JPH0550279B2 - - Google Patents

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JPH0550279B2
JPH0550279B2 JP60071263A JP7126385A JPH0550279B2 JP H0550279 B2 JPH0550279 B2 JP H0550279B2 JP 60071263 A JP60071263 A JP 60071263A JP 7126385 A JP7126385 A JP 7126385A JP H0550279 B2 JPH0550279 B2 JP H0550279B2
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amino acid
reagent
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polypeptide
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Shunaaberu Oigen
Kurisutofuaa Sukujorudo Ee
Torauisu Jeemusu
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Miles Inc
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C12Q1/37—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving peptidase or proteinase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C12Q1/44—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving esterase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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Description

【発明の詳細な説明】
本発明はエステル類が特に試験片中の試験試薬
中に適当な方法で含有されている、例えば体液中
のエステル分解及び／又は蛋白質分解酵素の分析
検出のための試薬に関する。発色性酵素基質（適
当なフエノール類のアミノ酸エステル類或いはペ
プチドエステル類）及び適当な場合にはこれらの
フエノール類とカツプリングして色を形成するジ
アゾニウム塩類の他に、本発明の試薬は又これら
のアミノ酸エステル類或いはペプチドエステル類
の酵素的切断の促進剤としての塩類も又含有する
ものである。これらの試薬は特に尿中の白血球の
検出に使用するのが好ましい。 体液、特に尿中の白血球の検出は腎臓及び尿性
殖系路の病気の診断において極めて重要である。
この検出は元々遠心分離にかけていない尿又は遠
心分離後の尿沈澱物において白血球の数を数える
ことにより行われていた。これらの両方法におい
ては、損なわれていない白血球を記録し得るにす
ぎない。しかしながら、白血球−リシスの速度は
尿媒体に応じて広範に変化し、例えば強アルカリ
性尿内においては白血球の半減期は僅かに60分に
過ぎない。これは、測定される白血球の計測数が
余りにも低いということを意味する。このリシス
の誤差を別にすれば白血球の非−遠心分離均質化
尿中の白血球の測定は計測数において極めて正確
な値を与えるものである。にも拘らず、この方法
は余り実際には利用されていないのは、手間及び
時間がかかり熟練者を必要とするからである。 医学的実践における、尿中における白血球の測
定のための好ましい方法は従つて尿沈澱物におけ
る所謂視野法であつた。このためには試料（沈
澱）を先ず遠心分離により得なければならなかつ
た。しかしながら、その際尿の他の構成々分も濃
縮され、これらには例えば塩類及び表皮細胞類が
含まれ、白血球の顕微鏡による計数を相当により
困難なものにする。変化する沈澱の含量、沈澱の
不均質性及び顕敏鏡の異つた光学的設計が白血球
計数を述べる際に比較的大きな誤差（数百％ま
で）に導いた。 これらの困難を回避するために、白血球は広範
囲の酵素スペクトルを有するので各種体液におけ
る白血球に対する検出原理として酵素反応を使用
する試みが既になされている。 即ち、例えば体液中における白血球の検出試薬
は西独公開公報2826965号、2836644号明細書より
公知であり、これらの明細書中においては白血球
内に存在するエステル分解及び／又は蛋白質分解
活性が分析目的のために利用されている。スルホ
ンフタレンエステル類或はアゾ色素エステル類が
白血球エステラーゼ及び／又はプロテアーゼの基
質として使用されている。酵素反応において放出
された色素は次いで公知の方法により測定され
る。しかしながら、これらの公報に記載された試
薬は、それらの反応時間が低い濃度の白血球に対
しては余りに長いので、なお実用目的のためには
感度が余りにも低いものである。 プロテアーゼ類及びエステラーゼ類の各種検出
方法が又組織化学及び植物化学的酵素学から公知
である〔例えば、A.G.E，ピアス，ヒストケミス
トリ，セオレテイカル・アンド・アプライド，第
３版，チヤーチル・リビングストン，エジンバラ
