量比を１：１００とする。３７°Ｃで４ 時間の後、２Ｍ１−リス−塩酸、ｐＨ８，２てｐＨを７．０に調整して消化を停 止させる。ｐＨを上げても溶けない沈澱物は遠心分離により除去する。上澄液を 、平衡化させたＤｎｐ−リジンセファロースカラムにかけ、０．０５ＭＮ　ａ　 Ｃ１−０゜０３Ｍ、ｐＨ７，４で流す。吸収されなかった画分を洗浄した後、カ ラムをＶＩＰ−グリシン（０，０５Ｍ５ｐ　Ｈ７，４）で溶出し、黄色の両分を 集め、真空透析で濃縮し、セファデックスＧ−７５カラムにかけ、ホッチマン（ Ｈｏｃｈｍａｎ　）らの方法により消化されなかったＦａｂ’からＦｖを分離す る（３９）。アフイニテイクロマトグラフィー用に、消化物２■について１ｎｌ のＶＩＰ−グリシンを使用し、溶出に０．３ｎｌのＶＩＰ−グリシンを使用する 。 精製したＦｖの触媒性抗体を、例２のようにＩｔｓ　ｌ標識ＶＩＰの切断の動力 学的解析により測定する。沈降平衡により測定したＦｖの分子量は約２５ｋＤで あるヘテロダイマーＦｖをホッチマン（Ｈｏｃｈｍａｎ　）らの方法によりその Ｈ鎖とＬ鎖由来の成分に分離する（３９）。 簡単に言えば、ＦｖをＤＥＡＥ−セルロースでｐＨ９，０で８Ｍ尿素中でクロマ トグラフィーをする。 あるいは例８の方法で分離する（ここでＦａｂの代わりにＦｖを用いる）。 いずれかの方法で産生されるＨ鎖とＬ鎖画分を、例９の標準化イムノブロッティ ング法により抗Ｈ鎖と抗り鎖抗体で染色して区別する。 精製したＦｖの触媒抗体を、例２のようにＩ！Ｓｘｌ＠識ＶＩＰの切断の動力学 的解析により測定する。沈降平衡により測定した別々のｖＬとｖＨ鎖の分子量は 約１２．５ｋＤである（３９）。 インターロイキン２と、プロ薬剤を薬剤に触媒的に活性化することかできる、ま たはプロ毒素を活性化Ｔｍ胞を制御することができる毒素に触媒的に活性化する ことができるＦｖ触媒抗体成分よりなる融合蛋白を、以下の方法で調製する。 触媒抗体融合蛋白を調製するために、基本的にショードーリ−（Ｃａｕｄｈａｕ ｒｙ　）らの記載する方法で、触媒モノクローナル抗体由来のＤＮＡ部分を用い 、４５Ｍリンカ−によりＶＬをコードするＤＮＡ部分に結合したｖＨをコードさ せて、プラスミドを組み立てる。次にｖＬ配列を、インターロイキン２をコード するＤＮＡ部分に結合させる（図９）。組み立てた遺伝子はＴ７プロモーターの 制御下にある。 原触媒抗体は米国特許第４．８８８．２８１号に記載の方法により調製される。 プロ毒素から毒素への中間遷移状態に対する類似物である化合物を合成する。次 にこの化合物を適当なアジュバントで調製し、抗体を産生ずるようにＢ細胞を誘 導するのに使用する。このＢ細胞を、プロ毒素から毒素への反応を触媒すること ができる抗体を産生ずるクローンを同定するためにスクリーニングする。 触媒性Ｖ８とＶＬ断片成分のＤＮＡ配列はいくつかの方法のうちの１つにより得 られる。１つの方法は、当該分野で公知の逆操作（既知のペプチド配列をコード するオリゴヌクレオチドを調製する）により、例１３から１６の方法で調製され るｖ８とＶＬ片のペプチド配列から、ｃＤＮＡを調製することである。もう１つ の方法は、目的の蛋白を産生ずる細胞から単離されたｍＲＮＡの逆転写によりｃ ＤＮＡを調製し、次に上記例１１と例１２に記載のＰＣＲにより増幅することで ある。インターロイキン２のｃＤＮＡ配列は、プラスミツドとしてロックビルメ リーランドのバイオチックリサーチラボラトリーズ（Ｂｉｏｔｅｅｈ　Ｒｅ５ｅ ａｒｃｈ　Ｌａｂｒａｔｏｒｉｅｓ　ｏｆ　ＲｏｃｋｖｉｌｌｅＭａｒｙｌａｎ ｄ）より得られる。アンピシリン耐性遺伝子に結合したＶｓ　（４５ｂｐ放射能 名カリウムｌ　−ＶＬをコードする配列は、Ｉ　ＰＴＧ誘導製のＴ７プロモータ ーの下流に、当該分野で公知の方法でＩＬ−２遺伝子を有するプラスミドに挿入 される。 融合蛋白は、ＩＬ−２部分が選択的に結合するようになり活性化Ｔ細胞と会合す るような動物に注射される。 次にプロ毒素またはプロ薬剤が投与される。結合または会合融合蛋白に到達した プロ毒素またはプロ薬剤は触媒性部分に切断されて、他の組織に有意な毒性を与 えることなくＴ細胞を殺す活性薬剤または活性毒素となる。この治療法は、広範 囲の疾患（例えば成人性Ｔ細胞白血病または自己免疫疾患、または病状の治療ま たは緩和のために好ましいＴ細胞の除去のための自己免疫反応）の治療に有用で ある。 抗代謝物とは、正常な細胞の代謝の生合成、利用、または代謝機能を妨害する化 合物である。癌の化学療法の選択性を成功させるためには、抗代謝物は正常な組 織に深刻な害を与えることなく、癌における１つまたはそれ以上の重要な代謝反 応に反対に影響を与えなければならない。 最も成功している抗癌剤は、その活性がＤＮＡまたはＲＮＡ合成を阻害すること に依存しているプリンまたはン（ｃＶｔａｒｉｂｉｎｅ）　、Ａ　ｒ　ａ　Ｃま たはＣＡ）であり、そのＤＮＡ合成阻害剤としての活性は、リボースの代わりに アラビノースが存在することに由来しており、これは２゜ヒドロキシ基の立体化 学の違いである。Ａｒ　ａＣは遊離の５′　ヒドロキシ型で投与され、細胞内に 入ってからのみリン酸化により活性化されて５°　−三リン酸型になる。 