JPH05500567A - 分析物検定方法及び素子 - Google Patents

分析物検定方法及び素子

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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 分析物検定方法及び素子 発明の分野 本発明は生化学及び化学の分野に関し、免疫検定、核酸配列分析、臨床化学、酵 素検定、及び毒素レセプター又はホルモンレセプター化合物等の、配位子/反配 位子結合の組合せ等に関する研究に応用される。本発明(上 光学的干渉特性に 基づく直接物理検定法を用いた固相法検定法である。固相法検定法において(上  受容物質は被膜を形成された支持物表面上に固定される。この固定された受容 物質層 分析物を含んでいると思われる流体にさらされる。この分析物(上 受 容物質と結合又は反応の可能な分子である。分析物は有機物でも無機物でも良い 。一般に1.lt、検定における受容物質と分析物の役割を逆転させても良い。
及更辺11 抗原抗体結合、ホルモンレセプター結合、酵素検定、核酸のハイブリダイゼーシ ョン暮 同種間の反応を調べる技術に検定がある。それぞれの検定構想で重要な の(よ どのように標識を発生させるかを決定することである。反応生成物の彩 色 細胞レベルの生物的作風 反応種の一つに共有結合する放射性 蛍光性又は 発光性の標識元素等の全てが使用されてきた 免疫検定の分野中で最も知られて いる例1ミ 酵素結合免疫吸着検定(ELISA)及びラジオイムノアッセイ( RI A)の二つがある。これら全ての方法で【よ 実験で実際に検知されるの は二つの分子の結合ではなく、結合反応に関連するなんらかの二次的作用である 。これらの技術のほとんどが、標識を発生させるための工程を特に必要とし、手 間がかかる上に危険物質や高価な器具設備の使用を強要される場合も多い。
二種類の同種検体間の結合又は反応を検知する際のより有利な手段として、結合 又は反応の直接的結果であるなんらかの物性変化を調べるという手段がある。例 え1fS 受容物質又は反応物質が支持物上に固定された薄膜として存在する場 合、厚さ、質量、光学的質量等のその薄膜の物性を分析物との結合又は反応後に 測定できれ(よ その手段をして直接的物理的検定とすることもあろう。
本発明(よ 薄膜の光学的干渉の原則に基づき、直接的物理的検定法を提供する 。
対象分析物を視覚的に検知するための正碌 迅速 安価な方法をめて、多くの様 々な技術が試行されてきた ギヤバーにより光学的検定技術を用いた検定法が研 究開発されてき既 ギヤバーは1975年12月16日に特許付与された米国特 許第3,926.564号において、免疫学的反応を生じる生物学的物質の二重 の層を視覚的に検知するための技術及び素子を述懐している。
ギヤバーの教示する素子は二つある。一つは金属の被膜を形成された基材であり 、二つめは金属と半導体物質で被膜形成された基材である。具体的な実施例の中 で(良 ガラスのスライド上にインジウムと金の合金を生じさせた後、スライド を加熱してインジウムを酸化させた 次にこの素子を、素子の表面上にほとんど 色の変化をEこさない生物学的物質の薄膜で覆つ翫 次にこの結合した生物学的 物質を、第一の物質に反応する生物学的物質を含んだ第二の流体に浸した この 二つの生物学的物質の間の結合反応(表素子上にコントラストの高い色を持った 点を生じさせ旭 しかしこの方法は大変優れてはいるが、充分とは言えないこと が判明してきん 視覚的検定の二番目の方法ji1986年9月22日に出願さね シロ及びカワ グチに付与された二つの日本特許出凰 特願昭61−222058号及び特願昭 61−222057号、また同じ発明者により1987年9月22日に出願され たヨーロッパ特許呂願第87113842..6号に説明されている。この方法 及び素子(友 金属基材、又は金属で被膜形成したガラス基材1:、光干渉層の 被膜を形成したものである。この光干渉層(表 第二の生物学的化合物を検知可 能な生物学的化合物で覆われる。このヨーロッパ8願(表 素子の反応した部分 と無反応の部分のコントラストを際だたせるため1:、反応した素子の表面にコ ロイド状の金の薄い層を付着させることを教示している。
この発明を実施する方法はいくつか安定上の問題を生じる。この発明はラングミ ュア−プロジェット技術の様な方法で物質層を素子に被膜形成するが、この層は 薄片に裂ける可能性がある。実施例の一つで(上 この問題を避けるために受容 物質の反応層を被膜形成して、分析物を受容物質に共有結合させている。これで は問題の解決にはならない。なぜなら、受容物質が素子に共有結合又は充分に付 着していないため、受容物質とそれに結合した分析物が分離する可能性があるか らである。さら110、コロイド状の金を付着させるなどの標識増幅技術なしで は 素子の反応部分と無反応部分の視覚的コントラストは容易に検知できるもの ではない。
ギヤバー及びシロ、カワグチにより示された従来技術に内在する欠点(表 結合 が起きたときに可視性の高い色の変化を起こせないことである。非常に正確で、 目に見える標識を持つ素子を従来技術で製作できなかった理由(上 干渉効果を 引き起こすために使用する物質を無作為に選択したことにある。素子の背景とな る干渉色(友 コントラストの大きなロールオーバ一点を生じるのに最適な条件 にはない。ロールオーバ一点と(友 かなり小さな厚さの変化であるため1:、 人間の目には色又は彩度の実質的な変化と認識される反射防止層または複数の反 射防止層の厚さであると定義される。よって、この素子の精度と感度には限界が ある。発生した標識の強度も、受容物質に結合可能な分析物の量、及び活性化し て結合の起きる素子上の部位数により異なる。標識を発生させるにはおうおうに して高濃度の分析物が必要である。なぜなら、低濃度の分析物(よ 入射光経路 に比較的小さな変化しか起こさず、この結果目に見える干渉変化は起きない。同 様1:、寸法の小さな分析物も認知不可能な標識しか生じず、従来の素子では容 易には検知できない。寸法の小さな分析物を高濃度にすることで強い結合反応を 得られたとしても、物質を無作為に選択したため、その彩色標識がかすかにしか 目に見えないことが度々ある。標識の弱さという問題を解決するため1:、増幅 技術を利用して標識の可視性を高めようとなされてき旭 増幅技術の一例として 前述のヨーロッパ特許出願第87113842.6号を参照されたい。
従来技術の素子(上 素子に金属及びそれに同等の物質を導入するという欠点が さらにある。金属基材、又はその上に配置された酸化金属層は使用はできるが、 表面特性のために余り好ましくない。結合の起きる位置での表面エネルギー及び 表面密度が変化するため、結合効果又は物質の吸着(上 適切な精度範囲に常に 保てるとは限らない。
ニグレンは1985年12月10日に付与された米国特許第4゜558.012 号において三番目の技術及び素子を開示する。この技術及び素子においては金属 は使用されない。しかし、この素子はその構成土 受容物質を素子にリンクさせ る化学物質が2.3種のみに限られている。
従来技術の問題を克服するに匝 活性化を容易に行うことができ、可視性の高い 標識を生じる安価で選択的な素子の開発が重要である。
従って本発明の目的【友 受容物質と対象分析物の反応及び結合によって生じる 可視性の干渉変化を視覚検知することに基づいた容易で高感度の検定方法の提供 にある。
さらに本発明の目的(よ 様々な濃度の分析物が検知できる素子の提供にある。
l川辺1カ 本発明は分析物の直接的検定のための新規な構成 特1ミ 分析物の種類のW& 肌 又は量の測定を目的として素子表面に結合される受容物質の構成を含む。本 発明は広義において、次の工程より成る分析物検定法を提供する。まず、基材物 質の表面に一つ又は複数の反射防止膜を形成し、なんらかの作用によって共有結 合又は吸着させる。次(ミ 対象分析物に応じた受容物質を反射防止膜の最上層 に付着させる。さらに対象分析物を含んだ流体に受容物質を接触させ、続いて被 膜形成された物質により生じた反射を調べ、彩色点等の適切な光学的標識が現れ たか否かを調べる。
本発明の構成は 従来使われてきた物質に比べてより感度に優ね コントラスト のより明瞭な色又は彩度を持った標識を生じさせることのできる反射防止物質を 含む。厚さ、屈折率ともに均一に被膜形成できる反射防止物質であり、安定度も 高く商業的に公知の方法により被膜形成できる物質であるならどのようなもので も本発明に使用可能である。
本発明の目的(よ 支持物上に被膜として形成されるか又は支持物として機能す る基材と、素子に結合された分析物の量が少ない時でも可視性の高い標識を生じ る等差数列上に選択的に並んだ一つまたは複数の反射防止層を備えた素子を提供 することである。
さらにもう一つの目的(よ 無反応の素子の背景干渉色又は彩度と強いコントラ ストをなす彩色標識と、分析物の結合のレベルが低いときも高感度を示す素子を 提供することにある。
この素子のもう一つの目的(飄 試料中の分析物の準定量測定に応じた様々な色 合いや彩度の色を生じさせることにある。
この素子の役目はざらE、多種の基材、反射防止物質及び受容物質から開発され うる検定の実施方法を新たに提供することにある。