−ロンドン−ニユーヨーク（Pearse，Histoche
−mistry，Theoretical and Applied 3rd editi
−on，Churchill Livingstone，Edinburgh−
London−NewYork）1968参照〕。一般的に、検
出のためには無色或いは僅かに着色したエステル
類が用いられ、これらは酵素により無色の酸及び
無色のアルコール（フエノール）成分に分解ささ
れる。このフエノール成分を次いで例えばジアゾ
ニウム塩とのカツプリング或いは酸化による引き
続く反応において着色生成物に転換する。例えば
シユマルツル（F.Schmalzl）及びブラウンスタ
イナー（H.Braunsteiner）はクリン・ウシユル
（Klin.Wscher.）46，642（1968）において、基質
としてナフトール−AS−Ｄ−クロロアセテート
及び放出されたナフトールと着色アゾ化合物を形
成するジアゾニウム塩を用いた特異的な細胞化学
的な白血球のエステラーゼの検出を記載してい
る。 しかしながら、このタイプの二成分系は体液、
例えば、尿における白血球の迅速且つ簡易な検出
のためには不適当であことが判明している。何故
ならば、それらは余りにも感度が低く、5000白血
球数／μlを含有する試料もなお反応を与えない程
度であるからである。 英国特許Ａ−1128371号及びヨーロツパ特許Ａ
−12957号は体液内の加水分解酵素の検出のため
に発色性基質としてのインドキシル及びチオイン
ドキシルエステル類の使用を記載している。この
基質の酵素的切断に際して遊離のインドキシルが
形成され、それは引続いて酸化されて容易に検出
できる青色色素インジゴになる。ヨーロツパ特許
Ａ−12957号に基づく市販の試験具は、Ｎ−トシ
ル−Ｌ−アラニンＬ−インドキシルエステルで含
浸された紙片よりなるものである。この試験片
を白血球を含む尿試料中に浸けると、それは青色
に変色する。しかしながら、最終着色に到達し、
試験を評価する迄にかかる長い待ち時間（約15
分）は、この製品の相当な欠点である。 ヨーロツパ特許Ａ−14929号は酵素的切断反応
のための各種促進剤（ピリジン誘導体、イミダゾ
ール誘導体、アルコール類、金属錯体）を記載し
ている。しかしながら、インドキシルの完全な酸
化までの比較的長い時間及びこの試験の低い感度
（検出限度：数千白血球数／μl）は依然欠点とし
て残る。同様なことは、ヨーロツパ特許Ａ−
34323号に従つた白血球酵素の基質としてロイコ
−インドアニリン類のエステル類を使用する場合
にも当てはまる。 ヨーロツパ特許Ａ−39880号は、ヨーロツパ特
許12957号及び14929号による基質と上記のジアゾ
ニウム塩とのカツプリングの検出原理との組み合
わせを与えるものである。この様にして白血球の
検出限界を相当に減少させることが可能である
が、実用に際して望まれる15−20白血球数／μlの
検出感度はなお達成されていない。 本発明の目的は、この様に白血球酵素による基
質の酵素的切断の促進の結果、尿中の白血球のよ
り高感度及びより迅速な検出を可能にするエステ
ル−切断酵素のための新規促進剤を発見すること
であつた。この目的は試薬系には塩類を使用する
ことにより達成される。 驚くべきことに、白血球酵素による発色性基質
の切断が塩の添加により相当に促進されるか、或
は、試験系内に既に存在する促進剤の作用が強め
られることが見出された。 本発明は(a)発色性酵素基質としてフエノール類
のアミノ酸エステル或いはペプチドエステル、(b)
成分(a)のアミノ酸エステル結合或いはペプチドエ
ステル結合の酵素的切断を促進する物質、適当な
場合には(c)ジアゾニウム塩、適当な場合には(d)緩
衝液、及び適当な場合には(e)担体及び／又は通常
の添加剤を含んでなるエステル分解及び／又は蛋
白質分解酵素の検出のための試薬において、塩が
促進物質として、適当な場合には他の活性化剤と
共に使用されることを特徴とするものに関する。 最後に、本発明は又液体試料特に体液における
エステル分解及び／又は蛋白質分解酵素の検出方
法において試料を本発明に従つた試薬と接触させ
生ずる色反応を測定することを特徴とする方法に
も関する。 本発明に従えば、促進作用を有する塩類は特に
アルカリ金属及びアルカリ土類金属の一価及び二
価のカチオン例えばLi+、Na+、K+及びMg++な
どの塩類である。活性化塩類の好ましいアニオン
類は一価、二価或いは三価の有機又は無機アニオ
ン類である。特に挙げることのできるアニオン類
はハロゲン及び擬ハロゲンアニオン、硫酸アニオ
ン及びリン酸アニオン、及び有機酸例えば酢酸、
トリフルオロ酢酸、トルエンスルホン酸及びコハ
ク酸のイオンである。 本発明に従えば、試験溶液中の塩類の濃度は好
ましくは0.05〜2M、特に好ましくは0.1〜Ｍであ
る。 担体の含浸のための配合において（下記の試験
器具の製造において）、これらの塩類は0.01M〜
2M、特に好ましくは0.1〜1Mの量で溶解される
のが好ましいい。 本発明に従つて使用される塩類は白血球酵素に
よるヨーロツパ特許Ａ−7407号、8428号、12557
号、14929号、34323号及び39880号に記載される
基質の酵素的切断並びに既に先に述べた基質の切
断を促進する〔ゴモリ（G.Gomori），ジエー・
ヒストケム・サイトケム（J.Histochem.
Cytochem.）６，469（1953）；リユフラー（H.ｏ¨
ffler），クリン・ウオツチエンシヤー（Klin.
