JPH05506210A - 単核細胞群における悪性細胞を破壊する緑色ポルフィリンを含有する組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 におする　を　る　ボルフ １ンを　る 皮盃立旦 本発明は、光力学療法の医学的応用に関する。より詳細には、本発明は、特定の ポルフィリン誘導化合物を、骨髄から調製されるような単核細胞調製物において 、正常な細胞の存在下で白血病細胞のような悪性細胞を破壊するのにの使用する ことに関する。

！見肢呈 白血病を含む様々な悪性疾患を煩う患者の緩解期を維持するために、自家骨髄移 植が行われてきた。この手法において、悪性疾患を煩う患者の骨髄は、緩解期に 取出され、患者が活性状態のがんを再発した後の再投与のために保管される（Ｇ ａＩｅ、　Ｒ，Ｐ、ら、Ｓｅｍ−ａ　ｓ　’ｎ　ｍ　ｏ　ｏ　（ＩＨ１７）　ｉ ４：４Ｑ−５４）　。

自己骨髄が使用されるとき、ＨＬＡ適合提供者（このことにより、同種骨髄移植 片が、急性の骨髄性白血病（ＡＭＬ）を煩う大人の６％に限定される）は必要で はないが、自己骨髄の深刻な欠点は、悪性細胞が推定的に緩解した骨髄中に存在 し得ることである。緩解骨髄から、残りの悪性細胞を除去する試みが多くなされ てきたが、あまり成功例がない（Ｃｈａ＋Ｉｐｌｉｎ、　Ｒ，ら、社ｍ’　ａ　 ｓ　ａｔ　ｏ　（１９ｇ？）　Ｌｌ：５５−６フ；　Ｃｈａｍｐｌｔｎ、Ｒ，Ｅ 、ら、Ｓｅｍ１ｎａ　’ｎ　ｅｍａｔｏｏ　（１９１１ｇ）　２５ニア４−８０ ；　Ｍａｌｉｋ、Ｚ、ら、旦ｉｔ　Ｊ　ａｎｃ　（１９８７）　５６−５８９− ５９５）　、　Ｍａｌｉｋの論文は、白血病細胞の、内因性ポルフィリンの光活 性化による破壊について、記載している。さらに、特定の両親媒性染料は、正常 な単核細胞に比べて、白血肩ｗＪ胞を大いに光感受性化することが報告されてい る（Ｓｉｅｂｅｒ、Ｆ、ら、Ｂｌｏｏｄ　（１９８５）　ａｌｌ：３２−３６； 　５ｉｅｂａｒ、　Ｆ、ら　、Ｐｈｏｔｏｃ　ｅｒａ　ｏｔｏｂｉ　Ｉ　（１９ １１７）　４６：７ｌ−７Ｌ　Ｓｒｎｇｅｒ、Ｃ，Ｒ，Ｊ、ら、紅土り工」μμ ア壮（１９８８）　６８：４Ｉ７−４２２；　Ｔｕｌｐａｚ。

組ら、Ｓｅ！ｆｉ’　ａｒｓ　ｔ　ｅｍａｔｏ　ｏ　（１９８８）　２５：６２ −７３）。

本発明の技術に有用な化合物は、１９８９年９月２８日に出願され本願に参考の ために組込まれる、同時係属中の米国特許第０７／４１４．２０１号に記載され ている。これらの化合物は、ヘマトポルフィリンまたは他の医学的に有用な誘導 体が吸収するよりも長い、約６７０〜７ｇ０ｎｍの範囲の波長の光を吸収する、 ヘマトポルフィリンのヒドロベンゾ誘導体である。これらの緑色ポルフィリン化 合物はまた、より短い波長に蛍光励起ピークを示し、これは診断の蛍光発光に使 用され得る。固形腸瘍および感染性生物を破壊するための、このタイプの化合物 の光活性化もまた記載されている。

ｌ豆亘皿孟 本発明は、造血細胞、例えば骨髄からの単核細胞から、悪性細胞を取り除（のに 有効な方法を提供する。この方法を適用すると、悪性疾患が緩解期にある患者の 自家骨髄を、その後再発時の移植に使用することが可能になる。本発明はまた、 活動性の白血病患者（緩解期でない）、もしくは同一の除去手法が効果的に作用 する他の（非白血病性）悪性疾患を煩う患者の骨髄または池の造血細胞から、悪 性細胞を取り除（効果的な方法を提供する。この方法は、造血細胞に加えられた 緑色ポルフィリンの、光活性化を利用する。

従って、１つの局面において、本発明は、骨髄組成物のような造血細胞組成物の 中の悪性細胞を選択的に破壊する方法に関し、該方法は、該細胞を、本願で定義 されている緑ポルフィリン（ＧＰ）に、悪性細胞によるＧＰの取り込みを生じる のに十分な時間だけ接触させる工程、該細胞調製物から余分のＧＰを除去する工 程の後、得られた組成物に、悪性細胞を破壊するのに有効な強度と時間で、該Ｇ ｐによって吸収される波長の照射線を照射する工程を包含し、それでもなお残存 する細胞の造血能が維持されている。

もう１つの局面において、本発明は、骨髄または他の造血細胞組成物の中に悪性 細胞が存在しないことを確認またはその存在を検出する方法に関し、該方法は、 該細胞組成物を本願に記載のＧｐに、上記のように接触させる工程、励起波長を 照射する工程および任意の存在する悪性細胞が吸収したＧｐに起因する蛍光が、 存在、または存在しないことを検出する工程、を包含する。

Ｍ血ｉ！呈量里 図１は、本発明の方法に使用される緑ポルフィリン（Ｇｐ）化合物の構造を示す 。

図２は、構造式３および４　（ＢＰＤ）で示されるヒドロ−モノベンゾポルフィ リン誘導体の４つの好ましい型の構造を示す。

図３は、白血病ＨＬ６０細胞によるＢＰＤの取り込みを示す。

図４は、マーカー緑色染料の存在と、白血病細胞の蛍光との関係を示す。

図５−７は、白血病細胞と正常な細胞に対するＦＡＣＳ分析の結果を示す。

図８は、血清のＢＩ’Ｄ取り込みに対する影響を示す。

図９Ａおよび図９Ｂは、悪性細胞への毒性に対するＢＰＩ４１の影響を示す。

図１ＯＡおよび図１０Ｂは、損傷細胞への毒性に対するＨＰＤ濃度の影響を示す 。

１を　るための５咀 本発明は、治療または診断のための、骨髄中の細胞のような造血細胞の、特定の ポルフィリン誘導体を用いた処置を提供する。

患者からの骨髄の回収および移植方法は、一般に、当該技術分野により公知であ る。本発明は、エクスビボで、骨髄から悪性細胞を除去し、およびこのような組 成物中の悪性細胞を検出する方法に帰せられる。

「に　なＧ　ム 本発明の方法に有用な化合物は、図１に示す構造を有している。これらの化合物 は、ヘマトポルフィリンの共役系の１つとアセチレン誘導体のジェノフィルとヲ 含ムティールス・アルダ−反応の結果、図１の構造式１および２に示すＡまたは Ｂ環に融合した、本願で「ヒドロベンゾ」と呼ぶ融合シクロへキサジエンを得る ことによってＨ製される。へ牛サジエン環におけるπ系の転移の結果、構造式３ および４の化合物が生じる。還元すると、構造式５および６の化合物が得られる 。図１に示すすべての化合物が本発明において有用であるが、構造式３および４ の化合物が好ましい。これらの化合物の特に好ましい型を図２に示す。

釦　本願で使用される用語「緑色ポルフィリン（Ｇｐ）　Ｊは、図１に総括的に 示される化合物である。ヒドロモノベンゾポルフィリン誘導体（ＢＰＤ）は、一 般に、図１の構造式３および４の化合物および図２に示す化合物のことを指し、 なぜなら、これらは、Ｇｐの好ましい型であるからである。