茜AIJ区朋 本発明の実施例の素子fi 基材、基材上に配置された一つ又は複数の反射防止 物質、及び最上層となる反射防止層より成る。この最上層となる反射防止層は活 性化して受容物質となったり、又は受容物質をなんらかの作用で素子に付着させ たりする。選択された受容物質は選ばれた分析物と結合及び/又は反応可能なも のでなくてはならない。対象分析物を含んだ流体試料を受容物質に接触させた時 1:、その物質と分析物との結合反応が、素子の厚さ、質量、又は光学的厚さの 変化を起こし、光学的干渉色変化を発生させる。
工程1 基材選択 この素子の第一要素は基材である。本発明は末端のユーザーの要望に応えるため に、多種の基材物質や形態に応用できる。基材の選択において(よ 以下に述べ る様々な性質をいくつか備えていなければならない。基材(よ 研磨シリコンや クロム等の拡散反射又は鏡倫反射を起こす物質により形成されるか、又はその被 膜を表面に形成していてもよい。あるいは基材はある種のプラスチック、ガラス 、石英等の、透過性を持った物質により形成されてもよい。また、基材は固体で も、剛性 可視性 準可撓性を備えたものでも、薄膜状やゲル状でもよい。基材 形成に適した物質(上例え(戴 石英、プラスチック、シリコン、非金風 金属 又は反射防止物質をその表面に形成することのできる機能的には金属と同等の物 質である。
基材として機能するよう選択された物質の屈折率及び光学的厚さ(上 このよう に大変感度の高い光学素子の設計において重要な要素である。基材として機能す ることのできる物質に(よ 二つの制約しかない。第一1:、その表面に反射防 止物質の被膜を形成できることである。第二1ミ 最も単純な素子の場合、基材 の屈折率がその基材の直接上に来る物質の屈折率の二乗にほぼ等しくなくてはな らず、より複雑な素子の場合で(友 基材の屈折率が表Aに示した式のうち一つ をほぼ満たさねばならないということである(しかし基材の屈折率と、その直接 上に来る物質の屈折率の比(よ本発明の趣旨を越えない範囲の値が可能である) 。標識発生のためには二番目の規準が重要である。素子及び素子の反応部分の両 方により生じる干渉色1山 目に見えるコントラストの強い色か、又(友 可視 性の高い標識を生じさせるような彩度のものでなくてはならない。例えは 屈折 率がほぼ4.1(波長に従い変化する)のシリコン・ウエーファを使用すると、 それに応じた多種の反射防止物質を素子の設計に利用できる。当業者であれ(区  この他にもこの素子への使用に同じように適した上記の規準を満たす基材物質 を呈示するであろう。直径が約4インチ、厚さが0.02インチのシリコン・ウ ェーファを使用して良い成果を収めたが、ウエーファの寸法(友 本発明には重 要ではない。
工程2 反射防止物質の選択と基材への固定速した基材を選択した後、反射防止 膜を選択し基材に固定する。
反射防止膜(よ 例えば吹き付は法や真空室における気相沈着等公知の被膜形成 技術を用いて基材表面上に形成される。他にも多種の有効な被膜形成技術が当業 者に既知である。反射防止物質が基材を完全に覆うか、又1よ パターン状又は くさび状の反射防止物質の層を基材に被膜形成するようにしてもよい。反射防止 物質として有効な物質は次の四つの性質を備えていても良い。 (1)物質は概 ね透明で、利用される厚さにおいては透過性が著しい。
(2)室温で安定している。 (3)当然ながら被膜形成に耐えうるよう、充分 に安定している。 (4)被膜となった時に反射光の波長をいくつか抑制可能で ある。
反射防止物質はまた電子光学的物質でも良い。磁界又は電界に置かれたときにこ の屈折率特性を変化させられる電子光学的物質又は磁気光学的物質を利用して、 ロールオーバ一点の精度を高めることができる。電子光学的物質の選択に当たっ て(飄 磁界又は電界によって生じさせることのできる最終屈折率が、ロールオ ーバ一点を最も正確に生じさせるために必要な屈折率とほぼ等しくなるようにし なければならない。反射防止物質には二つの機能がある。第一番目は干渉色を生 じさせることであり、第二番目は受容物質を次のように固定可能な最上層を形成 することである。即ち、素子に接触させた液体中の対象分析物に受容物質が選択 的に吸着又は結合する受容物質の能力を維持するように受容物質を固定する。
本発明の反射防止物質(よ 光のある種の波長の破壊的及び建設的干渉により干 渉色を生じる。例え(f−シリコン基材に500オングストロームの厚さで被膜 として形成された二酸化シリコンの反射防止層(上 黄褐色の干渉色を生じる。
同じような厚さで同じような基材に形成された酸化シリコン農 約480nmの 青波長を抑制するため、金色を生じる。
ロールオーバ一点の正確な素子を形成するために基材と反射防止物質にこのよう な独特な組合せを選択したの1よ 媒体中において光の波長のほぼ4分の1の厚 さを持ち、その真上及び真下にある媒体の屈折率の積の平方根にほぼ等しい屈折 率を持つ反射防止膜の存在に基づいている。ロールオーバ一点と(よ 検定等に おいて検知できる物質の存在の標識となる色や彩度のかなり顕著な変化を人間の 目で観察できるよう(ミ 一つ又は複数の反射防止層の測定された厚さによって 充分に高めた視覚的効果であると定義される。好ましく(ヨ この素子には反射 防止層をほとんど形成せず、より複雑な素子には表Aに示した式に対応したより 多くの反射防止層を形成すると良い。
被膜形成された反射防止物質の一つの特徴として(友 反射/透過光の比がある 。入射光がある媒体を通過して屈折率の異なる第二の媒体に入るときは常1:、 その光のある部分は媒体間の界面で反射し、ある部分は透過する。所望の反射/ 透過光比を達成するために基材は反射防止物質の薄膜で覆われる。この反射防止 層(表層の外表面及び基材の外表面からの反射を破壊的干渉によって相殺するよ う働く。部分的な破壊干渉を達成するために1友 反射の彩度はかなり強く、位 相外はぼ180度でなくてはならない。選択された波長がラムダの時、光学的厚 さがラムダ/4の反射防止膜は位相外の反射を生じる。
入射光の反射を最小限にするに(上 ラムダ/4は被膜形成さ相た物質の光学的 厚さに等しい値でなくてはならない。光学的厚さとは 膜の物理的厚さに膜の屈 折率を乗じたものである。よって、本発明の好適な実施例において(友 通常、 形成された光学的膜は、表Aに示したよう1:、波長の約4分の1の光学的厚さ 、又は波長の4分の1の光学的厚さのうち奇数のもの、又は反射を最小限にする 屈折率と厚さの組み合わせのうちの厚さに形成される。
しかしながら、正確な厚さの被膜を形成することだけではなく、空気/膜間及び 膜/基材間の界面における反射の彩度をほぼ等しくすることが必要である。最も 簡単な素子において彩度を等しくするに(上 屈折率は等比数列上になくてはな らない。大気の屈折率は1.0であるから、AR膜の屈折率は基材の平方根にほ ぼ等しくなくてはならない。言い換えれ[f、ある反射防止膜の厚さが光学的厚 さでは媒体中の光の波長の4分の1で、屈折率が真上及び真下にある媒体の屈折 率の積の平方根である時(:、最も反射が減少するということである。
反射防止膜はある特定の光の波長のほぼ4分の1の光学的厚さとなる。媒体を照 射するために使用する光(よ 色の変化と彩度の変4t つまり明−暗度イヒ  のどちらが好まれるかによって多色光又は単色光のどちらでもよい。反射防止物 質の厚さを最適条件に設定するために(山 反射防止膜の厚さを決定する際1: 、この反射防止膜の最上層上に被膜形成される受容物質の薄膜やその他の被膜等 の層を等式の計算要素に加λねばならない。
研磨シリコン・ウコーーファ等の基材の屈折率は540 n mの光(緑)の時 1:は約461である。表Aの第1式に質い素子のローニルオーバ一点の精度を 最大限にするために(よ、選択された反射防止物質の屈折率は約2.02でなく てはならない。し5かし5、基材の平方根に近い屈折率を持つ物質でも充分な成 果が得られることが判明している。物質の屈折率が基材の屈折率の完全平方根か ら遠ければ遠いほど、ロールオーバ一点は不明瞭となる。シリコンにおける最も 良い成果(よ 窒化シリコン等のように屈折率が2の物質や、酸化シリコン等の ように1.9−1゜8の物質で得られてきた 類似の屈折率を持ちこの選択され た基材に使用可能であろう他の反射防止物質として(よ 酸化すず、酸化亜鉱  酸化クロム チタン酸バリウム 硫化カドミウム 酸化マンガン、硫化訛硫化亜 仏 酸化ジルコニウム 酸化ニッケル、酸化アルミニウム窒化はう荒 フッ化マ グネシウム 酸化鉄、酸化窒化シリコン、酸化ベロン等が含まれるが、これらに 限られるものではない。
異なる屈折率を持つ多種の基材、及び対応する適した反射防止物質を単独又は組 み合わせて使用することにより、高感度でロールオーバ一点の正確な素子が開発 できる。基材上に被膜形成される反射防止層の数は1から無限大までの整数なら いくつでもよい。
層の数に制限を与える要素は次の二つのみである。即ち選択された物質の屈折率 がほぼ等差数列上にあることと、層の複数形成にかかる費用である。被膜形成技 術が進歩しており、本発明の範囲内で鑑みたとき、層の複数形成が容易に実用化 できることが期待される。
このスライド素子を窒化シリコンで特定の厚さに被膜形成すると、反射防止層は 青色の可視光線のうちある種の波長を抑制するため、褐色がかった金色の干渉色 を反射する。この要素の組合せでは褐色がかった金色が干渉色として用いられた が、スライドの可視干渉色は選択された基材物質、選択された反射防止層の化学 的組成と屈折束 及び被膜形成された層の厚さ及び数に応じて、スペクトル上の いかなる色でも良い。