Wochenscher）39，1120（1960）；ヴイツサー
（L.Visser）及びブラウト（E.BLout），フエド−
プロツク（Fed.−Proc.）28，407（1969）及びバ
イオケム・バイオフイズ・アクタ（Bio−chim.
Biophys.Acta）268，257（1972）及びスウイート
マン（F.Sweetman）及びオルスタイン（L.
Ornstein），ジエー・ヒストケム・サイトケム
（J.Histochem.Cytochem.）23，327（1974）〕。 本発明による試薬中の好ましい発色性基質は又
下記一般式（）で表わされる同時係属中の出願
に記載される化合物も又含むことができる： 〔式中、X1及びX2は同種又は異種であり、窒
素又はイオウを示し（但し、X1及びX2は同時に
はイオウを表わさない）、R1は水素或いは１〜６
の炭素数の場合によりハロゲン或いはヒドロキシ
ルで置換されてもよい場合により分岐したアルキ
ル基を表わし、R2及びR3は同種又は異種であり、
水素、C1−C6−アルキル基、C1−C6−アルコキ
シ基、C1−C6−アシル基、ハロゲン、トリフル
オロメチル基、ニトロ基、SO3H基、シアノ基、
C1−C8−アシルアミノ基、C1−C6−ジアルキル
アミノ基、或いはC6−C10−アリール基（これら
は又更にC1−C6−アルキル基、C1−C6−アルコ
キシ基、ハロゲン、シアノ基、ニトロ基、トリフ
ルオロメチル基、SO3H基、C1−C6−アシル基或
いはC1−C6−ジアルキルアミノ基により置換さ
れていてもよい）、或いはR2及びR3は一緒になつ
て縮合芳香族環好ましくはベンゼン環（これは更
に１個又は２個のR2基で置換されてもよい）を
形成し、Ａはアミノ酸基或いはペプチド基を示
し、及びＧは水素或いは好ましくはペプチド化学
において通常用いられる窒素保護基或いはその様
な基から誘導された基を表わす〕。 一般式〔〕で表わされる好ましい化合物は
X1がイオウを表わし、及びX2が窒素を表わすも
のである。R1が水素を表わす一般式（）の化
合物及びR2及びR3が同種又は異種であり、水素、
C1−C2−アルキル、C1−C2−アルコキシ基、ハ
ロゲン、C1−C4−ジアルキルアミノ基或いはベ
ンゼン基を表わすものは更に好ましい。 一般式（）の化合物におけるエステル基は５
−位にあるのが特に好ましい。 その他の本発明に従つて好ましい発色性基質
は、同様に同時係属中の出願に記載されている下
記一般式（）で表される化合物である： 〔式中、X3及びX4はＮ又はCHを表わし（但
し、いずれの場合にもX3或いはX4のいずれかは
Ｎを表わす）、R4、R5及びR6は同種又は異種であ
り、水素、C1−C6−アルキル基、C1−C6アルコ
キシ基、C1−C6−アシル基、ハロゲン、トリフ
ルオロメチル基、ニトロ基、SO3H基、シアノ
基、C1−C8−アシルアミノ基、C1−C6−ジアル
キルアミノ基、或いはC6−C10−アリール基（そ
れらは更にC1−C6−アルキル基、C1−C6−アル
コキシ基、ハロゲン、シアノ基、ニトロ基、トリ
フルオロメチル基、SO3H基、C1−C6−アシル基
或いはC1−C6−ジアルキルアミノ基により置換
されていてもよい）、或いはR5、R6は一緒になつ
て縮合芳香族環好ましくはベンゼン環（それは更
に１個又は２個のR4基により置換されていても
よい）を形成し、及びＡ及びＧは上記一般式
（）の場合に与えられたと同一の意義を有す
る〕。 上記一般式（）に従つた化合物においてX3
は好ましくはCHを表わし、X4は好ましくは窒素
を表わす。同意或いは異種であつてもよいR4、
R5及びR6は好ましくは水素、C1−C4−アルキル
基、C1−C4−アルコキシ基、アシルアミノ基
（酸基は１〜６個の炭素数の脂肪族或いは芳香族
基である）、C1−C4−ジアルキルアミノ基、ニト
ロ基、シアノ基、ハロゲン、或いはアリール基
（場合によりC1−C4−アルキル基、C1−C4−アル
コキシ基、或いはハロゲンで置換されていてもよ
い）を表わす。 特好ましくはR4、R5及びR6は水素、C1−C4−
アルキル基、フエニル基、或いはハロゲン、或い
はR5及びR6は一緒になつて縮合したベンゼン環
を形成する。 本発明に従つた試薬として適当な発色性基質は
又次の一般式で表わされる化合物である： （式中、R4、R5、R6、Ａ及びＧは上記一般式
（）の場合と同一の意味を有する）。 一般式（）、（）及び（）において、Ｇ−
