NO179410B - Analogifremgangsmåte for fremstilling av terapeutisk aktive monobenzofyriner og anvendelse av disse - Google Patents

Abstract

En gruppe ned hydro-monobenzoporfyrlner "grønne porfyrlner" (Gp) som har abeorbejonsmakslmum 1 området 670-780 nm er nyttig 1 behandlingen av forstyrrelser eller forhold som er utsatt for hematoporfyrlnderlvat-behandllng (HPD) 1 nærvar av lys, eller 1 behandling av virus, celler og vev generelt for å ødelegge uønskede mål. Anvendelsen av Gp fra oppfinnelsen tillater at bestrålingen benytter bølgelengder som er andre enn de som absorberes av blod. Gp fra oppfinnelsen kan ogå være konjugert til ligander som er spesifikke for reseptor eller til spesifikke lmmunoglobullner eller fragmenter derav til målepeslfIkke vev eller celler for strålebehandling. Anvendelse av disse materialene tillater at laver medlkamentnlvåer blir anvendt, og forhindrer således sldereaksjoner som kan ødelegge normalt vev.

Description

Oppfinnelsen vedrører en analogifremgangsmåte for fremstilling av terapeutisk aktive monobenzofyriner og anvendelse av lysabsorberende forbindelser, for å formidle destruksjon av uønskede celler eller vev eller andre uønskede materialer ved bestråling. Oppfinnelsen vedrører spesielt anvendelse av hydro-monobenzoporfyrinderivater som har absorbsjonsmaksimum i området 670-780 nm for å formidle bestrålingen av materialet som skal bli nedbrutt, og anvendelsen av disse forbindelsene konjugert til målspesifikke ligander, slike reseptorspesifikke ligander eller immunoglobuliner eller deres immunospesifikke fragmenter, for å fokusere effektene av bestråling på spesielle mål.

Anvendelse av hematoporfyrin og dens acetylerte derivatblan-ding hematoporfyrinderivat (HPD) systematisk, kombinert med bestråling for påvising og behandling av ondartede celler har en betydelig historie. HPD er en blanding av porfyriner som innbefatter hematoporfyrin selv, hydroksyetylvinyldeuteropor-fyrin, protoporfyrin og dihematoporfyrinetere. (Se f.eks. "Porphyrin Photosensitization", Kessel, D. , et al., eds.

(1983) Plenum Press.)

HPD synes "naturlig" å ha evnen til lokalisering i ondartede celler. Når den blir bestrålt, har den to egenskaper som gjør den nyttig. For det første, når den blir bestrålt med ultrafiolett eller synlig lys, har den evnen til å fluori-sere, og således er den nyttige i diagnostiske metoder som er knyttet til påvisning av ondartethet (se f.eks. Kessel, et al (supra); Gregory, H.B. Jr., et al., Ann Surg (1968) 167:827-829). Mer betydningsfullt for foreliggende oppfinnelse er kapasiteten til HPD; når den blir bestrålt med synlig lys viser HDD en cytotoksisk effekt på cellene der den er lokalisert (se f.eks. Diamond, I., et al., Lancet (1972) 2:1175-1177; Dougherty, T.J., et al., Cancer Research (1978) 38:2628-2635; Dougherty, T.J., et al., "The Science of Photo Medicine: (1982) J.D. Regan & J.A. Parrish, eds., sidene 625-638; Dougherty, T.J., et al., "Cancer: Priniciples and Practice of Oncology" (1982) V.T. DeVita Jr., et al., eds., sidene 1836-1844). Selv om det ikke definitivt er fastslått, synes effekten av HPD i drepeceller å være forårsaket av dannelse av singlett oksygen ved bestråling (Weishaupt, K.R., et al., Cancer Research (1976) 36:2326-2329). Flere mekanismer for denne effekten er blitt foreslått, og det er nylig blitt vist at den aktive bestanddelen i HPD som formidler den cytotoksiske effekten av synlig lysbestråling er blandingen av hematoporfyrinetere (DHE) (Dougherty, T.J., et al., "Porphyrin Localization and Treatment of Tumors"

(1984) sidene 301-314; Dougherty, T.J., CRC Critical Eeviews in Oncology/Hematology (1984) 2:83-116).

En renset form av den aktive bestanddel (ene) av HPD blir oppnådd ved justering av pH slik at det forårsaker oppsamling og utvinning av aggregatet som beskrevet i U.S. patent 4,649,151. Den rensede formen som kalles DHE i patentet blir forhandlet under varemerket Photofrin II og har blitt anvendt på en måte som er fullstendig analog til HPD.

I tillegg til in vivo-terapeutiske metoder og diagnostiske protokoller for tumorer som beskrevet i det ovenfor siterte patentet, kan porfyriner innbefattet HPD og dens mer rensede derivater bli anvendt i andre in vivo- og in vitro-anvendel-ser. F.eks. er lyssensibilisatorer nyttige i påvisning og behandling av aterosklerotiske plak som beskrevet i U.S. patent nr. 4,512,762 og 4,577,636. U.S. patent nr. 4,500,507 og 4,485,806 beskriver anvendelse av radiomerkede porfyrinforbindelser, innbefattet HPD til tumoravbilding. U.S. patent nr. 4,753,958 til University of California beskriver bruken av topisk anvendelse av porfyrinsensibilisatorer til diagnose og behandling av hudsykdommer. U.S. patent nr. 4,748,120 beskriver anvendelse av lyssensibilisatorer i behandling av fullblod eller blodkomponenter. Fotokjemisk dekontaminasjonsbehandling av blod og komponenter er også beskrevet i U.S. patent nr, 4,727,027 der lyssensibilisator-ene er furukumarin og dens derivater. I tillegg, blir virus inaktivert i terapeutiskk proteinsammensetninger in vitro som beskrevet i U.S. patent nr. 4,268,947.