すなわちこれはすでにプロ毒素であるが、全身的に与えられると、その活性化は 薬剤が入った任意の細胞（例えば癌細胞であろうが正常な細胞であろうが）で起 きる。 薬剤か広く全身性に分布する結果、無数の副作用（例えば吐き気、嘔吐、脱毛症 、骨髄抑制（ｍｙｅｌｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ）など）が起きる。 ＡｒａＣは、自発的な細胞内活性化は減少しているプロ毒素型に修飾することが できることが、明らかになった。第１に、生物学的結合剤は、標的になっている 組織に基づいて選択される。もし標的組織がリンパ様細胞（例えばＴ４細胞）で ある場合、または結合剤か前例で記載したように化学的または遺伝学的に触媒性 成分に結合しており、結合剤か標的癌組織に結合する能力、および触媒的にプロ 毒素を毒素に変える能力で選択される抗体または抗体成分である場合、これは例 １７に記載されたようにインターロイキン２である。第２にＡｒ　ａＣのプロ梨 が投与され、その活性化は、触媒性成分活性を有する組織に限定される。すなわ ちさらに好ましい癌組織と正常な組織の区別が起きる。Ａｒ　ａＣの半減期は極 めて短いため、癌の部位からのＡｒａＣの拡散は有意な全身性毒性を引き起こす 前に急速な非活性化をともなう。 Ａｒ　ａＣ［１５］のアミジンガラクトシルの合成は、スキーム２と３に概略が 示しである（図ＩＬ１２）。 スキームｌ　（図１０）のトリベンゾイル化誘導体［３］は、ピリジン中メタン スルホニルクロリドで処理し、次に７５℃でＮ、ＮＭ−ジメチルホルムアミド中 でリチウムアジドで置換することにより、［９］に変換される。１０％パラジウ ムまたはチャーコールの存在下で５０ｐｓｉの水素圧でエタノール中で水素添加 ［９］すると４°アミノ誘導体が得られる。　２．３．４．６−チトラーＤ−ベ ンジルー２−ｄ−ガラクトピラノース［１１］をジメチルスルホキシドと無水酢 酸で処理して２．３．４．６−チトラーＤ−ベンゾイルーＤ−ガラクトノ−１， ５−ラクトン［１２］を得て、次にこれをジオキサン中微量のアンバーライト１ Ｒ１２０Ｈ″″の存在下でアンモニア水溶液（２５％Ｗ／Ｗ）で縮合することに より、β−ガラクトノラクタム［１３］が調製される。［１３］をトリメチルオ キソニウムテトラフルオロバレートで処理してそのイミドエステル誘導体に変換 して、次に５′アミノ誘導体［ｌＯ］と反応させて充分に保護されたアミジンガ ラクトシル類似物［１４］が得られる。１０％パラジウムまたはチャーコールの 存在下で５０ｐｓｉの水素圧で水素添加した後、濃アンモニア水溶液で処理して 脱保護することにより［１５］が得られる。 シトシン−ベーターＤ−アラビノフラノシドの５′　−ベーターＤ−ガラクトー ス類似物［５］の合成は、スキームｌに概略か示しである（図１０）。 ＡｒａＣ［１３をピリジン中のビス（ｐ−メトキシフェニル）フェニルメチルク ロリドで処理した後、ベンゾイルクロリドでトリベンゾイル化し、次にジクロロ メタン中のトリクロロ酢酸で［２］をデトリチル化することにより、部分的に保 護された誘導体［３コが得られる。 ベーターＤ−ガラクトースペンタアセテート［６］を希デートが得られる［８］ 。ジクロロメタン中のルイス酸ボロントリフルオリドエーテレートの存在下で［ ８］に［３］を結合させると、［（４）］が得られる。 濃アンモニア水溶液を用いて［４］を完全に脱保護した後、Ａｒ　ａＣの５′　 −ベーターＤ−ガラクトース類似物［５Ｊが得られる。 抗体の産生と遷移状態類似物への結合のスクリーニングスキーム４（図１３）中 の［１５］に対するモノクローナル抗体は、適当な担体に結合させた後、基本的 に例１に記載の方法により産生される。抗体産生クローンをまず、米国特許第４ ．８８８．２８１号に記載の方法に類似の方法により、ＡｒａＣ類似物［１５］ へ結合する能力についてスクリーニングする。 インビトロ触媒活性測定 ［１５］に対する結合活性を示す抗体クローンを、基本的にケルナーと＝−７： ／　（Ｋｏｅｒｎｅｒ　ａｎｄ　Ｎｉｅｍａｎ）　（４１）に記載の測定法によ り、Ａｒ　ａＣ基質［５］からガラクトシル部分を切断する能力についてスクリ ーニングする（ただし、グルコースオキシダーゼの代わりにガラクトースオキシ ダーゼを用いる）。測定法、の原理は、ガラクトースオキシダーゼ／ルミノール 化学発光法を用いて触媒抗体によるプロ薬剤から放出されるガラクトースを検出 することである。 次に、好ましい性質を示す触媒抗体を用いて、前記例５．７．８−１４に記載の １つまたはそれ以上の有用な成分を産生させる。インタクトの触媒抗体の代わり に触媒性成分を使用すると、分子量が小さいという利点があり、組織への透過が 上昇する。 インビボ測定 標的細胞の存在下で触媒抗体成分によりガラクトシルＡｒａＣがＡｒａＣに変換 すると、ＤＮＡ合成が阻害さ本釣にギッシュ（４２）らの記載する方法により実 施され、ここではトリチウム化チミジンの取り込み測定法を用いて、植物血球凝 集素（ＰＨＡ）刺激ヒトリンパ球でのＤＮＡ合成を阻止するＡｒ　ａＣの能力か 測定される。 参考文献 １、Ｊａｎｄａ　ａｔ　ａｍ、　ｍ　ｚｕ、！　１１！１８−１１９１　（１９ １１Ｂ）。 ２、Ｂａ１ｄＷＬｒｌ、Σ、ａｎｄ　５ｃｈｕｌｔｚ、　ｐ、ｃ−鋭−２轟：　 １１０４−１１０７　（１９１１９）。 ３、！ｖａｒｓｏｎ　ａｎｄ　Ｌａｎ１ｒ、　叙−ｊｔｕ：　ｘｘａ４（１９８ ９）。 ４、°。 社鯰−−卯Ｖｏｌ　Ｖエエ、　ｐｕｂｌｉｓｈ＠ｄ　ｂｙ　Ｓｐｒｉｎｇ＊ｒ　 Ｖ＠ｒｌａｇ（１９８９）。 ５、　Ｐａｕｌ、Ｓ、、Ｖｏｌｌｙ、Ｄ、Ｊ、、Ｂａａｃｈ、Ｃ，Ｍ、、、７ｏ ｈｎｓｏｎ、Ｄ、Ｒ，。 ””１１ｇ　””　＃　””＠Ｙｐ　”ＪＬ　８比葛１旦：１工５Ｂ−６２（１ ９８９）。 ６、Ｒｏｈｏｌｔ、　Ｏ＋、　０ｎｏｕ＠、　ｌニー、　ａｎｄ　Ｐｒａｓｓｍ ａｎ、　Ｄ。 旦ムｍ　ｎ：　ｌフ３　（１９６４）。 ７、　％４ａｒｄ、Ｅ、Ｓ、、ＧｕｓＢｏｗ、Ｄ、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ、Ａ、Ｄ 、、Ｊｏｎａｓ。 Ｐ−Ｔ−ａｎ（！　Ｗｉｒｌｔ＠ｒ＃　Ｇ、　ａｎａｔユ幻、：　５４４−５４ ６　（１９８９）。 ８、Ｐ：Ａ＠１ｍａｎ、　Ｇ、Ｍ、、　０１ｉｎｓ、　Ｄ、Ｅ、、　Ｇａ１ｌｙ 、　Ｊ−Ａ−ａｎｄＺｉｎｄ畿ｒ、Ｎ、Ｄ、　’　、ＨΩ：　７５３−７６１（ １９６３）。 ９、Ｆｒａｎｔｋ、　Ｆ、　ａｎｃｉ　Ｎ＠ｚｌｉｎ、　Ｒ−５，’　、　ｌ： １２Ｂ−１ゴＯ（１９６３）。 工Ｏ−Ｆｒａｎａｋ、　Ｆ−ａｒ”　Ｎａｚｌｉｎ、　Ｒ−”　紅函山山１２！ ：　１９：１（Ｌ９６３）。 １１、Ｐｏｒｔｅｒ、　Ｒ＋Ｒ−ａｎｄ　Ｗｅｉｒ、　Ｒ−ｃ−、Ｂ’（Ｓｕｐ ｐｌ、　ｌ）＝　５１−６４　（１９６６）。 Ｌ２．　ＪａｔＯｎ、　コ、−Ｃ，，Ｋｌｉｎｍａｎ、Ｎ、Ｒ，、Ｇｉｖｏｌ、 Ｄ、ａｎｃｉ　ｇａｌａ。 ）Ｌ　、フ：　４１８５−４１９５　（１９６Ｂ）−１コ、／Ｒ（ｌｈＯｌｔ− ０−ｏｎｏｕａ、ｘ、ｕａ　ｈａｓｓｍａｎ、Ｄ、ｆｉｂＳ（Ｂし、」シ一り１ ．　ユニ：　１７３−４７８　（１９６コ）。 １４、Ｐｏｗ＠ｌｌ、　Ｍ、Ｊ、、　Ｍａｓｍ＠ｙ、　Ｒ，Ｊ、、　ａｎｄ　Ｒ ａｍ５．λ、Ｒ６ＰＣＴ／ＵＳ８９１０１９５０．　ｉｎｔ＠ｒｎａｔｉｏｎａ ｌ　ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ　Ｎｏ。 賢０８９／１０フ５４．　Ｉｎｔａｒｎａｔｉｏｎａｌ　ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏ ｎ　ｄａｔｓｉ　１６　Ｎｏｖ。 １９８９゜ １５、Ｈｏｃｌｕａａｎ、　：１．ｘｎｂａｒ、　Ｄ、　ａｎｄ　Ｇｉｖｏｌ、 　Ｄ、ム区融旭鉱＝Ｐｈａｎｍａｃｉａ、　Ｕｐｐｓｕｌａ　５ｖｓｄａｎ　Ｐ Ｐ−１２−ｉａ　（１９８６）。 １７＋　Ｐａｕｌ、Ｓ、、Ｖｏｌｌｅ、Ｄ、Ｊ、、Ｂｅａｃｈ、Ｃ，Ｍ、、Ｊｏ ｈｎｓｏｎ、Ｄ、Ｒ。 Ｐ””ｔ　Ｍ”７．ａｎｄ””Ｙｔ　””　＄巨！−遭ｔ　ｋμ＝１１５８−１ １６２　（１９８９）。 ｔロ　１０６＋ １９＋Ｈｕｍｓ、　Ｗ、Ｄ、、　５ａｓｔｒｙ、　Ｌ、、　工ｖ＠ｒｓｏｎ、　 Ｓ、Ａ、、　Ｋｉｎｇ、　Ａ、Ｓ、。 Ａｌｔｉｎｇ−Ｍｅｓｓ、Ｍ、、Ｂｕｒｔｏｎ、Ｄ、Ｒ，、Ｂａｎ）ｃｏｖｉｃ 、Ｓ、Ｊ、ａｎｄＩ４ｒｎ＠ｒ　ｔ　Ｒ＋入＋　シＪ１ｎ９しｋＬ：　ｚ２７ｓ −ｉ２ｓｚ　（１９ｇ９）。 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Ｂｒｏｗｎ、　Σ＋Ｌ、、　）Ｃａｙ、　Ｒ，Ｍ＋、　Ｏｒｒ、　Ｅ、Ｃ，、Ｓ ｈｏｅｍａｋｅｒ、　Ｃ，。 Ｇｏｌｄ＠、　Ｄ、Ｗ、、　）Ｃａｕｆｍａｎ、　Ｒ，＋７．、　Ｈａｗｉｃｋ 、　Ｒ，Ｍ、、　Ｗａｎｇ。 Σ、入、ａｎｄ　Ｃ１ａｒｋ、ＬＣ＋　シＪ１ｎ９し２２Ｊ１”　”０−８１５ ｚ（１９８５）。 ３２、Ｌａｅ、　Ｆ、、　Ｙｏｋｏｔａ、　’ｒ、、　０ｔｓｕｌｃｕ、　’ｒ 、、　Ｍｅｙｅｒｓｏｎ、　Ｐ、。 Ｖｉｌｌａｒ＠ｔ、Ｄ、、Ｃｏｆｆｍａｎ、Ｒ，、Ｍｏｓｍａｎｒ＋、丁。、Ｒ ｅｎｎ１ｃｋ。 Ｄ、、Ｒｏａｈｍ、Ｎ、、Ｓｍ１ｔｈ、Ｃ，、２１０ｔｎｌｋ、Ａ、ａｎｄ　Ａ ｒａｉ。 Ｘ、−工、　゛　旦ユニ　２０６１−２０６５（１９８６）。 コ３．　Ｙｏｋｏｔａ、Ｔ、、０ｔｓｕｋａ、Ｔ、、ＮｏＳｍａｎｎ、丁、、Ｂ ａｎｃｈａｒａａｕ。 ＋：ｒ、、　ＤａＦｒａｎｃｅ、　Ｔ、、　Ｂｌａｎｃｈａｒｄ、　Ｄ、、　Ｄ ａ　Ｖｒｉａｓ、　Ｊ、Ｅ、。 Ｌａｅ、　Ｆ、　ａｎｄ　Ａｒａｌ、　Ｋ、−工、　−！ム。 辺込、　ｊｌｌ：　５８９４−５８９６　（１９８６）。 ３４、Ｙａｎｇ、　Ｙ、−Ｃ，、Ｃ１ａｒｉａｔｔａ、λ、Ｂ、、　Ｔ＠ｍｐｌ ｅ、　Ｐ、Ａ、、　Ｃｈｕｎｇ。 Ｍ、Ｐ、、　Ｋｏｖａｃｉｃ、　Ｓ、、　Ｗｉｔｅｋ−Ｇｉａｎｒ＋ｏｔｔｉ、 　ｆｆ、ｓ、　ＸＡａｒｙ。 入−Ｃ＋、Ｘｒｉｚ、Ｒ，、Ｄｏｎａｈｕａ、Ｒ，！、、Ｗｏｎｇ、Ｇ、Ｇ−ａ ｎｄＣｌａｒｋ　Ｓ、Ｃ，、Ｑ−よ、　ＬＬ：　３−１０　（１９８６）。 ３５、Ｌｏｈ、　Ｅ、Ｙ、、　Ｅｌｌｉｏｔ、　：Ｉ−１，、Ｃｗｉｒｉａ、　 Ｓ、、　Ｌａｎ１ｅｒ、　Ｌ、Ｌ−ａｎ（！　Ｄａｖｉｔ、Ｍ−Ｍ、ｍ＃　２Ａ １：　２１？−２２０（１９８９）。 ３６、Ａｒｕｆｆｏ、　Ａ、　ａｎｄ　５ａａｄ、　Ｂ、　゛。 ｌニ：　８５７３−８５７７　（１９８７）。 ３７、Ｖａｎ　ｄ＠ｒ　Ｅｂ、入＋Ｊ、ａｎｄ　Ｇｒａｈａｍ、Ｆ、Ｌ、　。 