NO171072B

NO171072B - Middel for paavisning av esterolytiske eller proteolytiskeenzymer samt anvendelse av midlet

Info

Publication number: NO171072B
Application number: NO851142A
Authority: NO
Inventors: Eugen Schnabel; Christopher Skjold; James Travis
Original assignee: Miles Inc
Priority date: 1984-04-06
Filing date: 1985-03-21
Publication date: 1992-10-12
Also published as: ES8607400A1; FI86204B; AU4036285A; ES541869A0; ATE73500T1; ZA852269B; EP0158225A3; FI851352A0; FI86204C; IE850868L; DE3413118A1; EP0158225B1; NO851142L; JPH0550279B2; DK154685D0; EP0158225A2; CA1263591A; DE3585548D1; CA1263591C; AU560315B2

Description

Foreliggende oppfinnelse angår et middel for påvisning av esterolytiske eller proteolytiske enzymer.

Oppfinnelsen angår også anvendelsen av dette middel.

Midlene ifølge oppfinnelsen inneholder kromogene enzym-substrater (aminosyre- eller peptidestere av egnede fenoler) og eventuelt diazoniumsalter som kobles med fenolene under farvedannelse, samt salter som virker som akseleratorer for den enzymatiske spalting av aminosyre- henholdsvis peptid-esteren.

Oppfinnelsen finner særlig anvendelse ved påvisning av leukocytter, spesielt i urin.

Ved diagnose av sykdommer i nyrene og urogenitaltrakten er påvisningen av leukocytter i kroppsvæskene, spesielt i urinen, av stor betydning. Opprinnelig foregikk denne påvisningen ved telling av leukocyttene i usentrifugert urin eller i urinsediment. Ved begge fremgangsmåtene kan man bare fastslå intakte leukocytter. Det er likevel kjent at hastigheten for leukocytt-lysen er underkastet store variasjoner avhengig av urinmiljøet; i sterkt alkalisk urin er for eksempel leukocytt-halveringstiden bare 60 minutter. Dette medfører at det fastsettes for lave leukocytt-tall. Bortsett fra denne lyse-feilen gir den kvantitative mikroskopiske bestemmelsen av leukocytter i usentrifugert, homogenisert urin i tellekammeret meget nøyaktige verdier. Likevel anvendes disse fremgangsmåtene sjelden i praksis fordi de er arbeids- og tidkrevende og krever trenet personale.

Den fremgangsmåten til leukocytt-bestemmelsen i urin som foretrekkes i medisinsk praksis har derfor hittil vært den såkalte synsfeltmetoden i urinsediment. Først må prøven (sedimentet) utvinnes ved sentrifugering. Derved anrikes imidlertid også andre bestanddeler i urinen for eksempel salter og epitelceller - som gjør den mikroskopiske tellingen av leukocyttene betraktelig vanskeligere. Varierende sedimentinnhold, inhomogeniteter i sedimentet samt forskjel-lig optisk utstyr på mikroskopene medførte relativt store feil (opptil flere hundre prosent) ved angivelse av leukocytt-tallene.

For å unngå disse vanskelighetene er det gjort mange forsøk på å knytte påvisningen av leukocyttene i forskjellige kroppsvæsker til enzymatiske reaksjoner, fordi leukocyttene har et bredt enzymspektrum.

Innretninger til påvisning av leukocytter i kroppsvæsker er for eksempel kjent fra DE-OS 2 826 965 og 2 836 644, hvor esterolytisk og/eller proteolytisk aktivitet som finnes i leukocyttene benyttes for analytiske formål. Som substrat for leukocytt-esterasene og/eller -proteasene anvendes sulfonftaleinester eller azo-farvestoffrester. De farvestof-fene som settes fri ved den enzymatiske omsetningen bestemmes så ved kjente fremgangsmåter. Innretningene som beskrives i de nevnte publikasjoner er for lite følsomme for praktiske formål siden de ved lave leukocytt-konsentrasjoner viser for lange reaksjonstider.

Forskjellige fremgangsmåter til påvisning av proteaser og esteraser er også kjent fra den histo- og cytokjemiske enzymologien (se for eksempel A.G.E. Pearse, "Histochemistry, Theoretical and Applied", 3. utgave, Churchill Livingstone, Edinburgh-London-New York 1968). Til påvisning anvendes generelt farveløse eller svakt farvede estere, som av enzymet spaltes til en farveløs syre og eventuelt farveløs alkohol-(fenol)-komponent. Fenol-komponenten omsettes så i en følgereaksjon til farvede produkter, for eksempel ved kobling til diazoniumsalter eller ved oksydasjon. F. Schmalzl og H. Braunsteiner beskrives for eksempel i "Klin. Wschr.", 46, 642

(1968) en spesifikt cytokjemisk leukocytt-påvisning med naftol-AS-D-kloracetat som substrat og et diazoniumsalt som danner en farvet azo-forbindelse med den frigitte naftolen. For rask og enkel påvisning av leukocytter i kroppsvæsker som for eksempel urin, viser to komponentsystemer av denne type seg ikke å være egnet fordi de er altfor ufølsomme; prøver med 5000 leukocytter/pl viser fremdeles ingen reaksjon.