本発明に有用ない（っかの化合物またはそれらの前駆体の特定のＨ！！につぃて は、Ｍｏｒｇａｎ、　Ａ、Ｒ，ら、Ｊ　Ｃｈｅｒｔ　Ｓａｃ　Ｃｈｅ＊Ｃｏｍｍ ｕｎ　（１９８４）　ｐｐ、１０４７−１０４Ｊｌ；およびＰａｎｇｋａ、　Ｂ 、Ｓ、ら、ＪＯ■ｒ士二Ｃｈｅｗ　（１９８５）　５１：１０９４に記載されて いる。これらの刊行物に記載されているように、プロトポルフィリンｌｘジメチ ルエステルは、テトラシア／エチレンのような強力なディーＡ、Ｃ・７　／Ｌ／ 　ｆ　−：、；エノフィル試薬と反応すると、ヒドロジベンゾ誘導体に誘導され ることが以前から報告されている。しかし、これらの参考文献によって示される ように、アセチレンのより弱い電子吸引基の誘導体がディールス・アルダ−試薬 として使用されると、ヒドロジベンゾ誘導体が形成される。従って、プロトポル フィリンと、例えばジメチルアセチレンジカルホキシレー）　（ＤＭＡＤ）との 反応から直接、Ｒ１およびＲ２が、初めの、アセチレン−誘導ディールス・アル ダ−試薬Ｒ’Ｃ＝ＣＲ２−５この場合カルボメトキシの置換基を示す、図１の構 造式１および２に示される化合物が得られる。Ｒ１およびＲ２は、一般に、特に カルバルコキシ基、例えばカルボメト牛シまたはカルボエトキンである。Ｒ３は 、反応に使用されるポルフィリンに存在する置換基またはポルフィリンに誘導さ れた置換基を指す。Ｍｏｒｇａｎの参考文献では、反応物質はプロトポルフィリ ンＩＸジメチルエステルであった。従って、リガンドＲ３は、すべての場合にお いて、２−カルボメトキシエチルであった。

ＭｏｒｇａｎおよびＰａｎｇｋａの参考文献に開示されている、アセチＬ’７− 誘導ジェノフィルの置換基には、フェニルスルボニル、すなわち５Ｏ２Ｐｈが含 まれ、これは、上記文献に記載のような単一の置換基（β−フェニルスルホニル プロピエート）であるがまたは、Ｒ１およびＲ２の両方がスルホニル誘導体であ ると仮定してもよい。一般に、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、穏和な電 子吸引基であり、通常、カルバルコキシ、またはアルキルもしくはアリルスルホ ニル、またはＡおよびＢ環の一方だけではなく両方と反応するほどには電子を吸 引しない、他の任意の活性化置換基であり、例えばシアノまたは−ＣＯ！ＪＲ５ ＣＯ−（Ｒ５はアリルまたはアルキル）である。Ｒ１およびＲ２の一方は、必要 に応じてＨであり得てもよく、この場合もう一方は、ディールス・アルダ−反応 を行うのに十分な強度をもつ電子吸引性置換基である。

本願で使用する用語、カルボキシは、通常に定義されているように一〇〇〇ｌ（ であり、カルバルコキシは−ＣＯＯＲであり、ここでＲは、アルキルである。カ ルボキシアルキルは、置換基−Ｒｏ−ＣｏｏＨを指し、ここでＲｏは、アルキレ ンである。カルバルコキシアルキルは、−Ｒ−〇〇ＯＲを指し、ここでＲｏおよ びＲは、それぞれ、アルキレンおよびアルキルである。フルキルは、メチル、ｎ −へ牛シル、２−メチルペンチル、ｔ−ブチル、ｎ−プロピル等の１から６個の 炭素原子をもつ飽和の直鎖または分岐鎖ヒトミカルビルである。アルキレンは、 基が二価であること以外は、アルキルと同様である。アリルまたはアルキルスル ホニル部分は、式５Ｏ２Ｒを有し、ここでＲは上記に定義されたアルキルである か、またはアリルであり、ここでアリルは、ハロ（フルオロ、クロロ、ブロモま たは３−ド）、低級アルキル（１−４Ｃ）または低級アルコ牛シ（１−４Ｃ）か ら独立して選択される１から３個の置換基で必要に応じて置換されることのある フェニルである。さらに、Ｒ１およびＲ２のいずれか１つ、または両方がアリル 、すなわち、上記に定義−されたように必要に応じて置換されることのあるフェ ニルであり得る。

°図１に示すように％　Ｒ’−Ｃ＝Ｃ−Ｒ２とプロトポルフィリンＩＸ環系との 反応によって形成される付加物（Ｒ３は、２−カルボメトキシエチルまたは２− カルボエトキシエチルのような、２−カルボ亭ジエチルの保護型であり、Ｒ’は 、ＣＨ”ＣＨ２である）は、構造式１および２の化合物であり、ここで、構造式 ｌの化合物は、Ａ環への付加によって得られ、構造式２は、Ｂ環への付加によっ て得られる。これらの得られた構造式ｌおよび２の生成物において、Ｒ４は、Ｃ Ｂ”ＣＢ２のままであるが、このビニル基は、構造式１のＢ環または構造式２の Ａ環のビニル環置換基への付加または酸化によって、Ｒ′の他の態様に容易に誘 導される。

付加または酸化生成物は、もし付加された置換基が官能性の遊離性基であるなら ば、さらに置換され得る。例えば、−Ｂｒは、−ＯＨ，−ＯＲ（Ｒは、上記のよ うに１−６Ｃのアルキルである）、または−ＮＲ２、−Ｎ）ＩＲ，−ＮＲ２等で 置換され得る。好ましい実施態様では、付加された置換基の一方は、水素であり 、他方は、７１０（フルオロ、クロロ、ブロモまたはヨード）、ヒドロキシ、低 級アルコキシ、アミノまたはアミド、スルフヒドリルまたはオルガノスルフィド からなる群から選択されるか、またはそれ自身水素であり得る。ビニル基への付 加によって、得られる化合物の吸収スペクトルは著しく変化しない。

水のマルフフニフフ付加による生成物は、対応する環に、ヘマトポルフィリン環 系と類似の置換基構造を提供する。従って、本発明の化合物は、Ｒ′として様々 な基を含む。これには、下記に記載するような、他のポルフィリンまたはポルフ ィリン関連環系を提供する置換基が含まれる。

プロトポルフィリン！ＸのＲ３は、２−カルボキシエチル（−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ ＯＲ）である。しかし、Ｒ３の性質は（もし、環のπ結合に共役したπ結合を含 んでいなければ）、通常、ディールス・アルダ−反応の進行または得られる生成 物の効力および吸収スペクトルに関連しない。従って、Ｒ３は、例えば、低級ア ルキル（１−４０）、またはω−カルボキシアルキル（２−６Ｃ）またはそのエ ステルまたはアミドであり得る。Ｒ３置換基はまた、上記定義のハロゲンまたは 非反応置換基で置換され得る。しかし、本発明のＧｐ化合物のための適切な出発 物質は、天然に存在するポルフィリンであるので、好ましいＲ３の置換基は、　 ＣＨ２ＣＨ２Ｃ０ＯＨまたは−ＣＨ２ＣｔｌＲ２ＣＯＯＲであり、ここで、Ｒは 、アルキル（１−５Ｇ）である。

Ｒ３置換基の性質は、通常、ジエン基質の性質を変えてディールス・アルダ−反 応の進行に影響を与えることはないが、しかし、適切な溶解特性を付与すること によって反応を促進し、または反応の妨害を防ぐためには、誘導体化が必要であ り得ることに留意するべきである。従って、ＭｏｒｇａｎらおよびＰａｎｇｋａ らによって記載されているディールス・アルダ−反応は、遊離のカルボキシル基 による反応の妨害を防止し、適切な溶解特性を付与するために、基質としてプロ トポルフィリンｆＸのジメチルエステルを使用した。

本発明のＢＰＤ化合物において、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＲのエステル化されたカ ルボキシ基を加水分解または部分加水分解することは有利であることが見いださ れた。この加水分解は、Ｒ１、Ｒ２のエステル基よりもはるかに迅速に起こり、 得られる化合物の溶解特性は、非加水分解型の化合物よりもより望ましい。加水 分解は、二酸または一酸生成物（またはその塩）を生じる。

引用文献に記載のディールス・アルダ−反応から直接生じるヒドロモノベンゾポ ルフィリンはまた、この参考文献に記載のように（Ｍｏｒｇａｎら、およびＰａ ｎｇｋａら（前出）参照）、塩化メチレン中のトリエチルアミン（ＴＥＡ）また は１，５−ジアザビシクロ［５，４，０］ウンデカ−５−二ン（ＤＢｔｌ）のよ うな適切な試薬で処理することによって異性化し得、図１の３および４として示 される構造式の化合物を形成する。生成物の立体化学は、試薬に何を選択するか によって決定される。

図１の化合物３および４は、環外メチル基（構造式３のＡ環および構造式４のＢ 環）の、Ｒ２ｆ！換基に対する相対的位置を示していない。これらの著者によっ て、ＴＥＡを使用した転移では、角のメチル基とＲ２のシス構造が得られ、ＤＢ Ｕで処理すると、トランス生成物が生じることが見いだされている。このシス生 成物は、明らかに、速度論的に支配されている。なぜなら、シス生成物をＤＢＵ で処理すると、さらにトランス立体構造へと転移が起きるからである。従って、 図１の構造式３および４は、それぞれ環ＡおよびＢにおいて、ＴＥＡまたはＤＢ Ｕのいずれかの触媒作用で転移された生成物を、総括的に示す。