反射防止物質の光学的厚さく表 ある特定の波長が選択された時、等式 n「・ t=ウラムダ4で決定することができる。本発明(表口色光及びその包含する波 長をすべて利用できるよう構成することができる。よって波長を選ぶ際には波長 のある範囲から選択することができる。あるいは本発明(表 選択された単色光 の波長を利用できる構成とすることもできる。
反射防止物質の厚さく上 可視光線の波長のほぼ4分の1の厚さか、又は類似の 成果を達成できる波長の4分の1の光学的厚さのうち奇数倍のものとすることが できる。反射防止物質の厚さが増すにつれて、素子はファブリーペロットの干渉 計の基礎を成す原則により近似してくる。本発明中は単数の反射防止層を形成し た素子の作成方法を概ね述べているが、同時1:、ロールオーバ一点の正確な素 子は反射防止層が単数又は複数であれ添付の表Aの等式を使って作成することが 出来ることを考察及び開示している(ボーガン、 トリスコルの著書[ハンドブ ック オブ オプティックスJ [1978] 8−48.8−49を参照)。
これらの等式(友 生じる反射が少なくとも一つの波長でゼロ又はゼロに近い基 材、反射防止層、及び媒体の屈折率の組合せを示している。これら屈折率の組合 せ(よ 最小限の厚さの変化で、抑制された波長の変化を最大限にするよう選ば れている。
反射防止物質の積層構成に表Aの等式を利用することで、素子は明るい色の背景 となる干渉色を発生させる。この表は通常の入射光に調整されているので、大抵 の人が素子を視る垂直の視角から5−30度外れるように若干調整すると最適で あろう。 (素子は選択されたいかなる視角にも調整可能である。)くさび型を 使ったり、計算色さらに行うことで、ロールオーバ一点の正確な素子が作成でき る。通常カラー・フリンジの第一オーダーを使うとより正確な素子が出来ること が判明しているが、もし素子が適切に被膜形成されていれit カラー・フリン ジのどのオーダーでも使用できる。これらの構成技術を駆使して、標識又は背景 がスペクトルの紫外又は赤外域にある素子を作成することが出来る。このような タイプの素子に(友 結合した分析物の検知に器具を用いる必要が生じる可能性 もある。
被膜形成された反射防止物質の厚さ農 選択された構成 用いられた被膜形成工 程の精度、及び選択された物質の特性によって左右される。反射防止物質の被膜 形成時の外的影響(友 常に完全に制御できるとは限らない。従って、反射防止 物質による被膜形成の後に素子の背景となる干渉色を視覚的に選択するのが多く の場合適切であるということになる。
好適した背景干渉色を決定するために一つのモデルが作成された 選択された基 材がシリコン・ウエーファで、選択された反射防止物質が窒化シリコンの場合、 観察された色が褐色がかった金色からマゼンタ色の時に最もコントラストが高く はっきりとしたロールオーバ一点が生じるように思われる。ウエーファが第一オ ーダー・フリンジでは最後の色である深い青に見えるよう、シリコン・ウエーフ ァには窒化シリコンの厚い被膜が形成された 次に反射防止物質がリン酸槽でウ エーファにくさび状にエツチングされ翫 反射防止物質のエツチングにあたって (ヨくさびの一端で300オングストローム 他端で700オングストロームが 維持されるよう行われた 窒化シリコンは180度C2毎分秒おおよそ20オン グストロームでエツチングされ九 反射防止物質に適したエツチングの為の多種 の酸は市場で入手できる。
エツチングさ札 くさび状にされた素子は視覚的に異なる干渉色及び異なるロー ルオーバ一点を呈する。次(:、反射防止物質の厚さが、視覚的には最も顕著な 変化であると見られるロールオーバ一点の始点で測定される。これは反射防止物 質の最適な厚さである。なぜなら、少量の結合分析物でも素子の反応部分はだれ を起こし、新たな干渉色を生じるからである。
くさび状のモデルを観察して選択された厚さで被膜形成されるよう設計された素 子(上 完成の前に受容物質の層で覆われる。受容物質の光学的厚さく物理的厚 さに屈折率を乗じたもの)を等式の計算に入れてよい。物質の最上層、及び受容 物質の屈折率に対する反射防止物質の屈折率の比を、それぞれ個々の物質の物理 的厚さで乗じる。次1:、この等式を使うて反射防止物質の最適な厚さを決定す る。最上層を使用しない場合(友 反射防止物質と受容物質の屈折率の比を受容 物質の物理的厚さで乗じることができる。
この結果の値を反射防止物質にエツチングして最適な干渉色を維持することがで きる。ここである特定の素子のパラメーターを示すくさび状モデルは一度作成さ れれは 繰り返し利用できることが理解されねばならない。更1:、実際のモデ ルは多くの場合助けとはなるが、非常に明瞭なロールオーバ一点を持つ素子の作 成には欠かせないというわけではない。
屈折率が1.5の受容物質を50オングストロ一ム付着させるよう化学的に活性 化された窒化シリコンで覆われたシリコン・ウエーファのモデル(友 素子には およそ553オングストロームの反射防止物質を被膜形成させるべきであること を示した この物質量は基材または被膜となった物質の屈折率の変化によって異 なる。選択された厚さでは素子は茶色がかった金色に見えたが、選択された受容 物質がその表面に付着した後でも、干渉色は意図された通り元の茶色がかった金 色と類似の色で維持された工程3 活性化 素子に受容物質を固定するのに先だって、受容物質を素子に固定するよう活性化 の可能な反射防止物質の最上層が素子に被膜形成される。この最上層1山 反射 防止物質が素子に被膜形成されたときと同じ商業的に公知の工程で形成される。
しかしながら、素子上に被膜形成された反射防止物質がもともと化学的に活性化 可能であり、素子への受容物質の共有結合又は吸着が容易に起きる場合に1表  最上層は不要である。例え(戴 窒化シリコンの干渉層は最上層を被膜形成する ことなく活性化し旭 その他の実施例において1t、、二酸化シリコン及び他の 多種の物質の最上層が、おおよそ1−100オングストロームの厚さで窒化シリ コン上に被膜形成された 最上層の厚さは多岐にわたるが、厚い層を形成すると 入射光の経路の長さが変化して干渉効果に影響を及ぼすので、厚い層を使用する 時はこれを考慮に入れて反射防止物質の膜の厚さを決定した 活性化される物質は次の三つの特性を備えていると最も効果的である。即ち、素 子への被膜形成が容易であること、化学的活性化が容易であること、及び活性化 したときに受容物質が結合する部位が密集した表面を形成する、の三点である。
このような三つの特性が多種のシリコン組成轍 特に窒化シリコス 二酸化シリ コンにおいて認められた 当業者に公知である受容物質の結合方法はいずれも本発明の主旨を越えない範囲 で利用できる。
可視性の高度なロールオーバー森 及びコントラストの大きい干渉色又は彩度の 変化を生じる物質を使用することで、分析物を大量に素子へ結合させる必要性は 減少してきたが、結合部位が高密度である必要性は減少しなかった 活性化され た受容物質上で得られる活性結合部位が数多くあれ(戴 試料中の分析物の大半 が素子に反応し結合することができる。この結合反応が入射光の経路長さに変化 をもたらし、干渉色の変化を引き起こすのである。
共有結合の可能な官能基を得るため(:、又は受容物質の付着や場合によっては 分析物の付着のため1:、酸化窒化シリコン、二酸化シリコン、酸化シリコン等 の物質及び他の多種のシリコン組成物の様々な最上層がシラン化学で活性化され た これらの技術(上官能基化されたトリコキシシランによって表面のシラノー ル基を誘導体化することに基づく。これらの物質及び各々の化学物質(友可視性 の高度な干渉色標識を発生させるのに充分な結合部位を生じる。ここで当業者に 理解されねばならないの(よ 活性化される物質によっては 広範囲の活性化学 物質が利用できることである。
共有結合、吸着、又はなんらかの作用によって受容物質を素子に付着させるよう にこの物質は活性化されてよい。
表面を活性化させるに先立って、不特定の結合や背景ノイズを起こす可能性のあ る有機粒子を素子から取り除いてもよい。素子表面からの除去方法の一つ1友  真空室で酸素プラズマでエツチングすることである。素子表面から不純物を取り 除く最も適切な方法(上 選択された反射防止物質と最上層の特性による。場合 によって(上 受容物質の付着前に素子から不純物を取り除く必要のないことも ある。
素子を化学的に活性化させることで、素子に受容物質を付着させることが容易と なる。吸着や共有結合瓢 あるいはその他のなんらかの作用により被膜形成され 活性化された基材に受容物質を強固に付着させることが出来る。ラングミュア− プロジェット法等の方法を利用できるが、この方法で作成された素子(、t、他 の素子に比べて大抵の場合安定性が大きく劣る。
活性化された物質が、例え(f、、酸化窒化シリコン又は二酸化シリコンの場合 、受容物質を表面に共有結合させる官能基を伴った表面をシラン化学により活性 化させることが出来る。活性化の方法の一例は次の通りである。被膜形成された 25枚のウエーファが真空乾燥機内に納められる。この乾燥機内には15トルで 沸点が140度のN−(2−アミノエチル)−3−アミノプロピルトリメトキシ シランがほぼ2.5ミクロリットル入っている。選択されたアミノシラン組成物 の沸点(上 気相沈着を起こさせるための最適な圧力と温度を決定する。
この真空乾燥機は0.06トルになるまで30分間排気された後、1時間以上か けて100度まで温度を上げられる。この工程の結果 活性で安定したほぼ20 −30オングストロームの物質が素子に被膜として形成される。