I GB-A 1 128 371 og EP-A 12 957 beskrives anvendelsen av indoksyl- og tioindoksylestere som kromogene substrater for påvisning av hydrolytiske enzymer i kroppsvæsker. Ved den enzymatiske spaltingen av substratet oppstår fritt indoksyl, som deretter oksyderes til det lett påviselige blå farvestof-fet indigo. En kommersielt tilgjengelig forsøksinnretning på basis av EP-A 12 957 består av en strimmel filterpapir som er impregnert med N-tosyl-L-alanin-indoksylester. Ved dypping i en urinprøve som inneholder leukocytter farves denne forsøksstrimmelen blå. En vesentlig ulempe ved dette produktet er den lange ventetiden (ca. 15 minutter) inntil sluttfarven er nådd og resultatet kan avleses.

I EP-A 14 929 beskrives forskjelligartede akseleratorer (pyridinderivater; imidazolderivater; alkoholer; metallkomplekser) for den enzymatiske spaltingsreaksjonen. Ulemper er den relativt lange tiden en fullstendig oksydasjon av indoksyl tar og fremgangsmåtens dårlige følsomhet (påvis-ningsgrense: noen tusen leukocytter/pl). Det samme gjelder også for anvendelsen av estere av leuko-indoaniliner som substrat for leukocytt-enzymet ifølge EP-A 34 323. EP-A 39 880 foreslår en kombinasjon av substratet ifølge EP-A 12 957 eller 14 929 med det ovenfor diskuterte påvisningsprinsippet med kobling til diazoniumsalter. På denne måten lykkes det riktignok å senke påvisningsgrensen for leukocytter betydelig, likevel oppnås ikke den påvisningsnøyaktighet som ønskes ved praktisk anvendelse på 15-20 leukocytter/pl.

En oppgave ved foreliggende oppfinnelse er derfor å finne frem til nye aktivatorer for esterspaltende enzymer som ved en akselerering av den enzymatiske spaltingen av substratet ved hjelp av leukocytt-enzymer muliggjør en følsom og rask påvisning av leukocytter i urin. Denne oppgaven løses ved tilsetning av salter til reagenssystemet.

Det er overraskende funnet at spaltingen av det kromogene substratet ved leukocytt-enzymer akselereres betydelig ved salttilsetning, henholdsvis at virkningen av tilstedeværende aktivatorer i forsøkssystemet forsterkes.

I henhold til dette angår foreliggende oppfinnelse et middel for påvisning av esterolytiske eller proteolytiske enzymer, inneholdende (a) en aminosyreester eller peptidester av en fenol, som det kromogene enzymsubstratet, og (b) fra 0,05 M til 2 M av et stoff som akselererer den enzymatiske spalting av aminosyreester- eller peptidesterbindingen av komponent (a), samt eventuelt buffer, diazoniumsalt, N-dekanol eller n-undekanol og polyvinylpyrrolidon, og en polyaminosyre, og midlet karakteriseres ved at stoffet er et salt som har et kation valgt fra gruppen bestående Li<+>, Na<+>, K<+> og Mg<++> og et anion valgt fra gruppen bestående av halogenid, pseudohalogenid, sulfat, fosfat, acetat, trifluoracetat, sulfonat og succinat.

Oppfinnelsen angår i tillegg anvendelsen av et middel som beskrevet ovenfor for påvisning av esterolytiske eller proteolytiske enzymer i en flytende prøve, hvor den flytende prøven bringes i kontakt med middelet og farvereaksjonen som opptrer bestemmes.

Gjenstanden for foreliggende oppfinnelse finner særlig anvendelse i en innretning for påvisning av esterolytiske og/eller proteolytiske enzymer, og som inneholder

(a) en aminosyre- eller peptidester av en fenol som

kromogent enzymsubstrat,

(b) et stoff som akselererer den enzymatiske spaltingen av aminosyre- eller peptidesterforbindelsen i

komponent (a), eventuelt

(c) et diazoniumsalt, eventuelt

(d) en buffer, samt eventuelt

(e) en bærer og/eller vanlige tilsetningsstoffer,

der det som akselererende stoff, eventuelt sammen med andre aktivatorer, anvendes et salt.

