JPS6378052A

JPS6378052A - 安定化された免疫検出用簡易デバイス及び免疫検出方法

Info

Publication number: JPS6378052A
Application number: JP22205886A
Authority: JP
Inventors: Takeyuki Kawaguchi; 武行川口; Hisashi Jo; 尚志城
Original assignee: Teijin Ltd
Current assignee: Teijin Ltd
Priority date: 1986-09-22
Filing date: 1986-09-22
Publication date: 1988-04-08
Also published as: JPH048742B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（１）技術分野：本発明は、免疫診断を行うための非常に簡便な免疫検出
用デバイス、及びかかる免疫検出方法に関する。更に詳
しくは、本発明は抗原−抗体反応を反射性基板上で行わ
せることによる抗原物質や抗体タンパクの検出装置及び
その利用方法に関する。

（２）従来技術：極めて特異的な生化学反応である抗原−抗体反応を用い
て免疫学的診断かこれまで行われてさた。

具体的方法としては、放射性元素標識免疫診断（以下、
ＲＩＡと略す）、酵素標識免疫診断（ＥＩＡ）　、ケイ
光色素標識免疫診断（ＦＩＡ）及びラテックス凝集沈澱
法（Ｌ　Ｓ　Ａ　）などが知られており、実用にも供さ
れている。しかしながら、これらの方法はいずれも解決
されるべき技術的課題を抱えている。すなわち、ＲＩＡ
では検出感度は極めて良好であるが放射性元素を取扱う
特別な設備を要するし、ＥＩＡは検出完了までに長時間
（通常、数時間〜１日）を要し、またＦＩＡは検出感度
が充分ではなく、ＬＳＡは非特異的な凝集反応が避はテ
１く、特に極微量成分の検出に於て信頼性が問題となっ
ている。また、これらとは別の方法として、固体基板上
での抗原−抗体反応に伴なうタンパクの厚み増加を、楕
円偏光を用いて検出するエリプソメトリ−法が提案され
ている（特開昭５０−７６２２６＠公報参照）が、この
方法も高価な装置を必要とし、また膜厚の測定にも相当
の熟練を要する。こうした高価な装置を使うことなく、
簡便に抗原−抗体反応を目視により検出するための提案
として、固体基板上に蒸着された金粒子表面に抗体（又
は抗原）を吸着固定し、抗原−抗体反応に伴なう固定化
抗体（又は抗原）の膜厚増加による反射光の色調変化を
視認する方法がある（特開昭５９−１６０７６３号公報
参照）。この方法によれば、確かに抗原／抗体反応によ
り、固体基板上の金とタンパク薄膜複合体は色調が変化
するが、その変化は褐色から暗褐色に移るもので、非常
に不明瞭であり、抗原抗体反応の判定が極めて主観的に
なる可能性が高い。

（３）本発明の開示：かかる背景に鑑みて、本発明者は、抗原抗体反応を簡便
に、かつ明瞭に短時間で、感度よく検出する方法及びデ
バイスを鋭意検討した結果、固体基板上にて反射層と、
予め最適化した光干渉層とを設Ｃノだデバイスを用いれ
ばにいこと、さらに抗原又は抗体層が光干渉層表面に化
学結合することにより、基板からの剥離のない安定な免
疫検出デバイスが得られることを見い出し、本発明を完
成するに到った。

すなわら本発明は、実質的に乱反射のない光反射性基板
（■）、及びこの上に積層された光干渉層（ＩＩ）、更
にこのｌ１Ｊ（ＩＩ）の上に設けられた抗原又は抗体分
子と反応しつる化合物からなる反応性中間層（ＩＶＹ、
更に層（１ｖ）の上に設けられた実質的に単分子層から
なる抗原物質及び／又は抗体タンパクの層（ＩＩＩ）か
ら成り、当該１　（ＩＩＩ）の上で抗原−抗体反応を生
起せしめた後の膜厚の増加が可視光領域での光干渉色の
色調変化又は該デバイス表面での反射光の濃淡として検
出できるように当該光干渉層（ＩＩ）の光学膜厚が制御
されてなる安定化された免疫検出用簡易デバイス及びそ
れを利用した免疫検出法である。