Selv om behandling av tumorer og andre uønskede mål med HPD hygger på den indre evnen til HPD å lokalisere i ondartede celler, har en betydlig forbedring og forfining i spesifisiteten blitt oppnådd ved konjugering av hematoporfyrin til tumorspesifikke antistoffer. F.eks. når hematoporfyrin ble koblet til monoklonale antistoffer rettet mot en murin myosarcomacellelinje Ml, resulterte administrering av anti-Ml hematoporfyrin-konjugater mot tumorbærende dyr etterfulgt av eksponering til klartskinnende lys, i undertrykking av Ml-vekst (Mew, D., et al., J. Immunol. (1983) 130:1473-1477). I ytterligere arbeid ble hematoporfyrin konjugert til et monoklonalt antistoff som var spesifikt mot et antigen assosiert med en human leukemi (CAMAL) og konjugatene viste seg å formidle strålingsindusert dreping av de leukemiske cellene spesifikt, in vitro (Mew, D., et al., Cancer Research

(1985) 45:4380-4386). Konjugering av den beslektede forbindelsen klorin e^ til anti-T-celle Mab har også blitt rapportert (Oseroff, A.R., et al. (Proe. Nati. Acad. Sei. USA

(1986) 83:8744-8748).

Selv om konjugasjonen av hematoporfyrin til immunoglobuliner som er spesifikke for målceller bedrer evnen til hematoporfyrin å finne fram til de ønskede cellene eller vevet, løser dette fremdeles ikke et annet problem som er avhengig av denne generelle terapeutiske tilnærmelsen, nemlig at bølgelengden for stråling som er nødvendig for å aktivere hematoporfyrin eller HPD, som er i området 630 nm, også er en energi som raskt absorberes av porfyriner og andre naturlige kromoforer i blodet og annet vev. Derfor må relativt store mengder hematoporfyrin eller HPD bli administrert og det resulterer ofte i overfølsomhet hos pasienten for lys generelt. Det vil være ønskelig å administrere forbindelser for å formidle effektene av bestråling i en lavere mengde, og således unngå problemene med hypersensitivitet som utvises uspesifikt i den aktuelle organismen. Aktiviteten til visse av de forbindelsene er beskrevet i en artikkel av Richter, A.M., et al., i J. Nati. Cancer Inst. (1987) 79:1327-1332, sendt til utgiverne 19. januar 1988.

Oppfinnelsen angår en analogifremgangsmåte for fremstilling av terapeutisk aktiv monobenzoporfyrin (Gp) med formel

der hver R<1> og R^ uavhengig av hverandre er karbalkoksy (2-6C); en av gruppene R<3> er -CH2CH2COOH eller et salt derav og den andre gruppen R<3> er -CH2CH2COOR der R er alkyl (1-6C) og R<4 >er vinyl, eventuelt konjugert med et antistoff lg der lg er oppnådd fra et preparat av monoklonale antistoffer eller en ligand, kjennetegnet ved at fremgangsmåten omfatter delvis hydrolysering av en hydromonobenzoporfyrindiester med formel:

der R<1>, R^ og R<4> er som definert foran og begge gruppene R<3>' er -CH2CH2COOR der R er alkyl (1-6C).

Oppfinnelsen angår videre anvendelse av forbindelsene og/eller konjugatene til en in vitro metode for å påvise, lyssensitere, ødelegge eller svekke fungering av målbiologisk materiale.

Oppfinnelsen frembringer lysabsorberende forbindelser som evnen til å vise lys-formidlet cytotoksiske og diagnotiske effekter. I tillegg til deres in vitro-anvendelse kan disse forbindelsene bli administrert in vivo i relativt lave doser p.g.a. deres evne til å absorbere stråling som har energiom-råde på utsiden av det som normalt absorberes av komponentene som er tilstede i høye konsentrasjoner i blodet og annet vev, særlig porfyrinrester som normalt er assosiert med hemoglobin og myoglobin. Derfor, ved å fremskaffe disse modifiserte porfyrinene til in vitro-behandling ved lavere konsentrasjoner, blir hypersensitivitet til ikke-målrettet vev redusert, og strålebehandlingen kan bli utført ved en bølgelengde som de naturlige kromoforene ikke konkurrerer om fotonene med de aktive forbindelsene, og dette resulter i større inntrengingsdybde for lyset. Lignende fordeler tilfaller in vitro-behandlig av fargede materialer, slik som blodprøver.

Disse lysaktive forbindelsene er modifiserte porfyriner som i kraft av deres derivatisering undergår et skifte i absorbsjonsmaksimum slik at de synes grønne heller enn rød, og det indikerer deres absorbsjon av bølgelengde i det rødorange området. Denne samling av derivater har derfor fått kallenavnet "grønne porfyriner" (Gp) og har vist å gi sensitivitet på målceller ved konsentrasjoner som er mer enn 10 ganger lavere enn de som er nødvendig for hematoporfyrin (Hp) eller HPD.