Salter som virker akselererende er spesielt salter av én-eller toverdige kationer av alkali- og jordalkalimetaller, som for eksempel Li<+>, Na<+>, K<+> og Mg<++>. Foretrukne anioner for de aktiverende saltene er én-, to- "eller treverdige organiske eller uorganiske anioner. Spesielt kan nevnes halogenider og pseudohalogenider, sulfater og fosfater samt ioner av organiske syrer som eddiksyre, trifluoreddiksyre, toluensulfonsyre og ravsyre.

Konsentrasjonen av saltet i forsøksoppløsningen ligger fortrinnsvis mellom 0,05 molar og 2 molar, spesielt mellom 0,1 og 1 molar.

Ved den sammensetningen som benyttes for impregnering av bærerene (ved fremstillingen av forsøksinnretningen som beskrives nedenfor) oppløses saltene fortrinnsvis i mengder på fra 0,01 molar til 2 molar, spesielt fra 0,1 til 1 molar.

De saltene som ifølge oppfinnelsen benyttes akselererer den enzymatiske spaltingen av de substratene som beskrives i EP-A 7407, 8428, 12 557, 14 929, 34 323 og 39 880 ved leukocytt-enzymene, og også spaltingen av de substratene som er beskrevet tidligere [G. Gomori, "J. Histochem. Cytochem." 6, 469 (1953); E. Loffler, "Klin. Wochenschr. "39, 1120 (1961);

L. Visser og E. Blout, "Fed. Proe." 28, 407 (1969) samt

"Biochim. Biophys. Acta" 268. 257 (1972) og R. Sweetman og L. Ornstein, J. Histochem. "Cytochem." 23, 327 (1974)]. Til de foretrukne kromogene substratene i innretningene ifølge oppfinnelsen hører også forbindelser med den generelle formel

hvor

X]_ og X2 kan være like eller forskjellige og stå for nitrogen eller svovel, under den forutsetning av X^ og X2 ikke samtidig står for svovel;

Ri står for hydrogen eller en eventuelt forgrenet C^.g-alkylgruppe, som eventuelt kan være substituert med halogen-eller hydroksygrupper,

R2 og R3 kan være like eller forskjellige og stå for hydrogen, C]__g-alkylgrupper, C]__5-alkoksygrupper, C^.g-acylgrupper, halogen, trifluormetyl, nitro-, SO3H-, cyano-, Ci-g-acylaminogrupper, .g-dialkylaminogrupper eller Cg_10-arylgrupper, som videre kan være substituert med C]__g-alkylgrupper, _g-alkoksygrupper, halogen-, cyano-, nitro-, trifluormetyl-, SO3H-, C^.g-acylgrupper eller Cx.g-dialkylaminogrupper, eller R2 og R3 sammen kan danne en påkondensert aromatisk ring, fortrinnsvis en benzenring, som igjen kan være substituert med én eller to rester R2;

A står for en aminosyre- eller peptidrest, og

G står for hydrogen eller fortrinnsvis en i peptidkjemien vanlig, eller derav avledet, nitrogen-beskyttelsesgruppe.

Foretrukne forbindelser av generell formel (II) er slike hvor X± står for svovel og X2 står for nitrogen. Foretrukket er videre forbindelser av formel (II) hvor står for hydrogen og slike hvor R2 og R3, som kan være like eller forskjellige, står for hydrogen, C1.2-alkyl, C1.2-alkoksy, halogen, C^.^<->dialkylaminogrupper eller benzenrester.

Spesielt foretrukket er det ved forbindelser av formel (II) at esterresten står i 5-posisjon.

Andre kromogene substrater som foretrekkes ifølge oppfinnelsen er forbindelser med den generelle formel

hvor

X3 og X4 står for N eller CH, under den forutsetning at i ethvert tilfelle enten X3 eller X4 står for N,

R4, R5 og Rg er like eller forskjellige og står for hydrogen, Ci_g-alkylgrupper, Cx.g-alkoksygrupper, C^.g-acylgrupper, halogen, f luormetyl, nitro-, SO3H-, cyano-, C]__ g-acylamino-grupper, C^g-dialkylaminogrupper eller Cg_1o-ary19ruPPer» som igjen kan være substituert ved _g-alkylgrupper, C^.g-alkoksygrupper, halogen, cyano-, nitro-, trifluormetyl, SO3H-, Ci.g-acylgrupper eller C1.g-dialkylaminogrupper, eller R5 og Rg sammen kan danne en pakondensert aromatisk ring, fortrinnsvis en benzenring, som igjen kan være substituert med én eller to rester R4; og

A og G har de ved formel (II) angitte betydninger.

I forbindelsene ifølge den generelle formel (III) står fortrinnsvis X3 for CH og X4 for nitrogen. Fortrinnsvis betyr R4, R5 og Rg, som kan være like eller forskjellige, hydrogen, C1.4-alkyl, C1_4-alkoksy, acylamino- (hvor syreresten kan være alifatisk eller aromatisk med 1-6 atomer), Ci_4-dialkylamino-, nitro-, cyano-, halogen samt aryl, som eventuelt kan være substituert ved Ci_4-alkyl, Ci_4-alkoksy- eller halogen.