さらに、ディールス・アルダ−反応生成物は、チャコールパラジウムの存在下で 水素を用いて処理することによって選択的に還元され得、図１の構造式５および ６に示すような、それぞれ対応するＡ環およびＢ環のディールス・アルダ−生成 物に対する、環の飽和されたアナログを得る。これらの還元生成物は、あまり好 ましくない実施態様であり、構造式１−４の化合物と比較して、本発明の方法に は有用でない。

構造式１および２で表される化合物に関する上記の、残るビニル置換基（Ｒ′） の変換による誘導体化、および−Ｒ３の様々な種類についての記載はまた、構造 式３．４．５および６の化合物にも適用できる。

構造式３およびａ　（ＢＰＤ）の化合物、特に、Ｒ３に加水分解されたおよび部 分加水分解されたカルバルコキシ基を有する化合物は、最も好ましい。−ＣＯＯ Ｈを有する本発明の化合物は、遊回１の化合物の多くは、少なくとも１つのキラ ル中心を含むので、光学異性体として存在することが認識される。本発明の共役 体および方法は、不斉炭素の両方の立体配置を有する化合物を、化合物が単一の 立体異性体の単離体として提供されるか、またはエナンチオマーおよび／または ジアステレオマーの混合物であるかにかかわらず、含む。ジアステレオマーの混 合物の分離は、任意の通常の手段によって行われ、エナンチオマーの混合物は、 それらを光学的に活性な調製物と反応させ、得られるジアステレオマーを分離す る通常の技術によって分離され得る。

反応生成物は、Ａ環およびＢ環に対する付加の分離されていない混合物、例えば 、構造式ｌと２または３と４または５と６との混合物であり得ることもまた認識 すべきである。分離形態、すなわち、構造式３のみまたは構造式４のみ、あるい は任意の比の混合物が、本願に２撒の治療法および診断方法において使用され得 る。

用語「ジヒドロ」モノベンゾポルフィリンは、ポルフィリン環系とＲ’Ｃ”Ｃ− Ｒ２とのディールス・アルダ−反応により得られる直接の生成物およびその置換 生成物を指し、「テトラヒドロ」モノベンゾポルフィリンは、前記の構造式５お よび６に示す還元生成物を指し、「へ牛すヒドロ」モノベンゾポルフィリンは、 環外「ベンゾｊ環を完全に還元されて含む、アナログを指す。ヒドロモノベンゾ ポルフィリンは、すべての３つのクラスの酸化状態を含むものとして総括的に使 用される。モノベンゾポルフィリン自体は、それらの吸収最大値が必要とされる 範囲内ではないため、本発明の範囲外である。

図２は、４つの特に好ましいＧｐ化合物を示す。これらの化合物は、構造式３ま たは４を有するＧｐ杢であるため、集合的に、ベンゾポルフィリン誘導体（ＢＰ Ｄ）と呼ばれる。これらは、構造式３および４の置換生成物の加水分解または部 分加水分解型であり、ここで、Ｒ３のカルボキシル保護基の１つまたはその両方 は加水分解されている。Ｒ１およびＲ２におけるエステル基は、比較的ゆるやか に加水分解するため、図２に示す型への変換は容易に行われる。

これを説明する目的のために、Ｒ３は、＜Ｈ２ＣＦｈＣＯＯＲ３’と表される。

図２に示すように、各Ｒ３°は、好ましい化合物ＢＰＤ−ＤＡではＨであり、Ｒ １およびＲ２は、カルバルコキシであり、Ａ環が誘導体化されている。　ＢＰＤ −ＤＢは、８環が誘導体化されている、対応する化合物である。ＢＰＤ−ＭＡは ＢＰＤ−ＤＡの部分加水分解型を表し、ＢＰＤ−ＭＤはＢＰＤ−ＤＢの部分加水 分解型を表す。従って、後者の化合物において、Ｒ１およびＲ２はカルバルコキ シ、１つのＲ”はＨｌおよびもう１つのＲはアルキル（１−６Ｃ）である。構造 式ＢＰＤ−ＭＡおよびＢＰＤ−ＭＢの化合物は、Ｃ環のカルバルコキシエチルの みまたはＤ環のカルバルコキシエチルのみが加水分解されたものと均質であり得 、またはＣ環およびＤ環置換基の加水分解物の混合物であり得る。さらに、ＢＰ Ｄ−ＭＡ、　−ＭＢ、　−ＤＡおよび−ＤＢの中の任意の２つ以上の混合物が、 本発明の方法に使用され得る。

ディールス・アルダ−生成物のこれらの加水分解型は以前に開示されていないが 、本発明はまた、これらの化合物にも関する。従って、他の局面において、本発 明は、図２に示す構造式の化合物に関し、ここで、Ｒ１およびＲ２は、上記と同 様であり、Ｒは、アルキル（１〜６Ｃ）である。好ましい実施態様ではｓＲ’お よびＲ２は、カルバルコキシ、特にカルボメトキシまたはカルボエトキシである 。

Ｒ′がビニル以外のものであるかまたはＲ３が天然のものでない置換基である、 特定の他の実施態様もまた従来技術では開示されていないが、本発明は、この実 施態様にも関する。すなわち、本発明は、図１に示す化合物に関し、ここで、Ｒ １オヨヒＲ２は、独立して、カルバルコキシ（２−６Ｃ）　、フルキル（１−６ Ｃ）　、スルホニル、アリル（６−ＩＯＣ）スルボニル、アリル（６−１０Ｃ） 　、シアノ、および−ＣＯＮＲ５ＣＯ−からなる群から選択され、ここでＲ５は アリル（６−１０Ｃ）またはアルキル（１−６Ｃ）であり、 各Ｒ３は、独立して、カルボキシアルキル（２−６Ｃ）　；ｊ−たはその塩、ア ミド、エステルもしくはアシルヒドラゾンであるか、またはアルキル（１−６Ｃ ）であり、そしてＲ′は、Ｃ）ＩＣＨ２、ＣＨ０１？’°、−ＣＩＩＯｌ−ＧＯ ＯＲ’°、ＣＨ（ＯＲ’°）ＣＨ３、ＣＨ（ＯＲ”　）ＣＨ２０Ｒ”、−ＣＨ（ ＳＲ’°）ＣＬ、−ＣＦＩ（ＮＲ”２）ＣＨ３、−ＣＨ（ＣＮ）ＣＬ、−ＣＨ（ ＣＯＯＲ”）＋４．、−ＣＩ（（（○ＯＣＲ”）ＣＨ３、−ＣＨ（ハ０　）Ｃ） １３、または−ＣＨ（ハロ）ＣＨ２（ハロ）であり、 ここで、Ｒ４°は、Ｈであるか、または親水置換基で必要に応じて置換されるこ とのあるアルキル（１−５Ｃ）であり、またはＲ４は、ビニルを直接または間接 に誘導体化して得られるく１２Ｃの有機基、または Ｒ４は、本願中に定義されている、構造式−Ｌ−Ｐの１−３テトラピロール型環 核を含む基であり、 Ｒ′がＣＨＣＨ２のとき、両方の１１３が２−カルバルコキシエチルではあり得 ない。

構造式３および４の化合物およびその混合物は、特に好ましい。Ｒ；およびＲ２ が同一で、カルバルコキシ、特にカルボエトキシであるものも好ましく、また、 Ｒ４が−ＣＨＣＨ２、ＣＨ（ＯＨ）ＣＦＩ３もしくは−ＣＨ（ハＯ）ＣＨ３、ま たは式−［、−Ｐの１−３テトラビ（７−ル型核（以下に定義される）を含む基 であるものも好ましい。

本願で使用される用語「テトラピロール型核」は、下記骨およびその塩、エステ ル、アミドまたはアシルヒドラゾンの高度に共役したものを示す。これには、実 際には完全に共役した系である、ポルフィリン系；実際にはポルフィリンのジヒ ドロ型である、クロリン系；および完全に共役した系のテトラヒドロ型である、 還元クロリン系を含む。「ポルフィリン」を特定するとき、完全に共役した系が 示され、Ｇｐは、効果的には、ポルフィリン系のジヒド１１７型である。

本発明の化合物の１つのグループは、置換基Ｒ４が、少なくとも１つの追加のテ トラビロール型核を含むものである。得られた本発明の化合物は、テトラピロー ル型環系の少なくとも１つがＧｐである、二量体またはオリゴマーである。０９ 部分とそのＲ′部位を介した追加テトラビロール型系との結合は、エーテル、ア ミンまたはビニル結合を介し得る。Ｒ４に対応する（ＡおよびＢ環における）２ つの置換位置が利用可能であルホルフィリン環系の場合の、追７Ｉｌｌ誘導体化 もまた、以下に記載のように、形成され得る。