本発明に用いられる光反射性基板としては、金。

銀、銅、鉄、アルミ等の元厚則率の高い金属板か、他の
固体基板上にこれらの金属を蒸着又はスパッタリング等
の方法により薄膜形成したものが用いられる。また、本
発明の光干渉層としては次の要件を満すことが必要であ
る。すなわち、（１）可視光（波長３００〜８００ｎｍ
）に対して、実質的に反射特性を右さないこと、（２）
本発明のデバイスの最表面に設けた、抗体タンパク及び
／又は抗原物質層の抗原−抗体反応に伴う厚み増加が、
光の干渉色変化として表われる様に光干渉層の膜厚が制
御されていること及び（３）その表面が、抗原物質もし
くは抗体タンパクと充分な親和性又は反応性を有するこ
とである。

上記（１）〜（３）の要件のうち、（１）と（２）を満
す材料の中で、有機物質としては、可視光領域（３００
〜ａｏｏｎｍ）で実質的に反射特性を有さす、かつ薄膜
形成能のあるものなら使用可能であるが、好ましくは後
述の抗原抗体反応によるタンパクの膜厚増加に伴なった
光の干渉色変化が効率よく起るために、その膜厚を５０
〜１００　Ａオーダで制御できるものがよい。その様な
ものとしては、長鎖カルボン酸、及びその金属塩、ざら
に長鎖カルボン酸エステルのように水面上で安定な凝縮
単分子膜を形成する化合物、コーティングや蒸着による
２００ＯＡ以下の塗膜形成が可能な材料が好適例として
挙げられる。前者の具体例としては、パルミヂン酸、ス
テアリン酸、リグノセリン酸、Ａレイン酸、ω−トリコ
セン酸等の長鎖飽和及び不飽和カルボン酸、その］ニス
チル及び１〜３価の金属塩等があげられ、後者の具体例
としては、ポリメチル（メタ）アクリレート、ポリスヂ
レン、ポリアクリロニトリル、ポリ塩化ビニル等のビニ
ル系重合体、ポリエヂレン、ポリプロピレン、ポリ−４
−メヂルペンデンー１等のポリオレフィン、ポリアミド
、ポリエステル等の縮合系ポリマー等があげられる。一
方、光干渉層として無機化合物を用いる場合も一上記４
１機物の場合と同様に可視光領域で反射がなく、かつそ
の膜厚が５０〜１００２オーダで制御され、かつその表
面が抗体又は抗原タンパクと親和性を有するか反応性を
有することが必要である。その様な特性を備えているも
のとしては、酸化ケイ素、！！化デアルミ酸化錫、ｖ、
化鉛、酸化タングスデン、酸化マグネシウム、Ｖ化コバ
ルト。

酸化モリブデン、酸化チタン、酸化ジルコニウム。

酸化亜鉛、酸化タンタル等の金属酸化物、フッ化マグネ
シウム、フッ化ルテヂウム等の金属フッ化物、及びヂッ
化ケイ素やカリウムーヒ素等の金属間化合物などが挙げ
られる。これらは、蒸着法やスパッタリング法により所
望の膜厚に制御され光干渉層として本発明の反射基板上
に設けられる。

その膜厚としては、図２と図３に示した本発明のデバイ
スに於る入射光の光路差；　ｎ３　ｘ　（ＢＣ＋ＧＨ）
　　　＋　ｎ２　　　ｘ　　（ＣＤ＋ＦＧ）　　−ト　
ｒｌｌ　　　ｘ　　（ＤＥ＋ＥＦ）　　−ｒｌＱｘＢＪ
、及ヒｎ４　ｘ　（Ｂ’Ｃ’＋Ｉ’丁’）　＋ｎ３　Ｘ
　（Ｃ’Ｄ’−＋　Ｈ’Ｉ’）　＋ｎ２　ｘ　（Ｄ’ビ
＋Ｇ’ｔｌ’）　十ｎ１ｘ（Ｅ’Ｆ’十Ｆ’Ｇ’）　−
ｎＱ　ＸＢ’Ｌが入射光波長の整数倍になる様に制御さ
れなければならない。さらに、図２と図３とに於る上記
光路差も異なることが、抗原抗体反応部位の識別の為に
必要でおる。ちなみに、光干渉層の厚みは、この層の屈
折率が１．４〜２．０の範囲にあるときには、約５００
〜５０００人、好ましくは７００〜３０００人に制御す
ることが必要になる。

その様な正確な膜厚制御法としては、ラングミュアブロ
ージェット法（水面上の単分子膜を固体基板上に累積す
る方法）、スピンコード法及びスパッタ法などが挙げら
れる。