Spesielt foretrukket er R4, R5 og Rg, C1.4-alkyl, fenyl eller halogen, eller R5 og Rg danner sammen en påkondensert benzenring.

Som kromogent substrat for innretningene som beskrevet egner seg videre forbindelser av generell formel

hvor R4, Rg, A og G har de ved formel (III) angitte betydninger .

I de generelle formlene (II), (III) og (IV) står G - A - fortrinnsvis for en rest av generell formel

hvor

R7 står for hydrogen eller en eventuelt forgrenet alkyl-, cykloalkyl- eller arylrest med 1-15 C-atomer, fortrinnsvis 1-9 C-atomer, som eventuelt kan være substituert med en hydroksy-, en merkapto- eller en karboksylgruppe, og

Rg står for hydrogen eller fortrinnsvis -CO-alkyl, -C0-aralkyl, -CO-aryl, -SC^-alkyl eller -S02-aryl, hvor alkyl-resten kan være rettkjedet eller forgrenet med 1-9 C-atomer, fortrinnsvis 1-6 C-atomer og arylresten fortrinnsvis er benzolringer som eventuelt kan være substituert med C^_4~ alkylgrupper, C^-4-alkoksygrupper eller halogen.

Spesielt foretrukket står G-A- for en rest av en naturlig aminosyre eller et peptid av 2 til 8 slike aminosyrer som er utstyrt med en vanlig nitrogenbeskyttelsesgruppe.

Aminosyrerestene kan foreligge i L- eller D-form eller også i sin racemiske form. Spesielt foretrukket er rester av glysin, alanin, valin, leucin, isoleucin, fenylalanin og tyrosin, i ethvert tilfelle er L-formen spesielt foretrukket. Eventuelt tilstedeværende frie hydroksygrupper kan være acylert, fortrinnsvis acetylert.

Under en peptidrest i definisjonen av A er å forstå for eksempel di-, tri-, tetra- og pentapeptid, fortrinnsvis di-og tripeptid, hvor de ovenfor nevnte aminosyrene fortrinnsvis kommer i betraktning som aminosyrekomponenter.

Substratene av generelle formler (II), (III) og (IV) oppnås ved at man omsetter de tilsvarende fenolene med aminosyrer eller peptider av generell formel

hvor G og A har den ovenfor angitte betydning, eventuelt

egnede reaktive derivater derav etter vanlige fremgangsmåter innen peptidkjemien.

Egnede reaktive derivater er for eksempel syrekloridene og de blandingsanhydridene som vanligvis benyttes ved peptidsyn-tesen, for eksempel med klormaursyreetylester, eller aktiv ester som for eksempel pentaklorfenylester eller N-hydroksy-benztriazolester.

Innretningene ifølge oppfinnelsen inneholder fortrinnsvis som farvedanner som reagerer med fenoler (som settes fri ved den enzymatiske spaltningen), diazoniumsalter av generell formel

hvor

R' står for en lavere alkyl-, en lavere alkoksy-, en lavere alkylmerkapto-, en hydroksy-, nitro-, cyano-, trifluormetyl-, C]__g-alkylsulf onamido-, arylsulfonamido- , C^.g-alkylsulfon- , arylsulfon-, sulfonsyre-, karbonsyre-, en N-morfolino-, en N-tiomorfolino-, en N-pyrrolidino-, en eventuelt N'-alkylert N-piperazino-, en N-piperidinogruppe, halogen eller hydrogen,

R'3 står for en lavere alkyl-, en lavere alkoksy-, en aryloksy-, en lavere alkylmerkapto-, alkylamino-, dialkyl-amino-, en hydroksy-, nitro-, cyano-, C^.g-alkylsulfonamido-, arylsulfonamido-, C^.g-alkylsulfon-, arylsulfon-, sulfonsyre- , karbonsyre-, en N-morfolino-, N-tiomorfolino-, N-pyrrolidino-, en eventuelt N'-alkylert N-piperazino, N-piperidino-, fenylamino-, en eventuelt med en lavere alkyl-eller lavere alkoksyrest substituert fenylgrupe, halogen eller hydrogen.

R<*>2» R'4» R'5 som kan være like eller forskjellige, står alle for en lavere alkyl-, en lavere alkoksy-, nitro-, C^_g-alkylsulfonamido-, arylsulfonamido-, C^.g-alkylsulfon-, arylsulfon-, sulfonsyre-, karbonsyre-, en lavere alkylmer-kaptogruppe, halogen eller hydrogen og

X står for et stabiliserende anion,

hvor i hvert tilfelle 2 naborester i gruppen R'^ til R»5 kan være ringsluttet til en eventuelt med halogen, en C^_^,-alkyl-, en Ci_£,-alkoksy-, en nitro-, sulfonsyre- eller karbonsyregruppe substituert benzenring, slik at det oppstår et diazoniumsalt av naftalinrekken.