Gp blir utvalgt fra en gruppe av porfyrinderivater oppnådd ved å anvende Diels-Alder reaksjoner av acetylenderivater med profoporfyrin under forhold som påvirker en reaksjon ved bare en av de to tilgjengelig konjugerte, ikke-aromatiske dienstrukturer som er tilstede i protoporfyrin-IX ringsys-temet (ring A og B). Formelene vist i fig. 1 representerer grønne porfyriner. Av hensiktsmessige grunner blir også en forkortelse for begrepet hydro-monobenzoporfyrinderivat--"BPD"-- generelt anvendt for å referere til forbindelser med formelene 3 og 4 i fig. 1, ved at disse er foretrukne former av Gp.

Videre, kan de dimeriske formene av Gp bli frembragt, og således forsterke evnen til Gp-forbindelsen å absorbere lys på en per mol basis. Dimeriske og multimeriske former av Gp/porfyrinkombinasjoner kan også bli benyttet, og dette frembringer ytterligere absorbsjonsbølgelengder.

I tillegg, kan de modifiserte porfyrinene (referert til som "grønne porfyriner" eller "Gp") fra oppfinnelsen bli konjugert til spesifikke ligander som er reaktive med et mål, slik som reseptorspesifikke ligander eller immunoglobuliner eller immunospesifikke deler av immunoglobuliner, og det tillater at de blir mer konsentrerte i ønsket målvev eller substanser. Denne konjugasjonen tillater ytterligere senking av det nødvendige dosenivå siden materialet ikke blir sløst bort i fordeling i annet vev hvis ødeleggelse, som er meget uønsket, må bli unngått.

Et trekk ved oppfinnelsen vedrører således fremgangsmåter for lokalisering eller utføring av cytotoksisitet, dvs. lysfølsomhet med hensyn på målmaterialer ved å anvende hydro-monobenzoporfyriner fra oppfinnelsen enten alene eller som konjugater. Hydro-monobenzoporfyrinene er grønne porfyriner (Gp) som vist i fig. 1 og er lokalisert spesifikt in vivo til visse målvev, der deres tilstedeværelse kan bli påvist ved fluorescens eller ved andre anordninger når Gp er frembragt med ytterligere eller alternativ merking. Som angitt over, kan spesifisiteten til Gp bli ytterligere økt ved konjugering til ligander som er spesifikke for målet. I tillegg, når Gp blir bestrålt in situ ved å anvende lys i området 670-780 nm, resulterer lysaktiveringen i cytotoksisitet til det omgivende vevet. Celler som Gp normalt er tiltrukket til innbefatter tumorceller og neoplastiske celler generelt, såvelt som bakterier og annet sykelig vev. Figur 1 viser strukturen til grønne porfyrinforbindelser (Gp) som ble anvendt i fremgangsmåtene og konjugatene i oppfinnelsen . Figur 2 viser strukturen av to foretrukne former av hydro-monobenzoporfyrinderivat med formlene 3 og 4 (BPD). Figur 4 viser resultatene av hudfølsomhetsanalyse ved å anvende en BPD-forbindelse.

Alle forbindelsene som blir fremstilt ifølge oppfinnelsen benytter som lysabsorberende forbindelse et derivat av protoporfyrinringsystemet som har et lysabsorbsjonsmaksimum i området 670-780 nm.

Generelt blir dette skiftet oppnådd ved å effektivt mette en av de to rr-bindingene i en, men ikke to, av de fire pyrrol-ringene som utgjør det typiske porfyrinsystemet. I protoporfyrin-IX er to av pyrrolene som inneholder vinylsubstitu-sjoner slik at den eksocykliske n-bindingen er konjugert til en av de to n-bindingene i ringen. En Diels-Alder-reaksjon innbefatter en av disse konjugatsystemene med en acetylende-rivatdienofil og resulterer i en sammensmeltet cykloheksadien - referert til heretter som "hydrobenzo" - sammensmeltet til A-eller B-ringen. Rearrangement av n-systemet i heksadien-ringen resulterer i forbindelsene med formel 3 og 4. Disse forbindelsene frembringer det ønskede skifte i absorbsjonsmaksimum.

Spesifikk fremstilling av noen forbindelser som er nyttige i oppfinnelsen eller deres forløper er beskrevet av Morgan, A.R., et al., J. Chem. Soc. Chem. Commun. (1984) sidene 1047-1048; og av Pangka, B.S., et al., J. Organic Chem. (1986) 51:1094. Som beskrevet i disse publikasjonene er det tidligere blitt rapportert at protoporfyrin-IX dimetylester, når den blir reagert med sterk Diels-Alder-dienofilreagenser slik som tetracyanoetylen, blir derivatisert til hydro-dibenzoderivater. Som man kan se fra disse referansene, er det imidlertid klart at når acetylen blir derivatisert med mer svake elektrontiltrekkende grupper og anvent som et Diels-Alder-reagens, blir hydro-monobenzoderivater dannet.

De beskrevne substituentene i Morgan- og Pangka-referansene for acetylen-avledede dienofil innbefatter fenylsulfonyl-dvs. SOgPh, enten som en enkel substituent som beskrevet i de foregående referansene (p-fenylsulfonylpropiat) eller, formodentlig, der begge R<1> og R^ er sulfonylderivater. Generelt er R<*> og R^ hver uavhengig av hverandre moderate elektrontiltrekkende substituenter, og er mest vanlig karbalkoksy eller alkyl eller arylsulfonyl, eller en hvilken som helst annen aktiverende substituent som ikke er tilstrekkelig elektron-tiltrekkende til at det resulterer i reaksjon med både A og B-ringene, enn en reaksjon bare med en, slik som cyano eller -CONR^CO- der R^ er aryl eller alkyl. En av R<*> og R^ kan valgfritt være B mens den andre er en elektron-tiltrekkende substituent med tilstrekkelig styrke til å forenkle Diels-Alder-reaksjonen.

