JPH05503367A - ルミネッセンス減衰時間に基づくｐＨ値の測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 及びこのような指示薬物質を含む光学的センサ本発明は、試料の対象とする測定 領域内におけるｐＨ値を可逆的に連続測定するための、その試料が、酸又は塩基 として存在する指示薬物質と少な（とも間接的に接触し、そしてその指示薬物質 の蛍光減衰時間τが試料のｐＨ値に依存するような蛍光光学的測定装置のための 指示薬物質、及びこのような指示薬物質を含むセンサに関する。

ｐＨ値の測定は例えば化学、方法工学、製造工学又は環境分析学のような多（の 自然科学的及び工学的分野において重要である。それらの値を測定するための光 学的方法や装置は既に多数提案されている。その実際の技術水準についての概括 をフロリダ州Ｂｏｃａ　ＲａｔｏｎのＣＲＣＰｒｅｓｓ　Ｉｎｃ、刊行（１９９ １１の０．Ｓ、　ＷＯＬＦＢＥＩＳ〔編集〕の’ＣＲＣＢｏｏｋ　ｏｎ　Ｆｉｂ ２ｒ　０ｐｔｉｃ　ｃｈｅｍｉｃａｌ　５ｅｎｓｏｒｓ　ａｎｄ　Ｂｉｏｓｅｎ ｓｏｒｓ”の中にＬＥＩＮＥＲ＆　ＷＯＬＦＢＥＩＳ　が”Ｆｉｂｅｒ　０ｐｔ ｉｃ　ｐＨ５ｅｎｓｏｒｓ″に記述している。中でも２つの方法が実用的である として示されている：ｐＨ値の吸収の変化による測定及び適当な指示薬のルミネ ッセンスの変化による測定。吸収光学的センサはその基本概念が非常に単純であ るという特徴を有するが、実際に実施した場合に多くの問題に遭遇する（信号の 変化量が小さいこと、散乱光量が多いこと、長時間安定性が劣っていること等〕 、ルミネッセンス光学的センサはこれらの問題のい（つかを除いているけれども 、その長時間安定性はしばしば不十分であり、と言うのは指示薬の濃度が種々の 影響因子によって時間とともに変化し、それによって信号の変化が生じてこれが 測定結果に悪影響を及ぼすからである。

ルミネッセンス光学的な、中でも蛍光光学的なセンサの長時間安定性を著しく改 善する方法の１つはその蛍光強度ではなくて蛍光の減衰時間を測定に関連させる ことよりなる［ＬＩＰＰＩＴＳＣＨ等：Ａｎａｌｙｔｉｃａ　Ｃｈｉｎ＋ｉｃａ 　Ａｃｔａ″、　２０５　ｆ１９８８１．１−６］。ルミネッセンス減衰時間又 は蛍光減衰時間は指示薬濃度に殆ど無関係であり、従って濃度に基づ（測定誤差 が避けられる。減衰時間測定を用いるルミネッセンス光学的センサはこれまで、 なかでも物理的測定量（例えば温度等）及び酸素濃度の測定のために開発されて きている。ルミネッセンス光学的ｐＨセンサはルミネッセンス減衰時間の可逆的 変化とともにｐＨ値の変化に対して反応するような指示薬物質がまったく知られ ていなかったために長いこと実現することができなかった。

従来、減衰時間測定に基づ（蛍光光学的ｐＨセンサを実現するための研究は２つ しか実施されていない。

すなわちオーストリア特許ＡＴ−ＰＳ　３９３０３５　から光学的センサにおい て空間的に狭い接触状態にある２つの物質を備えることが公知となっており、そ の際その第１の物質はその測定されるべきｐＨ値に応答しない発蛍光団であり、 そしてその第２の物質はその発蛍光団の傾向に影響を与える発色団である。発蛍 光団と発色団との間のエネルギー移動によって惹起された蛍光減衰時間τの短縮 をｐＨ値の定量的測定に関連させる。しかしながらそのエネルギー移動量は発蛍 光団（ドナー）の蛍光スペクトルのｐＨ指示薬（アクセプタ）の吸収スペクトル との重量及びその空間的距離に関連し、従ってそれら両物質の空間的分布又は濃 度に不都合な態様で依存する。それによって減衰時間センサの本質的利点、かな わちその指示薬濃度への非依存性が失われてしまう。

ｐＨ値用の減衰時間センサを実現する第２の手段がＭ、　Ｃ，ＭＯＲＥＮＯ−Ｂ ＯＮＤＩ　等：”５ＰＩＥ”、　１３６８　（１９９０１１５７−１６４の「光 学的ファイバー検出におけるｐＨ−トランスダクションのための新しいルミネッ セント金属錯化合物」より公知である。