Fortrinnsvis står i den generelle formelen (IV)

R'l for C^_4-alkyl, C^_4-alkoksy, hydroksy, nitro, halogen eller hydrogen,

R'3 for en C^_4-alkyl-, Ci_4-alkoksy-, aryloksy-, C^_4-alkylamino-, Ci_4-dialkylamino-, nitro-, C^_4-alkylsulfon-amido-, arylsulfonsamido-, Ci_4-alkylsulfon-, arylsulfon-, N-morfolino-, N-pyrrolidino-, fenylamino- eller sulfonsyregruppe eller hydrogen, og

R<*>2' R'4» R'5 som kan være like eller forskjellige, for C^_^-alkyl-, <C>i_4~alkoksy-, C^_4-alkylamino-, C^_4~dialkylamino-, nitro-, Ci_4-alkylsulfonamido-, arylsulfonamido- eller sulfonsyregrupper, halogen eller hydrogen.

To og to naborester R' 1 til R'5 kan eventuelt være ringsluttet til en eventuelt med halogen, en Ci_4-alkyl-, C^_4~ alkoksy-, en nitro- eller sulfonsyregruppe-substituert benzenring.

Innenfor rammen av formel (V) står aryl i ethvert tilfelle for en aromatisk rest med 6 til 12 C-atomer, fortrinnsvis 6 C-atomer, som eventuelt kan være substituert med halogen, en Ci_4~alkyl eller C^-alkoksygruppe.

Diazoniumsaltene av den generelle formel (V) er i og for seg kjente og kan syntetiseres etter kjente fremgangsmåter (Houben-Weyl, "Methoden der organischen Chemie", bind X/3).

Fortrinnsvis inneholder innretningen som beskrevet til påvisning av proteolytiske enzymer og spesielt leukocytt-enzymet, et egnet buffersystem. For dette formål kommer for eksempel fosfat-, borat-, karbonat/hydrogenkarbonat-, karbonat-, barbiturat-, tris-(hydroksymetyl)-aminometan-(=tris), 2-amino-2-metylpropandiol-l,3-(=amediol)- eller aminosyrebuffer på tale, hvor man som regel velger pH-verdien og kapasiteten slik at det innstiller seg en pH-verdi i måleoppløsningen, henholdsvis på forsøksstrimmelen, på 6-10, fortrinnsvis 7-9.

Fortrinnsvis inneholder innretningene ved siden av salter som virker akselererende også andre aktivatorer, som til dels prinsipielt er kjent. Eksempler på egnede aktivatorer er de pyridinderivater, imidazolforbindelser, metallkomplekser og spesielt alkoholer som beskrives i EP-Å 14 929, hvor n-dekanol og fremfor alt n-undekanol er spesielt foretrukket. Dertil kan også nevnes hittil ukjente akseleratorer for den enzymatiske spaltningsreaksjonen for homo- og ko-polyaminosyrer som inneholder basiske aminosyrer [E. Katchalski og M. Sela i "Ådvances of Protein Chemistry" 13, 143-492 (1958); C.B. Anfinsen, M.L. Anson, J.T. Edsall og K. Bailey (Hrsg.); Academic Press Inc. Publishers, New York, N.Y.] samt sekvensielle polyaminosyrer.

Som basiske aminosyrer kommer slike aminosyrer som bærer amino- eller guanidinogrupper i sidekjedene på tale. Dette er spesielt i lysin og ornitin samt arginin, men også i basiske aminosyrer som ikke forekommer i naturlige proteiner som for eksempel diaminosmørsyre, diaminopropionsyre eller diaminipimelinsyre. De aminosyrene som inneholdes i polyaminosyrene kan være racemisk eller optisk aktivt i D-eller L-form. Molekylvektene for polyaminosyrene ligger mellom 1000 og 2 000 000, fortrinnsvis mellom 5000 og 500 000. Innholdet av basiske aminosyrer utgjør mellom 5 og 100 mol-#, fortrinnsvis 20 til 100 mol-#, beregnet på basis av polyaminosyren.

Innretningen kan også inneholde i og for seg kjente detergenser, da man derved kan oppnå en mer homogen farvefordeling og en mer intens farvedannelse. På tale kommer både kationak-tive og anionaktive detergenser, og også amfotære ikke-ioniske detergenser. Som eksempler på slike kan nevnes benzyl-dimetyl-tetradecyl-ammoniumklorid, natrium-dodecylsul-fat, zefirol, polyvinylpyrrolidon, heparinoid samt de polyaminosyrer og sekvenspolymerer som allerede er oppført som aktivatorer. Eventuelt kan også blandinger av to eller flere av de ovenfor angitte detergenser benyttes.