上記の光干渉層（ＩＩ＞と後で述べる抗原物質及び／又
は抗体タンパクの層（ＩＩＩ）との間に、抗原又は抗体
と反応しうる化合物から成る反応性中間層（１ｖ）を設
けて、上記層（ＩＩＩ）が本発明のデバイスから脱着し
たり、不安定になることを防ぐことも本発明の特徴であ
るが、その様な反応性中間層としては、タンパクのアミ
ン基、カルボキシル基又はチオール基のいずれかと反応
しうる化合物から成ることが好ましい。また、先に述べ
た光干渉が起るための膜厚の制限から、上記反応性層も
膜厚が精密に制御できることが好ましい。こうした条件
を満す反応性化合物の内、タンパクのアミン基と反応し
うるちのとしては、エポキシ基、酸無水物基、イソシア
ネート基、マレイミド基、アクリルアミド基を含む化合
物がおる。これらの化合物の中で薄膜形成が可能で、膜
厚制御がやりやすいものとしては、下記のものが具体例
として挙げられる。

Ｃｎ’−’２ｎ＋　１　　ｇ　　、　　（ＩＩは１０〜
３０の整数）。

Ｏ（ｌは２〜３０．　ｍは２以上の整数）。

（ｍ２．　ｍ３は２以上の整数、Ｘは１〜３０の整数）
ＣＶ　Ｅｌ　２ｙ＋　Ｉ　　Ｎ　ＣＯ（Ｖは１０〜３０
の整数）。

０Ｈ２＝ＣＨＣＮ）−Ｉ　　　ｃ　ｎ　Ｈ２ｎ＋１（Ｉ
Ｉ、ｚは１０〜３０の整数）。

タンパクのカルボキシル基と反応しうる本発明の化合物
としては、・くし乙Ｃ°　ト１２°−＋−１（ＩＩ　　ＬｔｌＯ〜
３０）　・Ｃｍ”−’２ｍ’＋Ｉ　　Ｎｆ１２（Ｉｌｌ
ｏは１６〜３０）等が例示される。また、タンパクのブ
Ａ−ル基と反応しうる本発明の化合物としては、すＣ，）−１２，−、−Ｉ　Ｎ　Ｃｏ　（ｙは１０〜３０
の整数）などが例示される。

−これらの化合物は、先に述べた光干渉層の上に、薄膜
として設けられ、しかも元厚ｇＪ＝１層より上の層全体
の光干渉色が可視領域に入るように、膜厚が制御されて
いなければならない。その様な薄膜としては２５〜５０
００人、好ましくは、３０〜３０００人の範囲が選ばれ
、これを実現するための製膜法としてはラングミュアブ
ロージェット（ＬＢ）法やスピンコード法が用いられる
が、特に膜厚制御の正確さからＬＢ法が好ましい。かく
して、本発明の元厚ｑ・１層表面に設（）られた反応性
層の表面に抗体又は抗原物質が上記に述べた反応により
、固定化される。

本発明のデバイス表面に固定される抗体タンパク又は抗
原物質としては、免疫反応に関わるもので、その最大分
子サイズが３０〜５００人好ましくは５０〜３００人の
範囲にあるものが光緩衝法による抗原−抗体反応には好
ましい。抗原の具体例としては、ＩＱＧ、Ｉｇ八、　ｌ
１ｊＥ、　１ｇ）ｆなどの免疫グロブリンや絨毛性性腺
刺激ホルモン（＋−１０Ｇ）、ガン胎児性抗原（ＣＥＡ
）などがめげられ、抗体としては、これらの抗原に対す
るポリクローナル又はモノクローナルな抗体が用いられ
る。

これらの抗体又は抗原は１１１独でも、相合けて用いて
もよい。また、これらのタンパクの認識部位（［ａｂ部
分）とＦｃ部分とを切りはなして用いてもよい。

これらの抗原や抗体を本発明のデバイス表面に固定化す
るためには、上記抗原又は抗体水溶液中にデバイスを０
．５〜１０時間、浸漬しておいたのら、物理的に付着し
ている抗原（又は抗体）分子を、充分に水洗すればよい
。この吸着処理により、抗原（又は抗体）が単分子層と
して前記の光干渉層上に固定化される。

かくしてデバイス表面に吸着された抗体又は／及び抗原
は一種でも良いし、二種以上でも構わない。二種以上の
抗原又は抗体を固定化する場合は、図４に示したように
光干渉層を設（プた反射性基板を、目的の抗１京又は抗
体の溶液に浸漬する深さを、該溶液毎に変えればよい。

このようにすれば、１種類の抗体（又は抗原）が付着し
た部分には別の抗体（又は抗原）は一般に吸着しない性
質を持っているので、複数の抗体（又は抗原）を単分子
層として同一のチップ上に固定することが可能になる。