この場合に例えばルテニウム錯化合物のような指示薬物質が用いられるが、この ものの蛍光は種々の酸によって動的に消光され、それにより蛍光の減衰時間が変 化する。いずれにしてもその消光の強さは緩衝液の種類と濃度とにより、またそ の消光させる酸の化学組成によって、そしてそのｐＨ値によっては間接的にしか 決定されない。従ってｐＨセンサとして有意に利用することは多くの場合に不可 能である。

ド　の言゛ハにおいて　いる′Ｍｃ″。

＊　電子的に励起された状態 ［１濃度 ＡＨ酸 八−兵役塩基 Ｈｌ　プロトン ｐＨニー１ｏｇｆＨ”ｌ　ｐＨ値 Ｂ　塩基 ＢＨ”　共役酸 に８　酸定数（酸の解離平衡定数） ｐＫｓ・−１ｏｇ（ＫＪ　酸又は共役酸のｐＫ値ｋＲ輻射減衰速度 ｋｃ　無輻射減励起速度（内部転換Ｓｔ　−Ｓｏ　又はインターシステムクロッ シングＳ、　−Ｔ、） ｋＡ　励起された状態の減衰速度（ルミネッセンス減衰速度〕ｋＡ’　ｋｍ　” 　ｋｃ τ　励起状態の寿命（ルミネッセンス減衰時間）τ・１／ｋ。

ｋｍ＋ｘ　電子的励起状態Ｓ＋から電子的励起状態Ｘへの無輻射転換速度 に、　プロトン化速度 ｋａｐ　脱プロトン化速度 以下において酸及び塩基についてはＢＲＯＥＮｓＴＥＤ−ＬＯＷＲＹ　の定義を 用いる：醒 反応　酸定数 ＡＨＱ　Ａ−＋　Ｈｏ　Ｋ、＝　［Ａ−］［ｕ０］／［ＡＩ堪蚤　酸定数 ＢＨ”　φ　Ｂ＋Ｈ’″　Ｋ、　＝　［Ｂ］　［Ｈ“］／　［ＢＨ”１本発明の 課題は、ｐＨ値測測定ための公知の減衰時間センサの上述した欠点を除き、そし て直接のｐＨ値測測定可能となるような指示薬物質を提供することである。

この課題は本発明に従い下記のようにして解決され、すなわち、１）その指示薬 物質のｐＫｍ　値がその電子的基底状態（Ｓｏ）においてその対象とする測定領 域の中に存在すること、その塩基のプロトン化速度に、又はその酸の脱プロトン 化速度ｋ。がその指示薬物質の励起状態（Ｓ、、　Ｘ）においてその励起状態の 減衰速度に、より小さいこと、及びその指示薬物質の酸型（ＡＨ”、ＢＨ”　） 及び塩基型（Ａ−’、Ｂ＠）のルミネッセンス減衰時間て富及びτ、が異なって いること、或いはまた、２）指示薬物質のｐＫｍ’値がその電子的励起状態（Ｓ 、、　Ｘ）においてその対象とする測定領域内に存在すること、その塩基のプロ トン化速度ｋｐ又はその酸の脱プロトン化速度ｋ。がその指示薬物質の励起状態 （ｓｒ、　ｘ）においてその励起状態の減衰速度ｋＡよりも大きいこと、及びそ の指示薬物質の酸型（ＡＨ”、ＢＨ”　）及び塩基型（Ａ−”、Ｂ”　）のルミ ネッセンス減衰時間τ、及びて、が異なっていることによって解決される。測定 されるルミネッセンス減衰時間τは上記基本的な両方の場合においてルミネッセ ンス減衰時間τ、及びτ、の関数であり、その際その重要度は試料内のｐＨ（ａ によって左右される。

本発明に従う指示薬物質の基本的諸性質は第１図及び第２図のグラフに図式的に 示されている。

異なった群の種々の指示薬物質はそれら異なったルミネッセンス減衰時間τ。

及び１：禽がどのように現れるかによって区別することができる。

すなわち本発明によれば、成る第１の群により指示薬物質の中性型（塩基Ｂ。

又は酸ＡＨ”）の少なくとも２つの励起状態（Ｓ、、　Ｘ）がその指示薬物質の イオン型の対応する励起状態（共役酸ＢＨ”又は兵役塩基Ａ−°）に比して互い に対して反対の配置で存在していること、及びその中性型の上記少なくとも２つ の励起状態の間の無輻射転換速度がその中性型の励起状態の減衰速度に、よりも 大きいことが要求される。

第２の群については本発明に従い、その指示薬物質の励起された中性型（塩基Ｂ °又は酸ＡＨ”）の輻射減衰速度に８及び指示薬物質の励起されたイオン型（共 役酸ＢＨ”又は共役塩基Ａ一つの輻射減衰速度ｋｌｌが異なっていることがめら れる。