Ａは好ましくは次の一般式を表わす： 〔式中、R7は水素或いは１〜15の炭素原子、
好ましくは１〜９個の炭素原子を有し、場合によ
りヒドロキシル基、メルカプト基或いはカルボキ
シル基により置換されている場合により分岐され
たアルキル基、シクロアルキル基或いはアリール
基を表わし、及びR8は水素、或いは好ましくは
−CO−アルキル、−CO−アラルキル基、−CO−
アリール基、−SO2−アルキル基或いは−SO2−
アリール基を表わし、アルキル基は１〜９個の炭
素数好ましくは１〜６個の炭素数を有する直鎖或
いは分岐鎖のものであり、及びアリール基は好ま
しくは場合によりC1−C4−アルキル基、C1−C4
−アルコキシ基或いはハロゲンにより置換されて
いるベンゼン環を表わす〕。 Ｇ−Ａ−は好ましくは、天然に存在するアミノ
酸或いは２〜８個のその様なアミノ酸のペプチド
で通常の窒素保護基を有する基を表わす。 アミノ酸基はそれらのＬ−或いはＤ−体或いは
それらのラセミ体であり得る。特に好ましい基は
グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロ
イシン、フエニルアラニン及びチロシンであり、
いずれの場合においてもＬ−体が特に好ましい。
存在する任意の遊離ヒドロキシ基はアシル化好ま
しくはアセチル化することができる。 Ａの定義におけるペプチド基は例えばジー、ト
リー、テトラー及びペンタ−ペプチド類、好まし
くはジ−及びトリ−ペプチド類を意味するものと
理解されるべきであり、好ましい使用可能なアミ
ノ酸成分は上記アミノ酸である。 一般式（）、（）、及び（）の基質は対応
するフエノール類と下記一般式： Ｇ−Ａ−OH （式中、Ｇ及びＡは上記意味を有する） 或いはその適当な反応性誘導体とペプチド化学
における常法に従つて反応させることにより得ら
れる。 適当な反応性誘導体の具体例は、通常ペプチド
合成において使用される酸クロリド類及び混合無
水物類例えばエチルクロロホルメート或いは活性
エステル類例えばペンタクロロフエニルエステル
類或いはＮ−ヒドロキシベンゾトリアゾールエス
テル類である。 本発明による試薬はフエノール類と反応する色
形成剤（酵素的切断時に放出）として下記一般式
で表わされるジアゾニウム塩を含有するのが好ま
しい： 〔式中、R1′は低級アルキル基、低級アルコキ
シ基、低級アルキルメルカプト基、ヒドロキシ
基、ニトロ基、シアノ基、トリフルオロメチル
基、C1−C8−アルキルスルホンアミド基、アリ
ールスルホンアミド基、C1−C8−アルキルスル
ホン基、アリールスルホン基、スルホン酸基或い
はカルボン酸基、Ｎ−モルホリノ基、Ｎ−チオモ
ルホリノ基、Ｎ−ピロリジノ基、場合により
N′−アルキル化されたＮ−ピペラジノ基或いは
Ｎ−ピペリジノ基、ハロゲン或いは水素を示し、
R3′は低級アルキル基、低級アルコキシ基、アリ
ールオキシ基、低級アルキルメルカプト基、アル
キルアミノ基或いはジアルキルアミノ基、ヒドロ
キシル基、ニトロ基、シアノ基、C1−C8−アル
キルスルホンアミド基、アリールスルホンアミド
基、C1−C8−アルキルスルホン基、アリールス
ルホン基、スルホン酸基或いはカルボン酸基、Ｎ
−モルホリノ基、Ｎ−チオモルホリノ基或いはＮ
−ピロリジノ基、場合によりN′−アルキル化さ
れたＮ−ピペラジノ基或いはＮ−ピペリジノ或い
はフエニルアミノ基、場合により低級アルキルも
しくは低級アルコキシ基により置換されていても
よいフエニル基、ハロゲン或いは水素を示し、
R′2、R′4及びR′5は同種又は異種であつてもよく
各々低級アルキル基、低級アルコキシ基、ニトロ
基、C1−C8−アルキルスルホンアミド基、アリ
ールスルホンアミド基、C1−C8−アルキルスル
ホン基、アリールスルホン基、スルホン酸基、或
いはカルボン酸基或いは低級アルキルメルカプト
基、ハロゲン或いは水素を表わし、及びＸは安定
化アニオンを示し、いずれの場合においても２個
の隣接基R1′〜R5′が環化して場合によりハロゲ
ン、C1〜C6−アルキル基、C1−C6−アルコキシ
基或いはニトロ基、スルホン酸基或いはカルボン
酸基により置換されていてもよいベンゼン環を形
成し、ナフタレン系列のジアゾニウム塩を形成す
ることが可能である〕。 好ましくは一般式（）において、R1′はC1−
C4−アルキル基、C1−C4−アルコキシ基、ヒド
ロキシル基、ニトロ基、ハロゲン或いは水素を表