上記のように、図１に示す構造式の化合物は、Ｒ４の実施態様が、最初のｃｐ生 成物のビニル基に対する付加によって形成される化合物を含む。従って、Ｒ′は 、簡単な付加反応によって形成される置換基と一致する任意の置換基であり得る 。従って、両方の付加される置換基は例えば、ＯＨまたはハロであり得、これら の置換基はさらに置換され得るか、または付加試薬がＯＸ型で、Ｒが環に隣接す る炭素に付加されて−ＣＨ２ＣＦＩｚ型のＲ′を形成し得る。

ＣＨ２０Ｈ，−ＣＩＯｌまたはｃｏｏｇ、ならびにその塩およびエステルのＲ４ を得るために、ビニル基はまた酸化もされ得る。

従って、一般に、Ｒ′は、ビニル基−ＣＩｌ＝ＣＨ２が、開裂または付加によっ て容易に変換された結果の任意の置換基、および遊離性の基と付加部分との反応 生成物を示す。典型的なＲ′置換ＣＩ’ｌ（ＯＨ）Ｍｅ、−ＣＨＢｒＭｅ、−Ｃ Ｈ（ＯＭａ）Ｍｅ、　−ＣＩ　（ピリジニウムプロミド）　Ｍｅ、−ＣＩ（ＳＴ Ｉ）Ｍｅおよびそのジスルフィド、−ＣＩＯ）ＩＣＨ２０）１．−ＣＩ（０、お よび−ＣＯＯＩ（または−ＣＯＯＭｅを含む。

Ｒ４が−Ｌ−Ｐであるとき、置換基構造式ｒ−Ｌ−ＰＪは、−し−が以下からな る群から選択され、 （ａ＞　’　（ｂ）　（ｃ） Ｐは、Ｇｐ（ここで、Ｇｐは、図１に示す構造式１−６で示されるＧｐであるが 、Ｒ１を欠失し、図１に示されるＲ４によって占められている位置を介してＬに 結合している）および以下の構造式０式％： （ここで、Ｒ３およびＲ１は、上記に定義される通りであり、これらで占められ ていない結合が次いでＬに結合している）からなる群から選択される。以下の省 略形 は、以下の構造式のポルフィリンを示す。

（−Ｌ−が構造式（ｅ）または（ｆ）であるとき、二重結合が結合する環系は、 以下に相当する共鳴系を 示されるように、二重結合が結合する環内に、宵し得る）　−Ｌ−Ｐの典型的な 実施態様は、 を含み、ここで、Ｒ４は、上記に定義される通りである。従って、本発明の化合 物は、 （ニス下金台０ 本発明の二量体およびオリゴマー化合物は、ポルフィリン自体の三量化およびオ リゴマー化のための反応に類似した反応を使用して調製され得る。緑色ポルフィ リンまたは緑色ポルフィリン／ポルフィリン結合は、直接形成され得るか、また はポルフィリンが結合された後、いずれが一方または両方の末端ポルフィリンが ディールス・アルダ−反応によって、対応する緑色ポルフィリンに変換され得る 。

本発明の化合物を形成するには、ｃｐまたはポルフィリンを、例えば塩化メチレ ン溶液中で、ＨＢｒで処理することにより、Ｇｐのビニル基をハロゲン化物、好 ましくは塩化物に変換し、付加生成物を回収する。得られた生成物は真空下に蒸 発させることによって回収し、塩化メチレンに再溶解し、固形炭酸カリウムのよ うな不溶性の塩基に添加する。これに、等当量の、結合されるテトラビロール型 核ｒＰＪを添加する。ここで、「Ｐ」の反応性Ｒ′部分は、１−ヒドロキシエチ ルである。この混合物を、適切な時間、通常約１２時間攪拌し、得られた二量体 のジアステレオマ一対（鏡像異性体対の型およびメン型）は、混合物からクロマ トグラフィーによって分離され得る。この手法で「Ｐ」によって示されるテトラ ピロール型核は、もう一つのＧｐまたはポルフィリンのいずれかであり得る。

ｒＰ］置換基がポルフィリンなら、さらにハロゲン化および反応させて、より高 次のオリゴマーを形成するために、追加のビニル基を利用可能にし得る。

−１４ビ＝ル基を有する実施態様においては　Ｒ４が１−ヒドロキシエチルであ るＧｐまたはポルフィリンを、同様に１−ヒドロキシエチルを架橋Ｒ４として有 する等当量の、結合しようとするテトラピロール型核と、トリフルオロメチルス ルホン酸のような強く請求核性でない酸と共に処理することにより、二量体が得 られる。この処理により、メチルプロペニルでｕ　合した二量体の沈澱が生じる 。（エーテル結合二量体は、硫酸のような代用酸を置換することにより、この反 応で副産物として形成され得る。） アミノ結合化合物は、ＢＢｒでビニル基を処理し、次いで所望の結合を得るため に適切なアミンで処理することにより形成され得る。

本発明の方法で用いられるＧｐは、応用法によっては、その効力を補佐する追加 の成分とも複合し得る。骨髄の悪性細胞を除去するのに用いられる場合、Ｇｐは さらに、本質的に細胞毒であるか、または光によって活性化される追加の細胞毒 性薬剤と複合し得るか、または共に用いられ得る。例えば、本発明のＧｐは、ジ フテリア毒、リシンＡ１　シュードモナス毒のようなプロティン毒、または非プ ロティン毒と複合し得る。

この実施態様では、Ｇｐが生来有するホーミング能力が、追加の細胞毒成分を優 先的に悪性細胞に対して向かわせるために、用いられる。

あるいは、除去または診断に応用される場合には、Ｇｐのホーミング能力は、悪 性細胞に特異的な、正常細胞に対抗する部分を複合することによっても高められ 得る。この標的特異的な成分は、例えば、その免疫グロブリンもしくはその部分 、または受容体に特異的なリガンドであり得る。

免疫グロブリン成分は種々の任意の物質であり得る。それは多クローン性または 単クローン性抗体調製物に由来し得、全抗体、またはＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂも しくはＦａｂ’画分のような、これらの抗体の免疫学的反応性断片を含有し得る 。全抗体の代用品として、そのような免疫学的反応性断片を使用することは当業 者に周知である。例えば、Ｓｐｉｅｇｅｌｂｅｒｇ、　Ｈ，Ｌ、、　”Ｉｍｍｕ ｎｏａｓｓａｙｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　Ｃ１１ｎｉｃａｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ− （１９７８）　３：１−２３参照。

多クローン性の抗血清は、抗体が所望される適切な抗原を哺乳動物に注射し、抗 原に対する血清中の抗体レベルをアッセイし、力価が高い時に抗血清を調製する という従来方法により調製される。単クローン性抗体調製物は、免疫動物から採 取した末梢血液のリンパ球または肺臓細胞を用いて、ウィルス感染、骨髄腫との 融合、または他の通常工程により、これらの細胞を不滅のものとし、単離したコ ロニーによる所望の抗体の生成についてスクリーニングを行うという、Ｋｏｅｈ ｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ法のような通常の方法によっても調製され得る。

単クローン性または多クローン性調製物からの断片の形成は、Ｓｐｉｅｇｅｌｂ ｅｒｇ、　Ｈ，Ｌ、　（前出）に記載のような通常手段により成し遂げられる。

特に本発明の方法に有用な抗体としては、Ｍａｌｃａｌ＋！、　Ａ、ら、εｘ　 Ｉ（ｅｍａｔｏｌ　（１９８４）　ｕ：５３９−５４７に記載のように調製され 得る、単クローン性抗体調製物ＣＡＭＡＩ、−１が含まれる。なお、　ＣＡＭＡ Ｌは、腫瘍マーカーである。

受容体に特異的なリガンドとは、悪性細胞表面の受容体と結合する部分のことを 指し、従って受容体の輪郭および電荷パターンに対して相補的である輪郭および 電荷パターンを有する。広範な種々の細胞の型が、ホルモン、成長因子、または 神経伝達物質に結合し得る特異的受容体を有することは十分に理解されている。

これらのい（つかは、悪性細胞のある種の型に存在する。しかし、受容体に特異 的なリガンドのこれらの実施態様が知られ、かつ理解されているが、「受容体に 特異的なリガンド」という本明細書で用いられている表現は、受容体と特異的に 結合するものなら、天然または合成のどのような物質をも示すものである。