最後に、指示薬物質の第３の群は指示薬物質の励起された中性型（塩基Ｂ°又は 酸ＡＨ”）の無輻射減励起速度ｋｃ及び指示薬物質の励起されたイオン型（共役 酸ＢＨ”°又は共役塩基Ａ−°）の無輻射減励起速度ｋｅが異なっていることに ょって特徴づけられる。

試料のｐＨ値の連続的な可逆的測定のためのルミネッセンス光学的センサは本発 明に従う上述した３つの群の指示薬物質のうちの１つを有する。

従って、以下の頁において、ルミネッセンス減衰時間τが試料のｐＨ値に直接か つ可逆的に依存するようなｐＨ感受性指示薬物質を選ぶための基準又は特徴事項 を総括してあげる： １、　−二′　のプロトンイ　は　能力　簡において　こる電子的に励起されて いないａ　（ＡＨ又はＢＨつのｐＫｇ　値がその対象とする測定領域内に存在す る。

１．１．′六薬声　Ｂ 共役酸（ＢＨ”）の脱プロトン化速度ｋ。Ｉ＠Ｈ”ゆ　１．Ｈ″）がこのものの ルミネッセンス減衰速度ｋＡ＋１Ｍゆ＊　ｍ　ｍｕｍ　ｅ　ｎ。よりも小さい。

電子的に励起された塩基（Ｂｏ）のルミネッセンス減衰速度ｋＡ（１１″ゆ＠　 ＊　１１１１１がこのもののプロトン化速度に、（、。＊　Ｍ”　４　ＩＨ”ｌ 　よりも大きい。

電子的に励起された塩基（Ｂｏ）の少なくとも２つの状態（例えばπ−π０及び ｎ−π”）がその共役酸の対応する電子的に励起された状態（ＢＨ”　）として 互に逆のエネルギー位置を有する。無輻射転換速度ｋｍ＋ｘｃｆｆｘｍＸ”＋− ｈｘＩｍｓ”＋＋が励起された状態Ｓ、　ｆＢＩ（”ｌのルミネッセンス減衰速 度に、よりも大きく、従って励起された状態（ＢＨ”及びＢ”）のルミネッセン ス減衰時間（τ）の異なった値が与えられる。

１．１．ｂ。

電子的に励起された塩基（Ｂｏ）のルミネッセンス減衰速度ｋＡ　Ｊｌｌ□ｏｓ 　、　ＢＭ＊、１ｗ：　と電子的に励起された共役酸（ＢＨ”）のルミネッセン ス減衰速度ｋＡｌ１Ｍ”−、□　＊　ｎｖｌとが異なっており（例えば両方の型 の異なった遷移確率及び類似した高い量子収率により）、従ってその励起状態（ ＢＨ”及びＢ”）のルミネッセンス減衰時間（τ）の異なった値が与えられる。

のの励起された共役酸（ＢＨ”）の無輻射減励起速度ｋｃ　ｔ、、Ｉ″　＃　Ｂ １４”ｌ　と異なっており、それによりその励起された状態（Ｂｌ（”及びＢ” ）のルミネッセンス減衰時間（τ）の異なった値が与えられる。

１．２．旨バー　ＡＨ 電子的に励起された状態における共役塩基（Ａ一つのプロトン化速度に、＋１− 。

−＋−Ａ−＊　ｌ、ｖｌがこのもののルミネッセンス減衰速度ｋＡｌＡ−”　４ Ａ−＊工、よりも小さい。

電子的に励起された酸（ＡＨ”）のルミネッセンス減衰遠度ｋＡＬ工°（Ｉ　Ａ ＨＩ　１１１１１がこのものの脱プロトン化速度ｋａａ（ＡＨ”　＃　Ａ−”　 ＋　Ｈ”ｌ　よりも大きい。

１．２．ａ。

電子的に励起された酸（ＡＨつの少なくとも２つの状態（例えばπ−π′及びｎ −１０）が互いに対して逆のエネルギー位置を、電子的に励起された兵役塩基（ Ａ−”）の対応する状態として有している。無輻射転換速度ｋｓ＋ｘ＋ｇ＋＋Ａ 、ｌ”＋　ｍＸ　ＩＡＨ”ｌ　＋が励起された状態Ｓ、（ＡＨ”）　のルミネッ センス減衰速度ｋＡよりも大きく、従って励起された状態（ＡＨ”　及びＡｏつ のルミネッセンス減衰時間（τ）の異なった値が与えられる。