Karboksy er, når det blir brukt her, definert på konvensjonell måte, -C00H og karbalkoksy er -C00R, der R er alkyl; karboksyalkyl refererer til substituenten -R'-C00H der R' er alkylen; karbalkoksyalkyl refererer til -R'-C00R der R' og R er hhv. alkylen og alkyl. Alkyl er en mettet rett eller forgrenet kjedehydrokarbyl med 1-6 karbonatomer slik som metyl, n-heksyl, 2-metylfenyl, t-butyl, n-propyl, osv. Alkylen er en alkyl med unntagelse av at gruppen er toverdig. Aryl eller alkylsulfonyldelene har formelen SO2R der R er alkyl som ovenfor definert, eller er aryl, der aryl er fenyl valgfritt substituert med 1-3 substituenter uavhengig av hverandre valgt blant halogener (fluor, klor, brom eller jod), laverealkyl (1-4C) eller laverealkoksy (1-4C). I tillegg, kan en eller begge R<1> og R<2> selv være aryl - dvs. fenyl valgfritt substituert som definert over.

R<3> i protoporfyrin-IX er 2-karboksyetyl (-CH2CH2C00H). R<3>'s natur (dersom den ikke inneholder en n-binding konjugert til ring n-bindingen) er ordinært ikke relevant for utviklingen av Diels-Alder-reaksjonen eller til effektiviteten og absorbsjonsspektrumet til det resulterende produktet. R<3> kan således f.eks. være laverealkyl (1-4C), eller o-karboksyalkyl (2-6C) eller estere eller amider av disse. R<3->substituenten kan også være substituert med halogen som definert over, eller med andre ikke-reaktive substituenter. Som hensiktsmessige utgangsmaterialer for Gp-forbindelsene i oppfinnelsen er imidlertid de naturlig forekommende porfyriner og substituenter for R<3> er CH2CH2C00H eller CH2CHR2-COOR, der R er alkyl (1-6C).

Det må bemerkes at, selv om R<3->substituentens natur ikke ordinært påvirker forløpet av Diels-Alder-reaksjonen ved å endre naturen til diensubstratet, kan derivatisering være nødvendig for å fremme reaksjonen ved å fremskaffe hensiktsmessig oppløslighetskaraktertrekk eller å forhindre forstyrrelse med reaksjonen. Således utnytter Diels-Alder-reaksjonene beskrevet av Morgan et al. og ved Pangka et al. dimetylesteren til protoporfyrin-IX som et substrat for å hindre forstyrrelse med reaksjonen ved den frie karbok-sylgruppen og for å frembringe hensiktsmessige oppløslighets-karaktertrekk.

I BPD-forbindelsene i oppfinnelsen har det blitt funnet fordelaktig å hydrolysere eller delvis hydrolysere den forestrede karboksygruppen i -CH2CH2COOR. Hydrolysen forekommer ved mye høyere hastighet enn den til estergruppene i R<1>, R<2>, og oppløslighetskaraktertrekkene til de resulterende forbindelsene er mer ønskelig enn de i uhydrolysert form. Hydrolyse resulterer i dlazid- eller monoazid-produkter (eller deres salter).

Hydro-monobenzoporfyriner som direkte resulterer fra Diels-Alder-reaksjonen beskrevet i de siterte referansene, kan også bli isomerisert som beskrevet der (se Morgan et al. og Pangka et al. (over)) til forbindelser med formelene vist som 3 og 4 i figur 1 ved behandling med passende reagenser slik som trietylamin (TEA) i metylenklorid eller 1,5-diazabicyklo-[5,4,0]undek-5-ene (DBU). Stereokjemien til produktet blir bestemt ved valg av reagensmiddel.

Skissene av forbindelsene 3 og 4 i figur 1 viser ikke den relative posisjonen til den eksocykliske metylgruppen (ring A i formel 3 og ring B i formel 4). Det har blitt funnet at rearrangement ved å anvende TEA gir cis-geometri for den vinklede metylgruppen og R<2>, mens behandling med DBU resulterer i trans-produktet. Dette cis-produktet ér tydelig kinetisk regulert, siden behandling av cis-produktet med DBU resulterer i et ytterligere rearrangement til transstereo-kjemi. Således viser formelene 3 og 4 i figur 1 de rearrangerte produktene generisk, fra enten TEA- eller DBU-kataly-serte rearrangement i hhv. ring A og B.

Forbindelsene med formelene 3 og 4 (BPD), og særlig de som har hydrolyserte eller særlig hydrolyserte karbalkoksygrupper i R<3> er mest foretrukket. Forbindelser i oppfinnelsen som inneholder -COOH kan bli fremstilt som den frie syre eller i form av salter med organiske eller uorganiske baser.

Det må bemerkes at forbindelsene i figur 1 inneholder minst et kiralt senter og derfor eksisterer som optiske isomere. Separasjon av blandinger med diastereomere kan bli gjennom-ført på en hvilken som helst konvensjonell måte; blandinger av enantiomere kan bli separert ved vanlige teknikker ved å reagere den med optisk aktive fremstillinger og separere de resulterende diastereomerene.