これにより、高価なモノクローナル抗体を効果的に固定
化することが可能になる。

かくの如く、抗体く又は抗原）か固定された本発明のデ
バイスを用いて抗原抗体反応により免疫検出（診断）を
行うに当っては、白色光を入射させて、その光干渉色変
化にＪ、す、抗原抗体反応部位を検出するか、単色光を
入射して、その反射光の明暗部の識別により、抗原−抗
体反応を識別する方法が用いられる。この方法に従えば
、１０−５〜１Ｑ−１２モル／１の抗体（又は抗原）が
数分〜３０分で検出できる。

以上述べた如く本発明に従えば、稀薄な濃度の抗原又は
抗体を短時間で感度よく、かつ簡便に検出することが可
能となり、その実用上の意義は極めて大である。以下、
実施例をあげ、本発明をさらに詳しく説明する。

実施例１ステアリン酸８ｍ（Ｊを１ｍｌの蒸留クロロボルムに溶
解して溶液とした。４９１．４　ｃｍ２の水槽表面積を
有する表面圧−面積曲線（以下π−八へ線と略す）測定
用水槽に張った塩化バリウム３Ｘ１０−５）ｆ、炭酸水
素カリウム４　Ｘ　１０−４　Ｈの混合水溶液上にウル
トラマイクロピペットを用いて、上記溶液２００μｌを
徐々に滴下した。滴下綿Ｙ後５分間静置し、表面圧２０
ｍＮ／ｍになるまで仕切板を移動さゼた。

この水面展開膜を表面圧２０ｍＮ／ｍを常に保ったまま
、疎水化処理（ステアリン酸鉄（Ｉｎ）塗イ「）を施し
たクロムめっきしたステンレス板（鏡面仕上げ）上に、
垂直浸漬、引き上げ法（以後ＬＢ法と略す〉によッテ３
５層（ｒｉ９！厚８５０　Ａ　）　累積シタ（詳細は新
実験化学講座第１８巻４９９頁）。この時基板は、ステ
アリン酸累積膜の存在により、光干渉色として黄色を呈
した。このステアリン酸バリウム層の上に、予め水面展
開したＮ−オクタデシルマレイミドの単分子膜を水平付
着法により一層累積した処、基板の光干渉色は黄橙色に
なった。

ついで、この基板を０．４Ｊｌ　／ｍ１のヒツジ抗ヒト
Ｉ（ＩＧＣＩ−１＆Ｌ鎖特異性）液に２時間浸漬したと
ころ、デバイス表面の光干渉による色調は赤となり、抗
ヒ１〜Ｉ（ＪＧが基板に単分子状に吸着したことがわか
った。さらにヒトＩＣＩＧ液（０，３＋ｎｇ　／ｍ＞に
２時間浸漬したところ、基板に吸着している抗ヒトＩ（
ＩＧとヒトＩｇＧとの抗原−抗体反応により、ヒトＩｇ
Ｇが基板に吸着し、デバイス表面の色調は、紫色となっ
た（図５参照）。

このことから、光反射性基板上に、光干渉層としてステ
アリン酸層（３５層膜厚８５０人）を設け、その上に抗
ヒトＩｑＧを吸着固定させたデバイスを用いると、その
色調変化により、ヒトＩｇＧの存在を［１視で検出でき
ることがわかった。

実施例２実施例１と同様にしてクロムめっきしたステンレス板に
ＬＢ法によりステアリン酸を４１層（膜厚１０００人）
累積したところ、基板の光干渉色は赤色となった。

この基板上に、予め水面上にて２０ｍＮ／ｍで圧縮され
たヘキサデシル−１，２−オキシラン（・Ｆ１６１−１
３３＞の単分子膜０平付着法により〇一層累積した。この累積膜を実施例１と同様に抗と１〜
ＩＩＪＧを吸着させたところ紫色、ざらにヒト１（ＪＧ
を反応させたところ青色となった。この光干渉色は、再
現よく発現し抗体タンパクが上記の基板に強固に反応固
定されていることが分った。

実施例３実施例１と同様な方法で△２蒸着ポリニブレンチレフタ
レー１〜上にＬＢ法によってステアリン酸水面展開膜を
３５層累積した。この時基板の光干渉色は黄色を呈し、
さらに実施例１と同様に抗ヒ１へＩｇＧを吸着させたと
ころ赤色、さらにヒト１ｇＧを反応させたところ紫色を
呈した。このことがらＡ２蒸着ポリエチレンテレフタレ
ート上にステアリン酸層（３５層膜厚８５０人）を有す
る基板に抗ヒ１へＩｇＧを固定したデバイスを用いると
その色調変化によりヒトＩ（ＩＧを目視で検出可能でお
ることがわかった。