Fortrinnsvis inkorporeres de forskjellige ovenfor beskrevne reagenser i innretningen i en inert bærer på i og for seg kjent måte, hvor det som bæreren fortrinnsvis anvendes porøse materialer, spesielt for eksempel filterpapir, men også kunststoffmembraner, glassfibermatter (US-PS 3 846 247), porøse keramikkstrimler, kunstfiberull, svampaktige materialer (US-PS 3 552 928), filt, tekstiler, tre, cellulose eller også silikagel.

De nevnte bærere impregneres for dette formål med en oppløsning av de ovenfor nevnte reagenser i et egnet lett fjernbart oppløsningsmiddel som vann, metanol, etanol, aceton, DMF eller DMSO. Fortrinnsvis foregår dette i to adskilte trinn: Først impregneres det med en vandig oppløsning som inneholder bufferen og andre vannoppløselige tilsetningsstoffer. Deretter impregneres det med en oppløsning av det kromogene enzymsubstratet av generell formel (V) og aktivatorene. Impregneringen kan imidlertid også gjennomføres i en annen rekkefølge eller med en annen sammensetning av begge impregneringsoppløsningene. Fortrinnsvis inneholder impregneringsoppløsningen eller den væsken som skal undersøkes det kromatogene substratet og diazoniumsaltet begge i konsentrasjoner på 10"^ til IO-<1 >mol/l, spesielt 10~<3> til 10~<2> mol/l, og saltet i en konsen-trasjon på fra 0,01 molar til 2 molar, spesielt fra 0,1 molar til 1 molar.

Ved anvendelse av filterpapir som matriks kan de ferdige forsøkspapirene anvendes som sådanne, eller på kjent måte klebes til gripestykker eller fortrinnsvis forsegles mellom kunststoffer og finmaskede nettverk, for eksempel ifølge DE-OS 2 118 455.

For fremstilling av filmbelagte forsøksstrimler tilsettes fortrinnsvis alle reagensene til oppløsningen eller disper-sjonen av et filmdannende stoff, for eksempel polyvinylester eller polyamid, og blandes til homogenitet. Blandingen strykes i tynne sjikt på en kunststoffbærer og tørkes. De slik fremstilte filmbelagte forsøksstrimlene deles etter tørkingen opp og kan anvendes som sådanne eller på kjent måte klebes til gripestykker eller for eksempel forsegles mellom kunststoffer og finmaskede nettverk ifølge DE-OS 2 118 455.

En diagnostisk innretning for påvisning av esterolytiske og/eller protolytiske enzymer, spesielt leukocyttenzymer, lar seg fremstille i form av pulverblandinger eller reagens-tabletter ved at de ovenfor angitte bestanddelene i forsøks-innretningen blandes med vanlige galeniske tilsetningsstoffer og granuleres. Tilsetningsstoffer av denne typen er for eksempel kullhydrater som mono-, oligo- eller polysakkarid, eller sukkeralkoholer som mannit, sorbit eller xylit, og andre oppløselige inerte forbindelser som polyetylenglykol eller polyvinylpyrrolidon. Pul verblandingene eller reagens-tablettene oppviser for eksempel en sluttvekt på ca. 50-200 mg, fortrinnsvis 50-80 mg.

Til fremstilling av lyofile preparater med totalvekt på ca. 5-20 mg, fortrinnsvis ca. 10 mg, frysetørres en oppløsning som ved siden av samtlige reagenser som er nødvendige for undersøkelsen, inneholder vanlige gitterdannere som for eksempel polyvinylpyrrolidon, og eventuelt andre fyllstoffer som for eksempel mannit, sorbit eller xylit.

En diagnostisk innretning i form av en oppløsning som anvender oppfinnelens middel, inneholder fortrinnsvis samtlige reagenser som er nødvendige for undersøkelsen. Som oppløsningsmiddel kommer vann og blandinger av vann med et vannløselig organisk oppløsningsmiddel som metanol, etanol, aceton eller dimetylformamid, på tale. Av holdbarhetsgrunner kan det være fordelaktig å fordele de reagensene som trengs for undersøkelsen i to eller flere oppløsninger som først blandes sammen ved den egentlige undersøkelsen.