１．２．ｂ。

電子的に励起された酸（ＡＨ”）のルミネッセンス減衰速度ｋａ＋ａＨ−８０１ １１１１と電子的に励起された共役塩基（Ａ−”）のルミネッセンス減衰速度ｋ Ａ　ＩＡ−Ｚ　Ａ−◆ｈｖｌ　とが異なっており（例えば両方の型の異なった遷 移確率及び類似した高い量子収率により）、従って励起状態（ＡＨ”　及びＡ− °）のルミネッセンス減衰時間（１：）の異なった値が与えられる。

１．２．Ｃ。

無輻射減励起速度ｋｃ　＋ＡＩ４°４　ＡＨＩがその励起された酸（ＡＨつにつ いてその励起された共役塩基（Ａ−”）の無輻射減励起速度ｋｃ　１４−”ｍ　 ａ−１と異なっていてそれによりその励起された状態（ＡＨ”　及び八一つのル ミネッセンス減衰時間（τ）の異なった値が与えられる。

領域内に存在する。

ｌ２上２指二遍崖基 電子的基底状態における共役酸（ＢＨ”）のｐＫｍ　値がその対象とする領域の 下限よりも低い。

電子的に励起された塩基（Ｂｏ）のルミネッセンス減衰速度ｋｋｃｍ”　−ａ　 ｍや、９゜がこのもののプロトン化速度ｋｐ　（ａ”　＋１　ｓ”４　ｍｌｌ□ ＊ｌ　よりも小さく、従ってプロトン化は電子的に励起された状態において起こ る。

２．１．ａ。

電子的に励起された共役酸（ＢＨ”　）の少な（とも２つの状態（例えばπ−π °及びｎ−π°）がその電子的に励起された塩基の対応する状態（Ｂ′〕として 互に逆のエネルギー位置を有する。無輻射転換速度ｋｓｌＸ１１目、、４°”ｌ 　＃　Ｘ　１１□゛１１が励起された状態Ｓ、　（ＢＨ”ｌのルミネッセンス減 衰速度ｋＡよりも大きく、従って励起された状！ｇ（ＢＨ−°及びＢ”）のルミ ネッセンス減衰時間（τ）の異なった値が与えられる。

電子的に励起された塩基（Ｂｏ）のルミネッセンス減衰速度ｋａ＋ｍ”、ｓ、。

、１と、電子的に励起された兵役酸（ＢＨ”　）のルミネッセンス減衰速度ｋａ 　＋ｇｏ””ＢＨ”＊。ｖｌとが異なっており（例えば両方の型の異なった遷移 確率及び類似した高い量子収率により）、従ってその励起状態（ＢＨ”°及びＢ ｏ）のルミネッセンス減衰時間（τ）の異なった値が与えられる。

無輻射減励起速度ｋＣ４°ゆ、１　がその励起された塩基（Ｂ”″）についてそ の励起された共役酸（ＢＨ”　）の無輻射減励起速度ｋＣ＋ｍ□゛′ゆ　、Ｈ″ ）　と異なっており、それによりその励起された状態（ＢＨ”及びＢ”）のルミ ネッセンス減衰時間（τ）の異なった値が与えられる。

の上限よりも高い値である。

電子的に励起された＠　（ＡＩ（”）のルミネッセンス減衰速度ｋＡｔａＨ”　 ＃　ＡＮや。、）がこのものの脱プロトン化速度ｋ。ＩＡＨ”　−ｅ　Ａ−”　 ＊　Ｍ’ｌ　よりも大きく、従って脱プロトン化が電子的に励起された状態にお いて起こる。

２．２．ａ。

電子的に励起された酸（ＡＨ＠）の少な（とも２つの状態（例えばπ−π９及び ｎ−π０）が互いに対して逆のエネルギー位置を、電子的に励起された共役塩基 （Ａ−”）の対応する状態として有している。無輻射転換速度ｋｇ＋ｘｎ＋ｔＡ 崎やＸ　＋ＡＭ’ｌ　１が励起された状態Ｓ、（ＡＩ”ｌ　のルミネッセンス減 衰速度ｋａよりも大きく、従って励起された状態（ＡＨ”　及びＡ”つのルミネ ッセンス減衰時間（τ）の異なった値が与えられる。

２．２．ｂ。

電子的に励起された！　（ＡＨ”）のルミネッセンス減衰速度に□ＡＨ”ｍ　Ａ Ｈｏ、７．。

と、電子的に励起された共役塩基（Ａ−＠）のルミネッセンス減衰速度に□、゛ ′″。

え−９７ｖ）　とが異なっており（例えば両方の型の異なった遷移確率及び類似 した高い量子収率により）、従って励起状態（ＡＨ”　及びＡ−°）のルミネッ センス減衰時間（τ）の異なった値が与えられる。