五＠：　８２６−８３９　（１９８０）。 ３Ｂ、Ｉｎｂａｒ、　Ｄ、　Ｒｏｔｍａｎ、　Ｍ　ａｎｄ　Ｇｉｖｏｌ、　Ｄ　 ’　、　。 １Ｍ：　６２７２　（１９７Ｘ）。 ３８、工ｎｂａｒｔ　Ｄｒ　Ｒｏｔ！ａａｎ＃　Ｍ　ａｎｃｌ　Ｇｉｖｏｌ、Ｄ −ｚｉ−≦ＩＬ」Ｌし≧Ｌ工急ｌし辺：　６２７２　（１９７１）。 コ９．　Ｈｏｃｈｎａｎ、Ｊ、Ｉｎｂａｒ、Ｄ、ａｎｄ　Ｇｉｖｏｌ、Ｄ、、Ｅ 、ＬＡＪ。 （Ｕ、Ｓ、＾、）旦：　２６５９　（１９７２）。 ４０、Ｖ、、７．　Ｃｈａｕａａｒｙ　ａｔ　ａｌ、、　ｍ、ｌｌ！！：　３９ ４　（１９８９）。 ４ｒ−Ｋｏａｒｎａｒ　ａｎｄＮｉｍａｎ　４４１，２１６−２２８（１９８１ １）。 ４２、Ｇ１５ｈ　ａｔ　ａｌ、　、よｌ：　１１５９−４１６２．　１９７１） ＦＩＧ、　１ ＩｇＧ　Ｆａｂ −１−−３Ｑ 、１ｋ−２Ｑ、１ 一−−−１４．４ ＦＩＧ、　３Ａ ＦＩＧ、　３Ｂ Ｆａｂ、　ｍｇ／ｍ１ 溶媒　Ｂ、　％ Ａ２１４ 保持時間、（分） ＦＩＧ、　５Ａ ＦＩＧ、６　当　量１ｎｍｏｌ ＦＩＧ、　７８ ＦＩＧ、　７Ｃ ＦＩＧ、　８ ３９　５９６０　Ｂ−９５ ＶＨ−＞＜−・　・　・　・　・　・　・　・　・　・　・　・　・　・　・　 ・　・　・　・　・　・　・　・　−・　−・・　・　・　■@・　・　・　− ＞＜−ＶＬ ＦＩＧ、　９ ＦＩＧ、　１０ （１５）　スキーム３ ＦＩＧ、　１２ 要　約　書 触媒抗体成分、触媒抗体成分の産生方法、触媒抗体成分（特に１本鎖と小さい成 分）の使用方法が開示される。 モノクローナル触媒抗体、触媒自己抗体または部位指令突然変異誘発により調製 される、アミド、ペプチド、エステルまたはグリコシド結合の切断または形成を 促進することができる触媒抗体成分が開示される。触媒抗体成分を単独で、また は他の抗体成分または他の生物学的部分とともに使用する方法か開示される。 補正書の写しく翻訳文）提出書（特許法制８４条の８）平成４年９月２４日

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．化学反応を触媒することができる抗体の成分において、該成分は軽鎖、重鎮 、Ｆｄ断片、軽鎖と重鎖の会合していない混合物、軽鎖の可変断片、重鎖の可変 断片、軽鎖の触媒性ドメイン、重鎖の触媒性ドメイン、重鎖と軽鎖よりなるヘテ ロダイマー、非共有結合的に会合しているＦｄ断片と軽鎖のヘテロダイマー、重 鎖のホモダイマー、および軽鎖からなるホモダイマーよりなる群から選択される 、上記成分。 ２．Ｆａｂ断片とＦｖ断片よりなる群から選択される成分である、ペプチド結合 の切断または形成を触媒することができる抗体の触媒性成分。 ３．成分は軽領である、請求項１に記載の触媒性を有する抗体の成分。 ４．成分は重鎖である、請求項１に記載の触媒性を有する抗体の成分。 ５．成分は軽鎖と重鎮の会合していない混合物である、請求項１に記載の触媒性 を有する抗体の成分。 ６．成分は軽鎖の可変断片である、請求項１に記載の触媒性を有する抗体の成分 。 ７．成分は重鎖の可変断片である、請求項１に記載の触媒性を有する抗体の成分 。 ８．成分は軽鎖の触媒性ドメインである、請求項１に記載の触媒性を有する抗体 の成分。 ９．成分は重鎖の触媒性ドメインである、請求項１に記載の触媒性を有する抗体 の成分。 １０．成分は軽鎖ホモダイマーである、請求項１に記載の触媒性を有する抗体の 成分。 １１．成分は重鎖ホモダイマーである、請求項１に記載の触媒性を有する抗体の 成分。 １２．成分は抗体のＦａｂ部分である、請求項２に記載の触媒性を有する抗体の 成分。 １３．成分は抗体のＦｖ部分である、請求項２に記載の触媒性を有する抗体の成 分。 １４．成分はヘテロダイマーである、請求項２に記載の触媒性を有する抗体の成 分。 １５．成分は少なくとも１つの他の分子に会合している、請求項１に記載の成分 。 １６．成分と他の分子の化学結合は共有結合である、請求項１に記載の成分。 １７．成分と他の分子の化学結合は非共有結合である、請求項１に記載の成分。 １８．他の分子は抗体である、請求項１５に記載の成分。 １９．他の分子は核酸である、請求項１５に記載の成分。 ２０．他の成分は生物学的結合剤である、請求項１５に記載の成分。 ２１．他の分子は酵素である、請求項１５に記載の成分。 ２２．他の分子は目的の抗原に結合することができる抗体の可変領域である、請 求項１５に記載の成分。 ２３．他の分子は細胞性リセプクーに結合する、請求項１５に記載の成分。 ２４．他の分子は固相支持体へのリンカーである、請求項１５に記載の成分。 ２５．生物学的結合剤は、アビジン、ストレプトアビジン、蛋白Ａおよび蛋白Ｇ よりなる群から選択される、請求項２０に記載の成分。 ２６．請求項１に記載の成分において、成分は、触媒活性を有する抗体成分を含 有する連続的ポリペプチド配列と少なくとも１つの他の蛋白をコードする核酸配 列により発現されるキメラ生成物であって、該核酸配列は：（ａ）触媒性成分を コードする最初の核酸配列；そして （ｂ）少なくとも１つの追加の蛋白をコードする少なくとも１つの追加の核酸配 列よりなる、上記成分。 ２７．