工程4 受容物質の付着 素子が一旦化学的に活性化されると、受容物質の付着は標準的な処理によって行 われる。この物質は多くの場合、素子への付着の前1ミ 希釈及び緩衝処理され ねばならない。受容物質を素子に付着させるのに必要な工程(友 選択された活 性化学物質と選択された受容物質によって異なるであろう。
活性化された素子への受容物質の付着方法の一例は次の通りである。選択された 受容物質(表 活性化された素子を納めたプラスチック・セルの培養箱中に配置 されたヒト・IgG溶解液である。
二のIgG溶解溶解液口hが7.4の10mMのリン酸ソーダ緩衝(0,9%) 液(P B S)が20ミリリツトル、20ミクログラム/mIのヒト・IgG (これによりヒト・IgGが超過する)、及び1%容量比のグルタルアルデヒド から成る。
この溶解液は室温で攪拌槽において一晩インキュ〆一トされる。
このインキュベーションに続いて、素子をイオン除去した蒸留水で洗浄する。次 にプロツキング工程を実施し7て不特定の結合量を減少させることも可能である 。この任意の工程に続いて、スライドを洗浄した後、N2の流れ又は加圧した空 気で乾燥するか、又は空気乾燥させる。
この時点で素子が完全に形成される。適切に包装さ札 4度Cで保管されれ(戴  素子は少なくとも2年−対象分析物を検定することができるであろう。
工程5 対象分析物の検定 次1:、その試料が分析物を含んでいるかを決定するために試料を素子に接触さ せる。試料と素子の接触の前(:、試料をリン酸ソーダ緩衝液等の希釈液で希釈 しておくのが適切であろう。試料の希釈液に対する比と選択される希釈液の種類 法 試料の性質と選択された検定技術によって異なる。
物質が明確で顕著なロールオーバ一点を生じるように構成されるので、小さな分 析物でも容易に検知できる。しかしながら、小型の分析物1友 受容物質と結合 したときに入射光の経路の長さに大きな変化を起こすようにより大きな分子と結 合させるのが望ましかった これにより反応を起こした素子によって引き起こさ れる標識が増加した そしてより大きな分子と結合した分析物の試料(飄 他の 分析物の試料と同じように取り扱われた当業者には理解されるであろうが、試料 は多種の方法によって素子に接触させることができる。例え(f−、素子への塗 末又は滴下、又は素子を試料に浸してもよいが、これに限られるものではない。
受容物質上への分析物の固定]上 スライドの加熱ブロック上でのインキュベー ション、又は素子の加熱ランプ又は赤外ランプ下への配置、又は過剰な試料水分 が蒸発するまで素子を室温でインキュベートする暮 様々な方法で効果を高める ことができる。ここで分析物の固定を高める技術法 受容物質と選択された分析 物の働きであることが理解されねばならない。
インキュベーションに引き続き、素子を充分に洗浄して、表面に固定していない 物質をすべて取り除く。次1m、N2の流瓢 加…空気プロッティング、吸い取 り紙又はそれに相当する他の方法により素子を乾燥する。
工程6 検定検知技術 結合した分析物の検知に(友 検知の為の適した手段を使用できる可能性がある にもかかわらず、視覚的及び器械による二つの検定検知技術が主に使用されてき た 以下に述べる例で1友 流体が対象分析物を含んでいるかどうかの確認1ミ  視覚的には干渉色現象が、器械的には厚さの変化の偏光解析法による測定が用 いられた 本発明の実施例となる素子は スペクトルの紫外板 可視又は赤外域の多色光又 は単色光を照射されることで、分析物が表面に結合したかどうかを確認すること ができる。シリコン・ウエーファ、酸化シリコンの反射防止層、二酸化シリコン の最上層、及び生物学的受容物質から成る無反応の素子は多色光を浴びると、最 大吸着がほぼ476ナノメータで、金色の干渉色を反射する。対照的1:、反応 した素子は多色光を浴びると紫色又は青色の干渉色を反射(分析物が結合しない ところでは金色)し、分析物が結合したところの最大吸着は500ナノメータか ら650ナノメータであった 反応点での色は表面に結合した分析物の濃度に直 接左右される。濃度が高ければ高いほど、色の変化又は彩度は著しくなる。
分析物が受容物質と相互反応すると、基材の最上層の物質の物理的厚さは増加又 は減少する。厚さの変化の結棗 光学的経路の長さも変化する。新しい光学的経 路長は干渉色又は彩度を変化させる。本発明では与えられた波長の破壌的干渉の ための適正な色移相を達成するため1m、AR(反射防止)膜の厚さ(上 波長 の4分の1の光学的厚さのうち奇数のものより通常少し小さくしである。空気は 媒体としてはAR膜又は基材よりも密度が低いため、両方の界面で反射のp1移 相が起こる。移相のうち、同じものは互いに相殺しあう。
よって、正味の移相を調べるのに唯一の要素となるの鷹2dX nrによって定 義される光学的経路差である。dはARの厚さの実際の測定結果であり、nrは AR膜の屈折率であると定義される。よって実際の移相LL2dn/ラムダに、 ラジアンであれば21〕1を乗じたもの、度数であれば360を乗じたものとな る。ARの厚さはほぼ光学的厚さで波長の4分の1のうち奇数のものである61 .かじ、この例では実際の光学的厚さは、ラムダ/4にほぼ等1.い。ここでラ ムダはピーク・パフオー・マンスのために選択された波長である。よって移相は およそ180度であり、ある種の波長が抑制されたため部分的な破壊的干渉が起 き、 (この選択された例では)金色の干渉色を呈する。
素子の最上層で分析物が受容物質に結合する時、光学的経路は前述したように増 加または減少する。この例で(友 分析物と受容物質との結合反応によって引き 起こされた実際の厚さの変化(良物質をほぼ20オングストローム増加させた  物質の増加量又は減少量は結合可能な分析物の大きさと量、及び発生可能な反応 結合部位の量の働きである。物質が30オングストローム増加することも珍しく ない。このような光学的経路の変化の結果、異なる波長が抑制さ札 分析物の結 合域を決める青色又は紫色の干渉色が生じる。
この検定の干渉標識の明晰度は検定を視る角度に多少左右される。よって、物質 、その厚さ及び最適なロールオーバ一点を生じる屈折率の計算に[よ この視角 も考慮に入れねばならない。標識強化技術は不要ではあるが、多種のフィルタ及 びポラライザーを使って、検定表面に対する通常以外の角度からみた干渉標識の 明晰度をより高めることができることが判明している。
標識強化技術を不必要とするため1ミ 背景干渉色をロールオーバ一点に近い最 適条件に配置して、反応1.た時にコントラストの大きい干渉色又は彩度を得る ようにしなければならない。この結果、人間の目が明瞭に識別できる色のコント ラス[・が得られる。
素子上で反応した分析物の既知の濃度は偏光解析計1..□−よって読み取るこ とができる。この結果得られたデル夕はより定量的な結果の標準曲線を得るため に使用することができる。本発明の趣旨の範囲内で、分析物の濃度を測定するそ の他の方法及び器具を使用できることは明らかなはずである。
例1 癌胎児抗原(CEA)の検知 (免疫検定−非競合法) 表面が高度に研磨さ托 与えられた波長で屈折率が4゜09のシリコン・ウエー ファが、平均屈折率が2. 0、物質の厚さが653オングストロームになるよ う、反射防止物質としての酸化窒化シリコンによって被膜形成された 最も顕著 なロールオーバ一点を達成するため(ミ はぼ480−470ナノメータの5皮 長が抑制された これらの波長を抑制するため1ミ 反射防止物質を、厚さが6 00オングストロームから586オングストロームの間になるまでエツチングさ れねばならなかつL反射防止物質の最適な厚さILL 受容物質の屈折率及び厚 さによってさらに決定される。これは多くの場合無視できる要素であり、考慮に 入れず済むが、本例で(表 屈折率がほぼ1,5でほぼ30−50オングストロ ームの物質が活性化された反射防止物質の最上層に被膜として形成されるべきで あると決定された 被膜形成された受容物質の厚さを乗じた二つの屈折率の比に より、より顕著なロールオーバ一点を達成するためにはほぼ35オングストロー ムの反射防止物質がエツチングされるべきであることが明らかとなつ旭 よって 、このスライドは反射防止物質がほぼ560−565オングストロームになるま でエツチングされた その後、素子は次の処理により、N−(2−アミノシラン )−3−アミノプロピルトリメトキシシラン)を用いて化学的に活性化され九] 、被膜形成されたウエーファt;l:、0.70トルの酸素中において、 17 5D、C,ミリアンペア、250RFワツトの陽極電流で5分は 酸素プラズマ エツチングされん2、酸素プラズマエツチャーから取り出してすぐ、ウエーファ は石英のラックに納められた このラック+i 2. 5ミクロリツトルのアミ ノシランを含んだ容器を固定させた真空乾燥器中に挿入された 3、この真空乾燥器は0.06トルになるまで30分間排気されれた この結果 、アミノシランがウエーファの表面に気相沈着することでウエーファが活性化さ れた 4、ここでウエーファは受容物質を固定させる用意が完了したまず、20m1の PBS、容量0. 