わし、R′3はC1−C4−アルキル基、C1−C4−アル
コキシ基、アリールオキシ基、C1−C4−アルキ
ルアミノ基、C1−C4−ジアルキルアミノ基、ニ
トロ基、C1−C4−アルキルスルホンアミド基、
アリールスルホンアミド基、C1−C4−アルキル
スルホン基、アリールスルホン基、Ｎ−モルホリ
ノ基、Ｎ−ピロリジノ基、フエニルアミノ基、或
いはスルホン酸基或いは水素を表わし、及びR′2、
R′4及びR′5は同種又は異種であつてもよくC1−〜
C4−アルキル基、C1−〜C4−アルコキシ基、C1
−〜C4−アルキルアミノ基、C1−〜C4−ジアル
キルアミノ基、ニトロ基、C1−〜C4−アルキル
スルホンアミド基、アリールスルホンアミド基或
いはスルホン酸基、ハロゲン或いは水素を表わ
す。 いずれの場合においても、R′1〜R′5の２つの隣
接基は環化して場合によりハロゲン或いはC1−
〜C4−アルキル或いはC1−〜C4−アルコキシ基
或いはニトロ基或いはスルホン酸基で置換されて
いるベンゼン環を場合により形成することができ
る。 一般式（）において、各場合におけるアリー
ル基は６〜12個の炭素原子、好ましくは６個の炭
素原子を有し、場合によりハロゲン或いはC1−
C4−アルキル基或いはC1−C4−アルコキシ基で
置換されている芳香族基を表わす。 一般式（）のジアゾニウム塩はそれ自体公知
であり、或いはそれらはそれ自体公知である方法
により合成することができる〔フーベン−ウエイ
ル（Houben−Weyl），有機化学法（Methods of
Organic Chemistry），Ｘ／３巻〕。 本発明による蛋白質分解酵素特に白血球酵素検
出用の試薬は、適当な緩衝系を含有するのが好ま
しい。この目的のための可能性のある系として
は、例えばリン酸塩、ホウ酸塩、炭酸塩／重炭酸
塩、炭酸塩、バルビツール酸塩、トリス−（ヒド
ロキシメチル）−アミノメタン（＝トリス）、２−
アミノ−２−メチル−プロパン−１，３−ジオー
ル（＝アメジオール）或いはアミノ酸緩衝液が挙
げられ、PH値及び能力は原則として６〜10、好ま
しくは７〜９のHz値が測定溶液或いは試験片にお
いて確立されるように選ばれる。 本発明に従つた試薬は、促進作用を有する塩類
に加えて、更にそれ自体公知の或はその他の活性
化剤を含有するのが好ましい。適当な活性化剤の
具体例としては、ピリジン誘導体、イミダゾール
化合物、金属錯体、及び特にヨーロツパ特許Ａ−
14929号明細書中に記載されているアルコール類、
ｎ−デカノール、及び就中、ｎ−ウンデカノール
が特に好ましい。酵素的切断反応について従来知
られていなかつた促進剤として、更に、塩基性ア
ミノ酸を含有するホモポリアミノ酸及びコポリア
ミノ酸〔イー・カチヤルスキ（E.Katchaiski）
及びエム・セラ（M.Sela），蛋白質化学の進歩
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アカデミツク・プレス・インコーポレーテツド・
パブリツシヤー（Academic Press Inc.
Publishers），ニユーヨーク，ニユーヨーク
（New York N.Y.）〕及び同時係属中の出願に記
載される逐次配列ポリアミノ酸等が挙げられる。
使用可能な塩基性アミノ酸類は、側鎖にアミノ基
或いはグアニジノ基を有するアミノ酸類である。
これらは、特に、リジン及びオルニチン、並びに
アルギニンであり、又天然蛋白質には存在しない
塩基性アミノ酸、例えばジアミノ酪酸、ジアミノ
プロピオン酸或いはジアミノピメリン酸である。
これらのポリアミノ酸に含有されるアミノ酸類は
ラセミ体或は光学的に活性なＤ−或いはＬ−体の
いずれであつてもよい。ポリアミノ酸の分子量は
1000乃至2000000であり、好ましくは5000乃至
500000である。塩基性アミノ酸の含量は、ポリア
ミノ酸に基き５乃至100モル％、好ましくは20乃
至100モル％である。 本発明に従つた試薬は又、より均質な色分布及
びより強力な着色がそれによつて達成されるの
で、それ自体公知の洗剤を含有することができ
る。カチオン性及びアニオン性洗剤の両者及び両
性非イオン性洗剤も又適当である。具体例として
は、ベンジルジメチル−テトラデシル−アンモニ
ウムクロリド、ドデシル硫酸ナトリウム、ゼフイ
ロール、ポリビニルピロリドン及びヘパリノイ
ド、並びに既に活性化剤として述べたポリアミノ