２．２．ｃ。

無輻射減励起速度ｋｃ　ｌＡｌ−ＡＩ’１１　がその励起されたＭ　（ＡＨ”） についてその励起された共役塩基（Ａ一つの無輻射減励起速度ｋｃ＋ａ−’　ｗ 　Ａ−１と異なっていてそれによりその励起された状態（ＡＨ’　及び八一つの ルミネッセンス減衰時間（て）の異なった値が与えられる。

上記１．及び２．にあげた基準を満たす物質は例えば脂肪族性及び芳香族性のア ミノ基（−Ｎｌ（、、−ｍ、−捕２）又はヘテロ環窒素化合物（−Ｎ＝）　を含 む指示薬塩基の中に存在する。上記の物質はその溶液のｐＨ値の低下とともにプ ロトンをその窒素原子の自由電子対に結合することができる。

その他、例えばフェノール性七ドロキシル基（ＯＨ）　、カルボン酸基（−ＣＯ ＯＩ（）を含む指示薬酸の中に公的な物質が存在する。これらはその溶液のｐＨ 値の上昇とともにプロトンを放出する。

前述の基準に該当する他の酸／塩基指示薬物質はこのような単純な型にはめ込む ことができない。ここではそのスペクトル的特性のｐＨに依存する変化が分子内 転位によって起こる。この転位は多数の中間段階を経て行われる。

文献において蛍光強度の測定との関連において既に古（からあげられている、例 えばクマリン類、フルオレッセイン、ナフチル誘導体及びとジン誘導体のような 指示薬も適している。

指示薬物質のｐＨ値に影響を与えるための可能な直換基として−ｃＨｓ　、−ｃ ｐ、、シアノ、カルボキシ、カルボキシアミド、フェニル及び高次ハロゲン化物 をあげることができる。

指示薬物質の発色団性の分子部分としては例えば駒部環状又は異部環状の（単核 又は多核の）芳香族性炭化水素があげられる。

上記１．にあげた機構の実施例の１つにおいて、その指示薬は例えば固体基材物 質の上に固定して試料と接触させる。その蛍光の励起は成る短時間光源（例えば 同軸的フラッシュランプ、パルス化されたレーザー、パルス化された発光ダイオ ード等）を用い、そしてスペクトル的に（吸収スペクトルが吸収型とイオン型と で重畳しない場合）その励起に用いるスペクトルがその指示薬の吸収を中性型の みならずイオン型においてもカバーされる程に広帯域であるか、又はＣ両型の吸 収スペクトルが重なり合う場合）スペクトル的にその重量領域の波長内で狭帯域 であるように行われる。その蛍光はカットオフフィルタによる励起光の分離の後 にスペクトル的に広帯域的に検出され（例えば光電増倍管又はピンフォトダイオ ードにより）、そしてその減衰時間は電子的に測定される。基底状態における解 離を問題とするために、吸収スペクトルのみならず蛍光スペクトルも変化するけ れども、これは励起及び検出の広帯域性或いは吸収スペクトル及びの帯域検出の 重量領域内での励起波長の選択によって測定になんら悪影響を及ぼすすことはな い。一旦記憶させた検量関数によってその各測定された減衰時間は接続されてい るコンピュータでｐＨ値に換算される。

以下において本発明に従う指示薬物質についての若干の具体例をその機能態様の 説明のもとに記述する。

１工１工互り例 指示薬塩基ニアクリジン 共役酸型の励起／輻射の最大：　３５６／４７５　ｒｉｌｌ塩基型の励起／Ｉ！ 射の最大　：　３５６／４３０　ｎｍ測定領域　ｐＨ４，０−７，０ 基底状態における酸型（ＢＨ”）のｐＫｇ　：　５．４５励起状態における酸型 （Ｂ）［つのｐＫｓ”　：　１０．７励起状態のルミネッセンス減衰時間　二　 τＣ□°°）・３３　ｎｓ対象とする測定領域（ｐＨ４−７）において両方の型 （ＢＨ”　及びＢ）が存在する。励起状態におけるｐＫｓ”は基底状態における ｐＫｓ　よりも５．２５単位大きい。これにより、励起状態において共役酸（Ｂ Ｈ”　）の脱プロトン化は起こらない。電子的に励起された塩基（Ｂ″）のルミ ネッセンス減衰速度りはこのもののプロトン化速度に、よりも大である。電子的 に励起された塩基（Ｂ゛）及び電子的に励起された共役酸（ＢＨ”　）のルミネ ッセンス減衰速度ｋＡは異なっている。これによって、励起状態のルミネッセン ス減衰時間の異なった値［１：　（ｉｓ”１；３３　ｎｓ　、　ｉ：　ｃｓ”ｌ 　：１４　ｎｓｌが与えられる。