標的細胞に特異的な成分または細胞毒成分のＧｐへの複合は、任意の通常方法に より成し遂げられる。Ｉｇおよびペプチド型リガンドのようなタンパク質の場合 、これらの部分間の直接の共有結合が、例えば、カルボジイミドのような脱水剤 を用いて成し遂げられる。Ｇｐを免疫グロブリン部分に共有結合させる特に好適 な方法は、主にジメチルスルフオキシド（ＤＭＳＯ）から成る反応媒質の存在下 、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣＩ ）で処理する方法である。ジシクロへキシルカルボジイミドまたはジエチルカル ボジイミドのような他の脱水剤もまた、通常の水性および部分的に水性である媒 賀と同様に用いられ得る。

非タンパクの受容体リガンドは当業者に既知の方法により、相応する官能基に基 づいてＧｐｌ、：複合し得る。

複合体の活性部分は、二官能性の架橋化合物によっても複合し得、これは２つの 活性成分それぞれを共有結合し得る。これらの種々の架橋は市販されており、典 型的リストとしては、例えば、Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａ１社のカタログに 掲載されているようなものが含まれる。これらの架橋は、ホモまたはへテロニ官 能性部分のいずれかであり、ジスルフィド、アミド、ヒドラゾンおよび種々の他 の架橋を形成し得る官能性を有する。

他の架橋としては、ポリアミン、ポリエーテル、ポリアミンアルコールのような ポリマーが、ケトン、酸、アルデヒド、イソシアン酸塩、または他の種々の基に よって成分に誘導されたものが含まれる。

複合体の活性部分を複合するのに用いられる技術は、任意の標準手段を含み、複 合の方法は、本発明の一部分を形成するものではない。よって、そのような複合 体を生成するために当業者に周知の有効な技術は、どのようなものも使用され得 る。

本発明の方法で用いるために、緑色ポルフィリン化合物それ自体または複合体の いずれかが、さらに追加的にＧｐを標識する化合物またはイオンにさらに誘導体 化され得る。放射性同位体、発色団、および蛍光標識を含む種々の標識部分が使 用され得る。

Ｇｐのみの化合物、またはＧｐが特異的結合物質と複合している化合物は、ポル フィリン系への適切な放射性カチオンの配位により、放射性同位体で標識され得 る。有用なカチオンとしては、テクネチウム、ガリウム、インジウムが含まれる 。

複合体では、特異的結合物質の片方または両方が標識に結合し得るか、関連し得 、または標識が０９部分それ自体に複合もしくは配位し得る。

Ｇｐまたはその複合体は、上述のように、または適切な金属イオンに錯体化する ときに用いられ得る。一般に当業者に理解されているように、テトラピロール型 核は、金属錯体を得るために、マグネシウムイオン、亜鉛イオン、第一スズイオ ン等のような適切なイオンで処理され得る。上述のように、金属イオンは放射標 識でもあり得る。テトラビロール型核における金属イオン含有物の性質および望 ましい性質は化合物が使用される特定の応用によって異なる。金属イオン含有物 が望まれるなら、既知の条件下、適切な金属塩を用いて、所望の金属イオンを挿 入し得る。例えば、塩化メチレンとメタノールの比が１：１中の酢酸亜鉛で化合 物を処理することにより、亜鉛イオンを導入し得る。

の、゛ 除去しようとする骨髄を標準技術を用いて被検体から取り出し、単核細胞を除去 プロトコルに用いる。骨髄が最も一般的に用いられる、移植のための造血細胞の ソースであるが、細胞、血液のような、他のソースもまた使用し得る。

前述のｃｐ化合物および／または複合体、特にそのＢＰＤ型は、除去しようとす る骨髄の造血細胞を、選択されたＧｐまたはこれらＧｐの混合物に、悪性細胞が Ｇｐ組成物を取込むに効果的な量および時間で接触させることにより、本発明の 方法で用いられる。過剰なＧｐ組成物を次に標準洗浄工程により除去する。

Ｇｐ組成物により効果的に既に標識されている悪性細胞を含有する得られた組成 物を、次に、Ｇｐ組成物により吸収される範囲、典型的には６７０−７８０ｎｍ の範囲で、悪性細胞を破壊させるに効果的な時間、照射線を放出する光源で照射 する。

骨髄細胞に接触するのに月いられるＧｐの濃度は、特異的Ｇｐ酸成分または選択 された成分により異なるが、例えば、図２に示すＢＰＤ化合物の典型的濃度は、 無血清の条件下で、５５−１Ｏ０ｎ／１０８細胞／ｍｌの範囲であり、好ましく は１１０−２０ｎ／１０６細胞／ｍｌである。これらの好適な濃度では、正常な を髄始原細胞の成長が促進される一方で、悪性細胞は照射により破壊される。イ ンキニベーシ３ンの時間もまた、光活性剤Ｇｐの選択により異なるが、図２に示 すＢＰＤ化合物では適切な時間は３０分から１時間の範囲である。

処理済みｔａの照射は典型的には、約５−６Ｊ／ｃ＋ｍ２、好ましくは５．４Ｊ ／ａｍ２の強度で、１−２時間行う。有用な光源としては、レーザ（６９０ｎｎ ＋）およびレーザ以外の（可視スペクトル）システムの両方が含まれる。

レーザ以外の光源としては、強度の放電灯（例：水銀灯、金属ハロゲン化物、高 圧ナトリウム）、シ３−トアーク放電灯（例：キセノン、スズハロゲン化物、コ ンパクトソースヨード）、通常の白熱灯または石英ハロゲン白熱灯、および蛍光 灯が挙げられる。

インキニベーション、過剰なＧｐの除去、および照射のための至適条件は、一般 に知られた技術により容易に確かめられ得る。

さらなる実例として、患者の移植工程のための自家移植の骨髄を調製する際は、 以下の典型的プロトコルに従う。

骨髄（ＢＭ）細胞を手術室の条件下で、患者から取り出す。

単核細胞集団を得るために、８Ｍ細胞を分離する（例えば、密度遠心分離機によ り）。この細胞集団は正常な造血細胞（自家移植の８Ｍ移植に続く患者の造血シ ステムの再構築に必要とされる）を含有するが、種々の数の悪性細胞をも含有す る。

８Ｍ細胞は洗浄され、透明容器で、処理に適した濃！ｆ（Ｓｘｔｏ’−１０８細 胞／ｍｌ）にまで希釈される。ベンゾポルフィリン誘導体（ＢＰＤ）は、冷凍溶 液から希釈され、適切な濃度で８Ｍ細胞に添加される。８Ｍ細胞は暗所で約１− ２時間ＢＰＤでイン亭ユベートされる。そして、細胞を遠心分離機にかけ、過剰 のＢＰＤを有する上澄み液を別の容器に移し、１０％のＦＣＳを含有するフェノ ール赤を含まない媒地で細胞を再度懸濁する。次いで、透明容器を１−２時間、 室温（２０℃）でゆるやかに攪拌しながら可視光にさらす。

光照射後、８Ｍ細胞を組織培養媒地で洗浄し、試料を分析のため取り出す。エク スビボでの除去工程（ＢＰＤ＋光）は、治療患者の造血の再構築に必要とされる 正常細胞を適切な数量残したまま、ＢＭに含まれる悪性細胞を選択して殺すこと が生じる。

除去された８Ｍ細胞を、自家移植の８Ｍ移植に必要とされるだけ低温保存する。

その時点で細胞を解凍し、事前に体内に存在する悪性細胞を根絶するための適切 なアブレーティブセラピ−（２ｂｌａｔｉｖｅ　ｔｈｅｒａｐｙ）を受けた患者 に、静脈注入する。これらの除去された自己の８Ｍ細胞は、正常な造血が得られ るように患者の骨髄に再移住する。

上述のプロトフルは、骨髄の造血維持の能力を維持する一方で、悪性細胞の除去 を促進する、さもなくば肯定的に作用させるための処理を追加することにより補 足し得る。例えば、ＣＰでの処理、照射、および悪性細胞の除去後、骨髄の残留 部分を、正常細胞の成長を促進するための適切な成長因子で処理し得る。そのよ うな因子としては、り１えば、種々の造血細胞由来の因子が含まれる。

についての　アセスメント 除去が完全に行われたかを確かめるため、または一般に骨髄試料から採取したよ うな造血細胞組成物を評定するため、Ｇｐで処理された組成物を、４０Ｇ−４９ ０ｒｖのオーダーの短波長の光、またはＵＶ光により励起し、悪性細胞中に蓄積 されたＧｐによる、典型的蛍光発光の有無を確かめる。

この工程は、インビボまたはエクスビボで行われ得る。骨髄から得られた処理済 み細胞を、事前に投与されたｃｐを除去するに十分な時間処理し、一般に前述通 りの濃度で、再びＧｐの宵効量に接触させ、使用されるｃｐの励起周波に相当す る短波長光で照射する。蛍光発光が標準法により検知される。加えて、特異的に Ｇｐを吸収する悪性ｍ胞の欠如が、細胞分類技術（ｃｅｌｌ−ｓｏｒｔｉｎｇ　 ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）により確かめられ得Ｎこのようにして、染色された悪性 細胞の欠如が示される。