酸類及び配列重合体等が挙げられる。適当な場合
には、上記二種以上の洗剤を使用することもでき
る。 本発明の試薬において、上記試薬はそれ自体公
知のタイプの不活性担体に含有されるのが好まし
く、特に好ましい担体マトリツクスは多孔性物質
例えば特に紙及びプラスチツク、ガラス繊維マ
ツトで作られた膜（米国特許3846247号明細書）、
多孔性セラミツク片、合成不織布繊維、スポンジ
材料（米国特許3552928号明細書）、フエルト、織
物、木材、セルロース或いはシリカゲルなどであ
る。 この目的のために、上記担体を容易に除去する
ことのできる溶媒例えば水、メタノール、エタノ
ール、アセトン、ジメチルホルムアミド或いはジ
メチルスルホキシドなどの適当な溶媒中の上記試
薬溶液で含浸する。これは、次の２つの工程によ
り行うのが好ましい。この材料を先ず緩衝液及び
その他の水溶性添加剤を含有すする水溶液で含浸
させる。それを次いで一般式（）の発色性酵素
基質及び活性化剤の溶液で含浸する。しかしなが
ら、この含浸は別の順序で行うこともでき、或い
は２つの含浸溶液の異つた組成を用いて行うこと
もできる。好ましくは、含浸溶液或いは検査され
るべき流体は各場合において発色性基質及びジア
ゾニウム塩を10-4〜10-1モル／特に10-3〜10-2
モル／で含有し、塩を0.01M〜2M特に0.1M〜
1Mで含有するのがよい。 紙がマトリツクスとして使用される場合には
仕上げられた試験紙はそのまゝ使用することが可
能であり、或いはそれらを公知の方法で把手に固
着させることができ、或いは例えば西独公開公報
2118455号明細書に従つてプラスチツク及び微細
メツシユ網目構造の間に密封して使用することが
可能である。 膜で被覆された試験片を製造するためには、好
ましくは全ての試薬をフイルム形成性物質、例え
ばポリビニルエステル或いはポリアミドなどの溶
液或いは分散液中に導入し、均一に混合する。こ
の混合物の薄層をプラスチツク製の担体上にハケ
塗りし、乾燥する。乾燥後、この様にして製造さ
れた膜被覆試験片を切断し、そのまゝ或いは公知
の方法で把手に固着し、或いは例えば西独特許公
開公報2118455号明細書に従つたプラスチツク及
び微細網目構造に密封されて使用することができ
る。 エステル分解及び蛋白質分解酵素特に白血球酵
素の検出のための本発明に従つた診断剤は、上記
試験試薬成分に通常の薬学的添加剤を添加し、混
合物を顆粒化することにより粉末混合物或いは試
薬錠剤の形態で形成することができる。この種類
の添加剤の具体例としては、炭水化物例えばモノ
−、オリゴ−或いはポリ−サツカライド類、或い
は糖−アルコール類例えばマンニトール、ソルビ
トール、もしくはキシリトール、或いはその他の
可溶性不活性化合物例えばポリエチレングリコー
ル類もしくはポリビニルピロリドンなどがある。
粉末混合物又は試薬錠剤は例えば約50〜200mg好
ましくは50〜80mgの最終重量を有する。 各場合において、約５〜20mg、好ましくは約10
mgの全重量の凍結乾燥体を調製するために、試験
に必要な全試薬に加えて通常の賦形剤例えばポリ
ビニルピロリドン及び適当であるならばその他の
充填剤例えばマンニトール、ソルビトール或いは
キシリトールなどを含有する溶液が凍結乾燥され
る。 本発明による溶液の形態の診断試薬は、試験に
必要な全ての試薬を含有するのが好ましい。使用
可能な溶媒は、水及び水と水溶性の有機溶媒例え
ばメタノール、エタノール、アセトン、或いはジ
メチルホルムアルデヒドとの混合物である。貯蔵
上の理由から試験に必要とされる試薬を実際の検
査時にのみ一緒に合一される２以上の溶液に試験
に必要な試薬を分割するのが有利である。 この様に調製された診断試薬は、検査されるべ
き体液に浸漬後或いは問題となる体液に添加後に
視覚的に或いは光度測定例えば反射光度測定或い
は細胞内における光度測定により測定することの
できる色形成を介して迅速且つ簡易なエステル分
解及び／又は蛋白質分解酵素特に白血球酵素の存
在の検出を可能にする。細胞当りの白血球酵素の
活性は実質的に一定のパラメーターとしてみなす
ことが出来るので検査される体液の白血球濃度は
色形成の強度から求めることができる。白血球酵
素の活性は白血球の溶解後においても十分に保持
されるので非溶解白血球及び溶解白血球の両者が
本発明の診断試薬を用いて記録される。それによ
り溶解による誤差は生じない。 以下の具体例は本発明を例示するものである。