1%のグルタルアルデヒド、及びたんばく質Aの活性域を覆 う合成ポリペプチドであるIGAP150ミクロリットルより成る溶解液が作ら れt−、(他の実験で(飄 たんばく質A又はたんばく質Gはl GAPに置換 されたが同様な結果が得られt−、) 5.200ミクロリツトルの癌胎児抗原に特異な単一クローン性抗体(多クロー ン性にも置換可能)を、ピペットで1ミリリツトルあたり1 m gになるよう にl GAP溶解液に滴下し旭6、化合した溶解液をペトリ皿中のウエーファの 上に配置して、室温で2時俣 振とう槽においてインキュベートした 次にベト リ皿を取り除き、冷却器に移して4度Cで48時間インキュベートして受容抗体 物質をさらに固定しL 未結合の物質をすべて取り除くためにウエーファをイオ ン除去した蒸留水で洗浄し、N2流で乾燥し旭 次に金色がかった褐色の素子を既知のCEA濃度を持つ五つの血清試料中のCE A抗原の存在を調べ翫被膜形成したウエーファを使用し、前述の方法で用意した 後述の検定の結果 次のような処理によって表1のデータを得h1、五つの血清 試料のすべてを10ミクロリツトル、ウエーファ表面に接触させ、ついで37度 Cで7分気 インキュベートしL他の実験では45度Cで3分間インキュベート を行ったが類似の結果が得られ旭 2.7分後、ウエーファをイオン除去した蒸留水で洗浄して未結合の物質をすべ て取り除い翫 次にウエーファを窒素流で乾燥し翫 スライドの視覚的検査の結 果、分析物濃度レベルの増加と相関関係にある色彩度を持ったピンク色の点が見 られた3、ウエーファの表面上の結合反応によって生じた厚さの変化を実証する ために器具を使用した ウエーファの反応部分の厚さの変化を、サガックス(登 録商標)の比較偏光解析計を使ってグレースケールを単位として測定した 表1 結合CEA抗原の測定 濃度 平均 標準 エユエZ二工尤 グに二区立二四 便差 CVO,020,12,7313,6 % 2.0 31.67 1.86 5.7%4.0 36.94 7.86 5. 0%8.0 44,682.56 5.6%16.0 60.85 3.73  6.1%例2 スライドの構成の比較 (臨床化学検定の比較) 光のほぼ同じ波長を抑制するため1:、二つのシリコン・ウエーファに二つの異 なる反射防止物質を用意しん 第一番目のシリコン・ウエーファ(よ 商業的な 方法で酸化窒化シリコンにより被膜形成さね はぼ590オングストロームまで エツチングを施したものである。第二番目のシリコン・ウエーファ(屈折率は4 .1)(よ 商業的な方法で屈折率が1.46の二酸化シリコンにより被膜形成 さね 厚さがほぼ808オングストロームになるまでエツチングを施したもので ある。両方の反射防止物質の選択された厚さはほぼ470−474ナノメータ域 の波長を抑制する。第一番目の素子は可視性の高いロールオーバ一点を生じるよ う構成され翫 シリコン・ウエーファの屈折率はほぼ4.1、酸化窒化シリコン 層の屈折率は2. 0であり、受容物質は考慮に入れられなかつ九 第二番目の 素子は第一番目の素子と同じ波長を抑制するように構成されたが、表Aの一番目 の等式に応じた構成をしなかったので、コントラストの高いロールオーバ一点を 生じなかった同じテストを各々の素子に行つ九 素子はN−(2−アミノエチル)−3−アミノプロピルトリメトキシシランを用 いて、次に述べる処理によって活性化され翫1、被膜形成されたウエーファにi 、175D、C,ミリアンペア、250RFワツトの陽極電流を流した0、70 )−ルの酸素中で5分間酸素プラズマエツチングを施した 2、ウエーファを酸素プラズマエツチャーから取り出してすぐに石英のラックに 納めた このラックを、2.5ミクロリツトルのアミノシランを含んだ容器を固 定させた状態で真空乾燥器に挿入し九 3、真空乾燥器を0.061−ルになるまで30分間排気した 次に乾燥器の温 度を1時間以上かけて100度まで上げた この工程の結果、アミノシランのウ エーファ表面への気相沈着によりつ工−ファが活性化された 4、ウエーファが活性化さ札 この活性化の過程で被膜と1−て形成された官能 基が受容物質として作用した この他の受容可能な物質は表面に被膜として形成 されなかっ旭酸化窒化シリコンを持つ第一番目のウエーファは金色がかった茶色 の干渉色を反射した 二酸化シリコンで被膜形成された第二番目のウエーファは 茶色がかった灰色の干渉色を反射した 次にこの二つのウエーファを使用してヒ トの妊娠を調へf:、4つの陽性の尿試料と一つの陰性のコントロール試料が使 用された検定1上 被膜形成された第−及び第二の被膜形成されたウエーファを 使用して以下に述べる方法で行われん この検定の結果表2のデータが得られ旭 1、phs、Oの0.02MのTRl5−HCI緩衝液及び0゜7%のウシ血清 アルブミンにより尿試料を1: 1に希釈し翫 緩衝液及びアルブミンは共に市 場でシグマ社から入手可能である。
2、次に希釈された五つの試料(はぼ15ミクロリツトル)を用意したウェーッ ア上に滴下し、室温で30分間インキュベートした 3、イオン除去した蒸留水でウエーファを洗浄して未結合の物質をすべて除去し 、窒素流で乾燥した 4、第一番目の素子(窒化シリコン)の視覚的検査の結果、陽性の尿が滴下され たところで(よ 可視性の高い紫がかった青色の4つの点が見られ旭 陰性の尿 で1友 ウエーファの金色がかった茶色の表面色には変化が見られなかつ九 第 二番目の素子(二酸化シリコン)の視覚的検査の結果 陽性の尿を接触させたと ころで(よ 微かに4つの灰青色の点が見られた 陰性の試料では茶色がかった 灰色の干渉色に変化は見られなかった5、ウエーファの反応部分の厚さの変化を 、サガックス(登録商標)の比較偏光解析計によってグレースケール単位で測定 し旭表2 平均 え試用 グセニー人ダニルー値 玉奥寛五素子1 素子2 素子1 素子2 妊娠陽性1 65,1 68,1 41.046.0妊娠陽性2 57.1 6 2,8 41,046.0妊娠陽性3 49,9 58. 0 4]、046. 0妊娠陽性4 55,2 61,4 41.0 46.0妊娠陰性5 43,0  48.0 41.0 46.0二つのウエーファ表面にはそれぞれ同様な量の 分析物が結合したが、分析物の素子への結合によって生じた標識の可視性には違 いがあった 酸化窒化シリコンで被膜形成された素子(友 金色の背景に対してコントラスト の高い鮮やかな青みがかった紫色の点を生じ九二酸化シリコンで被膜形成された 素子(よ 灰茶色の背景に対してさめた灰青色の点を生じ旭 分析物が少ないと 思われる三番目の試料が二酸化シリコンを施した素子ではあまり目だった色を出 さず、窒化シリコンを施した素子では可視性が高いことは注目に値する。
例3 リウマチ因子のくさび状検定 (準定量的検定) ガラスの顕微鏡スライド支持物を、商業的に実施可能な被膜形成工程により、ク ロム基材で被膜形成1.ノー。次にこの基材1:、反射防止物質、硫化カドミウ ムで厚さ5oOオングストローム又は物質まで被膜形成した 次に素子に希釈H CI酸中で機械的エツチングを施し、0オングストロームから500オンゲス1 〜ロームのくさび状の硫化カドミウムを形成した 次にエツチングを施L5た素 子1:、商業的に実施可能な気相沈着工程によって二酸化シリコンで50オング ストロームの被膜を形成した くさび状にしたスライド(上 はぼOから150 オングストロームの硫化カドミウムからは銀色 150から250オングストロ ームからは褐色250−325オングストロームは金@!、325から370オ ングストロームからは茶色がかった金色 370から400オングストロームか らはマゼンタ色 400から440オングストロームからは深い紫色 440か ら465オングストロームからは深い青色 475から5oOオングストローム からは藤紫色の反射が、それぞれ多色光下で通常の入射光への45度の角度で見 たときにあつh 次にN−(2−アミノエチル)−3−アミノプロピルトリメトキシシランを用い て以下に示す処理をして素子を化学的に活性化した。
]、被膜形成されたウェーファ(よ 酸素中に175D、C,ミリアンペアで2 50RFワツトの陽極電流を流した0、7トルの真空室で5分間酸素プラズマエ ツチングを施しt;2、ウエーファを酸素プラズマエツチャーから取り出してす ぐに石英のラックに納めた そして、5ミクロリツトルのN−(2−アミノエチ ル)−3−アミノプロピルトリメトキシシランを含んだ容器を設置した真空乾燥 器に挿入し翫 真空室は0.06トルになるまで30分間排気された そこで乾 燥器の温度を1時間以上かけて100度に上げ、アミノシランを完全に気相沈着 させ九3.2o○ミクログラム/ml のBGGと20m1のpss (前述の もの)と容量1%のグルタルアルデヒドを混合して受容物質溶解液を形成した  ウェーファをペトリ皿に置きこの受容物質溶解液を加え旭 4、受容物質の固定を高めるため]:、室温の振とう槽で15時間インキュベー トし九 5、インキュベートに続き、イオン除去した蒸留水で洗浄して未結合のウシ・ガ ンマグロブリンたんばく質をウエーファから取り除い九 6、スライド器具を洗浄して不特定結合の量を減少させた後、器具をブロッキン グ溶解液に浸し、振どう槽にて1時間インキュベートシた このブロッキング溶 解液LL 2 u g/m lの酸加水分解カゼイン、及び、総容量が20m1 となるのに充分なPBS中の容量/容量比が1%のグリセリン、及び重量/容量 比が2%のスクロースから成っている。
7、このプロツキング工程に次いで、イオン除去した蒸留水で洗浄して余分なブ ロッカ−をすべて取り除いL 次にスライドを窒素流で乾燥した 8、次にくさび状のスライドに 被膜形成された二つの陽性の血清試料、及び患 者の血清を付着させた 陽性試料のうち、一つは濃度が希釈剤1 m lあたり 7001 Uのものであった 二つめの陽性コントロール試料は濃度が希釈剤1  m lあたり1751Uであった これらの試料は次の工程により用意された a、陽性の患者血清試料1山 比が1: 1 (血清の容量:希釈剤の容量)に なるようにPBS (前述したもの)を加えて希釈された陽性コントロール試料 の一つ農 比が1= 1になるようにPBSを加えて希釈し、1mlあたりの濃 度7001Uを得t−41mlあたり1751Uのコントロール試料は1 m  lあたり7001 Uの試料を連続希釈することで得られん コントロール試料 の1m1あたりのIU値1上 陽性の未知の試料中に通常見受けられる濃度レベ ルに応じて多様にすることが可能である。