Det må videre bemerkes at reaksjonsproduktene kan være useparerte blandinger av A- og B-ringtilsetningen, f.eks. blandinger av formlene 3 og 4. En hver av de separerte formene - dvs. formlene 3 alene eller 4 alene, eller blandinger av et hvilket som helst forhold kan bli benyttet i fremgangsmåten.

Navnet "dihydro"-monobenzoporfyrin beskriver de direkte og rearrangementsproduktene fra Diels-Alder-reaksjonen av porfyrinringsystemet med R<1>C=C-R<2>. Hydro-monobenzoporfyrin blir anvendt generisk for å innbefatte alle tre klassene med oksyderingstilstand. Monobenzoporfyriner i seg selv er utenfor rekkevidden av oppfinnelsen ved at deres absorbsjonsmaksimum ikke faller innenfor det aktuelle området.

Figur 2 viser to særlig foretrukne forbindelser av oppfinnelsen som ikke har blitt tidligere beskrevet innenfor fagområdet. Disse forbindelsene er kollektivt betegnet benzoporfyrinderivat (BPD) ved at de er former av Gp som har formelene 3 eller 4. Disse er hydrolyserte eller delvis hydrolyserte former av de rearrangerte produktene med formelene 3 og 4, der en eller begge av de beskyttede karboksylgrupper til R<3> er hydrolysert. Estergruppen ved R<1 >og R<2> hydrolyserer relativt så langsomt at vanndanning til formene, vist i figur 2, er enkelt å gjennomføre.

I denne beskrivelsen er R<3> lik -CH2CH2COOR<3>'. I BPD-MA og BPD-MB er R<1> og R<2> karbalkoksy, en R<3>, er E og den andre R<3>, er alkyl (1-6C). Forbindelsene med formlene BPD-MA og BPD-MB kan være homogene der bare C-ringens karbaloksyetyl eller bare D-ringens karbaloksyetyl er hydrolysert, eller blandinger av C- og D-ringsubstituenthydrolysatene. I tillegg kan blandinger av et hvilket som helst av to eller flere BPD-MA, eller -MB, bli benyttet i fremgangsmåten i oppfinnelsen.

Som brukt her representerer "tetrapyrrol-typekjernen" et fireringsystem med skjelettet:

og et salt, ester, amid eller acylhydrazon derav, som er konjugert. Den Innbefatter porfyrlnsystemet, som er egentlig et fullstendig konjugert system, klorlnsystemet, som er egentlig en dlhydroform av porfyrin, og det reduserte klorlnsystemet som er en tetrahydroform av det fullstendig konjugerte systemet. Når "porfyrin" er spesifisert, indikerer det det fullstendig konjugerte systemet; Gp er egentlig en dlhydroform av porfyrlnsystemet.

En gruppe forbindelser fra oppfinnelsen er de der substituenten R<4> innbefatter minst en ytterligere tetrapyrrol-type-kjerne. De resulterende forbindelsene er dimere eller oligomere, der minst en av tetrapyrrol-typeringsystemene er Gp. Bindinger mellom Gp-delen gjennom posisjonen til R<4> til en ytterligere tetrapyrrol-typeringsystem kan være gjennom en eter, amin eller vinylbinding. Ytterligere derivatisering i tilfelle med porfyrinringsystemene som har to tilgjengelige substituentposisjoner (i både A- og B-ringer) som korrespon-derer til R<4> kan også bli dannet, som ytterligere beskrevet under.

Målspesifikke komponenter

Den målspesifikke komponenten kan f.eks. være et immunoglobu-lin eller en del av dette, eller en ligand som er spesifikk for reseptor.

Immunoglobulinkomponenten kan være en hvilken som helst av en lang rekke materialer. Den kan bli avledet fra polyklonale eller monoklonale antistoffremstillinger og kan inneholde hele antistoffer eller immunologisk reaktive fragmenter av disse antistoffene, slik som F(ab')2» Fab, eller Fab'-fragmenter. Anvendelse av slike immunologisk reaktive fragmenter som erstatter hele antistoffer er kjent innenfor fagområdet. Se f.eks. Spiegelberg, H.L., i "Immunoassays in the Clinical Laboratory" (1978) 3:1-23.

Polyklonalt anti-sera blir fremstilt på konvensjonelle måter ved å injisere et hensiktsmessig pattedyr med antigen som antistoffet er ønsket, analysere antistoffnivået i blodet mot antigenet, og fremstille antisera når ti terene er høye. Monoklonale antistoffpreparater kan også bli fremstilt konvensjonelt slik som ved fremgangsmåten til Koehler og Milstein ved å anvende perifere blodlymfocyter eller miltceller fra immuniserte dyr og ta livet av disse cellene enten ved viral infeksjon, ved sammensmelting med myelomer, eller ved andre konvensjonelle fremgangsmåter og screene fremstillingen av de ønskede antistoffene ved isolerte kolonier. Dannelse av fragmentene fra enten monoklonale eller polyklonale fremstillinger blir utført ved konvensjonelle anordninger som beskrevet av Spiegelberg, H.L. , ovenfor.

Særlig nyttige antistoffer eksemplifisert her innbefatter monoklonal antistoffremstilling CAMAL-1 som kan bli fremstilt som beskrevet av Malcolm, A., et al., Ex Hematol. (1984) 12:539-547; polyklonale eller monoklonale fremstillinger av anti-Ml antistoff som beskrevet av Mew, D. , et al., J.Immunol. (1983) 130:1473-1477 (over) og B16G antistoff som blir fremstilt som beskrevet av Maier, T., et al., J. Immunol. (1983) 131:1843; Steele, J.K., et al., Cell Immunol.