実施例４実施例１に於て、オクタデシルマレイミドの代りにオク
タデセンと無水マレイン酸の１：１交互共重合体を用い
、このもののクロロホルム溶液（１０ｍＬ／　２５ｔｎ
ｌ　＞を水面上に展開し、同様にデバイスを作成した。

このものを用い、抗ヒトＩ（ＩＧ抗体を反応固定したの
ら、ヒトＩＩＪＧの稀薄水溶液（１０−１０８／　ｆ　
）に３０分浸漬した処、光干渉に基ずくデバイス表面の
色調は、赤橙色から紫色へ変化した。

実施例５本デバイスが、目的とする抗原以外の物質に対しては、
色調変化を示さないことの実証例を示す。

実施例１と同様に作成したデバイスを抗生アルブミン液
（０，３ｍｇ、、’ｍｉ＞に２時間浸漬したところデバ
イス表面の光干渉による色調は赤色となった。

ついでヒトＩｇＧ液（０，３ｍＧ　／ｍｌ＞に２１．１
間浸漬したが基板の光干渉色に変化はみられなかった。

【図面の簡単な説明】

図１は本発明のデバイスの概念断面図でおる。図２は図１に対応するデバイスの光干渉の概念図２図３
は図１のデバイスに抗原が積層した場合の光干渉の概念
図である。図１〜図３において、１は光反射性基板（１）。２は光干渉層（ＩＩ）、３は反応性中間層（ＩＶＹ。４は単分子層（ＩＩＩ）、５は積層した抗原層を表わし
、ｎｏは空気の屈折率、　ｎｌ　は光干渉層（Ｉｔ＞の
屈折率、　ｎ２は中間層（ＩＶ）の屈折率、「）３は単
分子層（ＩＩＩ）の屈折率、ｎ４は積層した抗原層の屈
折率である。図４は本発明のデバイスの一態様であるマルチ抗体チッ
プの製造法の１具体例を示し、図５はマルチ抗体チップ
の例である。図６は免疫検出処理したデバイスの具体例の概念断面図
２図７はその色調の例である。図８は免疫グロブリンの概念図であり、図９は色調変化
を示す概念図である。

Claims

【特許請求の範囲】１、実質的に乱反射のない光反射性基板（ I ）、及び
この上に積層された光干渉層（II）、更にこの層（II）
の上に設けられた抗原又は抗体分子と反応しうる化合物
からなる反応性中間層（IV）、更に層（IV）の上に設け
られた実質的に単分子層からなる抗原物質及び／又は抗
体タンパクの層（III）から成り、当該層（III）の上で
抗原−抗体反応を生起せしめた後の膜厚の増加が可視光
領域での光干渉色の色調変化又は該デバイス表面での反
射光の濃淡として検出できるように当該光干渉層（II）
の光学膜厚が制御されてなる安定化された免疫検出用簡
易デバイス。２、当該反応性中間層（IV）を形成する物質が、抗体タ
ンパク又は抗原物質中のアミノ基、チオール基、又はカ
ルボキシル基のいずれかと反応しうる官能基を有するも
のである特許請求の範囲第１項記載の安定化された免疫
検出用デバイス。３、当該光干渉層（II）が３００〜８００ｎｍの可視光
領域で実質的に反射特性を有さず、かつ免疫タンパクに
親和性のある有機物薄膜である特許請求の範囲第１項記
載の安定化された免疫検出用簡易デバイス。４、当該有機物薄膜が単分子累積膜である特許請求の範
囲第３項記載の安定化された免疫検出用簡易デバイス。４、実質的に乱反射のない光反射性基板（ I ）及び、
この上に積層された光干渉層（II）、更にこの層（II）
の上に設けられた抗原又は抗体分子と反応しうる化合物
からなる反応性中間層（IV）、更に層（IV）の上に設け
られた実質的に単分子層からなる抗原物質及び／又は抗
体タンパクの層（III）から成り、当該層（III）の上で
抗原−抗体反応を生起せしめた後の膜厚の増加が可視光
領域での光干渉色の色調変化又は該デバイス表面での反
射光の濃淡として検出できるように当該光干渉層（II）
の光学膜厚が制御されてなる安定化された免疫検出用簡
易デバイスを、抗原又は抗体を含む被検査液に接触させ
、当該デバイス表面上の抗原−抗体反応部位と非反応部
位とを光干渉による色調の違い、又は入射単色光の反射
の明暗差として識別することを特徴とする免疫検出方法
。