よって、本発明のＧｐ化合物は、自己の骨髄調製物から悪性細胞を積極的に除去 するのにも、骨髄を評定する、例えば、除去工程が成功したかを確かめるのにも 有用である。

もちろん、確認工程において、Ｇｐ／蛍光技術を利用する必要はない。悪性細胞 の有無を検知するのに適切な方法であれば、どのような方法も都合よく使用され 得る。

以下の実施例は本発明のアプローチによる有効性を示すものであり、本発明の方 法を実例により説明するものである。

実１」口。

によるＢＰＤの、　・　°み 紐士Ｊ旧１袈 以下の白血病細胞系を分析のために用いた：Ｌ１２１０　（マウスのリンパ性白 血病細胞系）；ＨＬ６０（ヒトの急性前骨髄球白血病細胞系）；およびに５６２ （ヒトの慢性骨髄性白血病細胞系）。

これらの系を、３７℃で１０％の００２のインキニベータ中で、１０％のウシ胎 児血清（ＦＣＳ）を補ったフェノールレッドを含有しないＤＭＥ（ダルベツコに より改変されたイーグルの）培地中に維持し、ＡＴＣＣの明細に従い分配した。

単核球細胞をフィコール−ハイバック密度勾配遠心分離により、白血病の臨床的 単離物および正常ヒト骨髄の両方、ならびに末梢血（ヘパリン加試験管中に採取 ）から、抽出した。

血液試料では、全血液をＰＢＳ中で２倍に希釈した後、１０ｍ１の希釈された血 液を３ｍｌのフィコール−／翫イバ７りの上に積層した。１５００ｒｐｍで１７ 分間遠心にかけた後、全て単核球の白血球細胞を含有する単核球バンドを取出し た。これらの細胞をＰＢＳ中で３回洗浄し、そのまま使用するか、または１０％ のＤＭＳＯを含有するＤＭＥ培地中で低温で保存した。これらの低温保存細胞は 、３７℃のウォーターバスで迅速に温め、エタノールで洗浄し、ＰＢＳで１０倍 に希釈し、次に、ＰＢＳで３回洗浄してＤＭＳＯを除去した後月いた。

６〜８週齢の老齢のＤＢＡ／２Ｊ雌マウスの大腿およびけい骨から、洗浄し、２ ５ゲージ針を用いて吸引することにより骨髄を抽出し、単細胞懸濁液を調製した 。これらの骨髄細胞を遠心分離機で分離し、無ｌ！ＩＰＢＳで洗浄し、生存数を カウントした。

マウスの膵臓細胞を、同じＤＢＡ／２Ｊのマウスから抽出して、細胞をワイヤー メツシュに通過させ、単細胞懸濁液を調製することにより得た。これらの細胞は そのまま用いるか、または上記のように低温保存した。

二豆五五店 ＦＡＣ３分析の前に、特に他の記載がなければ、全ての細胞をＦＣ３非在下、フ ェノールレッドを含有しないＤＭＥ培地中で３０分間、下記のように、ＢＰＤま たはマーキング染料を有する３７℃、１０％ＣＯ２のインキニペータ中で、イン キユベートした。次に、細胞をＰＢＳ中で洗浄して余分の光増感剤を除去し、１ ｌ１００ｒｐで遠心分離し、フェノールレ・ラドを含有しない培地に再懸濁させ 、ＦＡＣ５を行った。

土豆且止遍 予備の蛍光分光分析のデータによると、図２に示すＢＰＤ−ＤＡは、４２０ｎｍ の光により励起され、３５６　ｎｍ　（ＵＶ）の光では励起される程度はより低 くなった。この化合物は６９０ｎｍで蛍光を発する。さらに、図２に示すＢＰＤ の４型の全てに関する予備データを、ＨＬ６０細胞を５．１０．またはｚｏｕｇ ／■ｌのこれらの化合物の各々と３０分間、インキコベートシ、ＵＶまたは可視 （４８８ｎｍ）光による励起の後、発する蛍光を測定して得た。ＦＡＣ３により ソートした場合、図３に示すように、ＢＰＤ−ＭＡが最大の蛍光を示したと思わ れる。従って、ＢＰＤ−ＭＡを次の分析で用いた。

に・　る 過塩素酸３．５−ジオクタデシルオキサカルボシアニン（Ｄｉｄ）、すなわち、 ４８９　ｎｍの光により励起された場合、緑色蛍光を発するカチオン性脂肪親和 性プローブを用いて処理することにより、ＢＰＤ−ＭＡの吸収と細胞の白血病性 質との相関を確認した。この染料は、細胞から細胞へ移動しない。１０μｇ／ｍ ｌのＢＰＤ−ＭＡとインキュベートされた正常なマウスの骨髄または膵臓細胞を 、ＦＡＣ８を行う直前に、１０μｇ／ｍｌのＢ　Ｐ　Ｄ−ＭＡおよび１００μｇ ／ＩｌｌのＤｉＯを用いて同じ時間インキュベートされたＬ１２１０細胞と混合 した。

ＵＶによる励起および吸収されたＢＰＤ−ＭＡに対応する基準として赤色蛍光を 用いて行われるＦＡＣ３の適用により、これらの細胞を１０の画分に分けた。次 に、各画分を４８８ｒｖの励起光および５３０ｒ＋ａ＋のフィルターを用いて、 緑色蛍光について再分析した；これにより、各画分中のＬ１２１０細胞の存在を 測定し得た。これらの結果を図４に示す。画分１０は、ＢＰＤの存在により最も 高い赤色蛍光を示していたが、緑色蛍光の比率も最も高かった。このように、Ｂ ＰＤの存在は、Ｌ１２１０細胞の存在と相関する。画分１および画分１０のｅｙ ｔｏｓｐｉｎｓによると、緑色光により励起させ、励起顕微鏡で調べた際、画分 １０中の大多数の細胞は緑色蛍光を発するが、画分１中の細胞はいずれも緑色蛍 光を示さなかった。従って、画分１０の高い赤色蛍光を発する、ＢＰＤを含有す る細胞は、Ｌ１２１０細胞と同定された。

吸収されたＢＰＤ−ＭＡによる赤色蛍光に基づ＜　ＦＡＣ５分析によると、白血 病細胞の画分に関してより高いレベルの蛍光が一貫して示された。正常なヒトの 骨髄または末梢の血液の単核球細胞を、ＢＰＤ−ＭＡ中で３０分間インキュベー トして得た結果を、Ｌ５６２またはＬ１２１０細胞の類似のインキ二ベーション と比較して図５に示す。同様に、図６は、正常なヒトの骨髄細胞の分析の結果を 、ＡＭＬ細胞の臨床的単離物と比較して示す。いずれの場合にも、白血病細胞に 関する取り込みは、明かにより多い。同様の結果が図７に示すように正常なマウ スの膵臓細胞と比較して、マウスの白血病細胞系Ｌ１２１０について得られる。

図８は、ウシ胎児血清の存在がＢＰＤ−ＭＡの取り込みに与える影響を示す。細 胞を、５　ｕ　ｇ／ｍｌのＢＰＤ−ＭＡを用いて３０分間、Ｆｅ２の非存在下か 、または５、工０、または２０％のＦｅ２の存在下でインキュベートした。正常 ＰＢＬ又はＡＭＬ臨床的単離物を用いた。図８に示すように、次第に童が増やさ れるＦｅ２の存在下では、特異的取り込みは減少する。

Ｌ立五呈 インビボにお（る　された、°１　ム　の遷 この実施例の結果によると、正常なマウスの造血始原細胞は、生存可能なままで あり、ＢＰＤを用いた混合母集団から悪性細胞を排除する照射プロトフルの後、 致死となるように照射されたＤＢＡ／２マウス中に造血を再構築可能である。

Ｌ１２１０細胞、すなわち、全ての新しい化学療法剤の有効性をテストするため に、国立癌研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎ５Ｈｔｕｔｅ）によ り用いられる典型的な白血病細胞系を、悪性細胞として用いた。

８〜ｌ０１４齢のＤ　Ｂ　Ａ／２雌マウマウスコバルト−６０放射源により致死 のγ−照射（９５０ラド）を露光し、その造血システムを破壊した。

照射の約１〜２時間後、これらのマウスの腹腔内に悪性造血細胞および非悪性造 血細胞の混合物を注射した。これらの混合物は、前もって本発明の除去方法を用 いて、その照射されたマウスの造血を再構築する能力について確認された。

このように、４匹のマウスに１０’の肺臓細胞および１０６のＬ１２１０細胞の 混合物を注射した。この混合物は、前もって、１００　ｎｇ／ｌａ１のＢ　Ｐ　 Ｄ−ＭＡを用いて３０分間インキ二べ一トし、５．　４Ｊ／ｃｉ２の可視光に、 ４０分間露光されていた。