b、希釈又はコントロール試料のそれぞれ5ミクロリツトルをそれぞれのウェー ファに置き、加熱ブロック上において45度で3分間インキュベートして分析物 の固定を高めたC1次にウエーファをイオン除去した水で洗浄して未結合物質を すべて取り除き、加圧空気流で乾燥させたくさび状の素子を多色光のもとて視覚 的検査を行うと、スライド上の反応したコントロール試料の反射は類似の色をし ていたが彩度にはばらつきがあった 1751U/mlのもの1よ 同じ反射防 止物質の厚さでは7001U/mlのものより色の鮮やかさが劣っていた 70 0IU/mlのもの、つまり高度に陽性のコントロール試料(よ スライドの銀 色の背景部分に可視性の標識を呈した 低度陽性の1751U/per mlの ものは反射防止層がより厚い時に可視性の標識を呈した 可視性のM識はスライ ドの褐色から金色の背景部分で現れてい旭 生じた色の中で最も顕著なものはロ ールオーバ一点において見られた このロールオーバ一点では紫味のある茶色が かった金色の背景1:、藤紫色の反応標識を生じていた 患者の血清試料が生じたしみ(よ 視覚的には1751U/mlのコントロール 試料と類似(、ていた ロールオーバ一点で生じた青色標識と視覚的に比較する と、同じ彩度のものに見える。この準定量的テスト法により、患者の試料と、素 子に被膜として形成されたコントロール試料によって生じた標準色曲線とを比較 して、試料中の自己免疫指標のおおよその量を調べることができる。
例4 セロトニン/ハブテンの検知 (競合法) 表面がやや一定でなく、ある特定の波長における屈折率が4゜02のシリコン・ ウエーファに酸化窒化シリコンの反射防止物質で被膜形成することができる。こ の酸化窒化シリコンの層(上 反射防止物質の単独層の公式に応じて形成するこ とができる。酸化窒化シリコンによるこの被膜の屈折率は1.92、被膜の厚さ はほぼ605オングストローム(+/−5オングストローム)となるであろう。
この厚さでは被膜形成されたウエーファは紫がかった黄色の干渉色を生じた こ の反射防止物質の被膜の最適な厚さく表 反射防止層の上に形成される僅かな量 の受容物質によって大きく変えられてはならない。
素子は次の処置によりN−(2−アミノエチル)−3−アミノプロピルトリメト キシシランを用いて化学的に活性化された1、被膜形成されたウエーファ11  175D、C,ミリアンペアで250RFワツトの陽極電流を流した0、711 −ルの酸素中で5分間酸素プラズマエツチングを施してもよい。
2、ウエーファを酸素プラズマエツチャーから取り出してすぐに石英のラックに 納め、その後5ミクロリツトルのアミノシランを入れた容器を固定させた状態で 真空乾燥器に挿入してもよい。
3、真空室は0.061−ルで30分間運転するべきである。その後乾燥器の温 度を1時間以上かけて100度に上げるべきである。
この工程がアミノシランをウエーファ表面上に気相沈着させ、つ工−ファは活性 化される。
上記の処置が行われると、アミンが誘導された表面を備えたウエーファができる はずである。アミノシランに対する表面反応部位数が限られているため、固定さ れるべき物質と無機ウエーファ表面の間に物理的バリアを作るためだけでなく、 反応部位の密度を増加させるためにも、表面のアミンに有機ポリマーをグラフト させると有効であることが判明している。これらの処理に沿った簡便なアプロー チI−L 過ヨウ素酸塩ナトリウムによって部分的に酸化した多糖デクストラン を使用する。酸化デキストランの緩衝液はアミン誘導化した表面と反応すると、 近傍のアルデヒドとアミンの間でシップ塩基を形成する。結果として、ボロハイ ドライドナトリウムを持つこれらのウエーファの減少が起き、安定的で高密度の ポリメリックアルコール表面が形成される。
ポリメリックアルコール表面を初めとして、多くの技術を利用してセロトニンと 接合するように表面を活性化させることができる。セロトニンを固定するための 二つの有効な方法は次の通りである。
1)反応媒体のphに応じてフェノール又は第一アミンのどちらかを核置換する ことで固定する多種の方j五2)フェノール環の電子芳香置換に基づくジアゾニ ウム塩による固定。
第一番目の方法の基本(友 セロトニン自体が多種のphレベルにおいて活性化 する性質にある。これらの技術はすべて、表面上の反応化合物をセロトニンによ って核置換することに依っている。理論的にft、、phが低いときに(よ フ ェノールの○Hは陽子を奪わ札 フェノキシトとのエーテルリンクの形成により 固定するであろう。phが高く中性に近いときに]社 第一アミンの方がフェノ ールよりも核性が大きくなり、第二アミンが形成されることで固定するであろう 。
この方法に二つの活性化処理を取り入れることも可能なはずである。
])塩化シアヌル酸活性化 基本条件下における塩化シアヌル酸との多アルコール表面の反応により、ジクロ ロアルコキシトリアジンが生じる。このジクロロアルコキシトリアジン未 上述 したように(スキーム1、等式1参照)次にフェノール又はアミンのどちらかと 反応する可能性がある。塩化シアヌル酸は高度で特異な活性を維持しながら作用 させることが比較的容易である。このリンカ−(よ 芳香組織のが強固なため、 固定された物質を表面から遠ざけようとする性質がある。
2)トリホスゲン活性化 強固であり、よって取り扱いも容易なホスゲンと同等の合成物であるトリホスゲ ンとの多アルコール表面の反応により、クロ[]フォルムが形成される(スキー l\1、等式2を参照)。ホスゲンで活性化されたアル:コール表面は高度の活 性を有するが、ホスゲンそのものの取り扱いの1.さのために、この工程はあま り実用的ではない。上記のようにこの方法を使用して、どちら側からでもセロト ニンを固定することが可能である。
ジアゾニウム塩を形成することにより固定する方法が二番目の方法である。この 二番目の方法に(表 活性化処理として(よ 多アルコール表面を4−ニトロベ ンゾイル クロライドと反応させ、その後直ちにハイドロサルファイドにより縮 合させることで、表面を4−アミノベンゾイック エステルで誘導化することを 取り入れることが可能なはずである。HCl中でこの表面を窒化ナトリウムと反 応させると不安定なジアゾニウム塩が生じる。このジアゾニウム塩はセロトニン と反応して、フェノール環の電子芳香置換を起こすはずである(スキーム2参照 )。この技術により塩化シアヌル酸組織の硬度は維持さね フェノール又は第一 アミンのどちらをも結び付けない。
次にセロトニンで被膜形成されたウエーファを、濃度レベルの異なる単一クロー ン性と多クローン性両方の多種の抗体に接触させて、発生する結合の量を観察す る。
理論的に(よ ここで金色がかった褐色の素子を競合検定法で使用しで、分析物 溶液中のハプテン及びセロ1〜ニンの存在を調べることができるかも1.れない 。分析物溶液を=抗体溶液ど混合1、イー溶液中で結合反応を起こさせる。この 溶液は欠にハプテンで被膜形成されたウエーファに接触させなければならな(八  溶液中に大皿の分析物(ハプテン)が存在ずれ(凰 溶液中のハプテンにまだ 結合していない抗体は少ないはずである。この未結合の抗体はつ工−ファ表面の 固定されたハプテンに結合し、反応したハプテン−抗体は表面には付着しないは ずである。よって、人里の分析物を含んだ分析物溶液は標識を少ししか、又は全 く生じないのである。
溶液中に分析物(ハプテン)が全く存在しないのであれIt 溶液中の抗体は活 性のまま維持さね 理論的には明るい藤紫色の干渉色を生じなからウエーファ表 面に結合するであろう。分析物の濃度が高ければ高いほど、観察者に見える藤紫 色の標識は低い。このテストは準定量的であってもよい。ウエーファは多種のハ プテン濃度でテストさね 発生した標識の色は紙片に再現される。次1:、未知 の分析物溶液によって反応したウエーファ上に生じた色とこの紙片の色を比較す る。もう一つの準定量的方法ではテスト素子1:、反応したハプテン濃度の印を 前もってスライド上に付しておいたウエーファを設けている。これによりプリン ト過程における誤った彩色を防ぐことはできるが、紙片の使用より費用は高くな る。
このテストは通常は視覚的なテストであり器具を使わないが、比較偏光解析計を 使って結合反応による膜厚の変化を確認してもよい。ウエーファの背景部分及び ウエーファの反応部分の光学的厚さを測定し、厚さの変化を比較することもでき るであろう。厚さの変化を測定に使用した測定単位はグレースケール単位である 。
この単位は比較偏差解析計から光学検知器に達した光の彩度を数字で表したもの である。標準曲線を得るためにグレースケール単位の値は分析物濃度と関連づけ てもよい。表3のデータは同じようなテスト形式によって異なるハプテンを検知 することで得られた 表3のような器具による比較データがセロトニンの検知に おいても得られるであろうことが予測できる。その検定は以下に示された手順に よって行うことができるであろう。
1、多種のハプテン濃度の溶液を準備する。第一溶液は5ミクロリツトルのPB Sを含んでいた 第二溶液は水1ミリリットル当り500mgのハプテンを含ん でいなければならない。水に対するハプテン濃度が、31pg/ml、62 p  g / m l、125pg / m l、500pg/ml、1000 p  g / m l、及び10゜000pg/mlとなるよう、希釈を連続して行 う。標準曲線を得るためにこれらの希釈を利用してもよい。