De diagnostiske innretningene fremstilt på denne måten muliggjør, etter neddykking i, eller tilsetning av, den kroppsvæsken som skal undersøkes, rask og enkel påvisning av nærværet av esterolytiske og/eller proteolytiske enzymer, spesielt leukocyttenzymer, ved hjelp av en farvedannelse, som kan måles visuelt eller fotometrisk, for eksempel remisjons-fotometrisk eller i en kyvette. Fordi aktiviteten av leukocyttenzymet pr. celle kan betraktes som en i det vesentlige konstant størrelse, gir intensiteten av farvedann-elsen leukocyttkonsentrasjonen i den undersøkte kroppsvæsken. Derved omfattes både intakte og lyserte leukocytter ved den diagnostiske innretningen, fordi aktiviteten av leukocyttenzymet opprettholdes fullstendig også etter lysering av leukocytten. Følgelig opptrer ingen lyseringsfeil.

De følgende eksempler tjener til beskrivelse av foreliggende oppfinnelse. Når ikke annet er angitt skal det ved mengde-angivelsene forstås vektdeler eller vektprosent.

Generell fremgangsmåte

Til 2,25 ml av den aktuelle bufferen som inneholder saltet tilsettes alt etter substratet 50-250 pl N-metylpyrrolidon som oppløsningsformidler og volumet av oppløsningen økes til 2,6 ml med buffer. Deretter ble det eventuelt tilsatt 5 pl av en oppløsning av 5-100 mg ekstra aktivatorer i 1 ml N-metylpyrrolidon samt 5 pl av en oppløsning av 2 mg natrium-docecylsulfat (SDS) henholdsvis 4 mg av de andre detergensene i 1 ml vann, eller N-metylpyrrolidon til reaksjonsblandingen. Etter omhyggelig blanding ble det tilsatt 5 pl av en IO-<1 >molar substratoppløsning i N-metylpyrrolidon, dimetylformamid eller dimetylsulfoksid til reaksjonsoppløsningen, og etter tilsetning av leukocyttsuspensjonen ble ekstinksjonsøkningen ved den angitte bølgelengden fulgt kontinuerlig. Spontanhydrolysen av substratet bestemmes i et parallellforsøk uten leukocytttilsats ved hjelp av ekstinksjonsøkningen.

For bestemmelse av omsetningshastigheten reduseres den ekstinksjonsøkningen som oppnås ved enzymreaksjonen med den verdi som finnes for spontanhydrolysen. Absoluttverdier for substratspaltingen (mol min.-<*>) kan beregnes fra ekstink-sjonsforskjellene ved hjelp av de molare ekstinksjonskoeffi-sientene.

Eksempel 1

Filterpapir (for eksempel "Eaton og Dikeman 205") impregneres etter hverandre med følgende oppløsninger og tørkes deretter ved 60°C.

Oppløsning 1; 0,1 M tris-(hydroksymetyl)-aminometan-saltsyre-buffer (pH 8,8), som inneholder 0,25 M natriumklorid og 3# polyvinylpyrrolidon.

Oppløsning 2: 7,5 • 10~<3> mol/l N-tosyl-L-alanin-5-hydroksy-1,2-benzisotiazolylester, 10~<2> mol/l 2,4-dimetoksybenzol-diazonium-tetrafluoroborat og 3,5 g n-undekanol/1 i vannfri aceton.

Man får et svakt gult farvet forsøkspapir som ved neddykking i leukocyttholdig urin farves rødbrunt.

Eksempel 2

Oppløsning 1: 0,1 M boratbuffer (pH = 9,0), som inneholder 356 polyvinylpyrrolidon og 0,25 mol/l natriumklorid.

Oppløsning 2: 5 • 10-<3> mol/l N-tosyl-L-alanin-3-hydroksy-5-fenyl-pyrrolester.

Oppløsning 3: 10~<2> mol/l 2-hydroksy-4-sulfo-naftyldiazonium-tetrafluoroborat og 3,5 g dekanol/1 i vannfri aceton.

Man får et svakt gulfarvet forsøkspapir som ved neddykking i leukocyttholdig urin farves rødt til fiolett.

Eksempel 3

Innflytelsen av saltkonsentrasjonen på spaltingen av N-tosyl-L-alanin-indoksylester i 0,1 M boratbuffer (pH 8,8) henholdsvis 0,1 M tris-(hydroksymetyl )-aminometanbuffer (pH 8,8) med leukocytter ved tilsetning av 10 jjg SDS og 125 jjg n-dekanol/- forsøksenhet.

Eksempel 4

Innflytelsen av saltkonsentrasjon på spaltingen av N-tosyl-L-alanin-indoksylester i 0,1 M tris-(hydroksymetyl)-aminometan-saltsyrebuffer (pH 8,8) med leukocytter, i nærvær av 10 yg SDS og 125 yg n-dekanol/forsøk.

(Bestemmelse av spaltingen ved 360 nm) .

Eksempel 5

Innflytelsen av saltkonsentrasjonen på spaltingen av N-tosyl-L-alanin-3-hydroksy-5-fenyl-pyrrolester ved hjelp av leukocytter i 0,1 M trisbuffer (pH 8,4) i nærvær av aktivatorer og detergenser.