コントロール群の２匹のマウスは各々、肺臓細胞を与えられていないか、または 悪性細胞を含有しない肺臓細胞のみを与えられた。

次に、これらの処理されたマウスをナイロンフィルタがはめ込まれたケージ中に 置き、腹水の形成および長期の生存についてモニターした。ＢＰＤにより処理さ れた混合物を注射されたマウスの長期の生存率は、肺臓細胞のみを注射されたマ ウスと同様であり、処理されていないマウスより有意に高かった。

実ＪＬ阿」− 轡　および　の　ＰＤＴ鳩 単核球細胞を、標準方法によりフィコール−ハイバック密度勾配遠心分離を用い て、ヘパリンを加えた試験管中に採取された全血液または骨髄から分離した。低 温保存された試料を３７℃のウォーターバス中で即座に融解させ、リン酸緩衝液 で処理した生理的食塩水を用いて３＠洗浄して残存ＤＭＳＯを除去した。回収し た骨髄単核球細胞を、１〜２ｘｌＱ’細胞／ｌ１１１に希釈した；回収したＰＢ Ｌ単核球細胞を、２〜４Ｘ１０’細胞／ａ＋１に希釈した。このようにして、正 常および悪性被験者の両方から細胞試料を得た。

Ｇｐ化合物、ＢＰＤ−ＭＡを、ＤＭＳＯ中＜７）４００μｇ／ｍｌの凍結ストッ クから希釈し、５＋＊Ｉのポリスチレン試験管中の０．５〜１＋ＨＤ細胞に加え 、最終濃度０〜１００ｎｇ／＋＊ｌノＢＰＤを得た。これらの細胞を３７℃で、 ５％の００２を用いて、１時間インキュベートし、１５００　ｒｐｖａで１０分 間遠心分、離し、１０％のウシ胎児血清を育するとは限らない、新しいｌ５ＣＯ ＶＥＳ中で再懸濁させた。次に、４つのクールホワイト色のデラックス蛍光灯を これらの細胞に照射した。この蛍光は、室温で１時間に１　、　５　ｍＷ／ｃｍ ２を提供する。

次に、標準コロニーアッセイにおいて、試料を２運でプレートシた。０．３ｍｌ の細胞、０．　３ｍｌのプレテストされたＰＨＡ−白血球により調整された培地 、０．　９ｍｌの絶食中のヒト血漿、および１．４■１のメチルセルロースを、 β−メルカプトエタノールと共にプレートすることにより、このアブセイは行わ れる。

１４日後、コロニーをカウントし、それらの結果をカウントされたコロニーの数 または未処理の照射されたコントロールに対する比率として表した。

これらの測定の結果により、正常な骨髄由来の単核球細胞をＢ　Ｐ　Ｄ−ＭＡ処 理し、照射プロトコルを行った場合、コロニーの数の増加が見られた。一方、急 性骨髄性白血病または慢性顆粒球性白血病に感染したことがわかっている患者由 来の骨髄を用いた場合、コロニーの数は減少した。ある測定では、ＣＭＬに感染 した患者の骨髄を用いると、１０　ｎｇ／ｍｌの低濃度のＢＰＤ−ＭＡは実際上 、コロニーの形成を消滅可能であった。これらの結果を図９Ａおよび図９Ｂに示 す。一方、同様の濃度のＢＰＤ−ＭＡは、正常な細胞を処置するために用いられ る場合、２５　ｎｇ／ｍｌの濃度まで、コロニー形成能力を有意に阻害しなかっ た（図１０Ａおよび図１０８）。

ｒｘＧＴ：ｙ　！−＝ ｒｘｃａＲＥｌ−２ ＦＸＧｔｍ　２−１ ＢＰＤ　−ｆｌＡ、　−ＭＢ、−ＰＡｔ−ρβのＦＡＯ，Ｓ′分析（荷ｇハノｆ ３ＰＤ−ＭＡ、　−ＭＢ、　−ｏｓ、　−ＤＢａ）　ＦＡＣＥ’ｌｒ　（ｃｔｖ ）ＦＡＣＳ：　、ＱＩ　Ｃ、ｐｉＱ）４．１２　ゴｈａ４ｒ１７１ｈ分、Ｆ／７ Ｆｉｇｕｒｅ　４ ＦＡＣ９＊ｔ−斤：　ｆＥＪｆ；ｎ−ｆ）ｔｊｌ、−９Ｅ＃１Ｆ４ｔ　Ｃ３０／ ｙｒインキｚＡ”−Ｖａ　：／ｌ　（ＡＶ）Ｆｉｇｕｒｅ　５ ＦＡＣ！９　竹＄ｆ　、＋　ｉ９じトｅＷＬｔｊＡｈＬ（ｕＶ：５９０）７４り ＯゲラへＺ搦ｔ Ｆｉｇｕｒｅ　６ ＦＡＯ８／オ祈ＳマｂスＩｌｌ卑解’￥、ｊ＃　ＬＩ２１Ｑ　（υＶ：ダ９０） 日ｇｕｒｅ７ ＦＡＣ９／７７’陥Ｆ’ＢＬす’ｊ　ＡＭＬ　＋７−３５　Ｃｕｕ　：ｆ９Ｄ） マイクロブ′７へ／岸Ｌ Ｆｉｇｕｒｅ　８ コロ；−７ｔ、セイ：７！（・１仏骨他庄白坤ＣＣ／’Ｉすｏ　、０１　．１　 １　１０ ９イワＯゲラ４／崩１ 日ｇｕｒｅ　９Ａ コロ；−アッセイ：ＡＭＬ（阿りｂ）−間悸（１輔１」２０十　六二　、０１　 ．１　１　１０ マイクロブ′７へ／ｍ乏 コ〇二−アソＣイ、正常ＰＢＬ ０ｎ／ｍｌ Ｆｉｇｕｒｅ　ＩＯＡ ｎｇ／ｍｌ Ｆｉｇｕｒｅ　ＩＯＢ 豐ｉｔ 自家移植片のために、悪性細胞を含まない骨髄または他の造血細胞を調製する方 法が記載されている。骨髄からの単核細胞は、緑色ポルフィリン（Ｇｐ）で処理 され、悪性細胞により選択的に該ｃｐが取り込まれ、次いで該Ｇｐによって吸収 された光の波長で照射され、悪性細胞が破壊される。取り除かれた骨髄細胞は次 いで自家移植に使用され得る。

国際調査報告 ＋−＋−１−−＋ａ−ｅ−ｃ−＋−−ｍｅ、ＣＡ９１１０００５］国際調査報告 Ｃ＾９１０００５３ Ｓ＾　４４７１７

Claims (18)