エエ旦、互り伝 指示薬酸：サリチルアルデヒド 酸型の励起／ＩＩ射の最大：　３２７１５２４　ｎｍ共役塩基型の励起／輻射の 最大：　３８０／４００　ｎｍ測定領域　ｐＨ７−１０ 基底状態における酸型（ＡＨ）のｐＫｓ　：　約８．５励起状態における酸型（ ＡＨ″″）のｐＫｓ”　：　約２励起状態のルミネッセンス減衰時間　：　τｌ Ａ♂ｌ５（ｉｎｓτ（Ａ”ｌ　”約３ｎｓ ｋＡ　よりも大きい。これにより、励起状態のルミネッセンス減衰時間の異なっ た値［τイ８°１　（１ｎｓ、ｔ：　Ｈｍ−”１　”約３　ｎｓ　］が与えられ る。

上−ヱー二凶倒 指示薬Ｍ：インドールー３−酢酸 測定領域　ｐ）Ｉ　２−４ 基底状態における酸型（ＡＩ（）のｐＫ、：　約３励起状態における酸型（ＡＨ ＠）のｐＫｌ”　：　約２励起状態のルミネッセンス減衰時間　：　τ（ａｓ” ｌ”　２．５　ｎｓτＩＡ−”ｌ　：９．Ｏｎｓ 対象とする測定領域（ｐＨ２−４）において両方の型（ＡＨ及びＡ−）が存在す る。励起状態におけるｐＫｇ”は基底状態におけるｐＫｇ　よりも約２単位小さ い。これにより、励起状態において共役塩基（Ａ−＠）のプロトン化は起こらな い。電子的に励起された酸（ＡＨ”）のルミネッセンス減衰速度りはこのものの 脱プロトン化速度ｋａｐ　よりも大きい。電子的に励起された酸（ＡＩ（つの無 輻射減励起速度ｋｅは電子的に励起された兵役塩基（Ａ−”）の無輻射減励起速 度ｋｃと異なっている。これにより、励起状態のルミネッセンス減衰時間の異な った値［１：ｃＡＨ″）　・２．５　ｎｓ、１：＋Ａ−”＋　・９．０　ｎｓｌ が与えられる。

ルミネッセンス減衰時間力省−塩基反応によってその電子的基底状態において影 響を受ける種々の指示薬の他の例は下記のとおりである：１．１．ｂに対し＝　 ９−アミノアクリジン１．２．ａに対し：　１−ヒドロキシ−アセチルナフタリ ンジヒドロキシアンスラキノン ニーヒドロキシベンゾニトリル ９−クロル−１Ｏ−ジエチルアミノメチルアントラセン１．２．ｂに対し：　ベ ンゾチアゾール誘導体ベンゾオキサゾール誘導体 ベンズイミダゾール誘導体 アザインドール サリチル酸メチル サリチル酸アミド １．２．ｃに対し：　ビリベルジン誘導体ポルフィリン誘導体 前記２、にあげた機構の実施例の１つにおいて、好適な指示薬を固体担体の上に 固定して試料の中に浸漬する。励起は成る短時間光源（例えば同軸的閃光ランプ ）を用い、そして指示薬の吸収波長に合致した色フィルタ（例えば干渉フィルタ ）により行ない、５ｆｆｌはカットオフフィルタにより励起光を分離した後でス ペクトル的に広帯域的に行なう（例えば光電場ｆｎ又はピンフォトダイオードに より）。ｐＨ値の決定は再びその測定された減衰時間より記憶させである検量関 数によって行なう。

以下において本発明に従う指示薬物質についての若干の具体例をその機能態様の 説明のもとに記述する。

主−エエ亘Ω泗 指示薬塩基＋　９（ＩＯＩＩ＋−アクリジノン共役酸型の励起７Ｎ射の最大＋　 ３９９／４５６　ｎｍ塩基型の励起／輻射の最大　：　３８３／４４０　ｎｍ測 定領域　ｐＨ０，５−２，５ 基底状態における酸型（ＢＨ”）のｐＫｉ　＋０．０２励起状態における酸型（ Ｂ）Ｉ”　）のｐＸｊ”　：１．７励起状態のルミネッセンス減衰時間　二で＋ ｓ、Ｉ”＋　”　１５１ｓτＣｍｌ１１＝２６ｎＳ 対象とする測定領域（ｐＨ０，２−３，２）において塩基型（Ｂ）が主として存 在する。励起状態におけるｐＫｓ”は基底状態におけるｐＬ　よりも１，７　単 位大きい。これにより、その対象とする測定領域において塩基型（Ｂ）が主とし て励起される。電子的に励起された塩基（Ｂ６）のルミネッセンス減衰速度に、 はこのもののプロトン化速度ｋｐよりも小さく、それにより、塩基（Ｂ１）のプ ロトン化が電子的に励起された状態において起こる。電子的に励起された塩基（ Ｂ°〕のルミネッセンス減衰速度に１と電子的に励起された共役酸（ＢＨ”　） のそれとは異なっている。これによって、励起状態のルミネッセンス減衰時間の 異なった値〔τ。、４１１．＝　１５　ｎｓ、τ♂）冨２６　ｎｓｌが与えられ る。