特に断りのない限り与えられた量は重量部或いは
重量％であると理解されるべきである。 一般的方法 基質に応じて50〜250μlのＮ−メチルピロリド
ンを可溶化剤として2.25mlの塩を含有する使用緩
衝液に添加し、溶液の容量を緩衝液を用いて2.5
mlにした。必要に応じて、１mlのＮ−メチルピロ
リドン中の５〜100mgの追加の活性化剤の溶液5μl
及び１mlの水或いはＮ−メチルピロリドン中の２
mgのドデシル硫酸ナトリウム（SDS）或いは４mg
のその他の洗剤の溶液5μlを次いで反応混合物中
に添加した。十分に撹拌後、Ｎ−メチルピロリド
ン、ジメチルホルムアミド或いはジメチルスルホ
キシド中の10-1モル濃度の蛋白質の溶液5μlを添
加し、白血球懸濁液の添加後述べられた波長にお
ける消失の増大を連続的に追跡した。並行して行
われた白血球の添加のない実験において消失の増
大の助けを借りて、基質の自然加水分解を測定し
た。 反応速度を求めるために、酵素反応において得
られた消失の増大は自然加水分解について求めら
れた値だけ差引いた。基質の切断に対する絶対値
（モル数／分）は、モル消失係数の助けを借りて
消失差から計算することができる。 実施例 １ 紙〔例えばイートン・アンド・ダイクマン
（Eaton and Dikeman）205〕を以下の溶液で逐
次含浸させ、次いで60℃で乾燥させた。 溶液１：0.25Mの塩化ナトリウム及び２％のポリ
ビニルピロリドンを含有する0.1Mトリス
−（ヒドロキシメチル）−アミノメタン／塩
酸緩衝液（PH8.8）。 溶液２：無水アセトン中7.5×10-3モル／のＮ
−トシル−Ｌ−アラニン−５−ヒドロキシ
−１，２−ベンズイソチアゾリルエステ
ル、10-2モル／の２，４−ジメトキシベ
ンゼンチアゾニウムテトラフルオポレート
及び3.5ｇのｎ−ウンデカノール／。 やゝ黄色に着色した試験紙で白血球を含有する
尿に浸漬すると赤褐色になる試験紙が得られる。 実施例 ２ 紙〔例えばイートン・アンド・ダイクマン
（Eaton and Dikeman）205〕を以下の溶液で逐
次含浸させ、次いで60℃で乾燥させた。 溶液１：３％のポリビニルピロリドン及び0.25モ
ルの塩化ナトリウム／を含有する0.1M
ホウ酸塩緩衝液（PH＝9.0）。 溶液２：無水アセトン中に５×10-3モル／のＮ
−トシル−Ｌ−アラニン−３−ヒドロキシ
−５−フエニル−ピロールエステル、10-2
モル／の２−ヒドロキシ−４−スルホ−
ナフチル−ジアゾニウムテトラフルオポレ
ート及び3.5ｇのデカノール／。 白黄色の試験紙であつて白血球を含有する尿に
浸漬すると赤色〜紫色になる試験紙が得られる。 実施例 ３ 10μｇのSDS及び125μｇのｎ−デカノール／試
験バツチを添加した白血球による0.1Mホウ酸塩
緩衝液（PH8.8）或いは0.1Mトリス−（ヒドロキ
シ）−アミノメタン緩衝液（PH8.8）中のＮ−トシ
ル−Ｌ−アラニンインドキシルエステルの切断に
及ぼす塩濃度の影響。
【表】
【表】 実施例 ４ 10μｇのSDS及び125μｇのｎ−デカノール／試
験バツチの存在下における白血球による0.1Mト
リス−（ヒドロキシメチル）−アミノメタン／塩酸
緩衝液（（PH8.8）中のＮ−トシル−Ｌ−アラニン
インドキシルエステルの切断に及ぼす塩濃度の影
響（360nmにおける切断の測定）。
【表】 実施例 ５ 活性化剤及び洗剤の存在下における0.1Mトリ
ス緩衝液（PH8.4）中における白血球によるＮ−
トシル−Ｌ−アラニン−ヒドロキシ−５−フエニ
ル−ピロールエステルの切断に及ぼす塩濃度の影
響（330nmにおける反応速度の測定）。
【表】
【表】
【表】 実施例 ６ 各種活性化剤及び洗剤の存在下における白血球
による炭酸塩緩衝液（PH8.4）中におけるＮ−ト
シル−Ｌ−アラニン−３−ヒドロキシ−５−フエ
ニルピロールエステルの切断に及ぼす塩化ナトリ
ウムの濃度の影響（330nmにおける切断速度の測
定）。
【表】
【表】 実施例 ８ 促進剤としてウンデカノール及び洗剤として
SDSの存在下における白血球による0.1Mホウ酸
塩緩衝液（PH8.4）中におけるＮ−トシル−Ｌ−
アラニン−３−ヒドロキシ−５−フエニル−ピロ
ールエステルの切断に及ぼす塩含量の影響
（320nmにおける切断速度の測定）。
【表】
【表】 Ｎ−トシル−Ｌ−アラニルエステル類の調製に