(1984) 90:303.

Den foregående listen er som eksempler og ikke begrensende; med en gang målvevet er kjent, kan antistoffet som er spesifikt for dette vevet bli fremstilt ved konvensjonelle anordninger. Derfor kan oppfinnelsen anvendes for å gjennomføre toksisitet mot et hvilket som helst ønsket mål.

Liganden som er spesifikk for reseptor Re" refererer til en del som binder en reseptor på celleoverflatene, og således inneholder konturer og ladningsmønstere som er komplementære til de på reseptoren. Liganden som er spesifik for reseptoren er symbolisert i formelene til forbindelsene i oppfinnelsen som Re<**>, der <*> indikerer at delen bundet i forbindelsen i oppfinnelsen ikke er reseptoren selv, men en substans som er komplementær til den. Det er fastslått at en lang rekke celletyper har spesifike reseptorer som er utformet til å binde hormoner, vekstfaktorer eller neurotransmittere. Selv om disse utformingene av ligandene som er spesifikke for reseptorene er kjent og forstått, refererer uttrykket "ligandspesifik for reseptor" brukt her, til en hvilken som helst substans, naturlig eller syntetisk, som binder spesifikt til en reseptor.

Eksempler på slike ligander innbefatter steroidhormoner, slik som progesteron, estrogener, androgener, og adrenale kortikale hormoner; vekstfaktorer slik som epiclermisk vekstfaktor, nervevekstfaktor, fibroblastvekstfaktor osv.; andre proteinhormoner slik som humant veksthormon, paraty-roidhormon osv.; og neurotransmittere slik som acetylcholin, serotonin og dopamin. En hver analog til disse substansene som lykkes i å binde til reseptoren er også innbefattet.

Binding

Konjugering av den mål-celle-spesifikke komponenten til hydro-monobenzoporfyrin kan bli gjennomført ved en hvilken som helst hensiktsmessig anordning. For proteiner slik som lg og visse Re<*1> kan en direkte kovalent binding mellom disse delene bli utført, f.eks. ved å anvende et dehydratiserende middel slik som karbodiimid og i dette tilfelle representerer L en kovalent binding. En særlig foretrukket fremgangsmåte for kovalent binding av hydro-monobenzoporfyriner til immunoglobulindelen er behandling med l-etyl-3-(3-dimetyl-aminopropyl)karbodiimid (EDCI) i nærvær av et reaksjonsmedium som består i hovedsak av dimetylsulfoksid (DMSO). En fremstilling som anvender denne foretrukne fremgangsmåten er illustrert i eksempel 3 under.

Andre dehydratiserende midler slik som dicykloheksylkar-bodiimid eller dietylkarbodiimid kan naturligvis også bli anvendt såvel som konvensjonelle vandige og delvis vandige medier.

Ikke-proteinreseptorligander kan bli konjugert til Gp ifølge deres relevante funksjonelle grupper ved hjelp av kjent teknikk innenfor fagområdet.

De aktive delene i konjugatet kan også bli konjugert gjennom linkerforbindelser som er bifunksjonelle, og har evnen til kovalent å binde hver av de to aktive komponentene. En lang rekke av disse linkerne er kommersielt tilgjengelig, og en typisk liste vil inkludere de som er funnet, f.eks. i katalogen til Pierce Chemical Co. Disse linkerne er enten homo- eller heterbifunksjonelie deler og innbefatter funksjonaliteter som har evnen til å danne disulfider, amider, hydrazoner og en lang rekke andre bindinger.

Andre linkere innbefatter polymerer slik som polyaminer, polyetere, polyaminalkoholer, derivatisert til komponenter ved hjelp av ketoner, syrer, aldehyder, isocyanater eller en lang rekke andre grupper.

Teknikkene som blir benyttet i konjugering av de aktive delene i konjugatet innbefatter enhver standardmetode og fremgangsmåte for konjugering og er ikke en del av oppfinnelsen .

Administrering og anvendelse

De forbedrede lysfølsomme forbindelsene i oppfinnelsen er nyttig generelt, på måten som er kjent innenfor fagområdet til hematoporfyrinderivat og for DHE. Disse materialene er nyttige for å sensitere neoplastiske celler eller annet abnormalt vev for nedbrytning ved bestråling ved å anvende synlig lys - ved lysaktivering har forbindelsene ingen direkte effekt, og de er heller ikke inne i enhver biologisk hendelse; imidlertid er energien fra lysaktiveringen antatt å bli overført til endogent oksygen for å omdanne den til singlettoksygen. Dette singlettoksygenet er antatt å være ansvarlig for den cytotoksiske effekten. I tillegg kan de lysaktiverte formene av porfyrinfluorescens som fluorescerer hjelpe til i lokalisering av tumoren.

Typiske indikasjoner som er kjent innenfor teknikken innbefatter destruksjon av tumorvev i faste tumorer, oppløsning av plaque i blodvæsker (se f.eks. U.S. patent 4,512,762); behandling av topiske forhold slik som akne, føtter hos idrettsmenn, vorter, papilloma og psoriasis og behandling av biologiske produkter (slik som blod til transfusjon) for infeksjonsmidler, siden tilstedeværelse av en membran i slike midler fremmer akkumulering av medikamentet.