2、多クローン性抗体溶液を、PBS1ミリリットル当り抗体がほぼ0.6mg となるように用意する。
3、多クローン性抗体を5ミクロリツトル、7本の別々の試験管にとる。5ミク ロリツトルの第−PBS溶液を1本の試験管に加え溶液を混合する。次に連続希 釈した5ミクロリツトルのハプテンを抗体混合物を入れた7本の別々の試験管に 加え、混合する。
4、各々の試験管から溶液を5ミクロリツトルずつ採り、被膜形成されたウエー ファに接触させる。次にウエーファを45度Cで3分間インキュベートする。
5.3分後、ウエーファをイオン除去した蒸留水で洗浄して未結合の物質をすべ て取り除く。次にウエーファを窒素流で乾燥させる。スライドを視覚的に検査す ると、理論的にLlll、抗体PBS溶液が加えられたところでは明るい藤紫色 の点、31pg/mlのハプテン/抗体 溶液が置かれたところでは明晰度の劣 る青色の点、 10.OOOpg/mlのハプテン濃度のものが加えられたとこ ろでは明るい青紫色の点が現れるはずである。連続希釈により、より暗い色合い の青色が生じるはずであるが、これはハプテン濃度の減少のためである。
6、色の変化を物理的に示すのはウエーファ表面に被膜形成された光学的厚さの 変化である。この厚さは比較偏光解析計により、グレースケールを単位として測 定することができる。以下に示す表3は結合した異なる抗体の測定結果である。
このデータは競合法で測定された類似のハプテンのものであるため、上記の手順 で行った測定と実際に近いものであるはずである。
表3 結合した抗体の測定 濃度 グレースケール ハブテン n ml 測淀− Opg/ml 53.2 31pg/ml 40.42 62pg/ml 34.00 125pg/ml 27.39 500pg/ml 26.63 1、OOOpg/ml 23.27 10、○OOpg/ml 15.04 分析物溶液中に存在するハプテンの量が少ないほど有効抗体濃度は高い。分析物 溶液中の有効抗体濃度が高いほど、固定されたハブテンと溶液中のフリーな抗体 の間の表面結合はより多く起きる。発生する表面結合が多いほど干渉色変化はよ り鮮やかになる。
反応点と背景干渉色(上 ウエーファの表面が均一でないために鏡像反射を起こ さなかった 例5 Aグループの連鎖球菌検知 このテストで(上 表面をよく研磨された3つのシリコンウェーファ、及びある 特定の波長で屈折率がほぼ4から4.08の表面が均一でない3つのシリコンウ ェーファを使用した それぞれのグループは類似の反射防止物質で被膜形成され t−、Aグループ農ある特定の波長で屈折率が1.97の酸化シリコンでほぼ5 50オンゲスドロ〜ムに被膜形成されf、:、Bグループ1上 ある特定の波長 で1.95の屈折率をもつ酸化窒化シリコンの被膜をほぼ560オングストロー ムに形成されf−、Cグループ(飄 ある特定の波長で屈折率が1.9の酸化は う素の被膜をほぼ550オングストロームに形成された これらの被膜形成(上  基材表面に一枚の光学的層を被膜として形成するのに利用される等式に大変近 い。
受容物質は25から30オングストロームの厚さに被膜として形成されん この 数字は反射防止物質の最適な厚さの計算には入れられなかっ旭 ウェーファの3 つのグループ1上 受容物質が付着するよう化学的に活性化された 活性化は以 下の処理によりN−2(2−アミノエチル)−3−アミノプロピルトリメトキシ シランを用いて行った 1、被膜形成されたウエーファE 175D、C,ミリアンペアで250RFワ ツトの陽極電流を流した。、7oトルの酸素中で5分間酸素プラズマエツチング を施した2、ウエーファを酸素プラズマエツチャーから取り比してすぐに石英の ラックに納め、2.5ミクロリツトルのアミノシランを入れた容器を固定させた 状態で真空乾燥器に挿入した3、真空室は0.06トルまで30分間排気された  その後乾燥器の温度を1時間以上かけて100度に上げ翫 この工程がアミノ シランをウエーファ表面上に気相沈着させ、ウエーファは活性化された 4、これでウェーファは受容物質を固定させる用意が整ったことになっ旭 まず 1ミリリットル当り250ミクログラムのウシ血清アルブミン(B S A)を リン酸ソーダ緩衝液(P B S)に溶解させた 10ミリリツトルのこの溶液 をph8.5に調整し、6つのウエーファを納めたプラスチックの培養セル箱に ピペットで滴下し翫 5、水溶液中25%のグルタルアルデヒドを50ミクロリツトル、この培養セル 箱に加えf:41ミリリットル当り5oミクログレインのたんばく質溶液25ミ クロリットルもまたこの培養セル箱に加え翫 6、培養セル筒中の6つのウエーファを振どう槽にて室温で1時間30分インキ ュベートした 7、(ベントレックス社から)商業的に入手可能な抗ストレップA(ウサギで培 養)を200ミクロリツトル、培養セル箱にピペットで入札 振とう槽にて室温 でもう1時間インキュベートシタ8、インキュベートに続いて、この培養セル箱 をほぼ48時肌4度Cで冷却し、受容抗体物質を素子により堅固に固定した 未 結合の物質をすべて取り去るためにウェーファをイオン除去した蒸留水で洗浄し 、N2流で乾燥し九 6つのウエーファは金色の色合いを見せたが、その中でも3つのウエーファは鏡 像反射を呈し、3つのウエーファは非鏡像反射を呈していた 次にこれらのウエ ーファを使用して、バクテリア形状又はバクテリアの溶解産物形状のどちらかの 形のストレッグAの存在を調べ旭 検定技術は以下に述べる通りである。
1、ウエーファをそれぞれ別々にしてプラスチック類の小型のテスト素子に納め る。このテスト素子は上ぶたの内側に目の荒い濾過紙が2枚貼着した設計である 。各々のテスト素子の一枚の紙1:は7ミクロリツトルの陽性コントロール試料 、二番目の紙には7ミクロリツトルの陰性コントロール試料が置かれている。ベ クトン ディッキンソンから商業的に入手されたこの陽性コントロール試料It 、o、02%のアジ化ナトリウム溶液中でAグループの連鎖球菌を加熱殺菌され た 陰性抑制試料(二 Pus 1m l当りBSAを50ミクログラム含んだ 溶液から得られ翫2、テスト素子のふたを閉じて被膜形成されたウェーファに濾 過紙を1分間接触させた 3、ふたを開けてウエーファを1分間空気乾燥した 次につx、 −ファをイオ ン除去した蒸留水で洗浄!−1、加圧空気で乾燥[7九ウエーフアを視覚的検査 した結果、非鏡像反射つニ〜ファ上では可視性の高い紫色の点が、鏡像反射ウエ ーフチ上では紫色の点が現れていち 非鏡像反射つエーファを視覚的検査したと ころ、鏡像反射ウェーファよりも角度との関係が小さいということが判明しん  点はすべてはっきりと区別がつくものであったが、濃度が低いときの反応色は鮮 明度が劣っていた ここで器具を使ってウエーファ表面上で起きた結合反応によ って生じた質量の増加を確認し翫 質量又は厚さの変化層 サガツクス(登録商 標)の比較偏光解析計によりグレースケール単位で測定されL前述の例は多種の 基材物質、方法 反射防止物質、分析携 及び受容物質について述べている。
これらのウエーファの設計(表 例4で述べられた競合法又は非競合法検定又は 阻害検定に使用することが可能である。検定(上免疫検定又は例2で述べたよう な臨床化学検定でも酵素検定でもよい。あるいはDNA又はRNA検知のために 設計されてもよい。
基材(よ 例3のクロムのような金属を含む多種の物質とすることが可能である 。金属が使用されるときC表 想定した屈折率を選択した等式に取り入れなけれ ばならない。この素子はその表面をくさび状又は平面にして、素子を定性的素子 又は準定量的素子とすることができる。前記の例はまた、素子を定量的な器具素 子とすることも可能であることを示している。この素子の光学層(よ 視覚的及 び器具による検査の両方):使用が可能である。、:のウエーファを測定するの に、光の波長ヌは彩度に測定するよう設計さ才“また器具を使用することもでき る。様々な物性値を検知する他の器具を使用して、このウエーファが器具を使っ た定性的又は定量的技術となるようにしてもよい。
前記の例]友 分析物付着の標識として干渉色の変化又は彩度の変化を発生させ るために、基材、反射防止物質、活性化物質、及び受容物質から成る素子を使い 、多種の分析物を検知するこの技術の有効性及び実用性を説明している。
前記の例で使用された基材フォーマット又は物質に制限されるなく、反射防止物 質を表面に結合させることのできる機能的に同等の基材フォーマット及び基材物 質の多種の組合せを利用することが可能である。
反射防止物質の層は活性化されて、受容物質として機能したり、受容物質をなん らかの作用で素子に付着又は固定したりすることができる。さら1:、本発明中 で使用された反射防止物質]上 最も高レベルの破壊的光干渉が得られるよう、 指定された光の波長のほぼ4分の1の波長の光学的厚さに被膜として形成される 。
AR被被膜指定された波長の4分の1以上なら多種に形成できる。つまり充分な 干渉色を得るためには破壊的干渉が完全である必要はなく、素子を照射するため には多色光及び単色光の両方を使用できるからである。表面に被膜形成されるA R物質の実際の量は多岐にわたる。これは指定された波長はどの様な波長のもの でもよく、AR膜の厚さを増加させると小型の分析物の結合に対する感度がより 高い素子ができるからである。