ついての一般的操作教示事項 エステル類は各場合において粉末化された炭酸
カリウムの存在下において無水メチルエチルケト
ン或いは無水トルエン中においてＮ−トシル−Ｌ
−アラニルクロリドとフエノール類を反応するこ
とにより調製された。約55℃において６〜12時間
撹拌した後40〜70％のフエノールが反応した。フ
エノール対K2CO3対酸クロリドのモル比は通常
１：1.5：1.5であつた。PH値は全反応時間を通し
て約７であつた。仕上げを行うに際し、炭酸カリ
ウムを約50℃で別し、次いで溶媒を真空蒸留に
より除去した。生成物をシリカゲル−溶出液（石
油エーテル：アセトン＝約９：１）によるカラム
クロマトグラフイー及び引続いて再結晶により精
製した。 Ｌ−ｐ−トシルアラニン 文献：フイツシヤー（E.Fischer）及びリプシツ
ツ（W.Lipschitz），B.48，362（1915）。 83.7ｇ（0.93モル）のＬ−アラニンを465mlの
約2Nの水酸化ナトリウム溶液に溶解する。186ｇ
（0.976モル）のｐ−トルエンスルホニルクロリド
をこの溶液に少しずつ70〜72℃において20分間に
亘つて添加する。スルホニルクロリドの添加の最
中に反応液は自動滴定器を用いて約2Nの水酸化
ナトリウム溶液でPH10に保たれる。ここにおいて
560mlの2N水酸化ナトリウム溶液が消費される。
反応液のPHが最早変化しない時点において、反応
液を15〜５℃に冷却し、37％強度の塩酸を用いて
PH３にする。分離した生成物を吸引により別
し、湿潤した過ケーキを2350mlの水から再結晶
する。収率：融点132〜135℃の185.5ｇ（理論値
の82％）のＬ−ｐ−トシルアラニン。 ｐ−トシル−Ｌ−アラニルクロリド 158.1ｇ（0.65モル）のｐ−トシル−Ｌ−アラ
ニンを350mlのチオニルクロリド中において40℃
で透明な溶液が形成されるまで撹拌する。過剰の
チオニルクロリドを次いで水ポンプ真空下に留去
する。フラスコ中の残渣を300mlの蒸留トルエン
中に入れる。透明なやゝ黄色を帯びた溶液が得ら
れ、これを撹拌した900mlのリグロイン中に注入
する。酸クロリドが析出する。次の日、それを吸
引過し、軽ガソリンで洗浄し、真空乾燥器内に
おいて、塩化カルシウム／水酸化カリウム上で乾
燥する。収率：155ｇ（理論値の91％）の殆んど
無色の結晶。融点81〜83℃。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １ (a) 発色性酵素基質として、フエノール類の
    アミノ酸エステル又はペプチドエステル、及び (b) 成分(a)のアミノ酸エステル結合又はペプチド
    エステル結合の酵素的切断を促進する物質とし
    て、Li+，Na+，K+及びMg++からなる群から
    選択されたカチオン並びに、ハロゲン化物、擬
    ハロゲン化物、硫酸塩、リン酸塩、酢酸塩、ト
    リフルオロ酢酸塩、スルホン酸塩及びコハク酸
    塩からなる群から選択されたアニオンを有する
    塩を、0.05M〜2M含むことを特徴とするエス
    テル分解酵素及び／又は蛋白質分解酵素検出用
    試薬。 ２ 1000〜2000000の分子量を有するポリペプチ
    ドを追加の促進物質として含有する特許請求の範
    囲第１項に記載の試薬。 ３ ポリペプチドが、１種類のアミノ酸から構成
    されているか、２種以上の異つたアミノ酸がラン
    ダムに配列して構成されているか、或いは２種以
    上の異つたアミノ酸が繰返しのアミノ酸配列で構
    成されている特許請求の範囲第２項に記載の試
    薬。 ４ ポリペプチドが、下記一般式で表わされるア
    ミノ酸から構成されている特許請求の範囲第３項
    記載の試薬： （式中、Ｒは水素或いは１〜15の炭素数を有
    し、１個或いは２個のヒドロキシル基、メルカプ
    ト基、カルボキシル基、アミノ基又はグアニジノ
    基により置換されていてよいアルキル基、シクロ
    アルキル基又はアラルキル基を表わす）。 ５ ポリペプチドの５〜100モル％のアミノ酸単
    位が、塩基性基を有する特許請求の範囲第３項に
    記載の試薬。 ６ 試薬が、不活性な担体に包含されている特許
    請求の範囲第１項に記載の試薬。
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