少なくとも１つの追加の蛋白をコードする追加の核酸配列は、触媒性成分 とは異なる生物学的機能を有する、請求項２６に記載の成分。 ２８．追加の蛋白は生物学的結合剤である、請求項２６に記載の成分。 ２９．リガンドがアビジン、ストレプトアビジン、蛋白Ａおよび蛋白Ｇよりなる 群から選択される、請求項２８に記載の成分。 ３０．追加の蛋白は、目的の抗原に結合することができる通常の抗体の重鎖であ る、請求項２６に記載の成分。 ３１．追加の蛋白は、目的の抗原に結合することができる通常の抗体の軽鎖であ る、請求項２６に記載の成分。 ３２．追加の蛋白は、目的の抗原に結合することができる通常の抗体の可変領域 である、請求項２６に記載の成分。 ３３．触媒活性を有する抗体成分は、プロ薬剤またはプロ毒素を薬剤または毒素 に触媒的に切断することができ、追加の蛋白はプロ薬剤またはプロ毒素の標的細 胞に結合することができる、請求項２６に記載の成分。 ３４．追加の蛋白はインターロイキン２である、請求項３３に記載の成分。 ３５．抗体の触媒性成分の調製方法において：（ａ）軽鎖、重鎖、Ｆｄ断片、軽 鎖と重鎮の会合していない混合物、軽鎖の可変断片、重鎖の可変断片、軽鎖の触 媒性ドメイン、重鎖の触媒性ドメイン、１つの軽鎖と１つの重鎮よりなるヘテロ ダイマー、非共有結合により結合したＦｄ断片と軽鎖からなるヘテロダイマー、 重鎖のホモダイマー、および軽鎖のホモダイマーよりなる群から選択される成分 に、上記抗体の断片化に適した条件に抗体をさらして、 （ｂ）目的の触媒性成分を得ることよりなる、上記方法。 ３６．抗体は触媒性である、請求項３５に記載の方法。 ３７．成分は、触媒抗体のまたはその重鎖のまたは軽鎖の可変領域の一部であり 、かつその活性を保持しているポリペプチドよりなる、触媒性ドメインである、 請求項３５に記載の方法。 ３８．成分は、成分をコードする少なくとも１つの遺伝子の少なくとも１つの断 片を、細胞中に挿入することより複製される、請求項３５に記載の方法。 ３９．細胞は、細菌、糸状菌、酵母、カビ、動物細胞、原生動物細胞、および植 物細胞よりなる群から選択される、請求項３８に記載の方法。 ４０．触媒性ドメインは以下の追加のステップよりなる方法により調製される、 請求項３７に記載の方法：（ａ）触媒抗体の可変傾城を一連のペプチド配列に切 断して、 （ｂ）ペプチド配列をスクリーニングして、触媒活性を有するペプチド配列を同 定して、 （ｃ）触媒性ドメインを精製する。 ４１．触媒性ドメインは以下の追加のステップよりなる方法により調製される、 請求項４０に記載の方法：（ａ）請求項４０のステップ（ｂ）で得られるペプチ ド配列を切断して、だんだん小さくなるペプチド配列を作成し； （ｂ）切断された配列をスクリーニングして、触媒活性を有するものを同定して ； （ｃ）切断生成物中に触媒活性が検出されなくなるまで、ステップ（ａ）と（ｂ ）を繰り返して；（ｄ）こうして同定されたドメインを精製する。 ４２．請求項４０に記載の方法において、触媒性ドメインは、該触媒性ドメイン のペプチド配列を決定し、触媒性ドメインのコピーを合成する、追加のステップ よりなる方法により調製される、上記方法。 ４３．以下のステップよりなる、触媒性ドメインを調製する方法： （ａ）触媒抗体の可変領域の配列を決定し；（ｂ）可変領域の配列の部分である 同族のペプチド配列の重複するシリーズを合成し； （ｃ）該同族シリーズをスクリーニングして、好ましい触媒性を有する同族のペ プチド配列を選択し；（ｄ）選択されたペプチド配列を合成する。 ４４．以下のステップよりなる、触媒性ドメインの調製方法： （ａ）触媒抗体の可変領域の配列を決定し；（ｂ）触媒抗体の可変領域をコード する遺伝子を細胞中に挿入し； （ｃ）細胞中で可変領域を発現させる。 ４５．挿入される遺伝子は可変領域の断片をコードする、請求項４４に記載の方 法。 ４６．細胞は、細菌、糸状菌、酵母、動物細胞、原生動物細胞、および植物細胞 よりなる群から選択される、請求項３８に記載の方法。 ４７．細胞は、細菌、糸状菌、酵母、動物細胞、原生動物細胞、および植物細胞 よりなる群から選択される、請求項４４に記載の方法。 ４８．遺伝子は細胞に挿入される前に突然変異誘発される、請求項３８に記載の 方法。 ４９．遺伝子は細胞に挿入された後に突然変異誘発される、請求項３８に記載の 方法。 ５０．遺伝子は細胞に挿入される前に突然変異誘発される、請求項４４に記載の 方法。 ５１．遺伝子は細胞に挿入された後に突然変異誘発される、請求項４４に記載の 方法。 ５２．以下のステップよりなる、抗体の触媒性成分の調製方法： （ａ）抗体の可変領域をコードする少なくとも１つの核酸配列を細胞に挿入し； （ｂ）挿入前に核酸配列を突然変異誘発させ；（ｃ）目的の触媒活性を示す抗体 の突然変異した可変領域の存在について、細胞とその子孫をスクリーニングして ； （ｄ）細胞を複製し； （ｅ）突然変異した核酸配列を発現させて、好ましい目的の触媒活性を存する翻 訳生成物を産生させる。 ５３．以下のステップよりなる方法により、触媒抗体の触媒性成分を産生する方 法： （ａ）抗体の可変領域をコードする少なくとも１つの核酸配列を細胞に挿入し； （ｂ）挿入後に核酸配列を突然変異誘発させ；（ｃ）目的の触媒活性を示す抗体 の突然変異した可変領域の存在について、細胞とその子孫をスクリーニングして ； （ｄ）細胞を複製し； （ｅ）突然変異した核酸配列を発現させて、好ましい目的の触媒活性を有する翻 訳生成物を産生させる。 ５４．細胞は、細菌、糸状菌、酵母、動物細胞、原生動物細胞、および植物細胞 よりなる群から選択される、請求項５２に記載の方法。 ５５．細胞は、細菌、糸状菌、酵母、動物細胞、原生動物細胞、および植物細胞 よりなる群から選択される、請求項５３に記載の方法。 ５６．以下のステップよりなる、抗体の触媒性成分をコードする遺伝子断片を選 択する方法： （ａ）成分をコードする少なくとも１つの遺伝子断片を選択し、 （ｂ）可変領域の発現に適した条件下で、細胞中に遺伝子断片を挿入し、 （ｃ）触媒性成分を発現するものについて細胞をスクリーニングする。 ５７．細胞は、細菌、糸状菌、酵母、動物細胞、原生動物細胞、および植物細胞 よりなる群から選択される、請求項５６に記載の方法。 ５８．請求項５６に記載の方法において、遺伝子断片は、軽鎖、重鎖、軽鎖の可 変領域、重鎖の可変領域、軽鎖の触媒性ドメイン、重鎖の触媒性ドメイン、およ びＦｄ断片よりなる群から選択される成分をコードする、上記方法。 ５９．抗体の触媒性成分と第２の蛋白よりなる２官能性キメラ生成物の調製方法 は、触媒活性を有する抗体成分を含有する連続のポリペプチド配列と、少なくと も１つの他の蛋白をコードする核酸配列を発現させることよりなる方法であって 、該核酸配列は： （ａ）触媒性成分をコードする第１の核酸配列；そして （ｂ）少なくとも１つの追加の蛋白をコードする少なくとも１つの追加の核酸配 列よりなる、上記方法。 ６０．少なくとも１つの追加の蛋白をコードする追加の核酸配列は、触媒性成分 のそれとは異なる生物学的機能を有する、請求項５９に記載の方法。 ６１．追加の蛋白は、生物学的結合剤である、請求項５９に記載の方法。 ６２．生物学的結合剤は、アビジン、ストレプトアビジン、蛋白Ａ、および蛋白 Ｇよりなる群から選択される、請求項６１に記載の方法。 ６３．追加の蛋白は、目的の抗原に結合することができる通常の抗体の重鎖であ る、請求項５９に記載の方法。 ６４．追加の蛋白は、目的の抗原に結合することができる通常の抗体の軽鎖であ る、請求項５９に記載の方法。 ６５．追加の蛋白は、目的の抗原に結合することができる通常の抗体の可変領域 である、請求項５９に記載の方法。 ６６．触媒活性を有する抗体成分は、プロ薬剤またはプロ毒素を薬剤または毒素 に触媒的に切断することができ、追加の蛋白は、プロ薬剤またはプロ毒素の標的 細胞に結合することができる、請求項５９に記載の方法。 ６７．追加の蛋白は、インターロイキン−２である、請求項５９に記載の方法。 ６８．抗体の触媒性成分の調製方法において：（ａ）軽鎖、重鎖、Ｆｄ断片、軽 鎖と重鎖の会合していない混合物、軽鎖の可変断片、重鎖の可変断片、軽鎖の触 媒性ドメイン、重鎖の触媒性ドメイン、１つの軽鎖と１つの重鎖よりなるヘテロ ダイマー、非共有結合により結合したＦｄ断片と軽鎖からなるヘテロダイマー、 重鎖のホモダイマー、および軽鎖のホモダイマーよりなる群から選択される成分 に、上記抗体を分画するのに適した条件に抗体をさらして、 （ｂ）成分を触媒活性についてスクリーニングして、（ｃ）目的の触媒性成分を 得ることよりなる、上記方法。 ６９．以下のステップよりなる、ペプチド結合の切断または形成を触媒すること ができ、抗体の成分であるヘテロダイマーの調製方法： （ａ）目的の抗体を同定し； （ｂ）抗体を少なくとも２つのヘテロダイマーに切断し； （ｃ）触媒活性についてヘテロダイマーをスクリーニングする。 ７０．抗体は触媒性である、請求項６９に記載の方法。 ７１．以下のステップよりなる、ペプチド結合の切断または形成を触媒すること ができ、抗体の成分であるヘテロダイマーの調製方法： （ａ）抗体産生細胞株を同定し； （ｂ）触媒性ヘテロダイマーを発現する細胞について細胞株をスクリーニングす る。 ７２．抗体は触媒性である、請求項７１に記載の方法。 ７３．以下のステップよりなる、化学反応を触媒することができ、抗体の軽鎖ま たは重鎖から組立られるホモダイマーの調製方法： （ａ）目的の抗体を同定し； （ｂ）抗体の軽鎖および重鎖成分を分離し；（ｃ）軽鎖または重鎖ホモダイマー の形成を促進する条件に軽鎖または重鎖をさらして； （ｄ）触媒活性についてホモダイマーをスクリーニングする。 ７４．抗体は触媒性である、請求項７３に記載の方法。 ７５．以下のステップよりなる、成分は化学反応を触媒することができる、抗体 の成分の調製方法：（ａ）動物の自己抗原に対する自己抗体を有する動物を同定 し； （ｂ）複数の自己抗体を有する血清画分を単離し；（ｃ）ステップ（ｂ）で得ら れる血清画分をスクリーニングして、反応の基質に結合する自己抗体を同定し； （ｄ）自己抗体の成分をスクリーニングして、自己抗体の触媒性成分を得る。 ７６．触媒性成分は自己抗体の触媒性成分である、請求項７５に記載の方法。 ７７．