旦、旦工旦幻遡 指示薬酸＝２−ナフトール 酸型の励起／輻射の最大：　３２８／３５６　ｎｍ共役塩基型の励起／＆Ｉ射の 最大：　３４８／４１０　ｎｍ測定領域　ｐＨ１，３−３，３ 基底状態における酸型（ＡＨ）のｐＫｍ　：　約９．８励起状態における酸型（ ＡＨ”）のｐＫｓ”　：　約２．８励起状態のルミネッセンス減衰時間　：　τ １Ａｌｌ”ｌ　＋９．Ｏｎｓτｌａ−”Ｉ　”　２．ａ　ｎｓ これにより、その対象とする測定領域においてその酸型（ＡＨ）だけが励起され において脱プロトン化が起こる。電子的に励起されたｖｉ（ＡＨ”）及び電子的 に励起された兵役塩基（八一つの各ルミネッセンス減衰速度に、は異なっている 。これによって、励起状態のルミネッセンス減衰時間の異なった値［１：ｆＡＨ ’ｌ　・９、Ｉｎｓ、　ｔ　＋ａ−”１　＝　２．８　ｎｓｌが与えられる。

ルミネッセンス減衰時間が酸−塩基反応によってその電子的励起状態において影 響を受ける種々の指示薬の他の例は下記のとおりである＋２．１．ａに対し：　 キニジン キニン ２．１．ｂに対し；　６−メドキシキノリン２．２．ｂに対し：　ニーヒドロキ シピレン１−ヒドロキシピレン−３，６，８〜トリスルホン酸横軸にｐＨ（＋１ を、そして縦軸に任意単位でエネルギー水準を取って示したグラフである。

第１図において指示薬物質のプロトン化又は解離がその基底状態Ｓ。において起 こる。そのｐＫ８値は対象とする測定領域Ｍ内にある。指示薬の共役酸ＢＨ”及 び塩基Ｂの各基底状態は数字１又は２、或いは励起状態ＳＩにおいてはド又は２ °で示す。図示の指示薬の例においてはｐ　Ｋ　ｍ″　値はその測定領域の上方 のｐＨスケールの中にある。これに対して、ある指示薬酸が存在する場合にｐ　 Ｋ　ｓ　”値は対象とする測定領域Ｍの下方に存在する。

第２図では指示薬塩基Ｂ０のプロトン化に、が励起状態Ｓ１において起こる。

そのｐ　ＫＭ”　値は対象とする測定領域Ｍの中にある。基底状態におけるｐＫ 、値は対象とする測定領域Ｍの下方にある。

第１図なおいても、また第２図においても減衰時間で、及び１：、は異なってい る。測定されたルミネッセンス減衰時間τは両方の基本的ケースにおいて各ルミ ネッセンス減衰時間τ６及びτＳの関数であり、その際その重要度は試料中に現 われるｐＨ値に依存する。

要約書 対象測定領域（ＭＪ内で試料のｐ）（値を可逆的に連続測定するに用いるルミネ ヅセンス光学的測定装置のための、そのルミネッセンス減衰時間τが試料のｐＨ 値に依存するような指示薬物質は下記の性質を有する：その指示薬物質のｐＫ。

値がその電子的基底状態（Ｓ。）においてその対象とする測定領域内にある。そ の塩基のプロトン化速度に９又はその酸の脱プロトン化速度に６ｐ　がその指示 薬物質の励起状態（Ｓ、、　Ｘ）においてその励起状態の減衰速度ｋＡよりも小 さくそしてその指示薬物質の酸型（ＡＨ”、ＢＨ”　）及び塩基型（Ａ−”、Ｂ ”　）のルミネッセンス減衰時間ｔ、及びτ、が異なっている。その指示薬物質 のｐＫ１″　値がその電子的励起状態（Ｓ、、　Ｘ）においてその対象とする測 定領域内にあるときはその塩基のプロトン化速度に、又はその酸の脱プロトン化 速度に６．がその指示薬物質の励起状態（Ｓ、、　Ｘ）においてその励起状態の 減衰速度に、よりも大きい。