Forbindelsene som er fremstilt i fremgangsmåten i oppfinnelsen kan bli anvendt i behandling av materialer in vitro for å ødelegge skadelig virus eller infeksjonsmidler. F.eks. kan blodplasma eller blod som skal bli behandlet i transifusjon eller lagret i bank for fremtidig transfusjon bli behandlet med forbindelser i oppfinnelsen og bestrålt til effektiv sterilisering. I tillegg kan biologiske produkter slik som faktor VIII, som blir fremstilt fra biologiske væsker, bli bestrålt i nærvær av forbindelsene fra oppfinnelsen for å ødelegge kontaminanter.

Eksempel 1

In vltro- evaluerlng av BPD- MA og - MB

De to forbindelsene vist i figur 2, der R<1> og R<2> er karbometoksy, ble testet in vitro på følgende måte: Målcellen ble vasket tre ganger i serumfritt medium (DME), talt og behandlet til en konsentrasjon på IO<7> celler pr. ml.

Til "affinitets"-analysen i mørke, ble 100 pl med målcelle-suspensjon og 100 jjI av testen eller kontrollforbindelsen blandet. "Merking" fikk anledning til å fortsette i 1 time ved 4'C, og de merkede cellene ble vasket i mørke tre ganger med 3 ml medium hver gang og suspendert på nytt i friskt medium. De resuspenderte cellene ble deretter utsatt for lyseksponering ved 300-750 nm i 30 minutter.

I en "direkte"-analyse ble målcellene bestrålt umiddelbart etter tilsetning av testen eller kontrollforbindelsen. Effekten av bestråling ble bestemt ved å anvende metoder som er hensiktsmessige for målcellene.

Når humane erytrocytter (RBCs) ble anvendt som målceller, var hemolysen forårsaket av bestråling på kontrollen (hematoporfyrin, Hp) merket og grønn porfyrin (Gp) merkede celler ble bestemt visuelt. Gp som ble anvendt i dette eksemplet var BPD-Db fra figur 2 der R<1> og R<2> er karboetoksy. Gjentatte tester viste at dette grønne porfyrinet var 20-30 ganger mer aktiv enn Hp i denne analysen. Således var en konsentrasjon på 250 ng/ml Hp nødvendig under forholdene over for å oppnå 50% hemolyse, mens bare 10 ng/ml med grønn porfyrin var nødvendig for å hemolysere 50% av RBCs.

Når den murine mastocytoma-cellelinje P815 ble anvendt ble resultatene bestemt som følger: Cellene ble merket som over, ved å anvende konsentrasjoner på 10-50 ng/ml Hp som kontroll og BPD-DB som testsubstansen. De resuspenderte cellene ble behandlet med 300-750 nm lys i 30 minutter og den resulterende levedyktigheten ble bestemt ved direkte telling ved å anvende eosin-Y eksklusjon, en standardprosedyre for å differensiere mellom levende og døde celler.

I andre bestemmelser som ble gjennomført som over, ble cellene som var utvunnet fra lyseksponering analysert for levedyktighet ved å inkubere dem i 18 timer i 10 >iCi/ml tritium-merket tymidin ifølge standardprosedyre der inkor-porert tymidin er ekvivalent med levedyktighet. Cellene ble høstet og radioaktivitetopptaket ble målt med en scintilla-sjonsteller.

50# P815 celler ble drept ved 580 ng/ml Hp, men bare 32 ng/ml grønn porfyrin (BPD-DB).

Resultatene fra hver bestemmelse på en lang rekke celler er vist i tabell 1 (LD50 i konsentrasjon av forbindelsen som er nødvendig for å drepe 50$ av cellepopulasjonen).

Begge forbindelsene var lyssensitive.

Eksempel 2

Blodlstrlbus. lon og nedbryting

Blodistribusjonsstudier er blitt utført ved å anvende tritiert BPD-MA og BPD-MB. Tabell 5 viser forholdene melom <3>E-BPD-MA konsentrasjonen i tumor og normalt vev bestemt i forskjellige tider etter injeksjon i mus som bærer P815 tumor som gjennomsnitt for 3 mus.

Tumorhudforhold er mest gunstig 3 timer etter IV-administrering av medikamentet.

For å bestemme bionedbrytbarheten ble tritierte BPD-MA injisert IV inn i P815 tumorbærende mus. Musene ble avlivet enten 3 eller 24 timer etter injeksjonen, og tumorer, lever og nyrer ble fjernet. BPD-MA i disse vevene ble ekstrahert og lysaktiviteten ble vurdert i P815 målceller som beskrevet over i eksempel 1 under standard in vitro-forhold. Selv om 100$ PBD-MA i tumor var aktiv i 3 timer, var bare 39$ aktiv ved 24 timer; både lever og nyrer degraderte PBD raskere enn det tumorvevet gjorde. Administrering av tritiert PBD-MB i samme system ga tilsvarende resultater.

Tilsvarende studier ved å anvende BPD-MA konjugert til en anti-keratin Mab i modellmurinsystemet som bærer KLN squamus tumorcellelinje viste forbedret konsentrasjon av medikamentet i målvevet.