以下のステップよりなる、化学反応を触媒することができる抗体の成分の 調製方法： （ａ）（１）反応物質； （２）ペプチドまたは他の担体分子に結合した反応物質； （３）反応中間体； （４）反応物質の類似物； （５）こうして作成したモノクローナル抗体は反応物質または反応中間体に結合 することができる、生成物の類似物；または （６）反応中間体の類似物よりなる群から選択される抗原に対する複数のモノク ローナル抗体を作成し； （ｂ）複数のモノクローナル抗体をスクリーニングして、反応の基質に結合する モノクローナル抗体を同定し； （ｃ）モノクローナル抗体の成分をスクリーニングして、モノクローナル抗体の 触媒性成分を得る。 ７８．以下のステップよりなる、成分は触媒抗体の成分であり、化学反応を触媒 することができる抗体の成分の調製方法： （ａ）（１）反応物質； （２）ペプチドまたは他の担体分子に結合した反応物質； （３）反応中間体； （４）反応物質の類似物； （５）こうして作成したモノクローナル抗体は反応物質または反応中間体に結合 することができる、生成物の類似物；または （６）反応中間体の類似物よりなる群から選択される抗原に対する複数のモノク ローナル抗体を作成し； （ｂ）複数のモノクローナル抗体をスクリーニングして、反応を触媒する成分を 同定し； （ｃ）モノクローナル抗体の触媒性成分を得る。 ７９．以下のステップよりなる、成分は触媒性モノクローナル抗体の成分であり 、化学反応を触媒することがてきる抗体の成分の調製方法： （ａ）（１）反応物質、 （２）ペプチドまたは他の担体分子に結合した反応物質、 （３）反応中間体、 （４）反応物質の類似物、 （５）こうして作成したモノクローナル抗体は反応物質または反応中間体に結合 することができる、生成物の類似物、または （６）反応中間体の類似物よりなる群から選択される抗原で動物を免疫して、動 物中に抗体産生リンパ球を産生させ； （ｂ）動物から抗体産生リンパ球を取り出し；（ｃ）抗体産生リンパ球をミエロ ーマ細胞と融合し、それぞれモノクローナル抗体を産生する複数のハイブリドー マ細胞を産生させ； （ｄ）複数のモノクローナル抗体をスクリーニングして、反応を触媒するモノク ローナル抗体を同定し；（ｅ）触媒性モノクローナル抗体の触媒性成分を得る。 ８０．以下のステップよりなる、酵素により触媒されることが公知である化学反 応を触媒することができる成分である、抗体の成分の調製方法： （ａ）酵素に対する複数のモノクローナル抗体を産生させ； （ｂ）複数のモノクローナル抗体をスクリーニングして、酵素に対する反応物質 の結合を阻害する第１のモノクローナル抗体を同定し； （ｃ）第１のモノクローナル抗体を回収し；（ｄ）ステップ（ｃ）で回収される 第１の抗体に対する複数の抗イディオタイプモノクローナル抗体を産生させ； （ｅ）ステップ（ｄ）で産生される複数の抗イディオタイプモノクローナル抗体 をスクリーニングして、反応物質に結合し反応速度を触媒的に上昇させる第２の モノクローナル抗体を同定し； （ｆ）それぞれモノクローナル抗体を産生する複数のハイブリドーマ細胞を培養 することにより、ステップ（ｅ）で同定される多数のモノクローナル抗体を産生 させ； （ｇ）モノクローナル抗体の触媒性成分を得る。 ８１．抗体を軽鎖および重領に解離させることよりなる、抗体の触媒性軽鎖また は触媒性重鎖の調製方法。 ８２．抗体を軽鎖および重鎖に解離させることよりなる、触媒抗体の触媒性軽鎖 または触媒性重鎖の調製方法。 ８３．以下のステップをさらに含む、請求項８１に記載の方法： （ａ）抗体をＦａｂおよびＦｃ断片に切断し；（ｂ）Ｆａｂ断片を還元そして次 にアルキル化して、軽鎖と重鎖をつないでいる結合を切断する。 ８４．以下のステップをさらに含む、請求項８２に記載の方法： （ａ）抗体をＦａｂおよびＦｃ断片に切断し；（ｂ）Ｆａｂ断片を還元そして次 にアルキル化して、軽鎖と重鎖Ｆｄ断片をつないでいる結合を切断する。 ８５．軽鎖と重鎖を分離するステップをさらに含む、請求項８３に記載の方法。 ８６．あらかじめ決められた範囲の分子量に対して選択的なゲルカラム中に抗体 を通すことにより、抗体を軽鎖と重鎖に解離する、請求項８２に記載の方法。 ８７．分子量の範囲は１０３から３×１０５ダルトンである、請求項８６に記載 の方法。 ８８．抗体を、ｐＨ１０．５までのアルカリ性のｐＨで、５μｇ／ｍｌ未満の濃 度に希釈した後に、軽鎖と重鎮が解離される、請求項７０に記載の方法。 ８９．軽鎖と重鎖は、鎖間の結合の化学的還元により解離される、請求項８１に 記載の方法。 ９０．軽鎖と重鎖は、鎖間の結合の酵素的切断により解離される、請求項８１に 記載の方法。 ９１．軽鎖と重鎖は、鎖間の結合の触媒的切断により解離される、請求項８１に 記載の方法。 ９２．軽鎖と重鎖は以下のステップよりなる方法で解離される、請求項８１に記 載の方法： （ａ）メルカプトエタノール、ジチオスレイトール、およびメルカプトエチルア ミンよりなる群から選択される還元剤の存在下で抗体を還元し、 （ｂ）還元ステップで生成したＳＨ基を、ヨードアセトアミドおよびヨード酢酸 よりなる群から選択されるアルキル化剤でアルキル化する。 ９３．以下のステップよりなる、請求項８１に記載の方法： （ａ）抗体をＦａｂとＦｃ断片に切断し；（ｂ）Ｆａｂ断片を還元そして次にア ルキル化して軽鎖と重鎖をつないでいる結合を切断し；（ｃ）結合を可能にする 条件下で、軽鎖と重鎖を軽鎖または重鎖にのみ結合することができるリガンドに 接触させ； （ｄ）リガンドが結合した軽鎖または重鎖を、結合していない軽鎖または重鎖か ら分離する。 ９４．軽鎖、重鎖、Ｆｄ断片、軽鎖と重鎖の会合していない混合物、軽鎖の可変 断片、重鎖の可変断片、軽鎖の触媒性ドメイン、重鎖の触媒性ドメイン、１つの 軽鎖と１つの重鎖よりなるヘテロダイマー、非共有結合で結合しているＦｄ断片 と軽鎖からなるヘテロダイマー、重鎖ホモダイマー、および軽鎖ホモダイマーよ りなる群から選択される抗体の成分において、該成分は触媒性を有し：（ａ）成 分への抗体の断片化に適した条件に抗体をさらして、 （ｂ）成分を触媒活性についてスクリーニングして、（ｃ）触媒性成分を得るこ とにより調製される、上記成分。 ９５．抗体は触媒性である、請求項９４に記載の成分。 ９６．以下のステップよりなる方法により調製される触媒性ドメイン： （ａ）触媒抗体の可変領域の配列を決定し；（ｂ）可変領域の配列の部分である 同族のペプチド配列の重複するシリーズを合成し； （ｃ）同族のシリーズをスクリーニングして、好ましい触媒性を有する同族のペ プチド配列を選択し；（ｄ）選択されたペプチド配列を合成する。 ９７．以下のステップよりなる方法により調製される触媒性ドメイン： （ａ）触媒抗体の可変領域の配列を決定し；（ｂ）触媒抗体の可変領域をコード する遺伝子を細胞中に挿入し； （ｃ）細胞中で可変領域を発現させる。 ９８．以下のステップよりなる方法により調製される抗体の触媒性成分： （ａ）抗体の可変領域をコードする少なくとも１つの核酸配列を、細胞中に挿入 し； （ｂ）核酸配列を挿入前に突然変異誘発させ；（ｃ）目的の触媒活性を示す抗体 の突然変異した可変領域の存在について、細胞とその子孫をスクリーニングして ； （ｄ）細胞を複製し； （ｅ）突然変異した核酸配列を発現させて、目的の触媒活性を有する翻訳生成物 を産生させる。 ９９．抗体が触媒性である、前記請求項に記載された、抗体の触媒性成分。 １００．抗体の触媒性成分と第２の蛋白よりなる２官能性キメラ生成物において 、触媒活性を有する抗体成分を含有する連続のポリペプチド配列と、少なくとも １つの他の蛋白をコードする核酸配列を発現させることにより調製されるキメラ 成分であって、該核酸配列は：（ａ）触媒性成分をコードする第１の核酸配列； そして （ｂ）触媒性成分とは異なる生物学的機能を有する少なくとも１つの追加の蛋白 をコードする少なくとも１つの追加の核酸配列よりなる、上記生成物。 １０１．以下のステップよりなる方法により調製される触媒性ヘテロダイマー： （ａ）目的の抗体を同定し； （ｂ）抗体を少なくとも２つのヘテロダイマーに切断し； （ｃ）触媒活性についてヘテロダイマーをスクリーニングする。 １０２．以下のステップよりなる方法により調製される触媒性ヘテロダイマー： （ａ）抗体産生細胞株を同定し； （ｂ）触媒性ヘテロダイマーを発現する細胞について細胞株をスクリーニングす る。 １０３．以下のステップよりなる方法により調製される触媒性ヘテロダイマー： （ａ）目的の抗体を同定し； （ｂ）抗体の軽鎖および重鎖成分を分離し；（ｃ）軽鎖または重鎖ホモダイマー の形成を促進する条件に軽鎖または重鎖をさらして； （ｄ）触媒活性についてホモダイマーをスクリーニングする。 １０４．以下のステップよりなる方法により調製される抗体の触媒性成分： （ａ）動物の自己抗原に対する自己抗体を有する動物を同定し； （ｂ）複数の自己抗体を有する血清画分を単離し；（ｃ）ステップ（ｂ）で得ら れる血清画分をスクリーニングして、反応の基質に結合する自己抗体を同定し； （ｄ）自己抗体の成分をスクリーニングして、自己抗体の触媒性成分を得る。 １０５．ペプチド結合の形成または切断を触媒することができる抗体の触媒性Ｆ ｖ成分であって、Ｆｖ成分は以下のステップよりなる方法により産生される：（ ａ）抗体をペプシンに接触させることにより抗体を選択的に切断して、Ｆｖ成分 を含む断片の混合物を産生し； （ｂ）Ｆｖ成分が精製されるように混合物を処理する。 １０６．抗体は触媒性である、請求項９４に記載の方法。 １０７．ペプチド結合の形成または切断を触媒することができる抗体の触媒性Ｆ ａｂ成分であって、Ｆａｂ成分は以下のステップよりなる方法により産生される ：（ａ）抗体を酵素パパインに接触させることにより抗体を選択的に切断して、 Ｆａｂ成分を含む断片の混合物を産生し； （ｂ）Ｆａｂ成分が有用に精製されるように混合物を処理する。 １０８．反応物質を抗体の触媒性成分に接触させることよりなる、化学反応を触 媒する方法において、成分は軽鎖、重鎖、Ｆｄ断片、軽鎖と重鎖の会合していな い混合物、軽鎖の可変断片、重鎖の可変断片、軽鎖の触媒性ドメイン、重鎖の触 媒性ドメイン、１つの軽鎖と１つの重鎖からなるヘテロダイマー、非共有結合的 に会合しているＦｄ断片と軽鎖からなるヘテロダイマー、重鎖のホモダイマー、 および軽鎖のホモダイマーよりなる群から選択される、上記方法。 １０９．１つまたは複数の反応物質を、Ｆａｂ断片とＦＶ断片よりなる群から選 択される抗体の触媒性成分に接触させることよりなる、ペプチド結合の切断と形 成を触媒する方法。