【特許請求の範囲】
1. １．骨髄細胞から悪性細胞を除去するのに使用される組成物であって、該悪性細 胞を含む該骨髄細胞に該組成物を、該悪性細胞による取り込みをなすに十分な時 間接触させる工程、次いで、該悪性細胞に破壊をもたらすに十分な時間および強 度で、該骨髄細胞に光を照射する工程と、を包含する方法において使用され、 ここで、該組成物が活性成分としてＧｐを含有する、組成物。
2. ２．前記Ｇｐが以下の構造式で表される、請求項１に記載の組成物： ▲数式、化学式、表等があります▼または▲数式、化学式、表等があります▼こ こで、各Ｒ１およびＲ２は、独立して、カルバルコキシ（２−６Ｃ）、アルキル （１−６Ｃ）スルホニル、アリル（６−１０Ｃ）スルホニル、アリル（６−１０ Ｃ）、シアノ、および−ＣＯＮＲ５ＣＯ−からなる群から選択され、Ｒ５は、ア リル（６−１０Ｃ）またはアルキル（１−６Ｃ）であり、 各Ｒ３は、独立して、カルボキシアルキル（２−６Ｃ）またはその塩、アミド、 エステルもしくはアシルヒドラゾンであるか、またはアルキル（１−６Ｃ）であ り、そしてＲ４は、ＣＨＣＨ２、ＣＨＯＲ４′、−ＣＨＯ、−ＣＯＯＲ４′、Ｃ Ｈ（ＯＲ４′）ＣＨ３、ＣＨ（ＯＲ４′）ＣＨ２ＯＲ４′、−ＣＨ（ＳＲ４′） ＣＨ３、−ＣＨ（ＮＲ４′２）ＣＨ３、−ＣＨ（ＣＮ）ＣＨ３、−ＣＨ（ＣＯＯ Ｒ４′）ＣＨ３、−ＣＨ（（ＯＯＣＲ４′）ＣＨ３、−ＣＨ（ハロ）ＣＨ３、ま たは−ＣＨ（ハロ）ＣＨ２（ハロ）で、ここで、Ｒ４′はＨであるか、または必 要に応じて親水性置換基で置換されることのあるアルキル（１−６Ｃ）であり、 または Ｒ４は、ビニルを直接または間接に誘導体化して得られる、＜１２Ｃの有機基で あり、または Ｒ４は、本願中に定義されている、式−Ｌ−Ｐの１−３テトラピロール型核を含 む基である。
3. ３．各Ｒ３が、独立して、カルボキシアルキル（２−６Ｃ）、またはその塩、ア ミド、エステルまたはアシルヒドラゾンであり、および／または 各Ｒ１およびＲ２が、独立して、カルバルコキシ（２−６Ｃ）およびアルキル（ １−６Ｃ）からなる群から選択され、および／または Ｒ４が、ＣＨＣＨ２またはＣＨ（ＯＲ４′）ＣＨ３であり、ここで、Ｒ４′はＨ またはアルキル（１−６Ｃ）である、請求項２に記載の組成物。
4. ４．各Ｒ３が、独立して、カルボキシエチル、またはその塩、アミドもしくはエ ステルであり、および／または各Ｒ１およびＲ２が、独立して、メトキシカルボ ニルまたはエトキシカルボニルである、請求項３に記載の組成物。
5. ５．Ｒ４が、ＣＨＣＨ２であり、および／または各Ｒ１およびＲ２が、独立して 、メトキシカルボニルまたはエトキシカルボニルである、請求項４に記載の組成 物。
6. ６．前記Ｇｐが、細胞毒性物質と結合し、または該Ｇｐが、前記悪性細胞に特異 的な標的特異的部分に結合している、請求項１に記載の組成物。
7. ７．骨髄または骨髄細胞の調製物中の悪性細胞の有無を検出するのに使用される 組成物であって、該骨髄または該細胞調製物に該組成物を、悪性細胞による該組 成物の取り込みをなすに十分な時間接触させる工程と、次いで、蛍光を励起する のに有効な波長で、該骨髄に光を照射する工程と、該蛍光の有無を検出する工程 と、を包含する方法において使用され、該組成物が、活性成分としてＧｐを含有 する、組成物。
8. ８．前記Ｇｐが以下の構造式で表される、請求項７に記載の組成物： ▲数式、化学式、表等があります▼または▲数式、化学式、表等があります▼こ こで、各Ｒ１およびＲ２は、独立して、カルバルコキシ（２−６Ｃ）、アルキル （１−６Ｃ）スルホニル、アリル（６−１０Ｃ）スルホニル、アリル（６−１０ Ｃ）、シアノ、および−ＣＯＮＲ５ＣＯ−からなる群から選択され、Ｒ５は、ア リル（６−１０Ｃ）またはアルキル（１−６Ｃ）であり、 各Ｒ３は、独立して、カルボキシアルキル（２−６Ｃ）またはその塩、アミド、 エステルもしくはアシルヒドラゾンであるか、またはアルキル（１−６Ｃ）であ り、そしてＲ４は、ＣＨＣＨ２、ＣＨＯＲ４、−ＣＨＯ、−ＣＯＯＲ４′、ＣＨ （ＯＲ４′）ＣＨ３、ＣＨ（ＯＲ４′）ＣＨ２ＯＲ４′、−ＣＨ（ＳＲ４′）Ｃ Ｈ３、−ＣＨ（ＮＲ４′２）ＣＨ３、−ＣＨ（ＣＮ）ＣＨ３、−ＣＨ（ＣＯＯＲ ４′）ＣＨ３、−ＣＨ（（ＯＯＣＲ４′）ＣＨ３、−ＣＨ（ハロ）ＣＨ３、また は−ＣＨ（ハロ）ＣＨ２（ハロ）で、ここで、Ｒ４′はＨであるかまたは必要に 応じて親水置換基で置換されることのあるアルキル（１−６Ｃ）であり、または Ｒ４は、ビニルを直接または間接に誘導化して得られる、＜１２Ｃの有機基であ り、または Ｒ４は、本願中に定義されている、式−Ｌ−Ｐの１−３テトラピロール型核を含 む基である。
9. ９．各Ｒ３が、独立して、カルボキシアルキル（２−６Ｃ）、またはその塩、ア ミド、エステルまたはアシルヒドラゾンであり、および／または 各Ｒ１およびＲ２が、独立して、カルバルコキシ（２−６Ｃ）およびアルキル（ １−６Ｃ）からなる群から選択され、および／または Ｒ４が、ＣＨＣＨ２またはＣＨ（ＯＲ４′）ＣＨ３であり、ここで、Ｒ４′はＨ またはアルキル（１−６Ｃ）である、請求項７に記載の組成物。
10. １０．各Ｒ３が、独立して、カルボキシエチル、またはその塩、アミドもしくは エステルであり、および／または各Ｒ１およびＲ２が、独立して、メトキシカル ボニルまたはエトキシカルボニルである、請求項７に記載の組成物。
11. １１．Ｒ４が、ＣＨＣＨ２であり、および／または各Ｒ１およびＲ２が、独立し て、メトキシカルボニルまたはエトキシカルボニルである、請求項７に記載の組 成物。
12. １２．前記Ｇｐが、細胞毒性物質と結合し、または該Ｇｐが、前記悪性細胞に特 異的な標的特異的部分に結合している、請求項７に記載の組成物。
13. １３．骨髄細胞、悪性細胞および該悪性細胞に取り込まれるのに有効な量のＧｐ を含む組成物。
14. １４．前記Ｇｐが以下の構造式で表される、請求項１３に記載の組成物： ▲数式、化学式、表等があります▼または▲数式、化学式、表等があります▼こ こで、各Ｒ１およびＲ２は、独立して、カルバルコキシ（２−６Ｃ）、アルキル （１−６Ｃ）スルホニル、アリル（６−１０Ｃ）スルホニル、アリル（６−１０ Ｃ）、シアノ、および−ＣＯＮＲ５ＣＯ−からなる群から選択され、Ｒ５は、ア リル（６−１０Ｃ）またはアルキル（１−６Ｃ）であり、 各Ｒ３は、独立して、カルボキシアルキル（２−６Ｃ）またはその塩、アミド、 エステルもしくはアシルヒドラゾンであるか、またはアルキル（１−６Ｃ）であ り、そしてＲ４は、ＣＨＣＨ２、ＣＨＯＲ４′、−ＣＨＯ、−ＣＯＯＲ４′、Ｃ Ｈ（ＯＲ４′）ＣＨ３、ＣＨ（ＯＲ４′）ＣＨ２ＯＲ４′、−ＣＨ（ＳＲ４′） ＣＨ３、−ＣＨ（ＮＲ４′２）ＣＨ３、−ＣＨ（ＣＮ）ＣＨ３、−ＣＨ（ＣＯＯ Ｒ４′）ＣＨ３、−ＣＨ（（ＯＯＣＲ４′）ＣＨ３、−ＣＨ（ハロ）ＣＨ３、ま たは−ＣＨ（ハロ）ＣＨ２（ハロ）で、ここで、Ｒ４′はＨであるかまたは必要 に応じて親水置換基で置換されることのあるアルキル（１−６Ｃ）であり、また は Ｒ４は、ビニルを直接または間接に誘導体化して得られる、＜１２Ｃの有機基で あり、または Ｒ４は、本願中に定義されている、式−Ｌ−Ｐの１−３テトラピロール型核を含 む基である。
15. １５．各Ｒ３が、独立して、カルボキシアルキル（２−６Ｃ）、またはその塩、 アミド、エステルまたはアシルヒドラゾンであり、および／または 各Ｒ１およびＲ２が、独立して、カルバルコキシ（２−６Ｃ）およびアルキル（ １−６Ｃ）からなる群から選択され、および／または Ｒ４が、ＣＨＣＨ２またはＣＨ（ＯＲ４′）ＣＨ３であり、ここで、Ｒ４′はＨ またはアルキル（１−６Ｃ）である、請求項１３に記載の組成物。
16. １６．各Ｒ３が、独立して、カルボキシエチル、またはその塩、アミドもしくは エステルであり、および／または各Ｒ１およびＲ２が、独立して、メトキシカル ボニルまたはエトキシカルボニルである、請求項１３に記載の組成物。
17. １７．Ｒ４が、ＣＨＣＨ２であり、および／／または各Ｒ１およびＲ２が、独立 して、メトキシカルボニルまたはエトキシカルボニルである、請求項１３に記載 の組成物。
18. １８．前記Ｇｐが、細胞毒性物質と結合し、または該Ｇｐが、前記悪性細胞に特 異的な標的特異的部分に結合している、請求項１３に記載の組成物。