Eksempel 3

In vlvo- lvssensitering av BPD

Studier av potensiell lyssensibilisatorer ble utført ved å anvende M-l rabdomykocerkomasystem i DBA/J2 mus. Sammenset-ningen som ble undersøkt ble fortynnet til en konsentrasjon på 800 pg/ml i PBS fra en lageroppløsning i DMSO ved 8 mg/ml (unntatt Photofrin II, som ble fortynnet direkte fra den kliniske medisinflasken). Dyrene (8 pr. gruppe) mottok 0,1 ml (80 pg) materiale IV 24 timer før eksponering til lys frembragt av en 150W wolframpære, rødt filter (transmissjons-lys >600 nm), varmt speil (reflekterer lys >720 nm) og 2 fiberoptikk ved 567 Jo/cm2 .

Resultatene som er vist i tabell 6 indikerer at alle BPD-forbindelsene som ble undersøkt ga positive resultater. De yppelige resultatene vist av Photofrin II sammensetningene kan forklares ved observasjonene at begynnende tumorstørrel-ser var mindre (et resultat av endring).

Tilsvarende studier, med unntagelse for å anvende en lysdose på 378 To/cm<5> resulterte i det som er vist i tabell 7,.

De foregående resultatene er foreløpige og analyseprotokol-lene har ennå ikke blitt optimalisert.

Eksempel 4

Endring i in vivo- analvse

Mus som bærer små tumorer ble injisert IV med medikament som skulle bli undersøkt. 3 timer senere ble dyrene tatt livet av og tumorene fjernet. Tumorcellene ble tatt fra hverandre for å danne en enkel cellesuspensjon, og cellene ble plettert ved 10<5>/brønn og eksponert til lys ved en foreskrevet dose. Platene ble inkubert over natten og analysert for levedyktighet ved MTT-analyse.

Resultatene fra en studie er vist i tabell 8.

Således var BPD-formene som ble undersøkt aktive i denne analysen; det synes at lysintensiteten og medikamentnivåene er utsatt for optimalisering og korrelasjon.

Eksempel 5

Sammenligning av BPD til Photofrin II- sammensetninger Mus som hærer P815 tumorer hie barbert og injisert med ekvivalente mengder lyssensibilisator, og eksponert til 72 Jo/cm<2> (80 mw/cm<2->15 min.-fullt spektrum) i forskjellige tidsintervaller. Eudbiopsier ble tatt 24 og 48 timer etter lysbestråling og visuelle evalueringer ble laget blindt. Resultatene av disse evalueringene er vist i fig. 4. BPD-MA og i mindre grad, BPD-MB hadde en hovedlyssensiteringsak-tivitet under disse forhold; dette var bare tilstede når lysbehandlingen ble gitt 3 timer etter medikamentadministre-ring, og det var i overensstemmelse med bionedbrytbarheten til disse forbindelsene.

Eksempel 6

Fremstilling av BPD- dimer- vinvlbundet

Til en omrørende oppløsning med BPD-DB (der R<1>=R<2=>karbomet-oksy og som er forestret slik at begge R<3> er karbometok-syetyl) (35 mg, 48 pmol) i 5 ml diklormetan avkjølt til tørris/acetontemperatur ble det tilsatt trifluormetansulfon-syre (34 pl, 380 pmol). En olje ble separert ut ved tilsetning av syre. Reaksjonen ble bragt opp til 0°C. Deretter ble 5 ml 5$ natriumbikarbonat tilsatt til reaksjonen for å nøytralisere syre. Produktet ble distribuert i det organiske laget som ble vasket 3 ganger med vann. Oppløs-ningsmidlet ble fjernet og produktet ble tørket azeotropt med acetonitril.

Preparativ tynnsjiktkromatografi på silisiumoksidgel eluert med 10$ etylacetat/diklormetan ga en enkelt fraksjon (28 mg, 80$ utbytte). Opprinnelig ion i massespektrum var 1 464. Det komplekse proton NMR på grunn av antall isomeriske forbindelser hadde det karakteristiske enkle vinylhydrogenet assosiert med en C-binding ved ca. 9,1 ppm.

Claims (7)

1. Analogifremgangsmåte for fremstilling av terapeutisk aktiv monobenzoporfyrin (Gp) med formel der hver R<1> og R<2> uavhengig av hverandre er karbalkoksy (2-6C); en av gruppene R<3> er -CH2CH2COOH eller et salt derav og den andre gruppen R<3> er -CH2CH2C00R der R er alkyl (1-6C) og R<4 >er vinyl, eventuelt konjugert med et antistoff lg der lg er oppnådd fra et preparat av monoklonale antistoffer eller en 1igand, karakterisert ved at fremgangsmåten omfatter delvis hydrolysering av en hydromonobenzoporfyrindiester med formel: der R<1>, R<2> og R<4> er som definert foran og begge gruppene R<3>' er -CH2CH2C00R der R er alkyl (1-6C).

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1 der hver av R<1> og R<2> uavhengig av hverandre blir valgt fra karbometoksy og karboetoksy, karakterisert ved at man går ut fra tilsvarende utgangsmaterialer.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 2 der R<1> og R<2> er karbometoksy, karakterisert ved at man går ut fra tilsvarende utgangsmaterialer.

4. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av de foregående krav der minst en av gruppene R i diesteren er metyl, karakterisert ved at man går ut fra tilsvarende utgangsmaterialer.

5. Anvendelse av forbindelsene og/eller konjugatene ifølge krav 1 til en in vitro metode for å påvise, lyssensitere, ødelegge eller svekke fungering av målbiologisk materiale.

6. Anvendelse ifølge krav 5 der bestråling skjer med lys som har en bølgelengde fra 670 til 780 nm.

7. Anvendelse ifølge krav 5 der det målbiologiske materialet er ikke-faste tumorceller i benmarg.