(Bestemmelse av omsetningshastigheten ved 330 nm).

Eksempel 6

Innflytelsen av natriumkloridkonsentrasjonen på spaltingen

av n-tosyl-L-alanin-3-hydroksy-5-fenyl-pyrrolester i karbonat-buffer ved pH 8,4 ved hjelp av leukocytter i nærvær av forskjellige aktivatorer og detergenser.

(Bestemmelse av spaltingshastigheten ved 330 nm) .

Eksempel 8

Innflytelsen av saltinnholdet på spaltingen av N-tosyl-L-alanin-3-hydroksy-5-fenyl-pyrrolester i 0,1 M boratbuffer, pH 8,4, ved hjelp av leukocytter i nærvær av undekanol som akselerator og SDS som detergens.

(Bestemmelse av spaltingshastigheten ved 320 nm) .

Generell fremgangsmåte for fremstilling av N-tosyl-L-alanyl-ester: Esteren ble i hvert tilfelle fremstilt ved omsetning av N-tosyl-L-alanylklorid med fenolene i absolutt metyletylketon eller absolutt toluen i nærvær av pulverisert kaliumkarbonat. Etter 6 til 12 timers omrøring ved ca. 55°C var mellom 4 0

og 70% av fenolen omsatt. Molforholdet f enol iK-^CO^ :syre-klorid var destillert av 1:1,5:1,5. pH-verdien lå under hele reaksjonstiden på ca. 7. Til opparbeidelse ble kaliumkarbonat avfiltrert ved 50 oC og deretter ble oppløsnings-middelet i vakuum. Rensingen foregikk ved søylekromatografi med kiselgel (petroleumseter:aceton = ca. 9:1) og deretter omkrystallisering.

L- p- tosylalanin

Litteratur: E. Fischer og W. Lipschitz, B. 48, 362 (1915).

83,7 g (0,93 mol) L-alanin oppløses i 465 ml ca. 2N-natronlut. Oppløsningen omsettes ved 70 - 72°C porsjonsvis med 186 g (0,9 76 mol) p-toluolsulfoklorid i løpet av 20 minutter.

Under tilsetningen av sulfonkloridet holdes reaksjonsblandingen ved hjelp av en automatisk titrator med ca. 2N-natronlut på pH 10; for å oppnå dette forbrukes 560 ml 2N-natronlut. Når pH for reaksjonsblandingen ikke lenger endres, avkjøles blandingen til 15-5"C og pH innstilles på 3 ved hjelp av 3756 saltsyre. Det utskilte produktet suges av, den fuktige filterkaken oppløses i 2350 ml vann.

Utbytte: 185,5 g (8256 av teoretisk utbytte) L-p-tosylalanin med smeltepunkt 132-135°C.

p- tosyl- L- alanylklorid

158,1 g (0,65 mol) L-p-tosylalanin røres inn i 350 ml tionylklorid ved 40°C inntil det oppstår en klar oppløsning. Deretter destillerer man overskuddet av tionylklorid av i vannstrålevakuum. Kolberesten tas opp i 300 ml destillert toluen. Det oppstår en klar, svakt gulaktig oppløsning som helles i 900 ml omrørt vaskebensin. Syrekloridet faller ut. Det suges av neste dag, vaskes med lettbensin og tørkes i en vakuumeksikkator over kalsiumklorid/kaliumhydroksyd.

Utbytte: 155 g (9156 av teoretisk utbytte) av nesten f arveløse krystaller med smeltepunkt 81-83°C.

Claims

1. Middel for påvisning av esterolytiske eller proteolytiske enzymer, inneholdende (a) en aminosyreester eller peptidester av en fenol, som det kromogene enzymsubstratet, og (b) fra 0,05 M til 2 M av et stoff som akselererer den enzymatiske spalting av aminosyreester- eller peptidesterbindingen av komponent (a), samt eventuelt buffer, diazoniumsalt, N-dekanol eller n-undekanol og polyvinylpyrrolidon, og en polyaminosyre, karakterisert ved at stoffet er et salt som har et kation valgt fra gruppen bestående Li<+>, Na<+>, K<+> og Mg<++> og et anion valgt fra gruppen bestående av halogenid, pseudohalogenid, sulfat, fosfat, acetat, trifluoracetat, sulfonat og succinat.

2. Middel ifølge krav 1, karakterisert ved at midlet er inkorporert i en inert bærer.

3. Anvendelse av et middel ifølge krav 1 for påvisning av esterolytiske eller proteolytiske enzymer i en flytende prøve, hvor den flytende prøven bringes i kontakt med middelet og farvereaksjonen som opptrer bestemmes.