国際調査報告

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. １．対象とする測定領域（Ｍ）の中で試料のｐＨ値を可逆的に連続測定するため の、その試料が、酸又は塩基として存在する指示薬物質と少なくとも間接的に接 触し、そしてその指示薬物質のルミネッセンス減衰時間τが試料のｐＨ値に依存 するようなルミネッセンス光学的測定装置のための指示薬物質において、その指 示薬物質のｐＫｓ値がその電子的基底状態（Ｓｏ）においてその対象とする測定 領域内にあること、その塩基のプロトン化速度ｋＰ又はその酸の脱プロトン化速 度ｋ■Ｐがその指示薬物質の励起状態（Ｓｉ，Ｘ）においてその励起状態の減衰 速度ｋＡよりも小さいこと、及びその指示薬物質の酸型（ＡＨ＊，ＢＨ＋＊）及 び塩基型（Ａ−＊，Ｂ＊）のルミネッセンス減衰時間τａ及びτｓが異なってい ることを特徴とする、上記指示薬物質。
2. ２．指示薬物質の中性型（塩基Ｂ＊又は酸ＡＨ＊）の少なくとも２つの励起状態 （Ｓｉ，Ｘ）が指示薬物質のイオン型の対応する励起状態（共役酸ＢＨ＋＊又は 共役塩基Ａ−＊）に比して互いに反対の配置で存在すること及びその中性型の上 記少なくとも２つの励起状態の間の無輻射転換速度が中性型の励起状態の減衰速 度ｋＰよりも大きいことを特徴とする、請求の範囲１の指示薬物質。
3. ３．指示薬物質の中性型の励起状態（塩基Ｂ＊又は酸Ａ＊）と指示薬物質のイオ ン型の励起状態（共役酸ＢＨ＋＊又は共役塩基Ａ−＊）との輻射減衰速度ｋＲが 異なっていることを特徴とする、請求の範囲１又は２の指示薬物質。
4. ４．指示薬物質の中性型の励起状態（塩基Ｂ＊又は酸Ａ＊）と指示薬物質のイオ ン型の励起状態（共役酸ＢＨ＋＊又は共役塩基Ａ−＊）との無輻射減励起速度ｋ Ｃが異なっていることを特徴とする、請求の範囲１又は２の指示薬物質。
5. ５．対象とする測定領域（Ｍ）の中で試料のｐＨ値を可逆的に連続測定するため の、その試料が、酸又は塩基として存在する指示薬物質と少なくとも間接的に接 触し、そしてその指示薬物質のルミネッセンス減衰時間τが試料のｐＨ値に依存 するようなルミネッセンス光学的測定装置のための指示薬物質において、その指 示薬物質のｐＫｓ＊値がその電子的励起状態（Ｓｉ，Ｘ）においてその対象とす る測定領域内にあること、その塩基のプロトン化速度ｋｐ又はその酸の脱プロト ン化速度ｋ■ｐがその指示薬物質の励起状態（Ｓｉ，Ｘ）においてその励起状態 の減衰速度ｋＡよりも大きいこと、及びその指示薬物質の酸型（ＡＨ＊，ＢＨ＋ ＊）及び塩基型（Ａ−＊，Ｂ＊）のルミネッセンス減衰時間τ■及びτ■が異な っていることを特徴とする、上記指示薬物質。
6. ６．指示薬物質の中性型（塩基Ｂ＊又は酸ＡＨ＊）の少なくとも２つの励起状態 （Ｓ１，Ｘ）が指示薬物質のイオン型の対応する励起状態（共役酸ＢＨ＋＊又は 共役塩基Ａ−＊）に比して互いに反対の配置で存在すること及びその中性型の上 記少なくとも２つの励起状態の間の無輻射転換速度が中性型の励起状態の減衰速 度ｋＰよりも大きいことを特徴とする、請求の範囲５の指示薬物質。
7. ７．指示薬物質の中性型の励起状態（塩基Ｂ＊又は酸Ａ＊）と指示薬物質のイオ ン型の励起状態（共役酸ＢＨ＋＊又は共役塩基Ａ−＊）との輻射減衰速度ｋＲが 異なっていることを特徴とする、請求の範囲５又は６の指示薬物質。
8. ８．指示薬物質の中性型の励起状態（塩基Ｂ＊又は酸Ａ＊）と指示薬物質のイオ ン型の励起状態（共役酸ＢＨ＋＊又は共役塩基Ａ−＊）との輻射減励起速度ｋＣ が異なっていることを特徴とする、請求の範囲５又は６の指示薬物質。
9. ９．化学的又は物理的に固定された請求の範囲１ないし８のいずれか１つに従う 指示薬物質を含む、試料のｐＨ値を可逆的に連続測定するためのルミネッセンス 光学的センサ。