AR層の物質的な組成1iAR物質及び選択された基材物質のの屈折率に基づい て選択される。よって、物質の組合せが正しく選択されれ(戯 はとんどすべて のAR物質を利用することができる。最上層のAR物質(上 活性化されて、受 容物質として機能するか又は受容物質を受容可能なように選択される。はとんど のAR物質(上 受容物質が素子に付着するようになんらかの手段で活性化する ことが可能である。従って、大変多くの物質を反射防止物質として利用すること ができる。
AR物質及び受容物質の組成 又匝 もし活性化物質が受容物質として機能して いるのであればAR物質及び分析物の組成に応じて、多種の化学的活性化方法が 利用できる。多種の物質又は官能基を活性化物質又は活性化過程として機能させ ることが可能である。
基材は 試験管、ウエーファ、ガラスのスライド、マイクロウェル等のどの様な 形状でもよく、固体の支持液 剛性可撓性又は準可撓性の支持液 ゲル、薄膜等 どのような形態でもよい。また、多種の適した物質、例えばガラス、シリコン、 ポリスチレン等ポリメリック炭化水素等のプラスチックから形成してもよい。ま た非鏡像反射、反射、透過性 鏡像反射のいずれかの性質を持つ物質から形成し てもよい。このように分析物の検知に有効な多くの方法が可能であるので、前述 の技術を用いて、分析物検知を行う多くの有効なアプローチが可能であろう。
この分析物検知は干渉色変化の視覚的検知に限られるものではない。色の変化は 赤外又は紫外域における変化でもよい。この場合は器具を用いた検知素子を使用 する。反応した素子(表 偏光解析計又はなんらかの作用によって起こった分析 物の結合を検知できるその他の器具を使って、定性的又は定量的に分析すること が可能である。
ここに述べられた発明の趣旨は異なる形で実施可能であろう。
本発明のこのようなその他の実施例(よ 先行技術によって限定される場合を除 いて、請求の範囲にすべて含まれるよう意図されている。
国際調査報告

Claims (46)

    【特許請求の範囲】
  1. 1.表面上に固定した1以上の反射防止物質層をその表面上で支持する基材、及 び 分析物と相互反応の可能な分析物受容物質層表面上で支持する前記反射防止物質 の最上層 からなる分析物検知剤において、 前記反射防止物質がある波長において反射が最小でほぼゼロとなるように選択さ れた厚さ及び屈折率の組合せであり、これにより分析物検知の標識となる厚さの 変化に対する検知能力が高められたことを特徴とする分析物検知剤。
  2. 2.前記基材がゲル状であることを特徴とする請求項1に記載の検知剤。
  3. 3.前記基材が薄膜であることを特徴とするの請求項1に記載の検知剤。
  4. 4.前記基材が可撓性物質であることを特徴とする請求項1に記載の検知剤。
  5. 5.前記基材が透過性を持つことを特徴とする請求項1に記載の検知剤。
  6. 6.前記基材が反射性を持つことを特徴とする請求項1に記載の検知剤。
  7. 7.前記基材が基材物質を支持可能な他の物質上に被膜として形成されることを 特徴とする請求項1に記載の検知剤。
  8. 8.前記基材がクロムであることを特徴とする請求項1による検知剤。
  9. 9.前記反射防止物質が前記基材にパターン状に被膜形成されていることを特徴 とする請求項1に記載の検知剤。
  10. 10.前記反射防止物質が前記基材上にくさび状に形成された被膜であることを 特徴とする請求項1に記載の検知剤。
  11. 11.反射防止層の少なくとも一つが電子光学的物質により成ることを特徴とす る請求項1に記載の検知剤。
  12. 12.検知される分析物が腫瘍標識であることを特徴とする請求項1に記載の検 知剤。
  13. 13.検知される分析物が癌胎児抗原であることを特徴とする請求項1に記載の 検知剤。
  14. 14.検知される分析物が妊娠の証拠であることを特徴とする請求項1に記載の 検知剤。
  15. 15.検知される分析物が自己免疫指標であることを特徴とする請求項1に記載 の検知剤。
  16. 16.検知される分析物がリウマチ因子であることを特徴とする請求項1に記載 の検知剤。
  17. 17.検知される分析物がバクテリア溶解産物であることを特徴とする請求項1 に記載の検知剤。
  18. 18.検知される分析物がバクテリアであることを特徴とする請求項1に記載の 検知剤。
  19. 19.検知される分析物が連鎖球菌Aであることを特徴とする請求項1に記載の 検知剤。
  20. 20.検知される分析物がハプテンであることを特徴とする請求項1に記載の検 知剤。
  21. 21.表面上に固定した1層以上の反射防止物質層をその表面上で支持可能な基 材、及び 分析物検知によつて生じた厚さの変化が最小の状態で、抑制された波長の変化を 最大になるよう選択された、基材及び反射防止物質の厚さ及び屈折率の組合せよ り成る分析物検知剤。
  22. 22.活性化した物質の一枚の層及び反射防止物質の一枚の層を含む二枚の別々 の層から成ることを特徴とする請求項21に記載の物。
  23. 23.分析物をテスト溶液から捕捉可能な反射防止物質の最上層を備えたことを 特徴とする請求項21に記載の物。
  24. 24.前記テスト溶液から分析物を捕捉するよう活性化可能な物質の最上層を備 えたことを特徴とする請求項21に記載の物。
  25. 25.前記基材がシリコンであることを特徴とする請求項21に記載の物。
  26. 26.前記反射防止物質が酸化窒化シリコンであることを特徴とする請求項21 に記載の物。
  27. 27.前記基材が金属であることを特徴とする請求項21に記載の物。
  28. 28.前記基材が非金属であることを特徴とする請求項21に記載の物。
  29. 29.前記基材がガラスであることを特徴とする請求項21に記載の物。
  30. 30.前記基材がプラスチックであることを特徴とする請求項21に記載の物。
  31. 31.前記反射防止物質が酸化ほう素であることを特徴とする請求項21に記載 の物。
  32. 32.溶液中の分析物の存在をテストするために、被膜形成された支持物を前記 溶液に接触させ、 前記支持物の反射の変化に証左される分析物の固定を検知する工程より成る、溶 液中分析物の存在を選択的に検知する工程。
  33. 33. 前記検知が視覚によるもので、厚さが媒体中の光の波長のおよそ4分の 1で、屈折率が層の真上及び真下の媒体の屈折率の積のほぼ平方根である反射防 止物質の被膜 から成り、前記検知が視覚によるもので、少なくとも一枚の層によつてその効果 を高められたことを特徴とする請求項32に記載の工程。
  34. 34.分析物の存在の検知が器具によつて行われることを特徴とする請求項32 に記載の工程。
  35. 35.分析物の存在の検知が人間の視覚によつて行われることを特徴とする請求 項32に記載の工程。
  36. 36.分析物の存在の検知が、少なくとも一枚の濾過紙を使用して行われること を特徴とする請求項32に記載の工程。
  37. 37.分析物の検知が、少なくとも一つのポラライザーを使用して行われること を特徴とする請求項32に記載の工程。
  38. 38.分析物の検知が垂直以外の角度で行われることを特徴とする請求項32に 記載の工程。
  39. 39.単色光で分析物検知剤を照射する工程を含むことを特徴とする請求項32 に記載の工程。
  40. 40.多色光で分析物検知剤を照射する工程を含むことを特徴とする請求項32 に記載の工程。
  41. 41.紫外光で分析物検知剤を照射する工程を含むことを特徴とする請求項32 に記載の工程。
  42. 42.赤外光で分析物検知剤を照射する工程を含むことを特徴とする請求項32 に記載の工程。
  43. 43.基材がポリマーであることを特徴とする請求項1による物。
  44. 44.被膜形成された支持物が、 その表面上に固定した1層以上の反射防止物質層をその表面上で支持する基材、 及び 分析物と相互反応可能な分析物受容物質の一枚の層を表面上に支持するである前 記反射防止物質の最上層から成り、 前記反射防止物質がある波長で反射が最小ほぼゼロとなるよう選択された厚さと 屈折率の組合せであり、これにより、分析物検知の標識となる厚さの変化の検知 能力が高められたことを特徴とする請求項32に記載の工程。
  45. 45.被膜形成された支持物が、 その表面上に固定した1層以上の反射防止物質層をその表面上で支持可能な基材 、 分析物検知によつて生じた厚さの変化が最小の状態で、抑制された波長の変化を 最大にするよう選択された、基材及び反射防止物質の厚さ及び屈折率の組合せ より成ることを特徴とする請求項32に記載の工程。
  46. 46.反射防止物質及び基材物質より成り、溶液中の特定の分析物を検知して可 視性のある色の変化を呈するように調整された被膜形成された素子において、 前記基材物質が少なくとも3.8の屈折率を持ち、光波長の破壊的及び建設的干 渉により反射防止的な干渉色を生じる色発生物質の層を少なくとも一つ支持し、 前記反射防止物質は人間が色の変化を検知するところであり、前記反射防止物質 の厚さを除くと厚さがおよそ20オングストロームより小さくなる差異膜厚間の 点よりほぼ50−150オングストローム以上小さい厚さであり、そして前記反 射防止物質が、前記特定の分析物が分析物受容物質に受容されて結合した時に、 可視性のある色の変化を生じるのに充分な厚さの分析物受容物質層で被膜形成さ れていることを特徴とする被膜形成された素子。
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